Verubecestat

编辑推荐文章 Editor's Recommendation 速览       α-折叠是一种罕见的多肽二级结构，不同于典型的多肽二级结构，α-折叠在单肽链延展的同时其链间氢键排列整齐且呈现强烈偶极矩。因其不稳定的分子排布方式，一直以来被视为蛋白质折叠过程中的瞬息产物而被忽视。随着晶体学和分子动力学技术的进步，在对多种神经退行性疾病相关蛋白的研究中发现，α-折叠可溶性寡聚体是淀粉样原纤维形成过程中出现的关键毒性中间体。因此明确α-折叠的形成原因及组装机制，有助于进一步揭示神经退行性疾病的致病原理，并提出针对性早筛干预和靶向治疗策略，同时有助于人工设计具备压电响应，仿生催化及药物递送等不同功能的自组装多肽纳米材料。本文总结了近年来基于不同二级结构自组装多肽的研究进展，特别是以α-折叠为首的非典型二级结构自组装多肽，重点综述了α-折叠多肽的组装机理，调控方式以及超分子结构，并对其相关生物材料的设计开发进行了展望。 【关键词】α-折叠 / 肽二级结构 / 阿尔茨海默症 / 多肽自组装 / 纳米结构 【作者信息】第一作者： 陈兆雨；通讯作者： 徐海* 01 1 引言 自组装是指在没有人为干预的情况下，组件借助自身的物理化学性质，自发组装形成有序结构和功能性聚集体的过程。自组装过程是自然界普遍存在的现象，小到分子晶体大到行星级天体系统，其范围广泛无处不在。自组装行为在生命活动中的存在过程最早可追溯到地球生命的起源阶段，核苷酸和氨基酸等生物小分子在“液液相分离”作用下相互聚集并最终组装成无膜凝聚体。随着生命形态的不断进化，尽管已形成由磷脂双分子层包裹的现代细胞，但高尔基体、内质网等高级细胞器在细胞质基质中的活动依旧遵循着“液液相分离”原则，且细胞中仍然保留了大量由“液液相分离”形成的无膜细胞器，如通过核糖体RNA和蛋白质组装成的核仁，通过多肽自组装形成的细胞骨架等。 多肽作为构筑和维系生命活动的基本单元，是介于大分子蛋白质和小分子氨基酸的中间片段，其既可通过多个氨基酸脱水缩合形成，也可通过蛋白质水解产生。多肽自组装在生命活动中广泛存在，并遵循着自下而上的分级组装过程，多肽分子首先在非极性氨基酸链段疏水作用的驱动下形成主链骨架，随后在骨架酰胺氢和羰基氧间的氢键作用下形成定义明确的二级结构，最终在不同非共价作用力驱动下形成尺寸形貌不同的组装体。多肽二级结构作为分子尺度上构成蛋白质三维结构的基本骨架，其直接影响了其最终功能。生命活动中定义明确的二级结构有α-螺旋、β-折叠（β-转角）以及无规卷曲等。此外，一些以α-折叠（α-sheet）为首的罕见二级结构如310-螺旋（310-helix）、π-螺旋（π-helix）等也在参与蛋白质动态调控，构筑离子通道等多种生命活动中发挥着重要的作用。 α-折叠二级结构概念由Pauling和Corey在1951年首次提出，不同于经典的β-折叠结构，其氨基—NH（δ+）全部集中于肽链一侧，相应的羰基—C ̿O（δ-）则全部位于另外一侧，链间氢键在折叠片中取向完全相同，这种特殊的氢键排布方式不仅造就了独特的极性界面，同时使其产生与典型多肽二级结构截然不同的圆二色光谱信号。然而因其不稳定的氢键排列方式，α-折叠一直被视为蛋白质折叠过程中出现的瞬息中间产物而被研究人员长期忽视。随着纳米医学和分子动力学模拟技术的进步，在对淀粉样蛋白原纤维形成过程的模拟中发现，以α-折叠为首的非典型二级结构在诱导构象转变过程中发挥了重要的作用。近年来，基于α-折叠的自组装短肽纳米管也被国内科研团队报道，这进一步证实了关于α-折叠二级结构预言的真实性。 本文以诱发神经退行性疾病的β淀粉样蛋白为切入点，首先回顾并列举了当前淀粉样原纤维形成过程中常见的β-折叠及罕见的α-折叠二级结构实例，并深入调研了它们之间的构象转变关系，进而归纳了近年来不同二级结构自组装多肽的设计思路，旨在引出α-折叠自组装多肽的构建方法及组装机制，并基于α-折叠的特殊氢键排布性质对相关领域应用进行了展望。 02 2 神经退行性疾病中的多肽二级结构 神经退行性疾病是一类由特定神经元逐渐萎缩从而导致相关神经结构出现慢性进行性病变及功能障碍的疾病。其通常由特定蛋白质或多肽错误折叠形成的毒性聚集体引起，这些毒性聚集体的形成过程与多肽的二级结构表达异常密切相关，特别是β-折叠。常见神经退行性疾病中的二级结构异常表达有阿尔茨海默病（AD）中的β淀粉样蛋白由α-螺旋或无规卷曲转变为β-折叠形成的β淀粉样斑块，帕金森病（PD）中的α-突触核蛋白由α-螺旋转变为β- 折叠形成的路易小体，亨廷顿病（HD）中的亨廷顿蛋白由聚谷氨酰胺错误表达形成的β- 折叠核内包涵体。随着纳米医学的进步，近来研究人员发现以α-折叠为首的罕见二级结构在神经退行型疾病相关蛋白的构象转变中发挥了重要作用。 2.1 β-折叠淀粉样纤维 β-折叠淀粉样纤维是由淀粉样蛋白通过β-折叠二级结构聚集而成的纤维状不溶寡聚物，是阿尔茨海默病中淀粉样斑块的核心成分，最早于1984年由Glenner和Wong发现。 Aβ在正常生理状态下主要以无定形可溶单体状态存在。然而在特定病理条件下，Aβ可以自组装成β-折叠二级结构，并自发聚集为交叉β（cross-β）淀粉样纤维。早期研究人员认为这些淀粉样纤维沉积是导致神经元细胞损伤的主要毒性产物，图1为通过固态NMR确定的Aβ1-40结构，相邻β链通过侧链间相互作用形成了平行β-折叠二级结构。此外，Tau蛋白的异常磷酸化也会导致蛋白从正常的α-螺旋或无规卷曲转变为具有β-折叠构象的神经原纤维缠结，这也是鉴定阿尔茨海默病的另一标志性病理特征。 图1 基于固态NMR的Aβ1-40结构。（a） Aβ1-40中的双层平行β折叠排列；（b） 能量最小化的Aβ1-40核心区域 在此基础上，Hardy和Higgins于1992年提出了淀粉样级联假说（Amyloid cascade hypothesis），即Aβ在脑内的沉积是引发Tau蛋白纤维缠结形成，神经元功能丢失以及认知障碍等系列病理变化的先导事件。淀粉样级联假说认为：阿尔茨海默症起始于Aβ在脑内的过度生成或清除障碍所触发的神经元损伤及后续神经变性。因此导致阿尔茨海默病的关键因素不在于β淀粉样原纤维沉积（老年斑）这种最终病理性产物，而在于可溶性Aβ寡聚体和更早期聚集体的出现所引发的神经突触可塑性改变。Zhang等总结了近30年来基于“β淀粉样蛋白级联假说”的研究文献、临床试验及治疗策略，指出可溶性Aβ寡聚体在诱发阿尔茨海默病中发挥着核心作用，进一步证实了针对早期可溶性Aβ寡聚体的干预策略才是阻断疾病产生的关键。 近年来，更多关于Aβ的遗传学和临床证据进一步为淀粉样级联假说提供了有力支持。DeMattos等采用携带突变型人类淀粉样前体蛋白的转基因小鼠模型，通过敲除小鼠的ApoE或clusterin基因，比较了单/双基因敲除对脑内淀粉样蛋白产生的影响。研究表明两种基因在抑制Aβ沉积上具有叠加效应，敲除任意一个基因均会显著提高脑脊液中的Aβ水平，并且两者还参与脑内可溶性Aβ的清除通路，在调控Aβ代谢运输和清除中发挥作用。Liu等则通过临床实验进一步证实了在衰老、中风和II型糖尿病患者神经元中clusterin基因表达会显著上升，更容易诱发Aβ的聚集。 上述遗传学及临床证据极大推动了以Aβ毒性寡聚体为靶点的药物研发，如针对β淀粉样前体蛋白酶1（BACE-1）的抑制剂药物Verubecestat，针对γ-分泌酶的抑制剂药物Atabecestat和Semagacestat等，然而这些药物在临床实验中均未到达预期，甚至引发了临床医学界对β淀粉样假说的质疑。直至新一代针对Aβ寡聚体的单克隆抗体药物（Aducanumab、Lecanemab等）在疾病早期患者的临床实验中显示出清除Aβ并减缓认知功能下降的潜力，这才重新证实了Aβ在阿尔茨海默症发病机制中的关键地位。但直至目前关于Aβ在病理条件下的产生原因、组装机理及构象转变过程仍尚未明确，亟待进一步研究。2.2 α-折叠中间体 α-折叠概念自提出以来长期缺乏晶体学证据，因此一直以来被视为蛋白折叠过程中瞬息出现的不稳定构象。直至有研究证实α-折叠二级结构与多种神经退行性疾病的发生密切相关：α-折叠可溶性寡聚体会破坏细胞膜完整性，诱导钙离子超载，线粒体功能障碍，最终导致神经元细胞凋亡。 α-折叠作为神经退行性疾病关键中间体的概念最早由Armen等于2004年提出。在此基础上，Daggett在对多种淀粉样变疾病中关键的毒性寡聚体蛋白（朊蛋白、溶菌酶变体、转甲状腺素蛋白）的进一步分子动力学模拟过程中发现，在低pH条件下，淀粉样蛋白部分变性可表现为罕见的α-折叠构象，并指出α-折叠可溶性寡聚体是导致神经毒性的核心结构。如图2a所示，传统的β-折叠链氢键呈锯齿状交叉排列，单一氨基酸均呈现β-折叠构象；α-螺旋链则呈现卷曲螺旋状且氢键方向一致，单一氨基酸均呈现右手α-螺旋构象；而α-折叠分别具备了两者的部分特征，其—NH与—C ̿O定向分布于主链两侧，氢键方向一致且呈极性排列，单一氨基酸为右手α-螺旋（αR）和左手α-螺旋（αL）构象交替排列，且整个肽链呈现类似于β-折叠的片层状态，链间氢键形成的片层既可以是平行也可以是反平行。从分子动力学模拟所得的拉氏图（图2b）中可进一步印证α-折叠中单一氨基酸的构象分布。 图2 α-折叠结构。（a）β-折叠链、α-折叠链和α-螺旋链的主链结构；（b）不同构象结构在拉氏图上的位置[34]；（c）β-折叠、α-折叠、α-螺旋和无规卷曲的圆二色光谱图 与此同时，圆二色光谱（CD）作为一种基于手性分子对左右旋圆偏振光吸收差异的光谱分析方法，能够在远紫外区（190~260 nm）敏感地反映出多肽二级结构。不同的多肽二级结构具有典型的圆二色光谱特征，如图2c所示，α-螺旋（α-helix）在约222与约208 nm处表现为负峰，在约193 nm处有一强正峰；β-折叠（β-sheet）则在约218 nm处出现一处弱负峰，在195~200 nm之间出现一处正峰；无规卷曲（Random coil）则仅在195~200 nm之间表现单一的负峰。相比之下，α-折叠（α-sheet）sheet的圆二色光谱特征与上述经典的多肽二级结构截然不同，其典型特征表现为：在约218 nm位置出现一处弱正峰，而在200 nm左右则出现一处负峰，光谱信号几乎与β-折叠的谱图呈现镜像对称关系（图2c，α-sheet和β-sheet）。造成这种独特性的主要原因有：（1）主链构象不同，β‑折叠主链氨基酸均呈现β构象，而α-折叠主链则由αR和αL构象交替排列而成；（2）偶极排列不同，β‑折叠骨架C=O与N—H偶极交替排列，而α-折叠骨架基团全部同向排列呈现高度有序化偶极。这种偶极取向的变化使得电子跃迁的旋光符号反转最终导致了α-折叠圆二色光谱图中的镜像化差异，因此对α-折叠圆二色光谱的研究，不仅为其在溶液中的存在与构象识别提供了直接光学证据，同时也为淀粉样变疾病的早筛和诊断创造了实验基础。 为了进一步确认α-折叠在神经退行性疾病中发挥的作用，Hopping等在Daggett分子动力学模拟结果的基础上设计了5种不同二级结构的多肽分别是β-折叠对照肽（β），无规卷曲对照肽（rc）以及3种不同修饰的α-折叠肽（α1-3），其中α-折叠肽采用了D-/L-型手性氨基酸交替排列策略以稳定构象。研究证实了α-折叠肽可以靶向结合毒性寡聚体从而达到抑制淀粉样蛋白聚集的效果，如图3a，c所示，在转甲状腺素蛋白（TTR）和淀粉样蛋白（Aβ）系统中，α-折叠肽（α1和α3）均显著抑制了TTR和Aβ的聚集，最高抑制率分别为72%和87%，而作为对照的β-折叠肽（β）和无规卷曲肽（rc）则均未表现出明显效果。进一步细胞毒性实验（图3b，d）也证实α-折叠肽几乎完全抑制了细胞毒性。这些结果共同证明：α-折叠肽可以特异性识别并中和可溶性毒性寡聚体，从而有效阻断淀粉样蛋白纤维化进程，以阻止毒性寡聚体对细胞膜的破坏及线粒体的损伤，同时侧面印证了在多种神经退行性疾病中真正发挥神经毒性的可溶性寡聚体为α-折叠二级结构，而非β-折叠。 图3 α-折叠多肽抑制淀粉样蛋白形成并选择性结合毒性寡聚体示意图：（a） 不同多肽与TTR蛋白共孵育后的聚集情况；（b） TTR溶液对神经肿瘤细胞SH-SY5Y的毒性；（c） 不同多肽与Aβ蛋白共孵育后的聚集情况；（d） Aβ溶液对SH-SY5Y的细胞毒性 基于α-折叠二级结构特殊的氢键排列方式，淀粉样蛋白中可溶性α-折叠寡聚体的肽链两侧带正电的酰胺氢和带负电的羰基氧基团排列整齐且呈现极性取向。如图4所示，相邻肽链在链间极性电荷的吸引下极易形成氢键，进而堆积成早期淀粉样可溶性寡聚体。这种极性取向形成的偶极矩极大增强了寡聚体分子的亲水-亲油分布差异，有助于其跨越细胞膜与膜蛋白受体等结合，从而导致神经元损伤。这种构象不仅作为Aβ寡聚体聚集过程中的关键媒介，同时也与多种神经退行性疾病药物抗体特异性结合一致，这进一步为α-折叠二级结构作为淀粉样蛋白毒性构象提供了临床实验支撑。 图4α-折叠在静电互补作用下寡聚化示意图 2.3 α向β构象转变 自β淀粉样级联假说提出以来，靶向消除β淀粉样纤维和抑制β淀粉样纤维形成通路一直是治疗以阿尔茨海默症为首的神经退行性疾病的主要策略，然而在过去的几十年里临床效果甚微，以至于引起了医学界对β淀粉样级联假说的质疑。如果上述α-折叠可溶性寡聚体是诱发神经毒性的主要构象，就解释了为何在多组临床实验中的靶向抗体药物可以特异性结合可溶性寡聚体却无法识别最终成熟的淀粉样原纤维。 研究人员在对多种与神经退行性疾病相关蛋白的分子动力学模拟中发现，在蛋白致病突变或机械应力等特定条件下，淀粉样蛋白中原有的β-折叠构象将被削弱，β-折叠主链可通过肽平面翻转（Peptide-plane flipping）开启ββ构象和αRαL构象间的转化通道，从而触发氢键重排及侧链重组以实现β-折叠到α-折叠的构象转变过程（图5a，b）。肽平面翻转现象在生命进程中十分常见，如图5c所示的UvrB-DNA解旋酶催化过程中的结构转换。因此，在神经退行性疾病早期，β-折叠通过ββ到αRαL型肽平面翻转形成可溶性α-折叠，这一过程可被视为构成早期有毒寡聚体的核心事件。若α-折叠构象结构作为真正的毒性中间体，其终将再次通过αRαL到ββ的逆转化过程恢复为β-折叠构象以完成最终β淀粉样原纤维的组装。 图5 UvrB-DNA解旋酶中的αRαL和ββ肽平面翻转：（a） 主链呈αLαRαLαR构象，（b） 肽平面翻转180°局部呈现ββ构象，（c） UvrB-DNA解旋酶示意图 为了进一步剖析α-折叠向β-折叠构象转变的逆向过程，Hayward等通过扭转角驱动模拟（Torsion-angle driving simulate）提出了两种不同的肽平面翻转路径，分别是协同翻转和顺序翻转。其中协同翻转为整个肽链同步旋转，而顺序翻转则是单个氨基酸残基沿肽链以N端到C端的方向依次翻转。模拟结果显示，在反平行β-折叠顺序肽平面翻转过程中，当肽平面翻转到90°时会出现肽链上的几何不匹配，使得链间氢键无法维持，最终导致氢键网络瓦解并出现肽链滑移和外展分离（图6）。而平行β-折叠无论协同翻转还是顺序翻转均能在肽链不发生解离的状态下保持氢键网络并实现与α-折叠构象之间的相互转化（图7a~d）。因此，反平行β-折叠向α-折叠的转变并不能像平行β-折叠一样在不断链的情况下完成，其必须经历短暂的链分离后再重新配对。这就解释了为何在成熟的淀粉样纤维中平行β-折叠更为普遍（平行β-折叠构象含量大于80%）。 图6 反平行β-折叠经顺序肽平面翻转向α-折叠构象转变过程中的肽链滑移-分离模型 图7 α-折叠通过肽平面翻转向β-折叠构象转变模型。协同翻转：（a） 平行向前，（b） 平行向后，（c） 反平行向前和（d） 反平行向后。顺序翻转：（e） 平行向前，（f） 平行向后，（g） 反平行向前和（h） 反平行向后 近年来，多学科证据进一步巩固了α-折叠可溶性寡聚体在神经退行性疾病中的关键作用。Shea等结合圆二色光谱（CD）、微流体调制-红外光谱（MMS-IR）和核磁共振（NMR）等多种表征手段，在Aβ滞后期直接识别并确定了α-折叠的结构信息，并在线虫和转基因小鼠模型动物学实验中进一步证实了发挥细胞毒性的关键结构为α-折叠可溶性寡聚体而非β-折叠纤维（图8a，d），同时设计了可特异性中和毒性寡聚体的α-折叠肽以抑制细胞毒性。Prosswimmer等则以转甲状腺素蛋白（TTR）为模型首次在原子尺度上捕捉到了β-折叠通过肽平面翻转转化为α-折叠的全过程，图8e详细展示了构象转换过程中的关键过渡步骤：早期外界条件的改变导致β-折叠原生氢键网络被破坏从而使肽平面发生快速翻转并暴露出极性界面，随后在水分子与极性界面之间形成的临时氢键介导下，主链最终形成α-折叠构象。同时这项研究也证实了“肽平面翻转-水介导-偶极驱动”的构象转变路线在多种神经退行性疾病中具有通用性，进一步明确了α-折叠毒性寡聚体的产生机制。 图8 α-折叠寡聚物的光谱与临床证据：（a） α-折叠细胞毒性实验，（b） 阿尔茨海默症大脑皮层细胞中浅色与深色包涵体，（c） 深色包涵体中的α-折叠寡聚物，（d） α-折叠MMS-IR特征光谱，（e） β-折叠向α-折叠转变示意图 不仅如此，α-折叠构象毒性寡聚体也在近期的临床研究中被进一步证实，Serwer等利用薄切电镜首次在阿尔茨海默病人大脑皮层细胞切片中发现大量浅-深双相脂褐素包涵体，其中浅色包涵体表面相对光滑，对比度较低，而深色包涵体则被α-折叠细丝状寡聚体所填充（图8b，c）。进一步研究发现深色包涵体是α-折叠向β-折叠构象转变的中间状态，随着α to β构象转变及脂质重新分配将最终漂白为浅色包涵体。因此，α-折叠毒性寡聚体是β-折叠淀粉样原纤维成熟过程中的关键过渡态，若α to β构象转变不彻底，其中残余α-折叠毒性寡聚体将破坏溶酶体膜并被释放至邻近细胞发挥毒性，从而驱动病理在脑内传播并最终导致大脑皮层细胞的进一步损伤。 2.4 α-折叠肽靶向治疗 α-折叠作为一种罕见的多肽二级结构与阿尔茨海默病等多种神经退行性疾病的早期发病过程密切相关。在淀粉样原纤维沉积成淀粉样斑块前的可溶性寡聚体阶段，多肽会暂时呈现α-折叠构型并表现出强烈的细胞毒性，从而严重破坏神经元细胞。α-折叠毒性寡聚体作为最早且最具致病性的可检测结构，若能在神经退行性疾病发病初期就特异性识别并被捕获，就可以干预α to β构象转变过程，从而大幅提前干预窗口期，为疾病的早筛及阻断提供可能。这足以颠覆当前常规的以淀粉样原纤维为目标的靶向治疗方法。 Shea和 Daggett系统总结了淀粉样纤维沉积过程中主导二级结构的变化：从最初的无规卷曲构象单体到低分子质量α-折叠构象可溶性寡聚体，再到高分子质量β-折叠构象纤维前体，最终沉积为淀粉样纤维斑块。通过对不同构象的细胞毒分析发现，在淀粉样斑块沉积过程中构象的细胞毒性是不断下降的，α-折叠中间体和α to β构象转变过程在这其中发挥了关键毒性作用。并对上述所涉及的各种构象的现有监测方法和针对疾病不同阶段的靶向抑制药物作用位点（图9b）分析得出，目前在研或已上市的大部分抗体和靶向抑制剂瞄准目标为疾病发生后期的 β-折叠构象或淀粉样斑块阶段，因此无法有效清除真正具备神经毒性的早期α-折叠寡聚体，导致长期以来临床效果一直有限。 图9 神经退行性疾病过程中的构象转变及治疗策略：（a）构象转变过程及表征技术，（b） 靶向药物及作用位点 在上述研究的基础上，Shea和Chen等进一步提出了一种针对阿尔茨海默症的早期诊断方法SOBA（可溶性寡聚体结合检测），通过人工合成的D-/L-型手性氨基酸交替排列的α-折叠肽（AP193）特异性结合可溶性寡聚体中的α-折叠毒性构象，从而降低α-折叠毒性构象对神经细胞的损伤。在379份血浆样本中SOBA监测对阿尔茨海默症的特异性识别高达99%，并可在症状出现前1~13年（平均6年）监测出高风险患者。图10证实了SOBA对α-折叠有毒寡聚体可以专一性识别并实现有效捕获，为SOBA应用于临床体液早筛提供了直接证据。同时，该方法仅需α-折叠主链的互补配对，可以有效避免侧链序列的限制，同时可通过更换监测序列将监测范围扩充至帕金森病等其他相关神经退行性疾病的诊断中。针对α-折叠毒性构象的SOBA监测开创了一种集检测-治疗于一体的诊断方法：作为可以同时监测血液和脑脊液的早筛工具，SOBA可以尽可能早发现高危人群并为他们提供充足的“可干预窗口期”，作为针对α-折叠毒性寡聚体的靶向多肽药物，还可以通过合理的序列设计扩充药物治疗范围，有望在更多神经退行性疾病的诊断中发挥作用。 图10 阿尔茨海默症的分子病理学过程：（a） 不同时间阶段阿尔茨海默症的病理学事件，（b） α-折叠寡聚体表现出明显的SOBA信号，（c） 经过SOBA治疗后的AD患者血液中α-折叠寡聚体信号明显下降 因此根据α-折叠毒性寡聚体合理设计可以与其特异性结合的α-折叠肽，在疾病的早期筛查和靶向治疗上展现出极大潜力，这极有可能代替现有的淀粉样原纤维靶向药物成为未来治疗以阿尔茨海默症的首的神经退行性疾病的主要策略。然而目前针对α-折叠二级结构研究的报道甚少，针对如何设计合成α-折叠肽、α-折叠肽的组装机制及形成机理等问题亟须进一步明确。 03 3 基于不同手性的自组装多肽 手性氨基酸是指α碳原子上连接4个不同基团从而形成两种镜像异构体的氨基酸分子，它们分别是L-型和D-型，除甘氨酸外所有的氨基酸均为手性氨基酸。目前研究人员已经发现，通过D-/L-型手性氨基酸交替排列可以稳定α-折叠二级结构，并基于此开发了针对α-折叠毒性寡聚体的靶向多肽药物。同时手性氨基酸还在不对称催化，组织工程、纳米生物材料等多个领域发挥着重要作用，特别是功能性自组装多肽的设计与合成。自然界中参与生命活动的绝大多数蛋白质均由L-型氨基酸构成，D-型氨基酸仅存在于少数微生物活动中，如参与革兰氏菌细胞壁的构建与动态重塑。这些D-型氨基酸的参与赋予了细菌细胞壁相当的机械强度和结构稳定性，从而进一步提升细菌对环境条件变化的适应能力。 基于此，研究人员构建多种具备不同手性的多肽纳米材料。为了进一步明确多肽自组装过程中的手性传递机制，Wang等通过改变自组装两亲性超短肽序列Ac-I3K-NH2中的氨基酸手性设计合成了3组手性相互对应两亲肽分别为：LI3LK和DI3DK、LI3DK和DI3LK及LaI3LK和DaI3DK。研究发现多肽纳米纤维的超分子手性是由I3K短肽C-端亲水性赖氨酸残基的手性所决定的，而其圆二色光谱中β-折叠特征信号则由疏水性异亮氨酸的手性所控制（图11a）。为了进一步验证局部手性对多肽高阶自组装的影响，Ju等在两亲性短肽I3K序列的不同位置插入不具备手性的柔性甘氨酸（G），进一步设计合成了IIIGK、IIGIK和IGIIK系列多肽（图11b），甘氨酸的插入造成了非氢键驱动的局部弯折，最终介导多肽组装形成不同形貌，这证实了柔性甘氨酸可在多肽自组装过程中充当“形貌-手性开关”，为多肽手性特征研究和区块异手性序列设计提供了条件。 图11 手性两亲性短肽自组装示意图：（a） 手性自组装短肽I3K，（b） 柔性甘氨酸在I3K中的手性截断作用 基于此，为了同时明确异手性多肽共组装的分子动力学机制，Wang等通过对I3K短肽的不同手性对映体进行共组装发现：具有相同螺旋倾向的立体异构肽共存时，为了实现不同链间氢键作用的最大化，β-链骨架会发生分子层面的手性扭转并传递至整个β-折叠最终改变纳米纤维的螺旋方向（图12a）。而具备芳香官能团的F3K系列手性短肽则表现出不同的共组装手性传递规律，互为手性对映体的LF₃LK与DF₃DK在等摩配比共组装后，由于侧链三对苯丙氨酸的π-π堆积及几何上的立体互补，使得不同肽链间结合能骤降（-51.56 kcal/mol，1 kcal/mol=4.184 kJ/mol）并最终交替排布形成宽平的β-折叠纳米带（图12b）。以上最新研究解释了手性互补和手性翻转在多肽共组装过程中的详细作用机制，为后续进一步设计手性交替α-折叠纳米材料提供了清晰指南。 图12 两亲性自组装短肽（a） I3K和（b） F3K手性对映体共组装示意图[65-66] 除不同手性多肽共组装以外，同一多肽的不同区域异手性在调控多肽超分子组装过程中也发挥了关键作用，不同于L-（FKFE）2和D-（FKFE）2等摩尔共组装形成的无旋向纳米纤维（图13a），区块异手性设计的多肽序列LFLKLFLEDFDKDFDE自组装成单分子厚的螺旋纳米带（图13b），且XRD和固态NMR表征进一步证实了组装体内几乎没有扭曲的cross-β结构，该研究证实区域异手性可以在分子层面消除β-链扭转倾向，从而精准的调控纳米带曲率，最终形成同序列同手性所无法获得的新型纳米形貌。 图13 不同手性短肽Ac-（FKFE）2-NH2（a） 共组装与（b）自组装结构示意图 此外，氨基酸手性设计在环状多肽的序列构筑中也发挥着重要作用，早在1994年Ghadiri等就通过D-/L-型手性氨基酸交替排列设计了β-折叠环肽cyclo-[（LTrp-DLeu）3-LGln-DLeu（图14a），并发现环肽可自组装形成人工跨膜离子通道，实现质子和离子的选择性跨膜运输（图14b）。近来多项研究证实环状多肽的组装结构对其序列中的氨基酸手性高度敏感，如全L-型氨基酸构成的环二肽cyclo-（LPhg-LPhg）组装形成的纳米片热稳定性远低于手性交替设计的环二肽cyclo-（LPhg-DPhg）所形成的纳米片；cyclo-（LTyr-LAla）倾向于形成肽纳米线，而手性交替设计的cyclo-（LTyr-DAla）则组装成尺寸更大更稳定的纳米微管（图14c）。目前基于环肽纳米管独特的中空结构和极易修饰的化学特性，其在构筑人工跨膜通道、药物载体递送、抗菌抗病毒等多个领域展现出了广泛的应用前景。由此可见，在β-折叠环状多肽的分子设计中调控氨基酸手性交替模式能够调控环肽的堆叠方式及螺旋节距从而影响最终组装体形貌。 图14 环肽序列设计：（a，b） 环肽cyclo-[（LTrp-DLeu）3- LGln-DLeu]序列及其轴向组装形成的纳米孔道，（c） cyclo- （LTyr-LAla）和cyclo-（LTyr-DAla）各自组装形貌示意图 综上所述，自然界中常见以L-型氨基酸为主导的多肽倾向形成右手螺旋β-折叠，而α-折叠作为与β-折叠截然不同的罕见二级结构，其肽链结构整体呈现平行伸展构象。因此为了打破β-折叠二级结构潜在的扭曲特征，多肽区块异手性设计（交替D-/L-构象、局部D-/L-构象）或对映体共组装等手性调控策略将是稳定α-折叠二级结构的必要开关。 04 4 基于不同二级结构的自组装多肽 多肽二级结构是由肽链间氢键稳定的有序构象，是构筑蛋白质更高层次的三维结构的稳定模板。不同二级结构的性质对应着不同的结构功能：如α-螺旋因其特殊的氢键聚集方式和结构韧性，常出现于跨膜蛋白中，β-折叠因其稳定的机械强度，广泛出现于结构蛋白中。然而在特定条件下，二级结构也会发生构象转变导致错误折叠，如α-螺旋或无规则卷曲向β-折叠的过度转变从而诱发的阿尔茨海默病等神经退行性疾病。得益于多肽固相合成技术的成熟，研究人员可以通过特定氨基酸的自由组合来设计合成多肽。为了进一步明确多肽自组装过程机制，近年来一系列自组装多肽序列被设计合成出来。在这其中类表面活性剂多肽最为常见，这类多肽序列一般较短，由疏水氨基酸片段和亲水氨基酸末端组合而成。 4.1 β-折叠 β-折叠是由两条或多条完全伸展的β-链通过主链羰基氧与相邻链酰胺氢之间形成的垂直于主链走向的氢键交联而成，其链间方向为平行或反平行。由于伴随着强烈的侧向堆积，富含β-折叠的组装体在其形态上表现出高度多态性，类似于淀粉样原纤维，自然界中最典型的β-折叠当属诱发神经退行性疾病的Aβ1-42淀粉样蛋白。 近年来大量的实验证据和模拟工作表明，β-折叠二级结构是两亲性多肽最常见的自组装骨架，如图15a所示，Han等以两亲性四肽I3K为原型，将异亮氨酸替换为疏水性较弱的亮氨酸设计合成了L3K，证实了在疏水强度减弱后，L3K组装形貌退化为无规卷曲球状胶束，而进一步延长疏水链长度合成的L5K则恢复为β-折叠纳米纤维，这揭示了氢键与疏水作用在多肽组装过程中的协同驱动。进一步的，Zhou等通过REMD对上述I3K、L3K和L5K系列多肽从单体到三聚体进行了系统性模拟，证实了在多肽组装过程中氨基酸残基构型倾向与链间氢键及疏水作用之间的相互竞争关系（图15b），Zhao等则在此基础上设计合成了同源多肽序列I₄K₂、KI₄K和I₂K₂I₂，实验发现由相同氨基酸组成的多肽仅通过改变亲/疏水残基的排列顺序就可以完成对β-折叠侧链堆积的精准调控，最终实现纳米纤维-纳米管-无序聚集3种形貌的可逆转换（图15c）。以上研究为多肽自组装分级调控提供了以下基本思路：（1）精确置换亲/疏水氨基酸残基位置；（2）调节疏水链长度与侧链几何排布；（3）引入不同手性氨基酸。 图15 β-折叠两亲性自组装超短肽的序列调控方式：（a，b） 氢键与疏水作用调控，（c） 氨基酸位置替换 α-螺旋是天然蛋白质中最常见且含量最丰富的二级结构。其主链羰基氧与下游第4个残基的酰胺氢（n，n+4）形成的链内氢键构成螺旋骨架，氢键方向平行于螺旋轴，并呈现出每圈3.6个残基的周期性重复，平均每个螺旋包含13个原子，因此α-螺旋又被称为3.613-螺旋。α-螺旋骨架之间通过侧链间互补的静电和疏水作用，可进一步缠绕成结构稳定的卷曲螺旋（Coiled-coil）高阶组装结构，因其紧密规整的氢键网络，可以有效屏蔽主链中的极性基团，α-螺旋广泛分布于跨膜蛋白的穿膜区域。 因此基于α-螺旋二级结构设计合成的自组装肽通常具有相对较长且排列有序的循环序列（图16）。受限于序列长度，在α-螺旋肽序列设计中必须在特定位置插入coiled-coil黏性末端等（图16b）特殊结构组件以实现其高阶自组装。 图16 α-螺旋自组装七肽循环序列设计 不同于β-折叠在组装初期就大量交联形成cross-β链间氢键，维持α-螺旋的氢键为链内氢键，从肽链N-端到C-端均指向同方向。早在21世纪初，Woolfson等[85]就提出了利用“黏性末端”结构部件构建α-螺旋多肽纳米纤维的方法：将α-螺旋按照七肽循环序列设计（abcdefg）x，七肽循环中a/d位采用异亮氨酸/亮氨酸构筑疏水核心，e/g位则采用谷氨酸/赖氨酸形成电荷互补，b/c/f位则填入丙氨酸以维持α-螺旋的基本倾向。如图16a所示，两条由4组七肽序列构成的28残基自组装肽（SAF-p1和 SAF-p2）在e/g位的盐桥作用下形成平行错位的黏性末端，并诱导多肽以卷曲螺旋形式实现高阶自组装。近来这种基于七肽循环序列模板（abcdefg）x设计α-螺旋自组装多肽的方法已被证实具有普适性。基于此，Li等通过将第2组和第4组七肽序列的a位突变为天冬酰胺，赖氨酸和组氨酸设计了3组α-螺旋肽分别为NN、NK和HH，其中NN序列通过链内埋藏的Asn-Asn间氢键以锁定平行的卷曲螺旋二聚体，并暴露出黏性末端；赖氨酸引入后的NK虽依然能形成卷曲螺旋二聚体，但因电荷排斥作用削弱了黏性末端的衔接作用，使其无法沿轴向伸展，高浓度下组装体长度大幅缩短；而使用组氨酸代替了天冬酰胺的HH则具备了金属离子响应性，可以在铜离子诱导下实现轴向组装。 上述研究详细解析了4种不同非共价相互作用在多肽分级自组装过程中的分工与协作：在整个α-螺旋肽的分级组装过程中，多肽分子首先在主链氢键的驱动下形成α-螺旋骨架，随后在侧链疏水作用和静电作用协同下形成平行卷曲螺旋二聚体，并最终在肽末端序列的互补关系及电荷作用形成的黏性末端作用下实现二聚体轴向缔合并组装为纳米长纤维，与此同时，金属离子-组氨酸的配位作用则可在特定pH值下实现对轴向关系的精准调控。 α-螺旋肽成熟的模板化设计规则不仅为我们解析了多肽组装过程中不同非共价作用力的作用机制，同时其特殊的氢键排列方向和氨基酸构型倾向与α-折叠肽极其相似，这为我们后续进一步设计合成α-折叠自组装肽提供了理论基础。 4.3 α-折叠 早在20世纪50年代，Pauling和Corey在提出α-螺旋和β-折叠等经典二级结构同时，预测了一种不寻常的片层结构，也就是“α-折叠”。α-折叠虽整体表现出与β-折叠一样舒展的肽链排布方式，但其单肽链上的羰基和氨基定向排布于链两侧，导致整个片层一侧富含带负电的羰基，而另一侧富含带正电的氨基，从而呈现出显著的偶极矩（图4，图17）。然而α-折叠二级结构自提出以来，因其常规条件下的不稳定性，一直被视为是蛋白质折叠过程中的瞬息中间体而被研究人员忽视。 图17 基于α-折叠结构的K+离子通道蛋白示意图 随着分子动力学模拟和晶体学解析技术的进步，α-折叠二级结构在近五年来获得了空前关注。Daggett等通过分子动力学模拟证实了α-折叠是诱导神经退行性疾病的主要毒性构象，并基于此构建了相关早筛干预和治疗策略。此外，在天然蛋白中α-折叠结构也被发现，图17是钾离子通道蛋白的穿膜区由4条包含5个残基的α-折叠链构成，这种设计充分利用了α-折叠链一侧整齐排列的羰基负电阵列，可以在专一抓取K+的同时避免α-折叠构象本身的聚集和毒性。这种基于α-折叠链的特殊通道蛋白也为后续人工离子孔蛋白的分子设计提供了范例。 截至目前，关于α-折叠二级结构的研究已有了初步进展，然而支撑α-折叠存在的证据仍大量依托于分子动力学模拟。为了进一步确认其结构真实性，目前研究人员正聚焦于α-折叠自组装肽的构建及相关晶体学证据的寻找。 考虑到α-折叠特殊的氢键排列方式，其分子链间强烈的偶极矩使其更容易在静电作用下发生线性组装，并产生与典型二级结构截然不同的形貌特征，因此更具生物材料潜力。截至目前，我们已经在D-/L-手性交替策略设计的2D-L4K和3D-L4K α-折叠自组装短肽序列基础上，设计了更多可以稳定存在的α-折叠自组装短肽，同时我们也成功利用α-折叠肽纳米管材料在蛋白保护、生物催化、压电响应等多个应用领域取得了初步进展，目前我们仍在不断探索扩大其产业化应用。 结论与展望 随着三维重构冷冻电镜及分子动力学模拟等微观表征技术的不断进步，多肽自组装领域迎来了迅速发展，然而这绝大部分研究都集中在β-折叠和α-螺旋等典型多肽二级结构。因此，基于罕见α-折叠二级结构自组装多肽的构建及其组装机制的研究是目前多肽自组装领域中的崭新研究方向，为非典型多肽二级结构及相关生物材料应用的开发提供了设计模板。本文归纳总结了近年来α-折叠二级结构的研究历程，分析了α-折叠在诱导神经退行型疾病中的核心作用，并从自组装多肽设计角度出发综述了基于不同手性和二级结构的自组装多肽，总结出了区块异手性设计，手性对映体共组装等多种构筑α-折叠自组装肽的设计方法。随后，进一步阐述了α-折叠肽纳米管的组装机制，并展望了其在极性生物材料领域的应用潜力。 我们认为对α-折叠二级结构自组装机制的深入研究，有望在生物医学和纳米材料科学领域发挥重要作用：（1）从生物医学角度，α-折叠可溶性寡聚体的发现证实了诱发神经退行性毒性的真正产物并非成熟的淀粉样原纤维，有助于研究人员进一步开发针对α-折叠构象的早筛试剂和靶向阻断药物，从而在疾病更早期实现有效干预。（2）从纳米材料科学角度，α-折叠提供了一种全新的分子构筑单元，将曾经仅存于理论中的α-折叠结构变为现实，同时α-折叠特殊的极性氢键网络和分子偶极矩赋予其常规纳米材料所不具备的特性，因此有望在压电响应、分子通道、药物可控释放和手性膜分离等多个领域发挥重要作用。 尽管对α-折叠二级结构的研究已经取得了一些重要进展，但未来研究中仍存在以下问题：（1）虽然通过手性设计的三肽结晶和两亲性五肽纳米管已经确认了α-折叠核心结构的真实性，但迄今仍缺乏完整连续的α-折叠原子级分辨率晶体解析和三维重构冷冻电镜证据。（2）尽管在K+通道蛋白等天然蛋白中捕捉到过α-折叠二级结构，但目前绝大多数实验证据均来自体外组装的小分子肽或重组蛋白，α-折叠作为一种毒性构象该如何在生命活动中发挥生物功能仍是未知，进一步解析其动态三维结构将是未来结构生物学有待攻克的核心问题。（3）α-折叠肽纳米管独特的极性结构和自修复氢键网络虽赋予了其特殊的结构性能，但α-折叠多肽的设计和合成较为困难且其结构强度仍需进一步优化，极大限制了实际应用的开发，因此进一步优化合成策略并实现产业扩大化将是未来纳米材料领域的研究重点。 综上所述，α-折叠二级结构已被证实是一种可功能化设计的全新多肽纳米材料，但目前仍处于初步验证阶段，在结构分辨率、检测标准、可控设计、体内存在证据及规模化制造等多个环节存在研究空白，未来仍需依托结构生物学、机器学习和合成生物学等多领域多学科协同合作，相信随着纳米生物科学的不断革新，α-折叠多肽二级结构将在各个领域中实现不断突破，并发挥重要作用。 · 编辑推荐 · Editor's Recommendation  推文篇幅有限，欢迎阅读原文，共飨学术 点击文末「阅读原文」，直达文献。 Authors:  Zhaoyu Chen, Xiaoyue Ma, Henghao Yu, and Hai Xu* Title: Peptides Secondary Structure of α-Sheet Published in: Progress in Chemistry, 2026, 38(2):319-336 DOI: 10.7536/PC20250612 感谢您的关注，欢迎引用本文！