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药研视角
2026.10.28 Online
近日,合肥物质院刘静/刘青松/王蓓蕾在药物化学权威期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为"Discovery of a Novel Pyrido[2,1-h]pteridin-6-one Derivative as a Potent and Orally Bioavailable HPK1 Inhibitor"的研究论文。
HPK1是T细胞活化的关键负调控因子,抑制其活性可增强抗肿瘤免疫应答,是癌症免疫治疗的新靶点,但目前尚无抑制剂获批上市。该研究基于结构的药物设计,通过骨架跃迁、环化与开环等策略构建了全新的吡啶并[2,1-h]蝶啶-6-酮骨架,获得先导化合物29(IC₅₀ = 6.0 nM)。该化合物在275种激酶中选择性优异,能有效抑制SLP-76磷酸化、增强T细胞功能,口服生物利用度良好;在小鼠结肠癌模型中呈剂量依赖性抑瘤效果,与抗PD-1联用肿瘤抑制率达83.8%,并显著促进肿瘤内T细胞浸润。该研究为HPK1抑制剂的研发提供了全新骨架和有前景的候选分子。
图文摘要
01
INTRODUCTION
研究背景
癌症免疫治疗是继化疗和靶向治疗之后肿瘤治疗的第三次革命性策略,与直接杀伤癌细胞的传统治疗不同,免疫治疗通过恢复免疫系统识别和攻击肿瘤的能力发挥作用;在各类免疫疗法中,以PD-1/PD-L1单克隆抗体为代表的免疫检查点抑制剂通过重振耗竭的T细胞已成为重要的治疗手段,但其在不同肿瘤类型中响应率不一(15%–85%)且复发率高,仍是亟待解决的主要难题。造血祖细胞激酶1(HPK1/MAP4K1)是哺乳动物 sterile 20 样(MST)激酶家族成员,在造血细胞中高表达,是免疫信号的关键负调控因子,可调控T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)信号级联反应以及抗原呈递细胞介导的免疫应答:受体激活后,HPK1经接头蛋白招募至信号复合物并发生自磷酸化,进而磷酸化下游底物SLP-76,导致TCR信号复合物去稳定化,最终抑制T细胞的活化与增殖。鉴于抑制HPK1有望重振耗竭T细胞、增强癌症免疫治疗,靶向HPK1已成为有前景的肿瘤免疫新策略,推动了大量药物研发工作。目前已开发出多种强效HPK1抑制剂,其中数个已进入临床试验:内酰胺类抑制剂NDI-101150正开展针对晚期实体瘤的I/II期临床试验并已显示临床获益;氮杂内酰胺类抑制剂PF-07265028的I期试验已终止;氨基吡嗪类衍生物BGB-15025处于I期安全性与耐受性评估阶段;另有CFI-402411、PRJ1-3024、GRC-54276、RGT-264、FB849、BB3008、XNW21015和BGB-26808等结构未公开的抑制剂也已进入临床试验,作为单药或与抗PD-1联用治疗晚期实体瘤。各类HPK1抑制剂(包括具有新颖结构的抑制剂)的持续研发凸显了该靶点的治疗潜力,而不同的核心骨架往往赋予化合物不同的性质和疗效特征;鉴于目前尚无HPK1抑制剂获批上市,有必要继续探索新颖的化学结构类型,以扩展可用的化学空间
02
RESULTS AND DISCUSSION
①构效关系(SAR)探索
研究人员先将默克的二氨基嘧啶甲酰胺类抑制剂(化合物1)对接至HPK1(PDB: 7M0K),明确其关键结合特征:氨基嘧啶与铰链残基Cys94、Glu92形成氢键,碱性氮与Asp101形成盐桥。据此保留氨基嘧啶,将分子内氢键环化构建二氢蝶啶酮骨架得2,但活性中等(IC₅₀ = 353.2 nM);去除干扰盐桥的甲氧基得3(18.8 nM),进一步优化得5(10.5 nM)。SAR研究表明:与Asp101的盐桥不可或缺,以吡唑、吡啶等弱碱性氮替代或去除二甲氨基均导致活性大幅下降。对R2位的疏水性优化显示对位取代优于间位,对氟、对甲基类似物16(5.3 nM)、17(5.9 nM)酶活最强;综合细胞水平IL-2促进作用和较低的细胞毒性,选择5而非16作为起点。经骨架跃迁得22(11.8 nM),再关环锁定构象得到刚性的吡啶并[2,1-h]蝶啶-6-酮骨架,其中S构型23(10.0 nM)优于R构型24,且甲基哌嗪基团不可替换。最后在溶剂暴露区优化,甲基哌嗪邻位引入小体积氟原子得先导化合物29(IC₅₀ = 6.0 nM),而氯、甲基等较大取代基因位阻显著降低活性,二甲氨基的阳离子特征亦为活性所必需。29无细胞毒性,剂量依赖性促进IL-2分泌;对接显示其三环核心占据疏水亚口袋,同时保留与Cys94的氢键和与Asp101的盐桥,故被选为先导化合物(IHMT-HPK1-550)进入后续评价。
②化合物29的选择性评价
为评估选择性,研究者在0.1 μM筛选浓度下将化合物29对275种激酶进行了全激酶谱分析(图8A),结果显示其选择性优异:仅NUAK1、ULK1、GLK、KHS和QIK五种脱靶激酶的抑制率超过60%(图8B)。其中对GLK(MAP4K3,抑制率76.1%)检测到部分活性,GLK与HPK1同属MAP4K家族,是已知的T细胞活化正向调控因子;采用全剂量反应的ADP-Glo激酶实验进一步表征显示,29对HPK1的选择性是GLK的13倍(IC₅₀分别为6 nM和78.5 nM)(图8C)。此外,29对TCR信号通路中的关键激酶(包括ZAP70、LCK、FYN、ITK以及JAK1/2/3)仅表现出极弱的抑制活性(0.1 μM时抑制率均低于50%),而这些激酶对免疫细胞正常活化至关重要。
③化合物29的体外评价
鉴于HPK1通过磷酸化SLP-76发挥对TCR信号的关键负调控作用,研究者在anti-CD3/CD28刺激的Jurkat细胞和人外周血单个核细胞(PBMCs)中评估了化合物29对SLP-76磷酸化(p-SLP-76)水平的抑制效果:29剂量依赖性地降低p-SLP-76水平,并在0.03 μM时几乎完全抑制两种细胞中的p-SLP-76(图9A)。为更好地模拟临床相关的T细胞应答,研究者进一步评估了T细胞功能(图9B):总体而言,29以剂量依赖方式增强IL-2和IFN-γ的分泌,其中在0.014 μM时使IL-2分泌增加约2倍,在0.371 μM时增强超过4倍;对IFN-γ,在0.014 μM时即观察到超过2倍的增加。在上述两项实验中,化合物29的整体效力均优于参照化合物1,尤其是在促进IL-2分泌方面。
④化合物29的药代动力学评价
研究者首先在鼠肝微粒体和小鼠血浆中评估了化合物29的代谢稳定性及蛋白结合(表S2、图S1):29在鼠肝微粒体中的半衰期(T₁/₂)为462分钟,在小鼠血浆中孵育120分钟后几乎未观察到降解,血浆蛋白结合率超过90%。随后在小鼠体内评价了其药代动力学特征(表6):静脉注射(1 mg/kg)后分布容积很大(V_ss = 63558 mL/kg),这与分子中存在两个碱性官能团相一致;口服(10 mg/kg)后,29的系统暴露量中等(C_max = 23.0 ng/mL,AUC₀₋ₜ = 85.3 ng·h/mL),T₁/₂为3.42小时,计算所得口服生物利用度为143%。组织分布实验(图S2)显示,口服给药10 mg/kg后,29在给药后0.5小时即迅速、广泛地渗透各组织,肝(10623 ng/g)、肺(3577 ng/g)、脾(2580 ng/g)、肾(950 ng/g)和肠道(271 ng/g)中的药物水平远高于血浆和心脏,且给药后4小时组织暴露仍持续存在,表明29优先蓄积于实体器官而非全身循环。上述药代数据支持通过口服途径给药,并为后续体内药效学评价提供了依据。
⑤化合物29的体内抗肿瘤药效评价
体内药效实验前,研究者先用CellTiter-Glo实验证实29对CT26.WT肿瘤细胞增殖无直接抑制作用(图S5)。随后在携带小鼠CT26.WT结肠癌的免疫健全小鼠中评估其抗肿瘤效果(图10):治疗12天后,各组小鼠体重与溶媒对照组相比均无显著变化(图10A);口服29单药呈剂量依赖性抑瘤,10 mg/kg和40 mg/kg剂量下的肿瘤生长抑制率(TGI)分别为18.6%和48.1%(图10B);而口服29(20 mg/kg)与抗PD-1抗体联用则显著增强抗肿瘤效果,TGI达83.8%(图10C),且联用组平均脾脏重量恢复至0.09 g,接近正常小鼠水平(图10D)。实验终点时,ELISA检测显示联用治疗显著上调肿瘤组织和外周血中IFN-γ和IL-2的分泌水平(图10E);肿瘤组织的H&E染色及CD8、CD3免疫组化染色(图10F)显示,溶媒对照组几乎无CD8⁺和CD3⁺ T细胞浸润,而29单药组和联用组均促进了肿瘤内CD8⁺/CD3⁺ T细胞浸润。上述结果表明,单独抑制HPK1仅能适度增强局部抗肿瘤免疫,尚不足以引发广泛的肿瘤细胞杀伤;细胞因子分泌、H&E形态学和CD8/CD3免疫组化等多维度证据共同证实,抑制HPK1可通过改善免疫抑制的肿瘤微环境、募集大量细胞毒性T淋巴细胞进入肿瘤,从而增强抗PD-1的治疗效果。
总结与展望
本研究报告了一种新型HPK1抑制剂的发现过程:以默克公司先前报道的二氨基嘧啶甲酰胺类HPK1抑制剂骨架为基础,采用基于结构的药物设计方法,运用环化、开环和关环等结构优化策略,发现了具有全新吡啶并[2,1-h]蝶啶-6-酮核心骨架的化合物29。29对HPK1表现出强效的抑制活性(IC₅₀ = 6.0 nM),在275种激酶panel中显示出高选择性;在细胞实验中,29剂量依赖性地抑制SLP-76磷酸化,并在Jurkat T细胞和人PBMCs中显著增强T细胞功能;药代动力学评价表明29具有优秀的口服吸收和总体可接受的药代性质。体内实验中,29在CT26.WT同源小鼠模型中呈剂量依赖性抗肿瘤活性,20 mg/kg单药治疗肿瘤生长抑制率达33.3%;与抗PD-1抗体联用(20 mg/kg)显著增强抗肿瘤效力,TGI达83.8%。此外,细胞因子分泌、H&E染色和免疫组化结果表明,抑制HPK1可通过募集细胞毒性T淋巴细胞进入肿瘤,增强抗PD-1的治疗效果。本研究采用的基于结构的优化策略为HPK1抑制剂骨架探索提供了新方向;上述结果共同确立吡啶并[2,1-h]蝶啶-6-酮衍生物29既是有价值的药理学工具,也是有前景的免疫治疗候选分子,值得进一步的临床前开发。
文献详细全面信息请跳转原文阅读:
https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.6c01376
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