Ertumaxomab

中文摘要抗体药物具有特异性高、不良反应少的特点，已成为肿瘤治疗的热点。双特异性抗体（双抗）是指同时结合2个不同抗原或同一抗原2个表位的抗体。与单特异性抗体相比，双抗具有高度特异性，增强了治疗有效性和安全性，同时减少了不良反应。已有多种双抗药物获批上市，进入临床研究的双抗药物数量不断增加。双抗药物的形式持续在更新，应用范围也在扩大，在未来具有非常好的应用前景。此文就目前已有的双抗类型、作用机制及目前双抗制备上面临的困难等进行概述。正文恶性肿瘤是世界范围内研究需求最迫切的疾病之一，通过激活调控人体免疫系统来治疗肿瘤的免疫疗法成为最有前景的特异性治疗方式。单克隆抗体（单抗）药物特异性高、不良反应少，成为肿瘤免疫治疗的重要药物。但恶性肿瘤可通过多种方式促进生长，单特异性单抗途径不能长期有效改善疾病，很多患者在后期产生不良反应或逐渐产生耐药性，严重影响治疗效果，因此亟须寻找新的治疗药物。双特异性抗体（双抗）指能够同时结合2个不同抗原或同一抗原2个不同表位的抗体，增加了多靶向性和多功能性，减少了不良反应，克服了单特异性单抗药物的局限性[1]。随着基因工程技术发展，抗体结构学研究及产业技术成熟化，双抗逐渐成为新一代有力的治疗工具。目前已有多种类型的双抗药物正在进行临床试验，双抗类型不断更新优化。本文就双抗目前现有的类型、作用机制及双抗药物现状进行综述。1双抗的类型1.1按是否存在Fc区域分类双抗有多种形式，按是否存在Fc区域在结构上可分为IgG样和非IgG样，如图1所示。1.1.1  IgG样形式    此类传统抗体具有较多由Fc区域介导的生物学功能，如抗体依赖细胞杀伤作用、补体依赖细胞毒性杀伤以及抗体依赖细胞吞噬作用等[2]。Fc区域可使相对分子质量较大的抗体在血液中趋于稳定，延长血液半衰期。同时，带有Fc区域的双抗形式更容易纯化[3]。相反，增加Fc区域会影响双抗的生物活性和亲和力，增加双抗分析和检测的难度[4]。Triomab Quadroma平台是为解决杂交-杂交瘤的错配率问题，通过大鼠和小鼠不同种系细胞融合获得的嵌合型四倍体细胞。因种系不同降低了错配概率，获得一种稳定且功能良好的形式，称为Triomab[5]。Triomab由大鼠IgG2b链和小鼠IgG2a链的2个半抗体组成，其具有3个不同的结合位点，包括2个不同的肿瘤相关抗原特异性结合位点以及嵌合抗体Fc区[3]，其中1个Fab片段结合T细胞的CD3位点，使得免疫细胞富集于肿瘤微环境，促进免疫系统的运作。但该形式异源性高、半衰期短，还需对该抗体的免疫原性进行改进。德国费森尤斯公司的Catumaxomab是通过该方法生产的首个获准用于治疗腹水的双抗[6]，利用该技术的其他双抗如瑞士罗氏公司的Ertumaxomab正在研发中[7]。单链Fv（single chain Fv，ScFv）由抗体重链和轻链可变区通过一段短肽（一般为甘氨酸-丝氨酸组合）连接组成[8]，是具有抗原结合活性的最小功能单位。在传统抗体的C端或N端通过柔性肽接头连接ScFv形成IgG-ScFv，该分子同时结合4个抗原，增加了单个抗体的效价。因为增加了空间位阻，所以ScFv的功能及稳定性还需进行优化修饰。杵臼结构（knob-into-hole，KiH）是为减少错配、促进异源二聚化而研发的一种新方法。为阻止同种抗体重链配对，其中一种抗体重链CH3区域用大分子氨基酸替换原有的小分子氨基酸形成杵区域，另一抗体的相应位置用小分子氨基酸替换大分子氨基酸形成臼区域，杵和臼通过空间位阻配对形成异源性二聚体[9]，减少错配问题的发生。该方法大幅降低了重链之间的错配，但轻链的错配现象仍然存在，目前该技术专利已过期，多个公司正在对此方法进行优化。为减少轻重链之间的错配，瑞士罗氏公司在KiH的基础上开发出CrossMab技术。由2条异源重链和异源轻链组成类似天然IgG的双抗结构，Fc结构域采用KiH技术促进异源二聚体形成，同时将其中一对轻链和重链的完整F(ab)或者CH1-CL部分进行互换，使轻链与对应的重链精确配对[10]。特定的轻链修饰可减少与未修饰的重链配对产生无用形式。该技术可获得纯度较好且保持稳定的理想抗体，目前有多种抗体正在进行临床试验。除连接ScFv外，也有通过肽接头连接2个传统抗体形成四价大分子，称为(IgG)2。该形式在设计上较简便，通过长短合适的肽接头连接，不影响两者的生物活性。但因2个抗体的组合增加了空间位阻，到达组织的药物有效浓度较传统形式减少，稳定性与IgG-ScFv类似，需要进一步优化。κ-λ型抗体指抗体的同一重链结合不同亚型轻链形成同种异型的双抗。该种双抗中重链相同，避免重链错配；2条轻链分别为κ和λ，通过不同亲和层析方法去除同源κ-κ和λ-λ。同时该结构未引入突变，结构与天然抗体相似，免疫原性较低，生产工艺也与天然抗体类似[10]。1.1.2  非IgG样形式    非IgG样形式主要指不存在Fc区域的抗体形式。不包含Fc区域的抗体相对分子质量普遍较小，易通过组织屏障，在体内可以较快地定位至特定抗原结合区域，减少非特异性。该形式双抗大部分由单链抗体组成，通过单链抗体与短肽连接构成多种形式[11]。缺乏Fc区域也造成一些缺点，如无法结合Fc受体介导体液中循环利用，在体内药物清除较快，血液半衰期短，需要多次给药达到有效剂量[12]。剂量的增加以及间隔周期的缩短极大增加该种双抗的治疗费用，且是否诱导耐受目前还未有一致的结论。根据连接肽的长度使单链抗体简单配对二聚体化的双抗形式称为Diabody。一个抗体的重链可变区（variable region of heavy chain，VH）和轻链可变区（variable region of light chain，VL）分别与另一个抗体的VL和VH连接组成2条互补的ScFv，进行组装形成功能性的双抗[13]。最具代表性的是德国Micromet公司的BiTE[14]，该形式保留了亲本抗体的结合活性，并证明了 2种抗原不受空间阻碍可同时结合，该种形式的双抗较低剂量浓度即可产生相应的治疗效果[15]；同时，较小的相对分子质量可使药物迅速达到作用靶点，减少免疫原性的产生。Triabody形式指缩短形成Diabody的连接肽长度，使Diabody两端游离的VH、VL再与第3个ScFv片段进行配对形成的三聚体形式[13]。该种形式在Diabody基础上从二价增加到三价，增加了亲和力，减少脱靶率[16]。此外，分子大小增加，使得该种形式在体内循环时间较长。Diabody的形成依赖于轻重链之间的互补配对，在此基础上选择其中一种抗体的VH和VL进行突变修饰构建二硫键，这种形式的双抗称为DART[17]。二硫键促进了 VH和VL之间的正确配对，在自然配对的同时结合二硫键增加了该形式的稳定性，使得该形式在体内的作用时间增加，但较天然形式一定程度上降低了抗原结合活性[18]。TandAb指2个抗体的2对VH-VL依次连接形成2条互补配对的VL1-VH2-VH2-VL1(VH1-VL2-VL2-VH1)组装形成的四聚体形式[19]，可以同时结合4个抗原表位，对靶细胞具有更高的亲和力。连接肽的存在使得该形式可以正确配对，减少错配的产生。其与多价ScFv有类似的特征，但因单价形式的相对分子质量较大，存在较大空间位阻，因此是否能良好地结合抗原表位还需要进行验证。F(ab')2是指胃蛋白酶消化整个IgG抗体、去除大部分Fc段后完整保留铰链区后得到的抗体片段。F(ab')2通过二硫键连接，保证该片段的稳定性[20]。同时，去除Fc段增加在组织内的渗透性，使F(ab')2可以定位于天然抗体形式无法靶向的区域，同时避免Fc介导的非特异性。ImmTAC是一种新型双抗，由基因工程技术改造的T细胞受体以及抗CD3或其他肿瘤相关抗原的ScFv组成[21]。改造的T细胞受体片段具有极高的肿瘤抗原亲和力，可显著提高抗原结合特异性识别，并结合肿瘤细胞表面的抗原肽-HLA复合物形成复合体；另一抗体链通过结合T细胞表面的CD3将免疫T细胞聚集在结合的肿瘤细胞处破坏肿瘤细胞。该种形式最大的特征在于重定向T细胞及利用细胞分子的相互调节抑制肿瘤细胞生长。链霉亲和素是一种稳定的四聚体蛋白，其与生物素具有高亲和的结合效应。小分子形式的单链抗体容易断链在体内进而被消除，链霉亲和素与生物素分别与抗体的轻重链共同连接表达，通过生物素-链霉亲和素的强结合，促进轻重链互补配对形成有效的多价双抗[22]。生物素与链霉亲和素的强亲和力作用使该形式的抗体单链能够有效结合在一起，同时结合多个靶标抗原发挥作用。1.2按作用机制分类双抗靶向的细胞类型不同，产生的效应不同。大部分双抗中一个靶点靶向免疫细胞，另一个靶点靶向肿瘤细胞。通过激活免疫系统，招募免疫细胞来进行肿瘤细胞的杀伤是双抗最常见的作用机制。以下根据靶点的作用机制进行分类。1.2.1  T细胞桥接型    T细胞桥接型指其中一个靶点靶向T细胞表面的相关抗原如CD3，另一个靶向肿瘤相关抗原如人类表皮生长因子受体2、CD20[23]。该双抗结合2个表位后在肿瘤细胞周围激活效应T细胞，并招募多种免疫细胞发挥免疫效应对肿瘤细胞进行杀伤。这是双抗药物最常用的作用机制，重定向免疫细胞的同时，减少不良反应的发生。获批上市的2个双抗药物Catumaxomab和Blinatumomab都应用了该作用机制。目前在研的大部分双抗选择了CD3作为其中一个靶标[24]。1.2.2  免疫检查点阻断-肿瘤相关抗原抑制型     这种双抗与肿瘤相关抗原结合靶向肿瘤细胞的同时，阻断免疫细胞表面的免疫检查点如程序性死亡蛋白（programmed death，PD）1以解除免疫抑制，激活免疫效应及肿瘤细胞的杀伤作用[25]。该机制与T细胞桥接型机制类似，利用一只臂结合免疫细胞，另一只臂结合肿瘤细胞，将免疫细胞富集于肿瘤细胞环境，解除免疫抑制增强对肿瘤细胞的杀伤，如信达生物制药（苏州）有限公司在研的PD-1和人类表皮生长因子2相关的双抗药物。1.2.3  免疫检查点阻断-肿瘤微环境调节型    肿瘤细胞的生长依赖肿瘤微环境，肿瘤促进因子如转化生长因子β、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肿瘤后期起着重要作用，通过促进血管形成、诱导上皮间质转化促进肿瘤的扩增与迁移。该类型双抗在阻断免疫检查点激活免疫应答的同时，结合相关的肿瘤促进因子抑制肿瘤生长，实现有效治疗。之前备受瞩目的M7824（PD配体1、转化生长因子β）药物属于此种形式[26]。1.2.4  双免疫检查点阻断型    在肿瘤细胞表面有相应的免疫检查点与免疫细胞表面结合，增强肿瘤免疫逃逸。同时阻断在免疫细胞和肿瘤细胞表面表达的免疫检查点，解除肿瘤介导的相关免疫抑制信号通路，可以减弱肿瘤细胞免疫逃逸，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。该种形式在提高对恶性肿瘤细胞的疗效时，可降低对于正常细胞的不良反应，提高安全性[27]。目前国内多家企业有该类型的双抗药物，如江苏康宁杰瑞生物制药有限公司的KN046（PD配体1和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4）等。1.2.5  双肿瘤相关抗原抑制型    肿瘤可转换多种信号通路来调节单抗阻断一条信号通路所造成的抑制。该种形式同时结合2种肿瘤相关抗原，阻断参与肿瘤生长的多条信号通路。受体酪氨酸激酶家族在多种肿瘤细胞生长过程中起重要作用，抑制受体酪氨酸激酶家族可以有效控制肿瘤细胞生长[28]，同时阻断多个酪氨酸激酶或其配体信号通路，可明显减少肿瘤细胞通过转换信号通路免疫逃逸，提高治疗效果。除了结合2个不同抗原外，也有可以同时结合同一抗原不同表位的双抗药物正在研发。1.2.6  促功能复合体蛋白形成型    体内缺乏特定蛋白的人群无法通过自身分泌形成功能复合体，来激发级联反应行使相关功能。已获批上市的瑞士罗氏公司的Emicizumab利用设计的抗原结合臂同时结合凝血因子Ⅸa和凝血因子Ⅹ形成功能复合体，模拟凝血因子Ⅷ在体内的凝血调节功能，治疗凝血因子Ⅷ缺乏的A型血友病患者。2双抗的药物现状经多年发展，双抗药物研究日趋成熟。全球多家医药企业在研多种形式的双抗药物，不断有双抗进入临床试验阶段。本文重点选择目前已上市且关注度较高的几种药物进行总结。2.1Catumaxomab德国费森尤斯公司的Catumaxomab是全球首个经欧洲药品管理局批准上市的双抗药物，其2个靶点分别为CD3和上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule， EpCAM）。EpCAM 在肿瘤环境中高度表达，在肿瘤细胞生长迁移过程中起重要作用，参与多种信号通路的转导和多种细胞的生长调节[29]。该药物主要适用于恶性腹水，一种腹腔转移癌患者晚期常见并发症[30]。Catumaxomab增加了患者无穿刺的存活率，减少了化学治疗（化疗）的使用。该药物由Quadroma技术制备，由于生产工艺复杂且副产物较多，药物纯化过程繁琐，上市后价格昂贵，且在长期应用过程中患者出现明显的不良反应，因此该药物在2017年宣布退市。2.2Blinatumomab美国安进公司的Blinatumomab是首个经美国FDA批准上市的双抗药物，用于治疗费氏染色体阴性的前体B细胞急性淋巴细胞白血病[31]。Blinatumomab被称为双特异性T细胞接合器，由抗CD3和CD19的2条ScFv组成，因缺乏Fc区域体积小且高度灵活，可以迅速渗透至肿瘤细胞区域，使免疫细胞与肿瘤细胞密切相互作用[21]。CD19在恶性B细胞表面高表达，Blinatumomab在特异性结合B细胞后，通过CD3靶向CD3+ T细胞，激活T细胞对恶性B细胞的杀伤。该药物首次建立了利用重组技术制备的单链抗体平台，拓展了双抗药物形式。因其快速定位、高亲和力的特点，低剂量也可产生显著治疗效果，上市后受到广泛应用。2.3EmicizumabEmicizumab是瑞士罗氏公司开发的靶向凝血因子IXa和X的一种新型双抗。与之前获批的药物机制不同，Emicizumab模仿凝血因子Ⅷ在体内的功能，与凝血因子IXa、Ⅹ结合后形成功能复合体，进行凝血级联反应发挥凝血功能[32]，应用于罕见病A型血友病的治疗。目前针对A型血友病的治疗手段存在局限性，替代治疗间隔期限短。Emicizumab解决了A型血友病患者体内不能自主合成凝血因子Ⅷ的障碍，模仿正常人体内凝血过程完成凝血功能；同时该药物还具有预防效果，预防性治疗在临床试验中取得良好结果，且对治疗后产生抑制的患者也达到预期效果[33-34]。该药物目前已经被美国、日本以及欧洲相继批准应用于治疗A型血友病。该药物临床应用的成功预示了双抗药物应用范围的广泛性和前景；同时该药物的作用机制也增加了双抗药物的靶点选择丰富性和形式多样性。2.4Amivantamab美国强生公司的Amivantamab是2021年获得FDA批准的一款靶向表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和间质表皮转化因子（c-mesenchymal-epithelial transition factor，c-Met）的双抗药物，用于治疗化疗后EGFR突变的非小细胞肺癌[35]。EGFR在大多数肿瘤细胞中高度表达，参与肿瘤细胞生长过程中的信号调节。c-Met在肿瘤细胞中高度表达，其与肝细胞生长因子的结合在肿瘤的生长扩增、转移扩散过程中具有重要作用。临床试验显示Amivantamab在同时结合突变的EGFR和c-Met位点后阻断了其参与的信号转导过程，改善了非小细胞肺癌患者化疗后的恶化。Amivantamab改善突变位点导致的耐药，同时在Fc区域的修饰对于Amivantamab促进免疫细胞和肿瘤细胞相互作用起着重要作用，为EGFR突变非小细胞肺癌患者提供了有效的治疗手段[36]。2.5Faricimab瑞士罗氏公司的Faricimab是全球首个针对眼科疾病的KiH形式双抗药物[37]，在治疗年龄相关性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿及糖尿病致视网膜病变等疾病上取得良好临床试验结果[38]。Faricimab的靶点分别为VEGF-A和血管生成素（angiopoietin，Ang）2，都参与调节血管生成及炎症信号通路上的调节。研究表明VEGF-A和Ang-2在多种视网膜疾病中高度表达，阻断VEGF-A和Ang-2减少血管生成，可抑制肿瘤生长改善疾病进展；同时，Faricimab降低了炎症相关因子如IL-8的表达，也减少了治疗时不良反应的发生[39]。因为眼部的特殊性，该抗体去除了 Fc区域介导的生物学作用，避免损伤眼部组织[38]。除已上市的双抗药物，很多临床试验结果良好的双抗药物都备受关注。国内医药企业也有接近60种双抗药物进入了临床阶段。3挑战尽管目前双抗药物的出现为多种疾病的治疗提供了更多选择，但双抗药物在生产制备及应用过程中出现了多方面的困难，重点包括以下几个方面。3.1纯化及生产工艺因为存在随机性和异质性，轻重链之间非常容易错配；虽然为减少错配设计了多种手段修饰改造区分2个抗体的轻重链，但对于抗体的修饰改造增加了工艺步骤及制备时间。相对于单特异性单抗，双抗的随机配对产生更多副产物，缺少部分片段但Fc趋于完整的副产物也无法通过蛋白色谱柱分离[40]。另外，在双抗纯化过程中时常产生多聚体。已有研究证明异源二聚体在不同条件下可通过阳离子交换层析和离子交换层析进行分离[1]，但是目前尚无有效分离单特异性同源二聚体的方法[41]。同时，构建的重链和轻链在体内组装并有效共表达很大程度上依赖稳定表达细胞克隆的选择，在稳定细胞中共表达对于IgG样双抗制备非常关键[42]；温度等培养条件也会影响半抗体的表达和聚集体的形成[43]。3.2活性研究不同于天然形式的单抗，无论是IgG样形式还是非IgG样形式，都需要设计出特定的方法来验证双抗2个靶点的功能是否完整。靶点的选择不同，验证的方法不同。2个靶点之间形成的叠加效应不同于单个靶点的活性验证，需要特定的验证方法，使得双抗药物的活性研究方法难以统一。3.3细胞毒性双抗药物主要通过将免疫细胞富集于肿瘤微环境，增加免疫特异性的同时，减少体内正常细胞的非特异性杀伤。但激活后的免疫细胞相互调节，往往使得免疫应答中一系列效应持续运转，导致细胞因子分泌过多发生细胞因子风暴，虽然该情况发生概率较小，但是严重程度较高。需要慎重选择合适的靶点以减少细胞因子风暴的发生。3.4评价标准双抗药物的研究体系是在单特异性单抗药物体系基础上进行改进的，评价标准也相似。但作为新一代药物，双抗药物区别于2种单特异性单抗药物的联用。除了改善单特异性单抗药物治疗产生的耐药性外，应更多建立针对双抗药物的评价指标，更多关注多靶点带来的协同效应。同时，针对双抗药物更应注重无进展生存期、总体生存期等长期治疗效果评价。3.5应用范围目前获批使用的双抗药物均作用于肿瘤微环境，针对血液型的恶性肿瘤疾病。但实体瘤患病率远远高于非实体瘤，对于实体瘤的治疗需求更加迫切。目前国外大部分在研双抗药物针对血液瘤，而国内针对实体瘤的在研双抗药物较多，一些药物在实体瘤中取得了良好的治疗效果[44]。另外，Emicizumab的成功标志了双抗药物不仅对肿瘤疾病前景良好，在自身免疫及其他疾病上也有非常大的开发潜力，未来双抗药物的应用范围会不断增加。4展望作为抗体药物中的新兴产业，双抗研发目前处于发展阶段。在生物工程、基因工程技术革新下，双抗药物生产逐渐标准化。大部分双抗的作用机制主要为T细胞导向疗法，将T细胞重定向富集于肿瘤微环境激活免疫效应；此外就是双重免疫检查点的阻断和肿瘤相关抗原双重阻断机制。双免疫检查点阻断与T细胞导向目的类似，促进免疫细胞与肿瘤细胞密切接触的同时激活免疫效应；肿瘤相关抗原双重阻断是为了叠加肿瘤相关抗原的结合，增强有效靶标的结合，发挥治疗作用[45]。对于不同形式的双抗，纯化方式以及活性研究方法不同，这是双抗药物目前尚需解决的难点；同时，为保证2个靶点相辅相成，国内双抗药物在靶点选择以及连接方式上较为传统，存在较大的局限性。Emicizumab与传统双抗靶点的选择不同，创新性地选择了非肿瘤相关抗原。在未来，对比单一靶点的治疗，双抗药物在临床治疗中的良好表现有望成为针对自身免疫、肿瘤治疗的有利治疗手段。选择新型的靶点、设计构建新形式、快速获得高质量蛋白、简化生产工艺以及提高有效性和安全性这些方面仍需继续探索，针对现有双抗药物出现的细胞因子风暴、神经毒性、药物分子特征等问题也需深入研究及改进解决。未来，双抗药物的应用和前景仍然充满希望。抗体药领域已经发展成为未来生物药的主力军之一。鉴于此，“创新驱动 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