IDX-184

点击蓝字 ↑ 关注药研视角 PharmaView JMC速览 2025.11.04 近日，北京理工大学梁建华/孟子晖/于明加/Irfan Muhammad团队在药物化学权威期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为“基于结构信息学的高协同性PROTAC设计：靶向SARS-CoV-2 RNA依赖性RNA聚合酶的点击化学与增强采样模拟研究”的研究论文。该研究提出并验证了一种靶向新冠病毒RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）的高效PROTAC降解剂——PROTAC 10，其通过点击化学构建三唑-烷基连接子，实现高正协同性（α=45.9）与纳摩尔级亲和力（Kd=1.09 nM），在感染细胞中有效诱导RdRp降解（DC₅₀=1.97 μM），展现出优异的抗病毒活性（IC₅₀=3.12 μM）。本研究为开发广谱、抗耐药的抗病毒PROTAC药物提供了新范式。JMC快讯|北理工梁建华&于明加&琶洲实验室朱心红联合报道了一类新型新型sEH抑制剂治疗急性胰腺炎（第一作者：丁静博士） 1 min速览 研究背景 靶向蛋白降解（TPD）技术，尤其是蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs），在药物发现领域具有变革性潜力，其通过招募E3泛素连接酶降解靶蛋白，相比传统抑制剂有独特优势。 然而，PROTACs在抗病毒治疗中的应用仍有限，面临诸多挑战，如分子量过大影响细胞通透性、三元复合物协同性不佳、脱靶效应以及药代动力学性质不理想等。 SARS-CoV-2的RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）是病毒复制中的关键酶，且在不同冠状病毒中高度保守，无人类同源物，是理想的抗病毒靶点。目前尚无靶向SARS-CoV-2 RdRp的PROTAC报道。 重点内容 结构导向设计： 研究团队基于结构导向策略，利用已获批或临床优化的RdRp抑制剂（如莫努匹韦、瑞德西韦等）作为弹头，针对E3连接酶（CRBN/VHL）进行优化，设计并筛选了600种候选PROTAC分子。 优选分子： 通过综合计算模拟与实验验证，确定了以莫努匹韦和CRBN E3连接酶为配体的PROTAC 10为最优分子。其具有超高亲和力（Kd = 1.09 nM）、显著正协同效应（α = 45.9）和高效的RdRp降解能力（DC₅₀ = 1.97 μM）。 分子特性与机制： PROTAC 10通过点击化学反应合成，含有三唑-烷基连接子，能在亲水/疏水环境中发生构象变化（变色龙性质），增强细胞通透性和三元复合物稳定性。分子动力学模拟、等温滴定量热（ITC）和表面等离子共振（SPR）实验证实其三元复合物具有优异的热力学稳定性和结合动力学特征。 抗病毒活性与特异性： 在SARS-CoV-2感染的细胞中，PROTAC 10能有效降解RdRp蛋白，DC₅₀为1.97 μM，并表现出强效抗病毒活性（IC₅₀ = 3.12 μM）。Western blot分析表明其降解作用呈剂量依赖性，且对CRBN新底物IKZF1/3无影响，显示出良好的特异性。 研究总结 本研究成功设计并验证了一种高效协同、靶向SARS-CoV-2 RdRp的PROTAC降解剂，解决了传统PROTAC在抗病毒应用中存在的细胞通透性、协同性和稳定性等关键问题。该研究不仅提供了一种潜在的广谱、抗耐药的抗冠状病毒药物候选分子，也为今后抗病毒PROTAC药物的设计与优化提供了重要的理论依据和实践范式。 图片来源：ACS 详细阅读 01 INTRODUCTION 研究背景 在抗病毒药物研发领域，PROTAC技术通过招募E3泛素连接酶实现靶蛋白的催化性降解，理论上可克服传统抑制剂需持续高浓度、易突变耐药等局限，然而实际应用于抗病毒治疗时仍面临分子量过大导致细胞通透性下降、脱靶毒性、三元复合物协同效率不足以及病毒高突变率带来的选择压力等瓶颈。为此，作者提出以结构导向策略重塑PROTAC设计：一方面锁定在冠状病毒中高度保守、无人类同源物且对病毒复制至关重要的RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）作为降解靶点，另一方面通过点击化学拼装低分子量片段以降低分子量并提升成药性，同时借助增强采样模拟对连接子长度、柔性及杂原子排布进行系统优化，以兼顾膜通透性与三元复合物稳定性，从而为开发可抵御病毒进化、具备广谱抗冠状病毒潜力的PROTAC奠定理论与技术框架。 02 Drug Design ①靶蛋白与E3配体的结合模式解析 作者首先建立了一套计算筛选流程，对600个以瑞德西韦、莫努匹韦或IDX-184为弹头、分别连接VHL或CRBN配体的PROTAC候选物进行系统评估：通过AutoDock Vina将各弹头对接到SARS-CoV-2 RdRp（PDB 7BTF）活性位点，确认瑞德西韦结合能最低（−8.69 kcal mol⁻¹），而莫努匹韦与IDX-184相近（约−7.7 kcal mol⁻¹）；随后用ZDock开展RdRp-配体复合物与CRBN/VHL-配体复合物的蛋白-蛋白对接，筛选出两配体距离最近、溶剂暴露且空间取向兼容的构象作为连接位点，并以ZDock评分和聚类密度判定最优结合姿态；基于上述“可连接”构象，利用SeeSAR在8–16 Å长度范围内遍历线性、杂环及线性-杂环混合连接子，最终按结合自由能、关键残基氢键/疏水作用及构象稳定性排序，从600个候选中挑出6个进入后续实验验证，其中莫努匹韦-CRBN体系（PROTAC 10）因 linker 最短（~10 Å）、结合能最低（−18.42 kcal mol⁻¹）且保持与催化残基的多点相互作用而被确立为先导化合物。 ②先导PROTAC的相互作用与连接子构效关系解析 本研究对六种进入实验验证的PROTAC进行残基水平解析发现，瑞德西韦系列通过THR680、ASP623等氢键与RdRp结合但亲和力仅−9.06/−7.67 kcal mol⁻¹，IDX-184系列依赖ARG555、ALA550双氢键作用能量居中，而莫努匹韦-CRBN组合（PROTAC 10）凭借PRO620、ASN691、ARG553/555等七组氢键及四条疏水作用将结合能提升至−18.42 kcal mol⁻¹；连接子化学的系统比较显示，刚性双噻唑或噻唑啉虽能增强二元亲和，却因空间位阻破坏三元复合物构象匹配，柔性PEG链则因熵罚降低稳定性，作者最终确定10 Å长的三唑-烷基-乙氧基杂合连接子可在CRBN侧提供极性乙氧基与ASN353、TYR357形成氢键，在RdRp侧借三唑环定向刚性减少构象熵，同时烷基链保持足够柔度以避免立体冲突，由此使PROTAC 10在维持分子量<900 Da、LogS −4.01的药物性质前提下，实现三元复合物热力学最稳定、降解效率最高的综合优势。 图片来源：ACS 03 RESULTS ①二元与三元复合物的分子动力学特征 100 ns 重复分子动力学模拟显示，仅有 PROTAC 10 的三元组合（RdRp-PROTAC-CRBN）能把平均 RMSD 稳定在 1.5 Å 以内，而其二元复合物（PROTAC-RdRp 或 PROTAC-CRBN）RMSD 分别高达 4.25 Å 与 6.19 Å，提示三元装配显著压缩整体构象；回转半径 Rg 与溶剂可及表面积 SASA 同步下降、势能更低，表明连接子通过三唑-烷基的“半柔性”将两蛋白拉至紧密包埋状态。MMPBSA 自由能计算给出三元 ΔG_TER = −247 kcal mol⁻¹，远低于两二元复合物的 −71 与 −13 kcal mol⁻¹，验证了“三元优于二元”的热力学趋势；在三段独立轨迹中，连接子始终与 RdRp 溶剂暴露的 LYS551 保持氢键/范德华接触，该赖氨酸距 CRBN 催化中心仅 10 Å，为后续泛素转移提供几何便利。综合 RMSD、Rg、SASA 与自由能数据，作者确认 PROTAC 10 能在生理条件下自组装为稳定、紧凑且酶-赖氨酸邻近的三元复合物，为高效降解奠定结构基础。 ②ITC热力学验证PROTAC二元亲和与三元协同性 反向等温滴定量热（ITC）实验显示，PROTAC 10与RdRp或CRBN单独结合时均呈“熵驱动”特征：RdRp-PROTAC二元体系的ΔH仅−7.89 kJ mol⁻¹，却被TΔS +41.2 kJ mol⁻¹的构象熵优势推向Kd 10.2 nM；CRBN-PROTAC二元体系类似，TΔS +46.6 kJ mol⁻¹，Kd 50 nM。当向已形成的RdRp-PROTAC复合物中滴加CRBN时，记录到显著放热且峰值逐次减弱，表明三元复合物持续生成；拟合得到三元Kd为1.09 nM，显著优于任一二元体系，对应正协同因子α=45.9（CRBN方向）和α=9.4（RdRp方向）。热力学分解指出，三元形成时ΔH升至−14.03 kJ mol⁻¹，TΔS仍保持+37.2 kJ mol⁻¹，说明界面氢键/范德华作用增强的同时，疏水表面去溶剂化释放的熵继续提供驱动力。数学模型基于实测Kd与α计算生理浓度下物种分布，预测74% RdRp与76% CRBN将以三元形式存在，进一步量化验证了PROTAC 10通过“熵-焓协同”高效组装RdRp-PROTAC-CRBN三元复合物，为后续泛素化与降解奠定热力学保障。 ③SPR表面等离子共振测定二元亲和与三元协同动力学 多循环与单循环表面等离子共振（SPR）实验进一步证实，PROTAC 10与RdRp或CRBN单独结合时的平衡解离常数Kd分别为15.2 nM和47 nM，对应的结合速率kon 7.6×10⁵ M⁻¹s⁻¹、1.4×10⁴ M⁻¹s⁻¹，解离速率koff 5×10⁻⁵ s⁻¹、3×10⁻⁶ s⁻¹；当预形成RdRp-PROTAC复合物后流经CRBN芯片，三元复合物呈现显著 slower 的解离（koff 1×10⁻⁵ s⁻¹）与更快的结合（kon 1.26×10⁸ M⁻¹s⁻¹），Kd收紧至1.26 nM。由此计算出的协同因子α(RdRp)=12.1、α(CRB N)=37.3，与ITC结果高度一致，表明任一蛋白的存在均显著增强PROTAC 10对另一蛋白的捕获能力。浓度梯度传感图显示三元复合物的RU响应随蛋白浓度升高而线性增加，且解离阶段信号回降缓慢，直观展示其高稳定性与慢解离特征；对照实验在无蛋白通道几乎无信号，排除非特异性吸附。综合动力学与热力学参数，SPR再次验证PROTAC 10通过正协同效应高效组装稳定的三元复合物，为后续细胞内RdRp降解提供强有力的动力学保障。 图片来源：ACS ④点击化学合成三唑-烷基连接子PROTAC 10 作者采用模块化点击化学策略，将莫努匹韦（POI配体）与沙利度胺衍生物（CRBN配体）通过CuAAC反应高效拼合：首先用丙酮保护莫努匹韦的邻二醇得缩酮中间体2，经DMTCl选择性保护羟基得3，再与6-叠氮己酰氯酯化引入叠氮臂得4；同时3-羟基沙利度胺7与3-丁炔醇经Mitsunobu反应制得炔基前体8；两者在CuSO₄/抗坏血酸钠催化下形成中心1,2,3-三唑环，最后TFA脱缩酮得到目标分子PROTAC 10，总收率81%，HPLC纯度≥98%。该路线在温和条件下实现三唑-烷基连接子的区域选择性构建，使分子量控制在900 Da以内；连接子中的三唑提供刚性取向，乙氧基侧链增强极性相互作用，烷基链保持柔度，兼顾细胞膜通透与三元复合物稳定。作者还通过无约束MD模拟证实，该结构在氯仿模拟的疏水环境中可折叠形成分子内氢键，3D-PSA降低、构象呈盘状，从而定量展现“变色龙”性质，为后续高协同、可透膜的降解剂设计提供可复制的化学范例。 图片来源：ACS ⑤RdRp降解速率与抗病毒活性测定 Western blot量效实验显示，PROTAC 10在SARS-CoV-2感染Vero细胞中可浓度依赖地降解RdRp：0.1 μM几乎无影响，2.5 μM减少>50%，5–10 μM接近完全清除，DC₅₀=1.97±0.05 μM；载体DMSO或10 μM处理均未影响GAPDH及CRBN新底物IKZF1/3，证实降解靶向特异。CCK-8细胞抗病毒测试给出IC₅₀=3.12±0.09 μM，与DC₅₀接近且略高，表明病毒抑制主要由RdRp降解驱动而非单纯抑制。Hill斜率>1的量效曲线及时间与浓度依赖性蛋白条带灰度下降进一步佐证正协同三元复合物在细胞内高效形成并持续清除靶蛋白，为PROTAC 10作为广谱抗冠状病毒降解剂提供细胞水平的直接证据。 ⑥CRBN型PROTAC 10的体内外药代动力学与成药性评估 借助ADMETlab 3.0与SWISS ADME预测，PROTAC 10展现可开发药代特征：分子量725 Da，cLogP 3.2，水溶性log S –4.01（落在理想区间–5~0.5），无PAINS警报，对CYP2C9/2D6/3A4无显著抑制，Caco-2表观渗透系数1.6×10⁻⁵ cm s⁻¹，血浆蛋白结合率46.7%，提示口服吸收与血药游离浓度良好；毒性模块预测无致突变、致癌或急性肝损伤风险。与VHL型同系物相比，CRBN配体加三唑-烷基短链策略使极性表面积降低、分子内氢键增多，变色龙行为增强细胞通透，同时保持三元复合物稳定。该计算评估与前期SPR/ITC协同数据一致，表明通过点击化学微调连接子即可在不牺牲降解效力的前提下获得理想的早期药代与安全窗口，为后续动物体内抗病毒实验和剂型优化奠定坚实基础。 CONCLUSIONS 本研究整合结构信息学、点击化学与多尺度模拟，首次实现高协同、可口服的SARS-CoV-2 RdRp PROTAC降解剂理性设计；先导分子PROTAC 10凭借三唑-烷基连接子在二元亲和（Kd 1.09 nM）、三元协同（α 45.9）及细胞通透间取得最佳平衡，以DC₅₀ 1.97 μM高效清除病毒RdRp并展现IC₅₀ 3.12 μM的抗病毒活性，且无明显脱靶。该工作不仅提供一种抗耐药广谱冠状病毒候选药物，更确立“短链杂合-变色龙连接子”普适策略，为突破PROTAC分子量-成药性瓶颈、加速抗病毒靶向蛋白降解疗法临床转化奠定新范式。 文献详细全面信息请跳转原文阅读： https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c02065  喜欢此内容的人还喜欢 【JMC】广州实验室陈新文/杨琪&药科大李志裕/徐熙：新型三环类RSV融合蛋白抑制剂及抗病毒活性 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