Clifutinib Besylate

近日，东阳光药业团队在国际权威药物化学期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为“发现FLT3-ITD抑制剂Clifutinib：一种新型双苯乙炔脲衍生物及其在复发/难治性FLT3-ITD阳性急性髓系白血病治疗中的临床试验研究”的研究论文。Clifutinib作为一种新型的FLT3-ITD抑制剂，通过抑制FLT3-ITD激酶活性，显著抑制了携带FLT3-ITD突变的AML细胞系MV-4-11和MOLM-13的增殖，其IC50值分别为1.5 nM和1.4 nM。此外，Clifutinib在小鼠模型中也展现出良好的药代动力学特性和抗肿瘤效果，且未引起显著体重下降等不良反应。目前，Clifutinib已进入III期临床试验（NCT05586074），有望为复发/难治性FLT3-ITD阳性AML患者提供新的治疗选择。克立福替尼（Clifutinib，苯磺酸克立福替尼）是东阳光药业自主研发的一款高选择性FLT3抑制剂，克立福替尼是国内首个进入III期临床试验的国产FLT3抑制剂，标志着其在AML治疗领域的领先地位。一分钟速览研究背景急性髓系白血病（AML）是一种常见且预后极差的恶性血液疾病，其中FLT3-ITD（FMS样酪氨酸激酶3内部串联重复突变）是AML中最常见的基因突变之一，与疾病进展和不良预后密切相关。尽管已有多种FLT3抑制剂进入临床，但仍有部分患者对治疗产生耐药性，且现有药物存在一定的副作用。因此，开发更有效、更安全的FLT3-ITD抑制剂是当前研究的热点。重点内容东阳光药业团队通过合理药物设计，开发了一系列双苯乙炔脲衍生物作为新型FLT3-ITD抑制剂。其中，化合物9e（命名为Clifutinib）表现出优异的活性和药物特性。研究结果表明，Clifutinib对FLT3-ITD激酶的抑制活性极强，IC50值仅为15.1 nM，并且在MV-4-11和MOLM-13两种携带FLT3-ITD突变的AML细胞系中展现出显著的抗增殖活性，IC50值分别为1.5 nM和1.4 nM。此外，Clifutinib在小鼠模型中也表现出良好的药代动力学特性和抗肿瘤效果，且未引起显著体重下降等不良反应。研究总结Clifutinib作为一种新型的双苯乙炔脲衍生物，具有高选择性、高活性和良好的药物特性，有望成为治疗复发/难治性FLT3-ITD阳性AML的有效药物。目前，Clifutinib已进入III期临床试验（NCT05586074），其临床数据将进一步验证其在AML治疗中的潜力。图片来源：ACS详细阅读01Background研究背景FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）是一种跨膜酪氨酸激酶，属于III型分裂激酶域家族，与KIT、FMS和PDGFR等激酶密切相关。FLT3通过与细胞外配体结合促进二聚化和自身磷酸化，激活下游的RAS/MAPK、PI3K/AKT和JAK/STAT5信号通路，从而调节造血干细胞的增殖、分化和存活等细胞过程。然而，FLT3的激活突变，尤其是内部串联重复（ITD）突变，在急性髓系白血病（AML）中频繁出现，并与不良预后相关。AML是一种常见且具有侵袭性的致命恶性肿瘤，全球每年约有超过250,000人死于AML相关的癌症。FLT3-ITD突变在AML患者中占比约25%，这些突变通过促进配体非依赖性二聚化，持续激活FLT3信号通路，导致白血病细胞的异常增殖和分化。因此，FLT3-ITD突变已成为AML治疗的一个重要靶点。过去几十年中，虽然已有多种FLT3抑制剂被研究作为潜在的治疗药物，但这些抑制剂在特异性、亲和力和结合位点上存在差异，且部分患者在接受治疗后仍会复发。此外，一些抑制剂还存在如QTc间期延长、发热性中性粒细胞减少和全血细胞减少等非靶向效应引起的副作用。鉴于此，研究团队致力于探索更有效、更具选择性且更安全的FLT3-ITD抑制剂，以期为FLT3-ITD阳性AML的临床治疗提供新的选择。图片来源：ACS02Drug Design药物设计与评价①药物设计在本研究中，研究团队采用了一种非经典的生物电子等排策略，用苯乙炔基团替换Quizartinib中的苯并咪唑并噻唑部分。这种替换有望减少因三杂环化合物的电子富集性质所导致的hERG毒性，主要目标是发现新的、更具选择性和更安全的FLT3-ITD抑制剂。图片来源：ACS②构效关系探究新合成的化合物通过CTG实验评估了它们对携带FLT3-ITD突变的人类急性髓系白血病（AML）细胞系MV-4-11的抗增殖活性。已获批准的化合物6（Quizartinib）作为阳性对照，显示出平均IC50值为0.9 nM的强抗增殖活性，与先前报道的数据相当。令人鼓舞的是，新合成的双苯乙炔脲衍生物9a也显示出显著的抗增殖活性，其IC50值为1.4 nM，与Quizartinib相当。这一发现表明，苯乙炔基团可以作为有效的片段替代Quizartinib中的苯并咪唑并噻唑部分，提供了一类具有卓越抗增殖活性的新型高效FLT3-ITD抑制剂，这与我们的设计策略一致。基于这一发现，化合物9a被选为先导化合物，并首先研究了其R1取代基的构效关系（SAR），因为该取代基的位置延伸至溶剂可及区域。化合物9a、9b和9d对MV-4-11细胞的抗增殖活性相当（IC50值分别为1.4、1.6和1.1 nM），证实了9a中的2-吗啉乙氧基可以被9b中的4-甲基哌嗪-1-乙氧基和9d中的六氢-6H-[1,4]二氧杂环庚烷-6-乙氧基所替代。然而，用9c中的甲氧乙基-N,N-二甲基哌啶-4-氨基替代则导致抗增殖活性降低了24.5倍（IC50值为34.4 nM）。这些结果表明，9e中的2-吗啉乙氧基可以被不同的亲水基团替代，同时保持对MV-4-11 AML细胞的抗增殖活性。考虑到苯乙炔基团与Quizartinib中的苯并咪唑并噻唑基团的长度差异，尝试通过延长亲水R1取代基的（CH2）n链来匹配Quizartinib的几何长度。通过系统地将（CH2）2链延长至（CH2）3，合成了化合物9e至9h，以研究连接链长度对抗增殖活性的影响。如预期所示，化合物9e至9h对MV-4-11细胞的抗增殖活性与化合物9a至9d相当，其IC50值分别为1.5、2.4、8和3.1 nM。然而，用9i中的3-甲氧基丙基-2-氧杂-6-氮杂螺[3.4]辛烷基团替代9e中的3-吗啉丙氧基，导致抗增殖活性降低了9.52倍，IC50值为13.8 nM。令人困惑的是，吡啶衍生物9j无活性，而将9e中的苯乙炔基团替换为9k中的3-（丙-1-炔-1-基）吡唑并[1,5-a]嘧啶基团则显示出相当的抗增殖活性，IC50值为1.9 nM。结果表明，苯乙炔基团可以被双杂环乙炔基团替代，同时保持强大的抗增殖活性，尽管药物特性可能不太理想。SAR研究表明，R1位置可以耐受广泛的亲水基团替代。表2展示了化合物中R2、R3和R4位置的结构关系对活性的影响。在化合物9e的R2位置引入氟原子得到化合物9l，其抗增殖活性略有下降，IC50值为4.8 nM。然而，当引入更大的取代基，如化合物9m中的甲氧基和化合物9n中的氰基时，抗增殖活性显著降低。这种活性下降归因于这些取代基（尤其是氰基）的位阻效应，以及它们的吸电子效应进一步降低了邻近脲基团的碱性，削弱了与FLT3残基Glu661的氢键作用，最终降低了抗增殖活性。在R3位置也观察到了类似的趋势，如化合物9p和9q所示，它们的IC50值分别为426.4 nM和25.5 nM，表明在R3位置引入大取代基是不被允许的。相比之下，R4位置对不同取代基的耐受性更强，如化合物9r至9v所示，它们均表现出较强的抗增殖活性。总结来说，对R2、R3和R4位置的优化研究表明，在R2和R3位置引入不同的取代基会导致抗增殖活性降低，而R4位置则能够耐受多种不同的取代基。随后，研究者对几种具有良好抗增殖活性的化合物进行了药代动力学（PK）性质的评估，这些化合物在大鼠中口服给药（5 mg/kg）后，其血浆中的半衰期（T1/2）、清除率（CL）、曲线下面积（AUClast）和生物利用度（F%）等参数被测定（见表3）。其中，化合物9e和9o表现出了相似的血浆半衰期（分别为4.45小时和5.86小时），较低的清除率（分别为6.67 mL/min/kg和4.83 mL/min/kg），更好的曲线下面积（分别为8313 h•ng/mL和11346 h•ng/mL），以及更高的生物利用度（分别为67.9%和69.3%），这些参数与Quizartinib（T1/2 = 5.22小时，CL = 7.33 mL/min/kg，AUClast = 6321 h•ng/mL，F% = 57.6%）相比，显示出更优异的药代动力学特性。特别值得注意的是，在30 μM的浓度下，化合物9e对hERG离子通道的阻断作用较弱（抑制率为22.78%），低于化合物9o（抑制率为36.3%）。综合这些结果，表明化合物9e在大鼠中具有出色的药代动力学特性，并且具有较低的hERG毒性潜在风险。图片来源：ACS03In vitro In Vivo体内外评价①化合物9e在小鼠、犬和猴体内的药代动力学（PK）特性研究研究者还对化合物9e在小鼠、犬和猴体内的药代动力学（PK）特性进行了研究，这些动物分别通过静脉注射（IV）和口服（PO）的方式给药。如表4所示，化合物9e在这些动物体内表现出低清除率（CL分别为18.9、11.3和1.35 mL/min/kg）、适中的半衰期（T1/2分别为1.73、7.41和8.94小时）、相对较低的分布容积（Vss分别为1.36、5.08和0.996 L/kg），以及较高的口服生物利用度（F%分别为50.3%、71.91%和20.05%）。这些结果表明，化合物9e具有良好的药代动力学特性，支持对其进一步开展体内外研究。图片来源：ACS②在多种人类肿瘤细胞系中评估化合物9e的选择性基于上述结果，研究者进一步在多种人类肿瘤细胞系中评估了化合物9e的选择性（见表5）。结果显示，化合物9e对内源性表达FLT3-ITD的MV-4-11和MOLM-13细胞表现出显著的选择性和抗增殖活性；然而，对于不表达FLT3-ITD的细胞系（如RS4;11、HL-60、MOLT-4、RPMI8226和K562），其抗增殖效果极小或不存在。为了进一步研究化合物9e的细胞活性及其对携带FLT3-ITD-TKD二次突变细胞的抗增殖活性，研究者使用了经过基因工程改造的亲本Ba/F3细胞系以及一系列FLT3突变转化的Ba/F3细胞。如表6所示，化合物9e对Ba/F3-FLT3-ITD细胞（IC50 = 0.9 nM）以及其他携带FLT3-ITD-TKD二次突变的Ba/F3细胞（IC50 = 2.9−302 nM）表现出显著的抗增殖活性，但对亲本Ba/F3细胞无活性。这些数据表明，化合物9e是一种强效的选择性FLT3-ITD抑制剂，能够克服FLT3-ITD-TKD二次突变。此外，化合物9e还对由最常见的FLT3-TKD突变（D835Y、D835H和D835V）驱动的BaF3细胞表现出显著的抗增殖活性，其IC50值分别为5.4 nM、10.9 nM和37.4 nM。图片来源：ACS③机制探究化合物9e对FLT3-ITD突变的白血病细胞表现出良好的抗增殖活性，但对FLT3野生型细胞没有这种活性。从机制上讲，化合物9e能够诱导FLT3-ITD突变的急性髓系白血病（AML）细胞发生凋亡。为了研究这一现象，研究者用不同浓度的化合物9e（1−100 nM）处理MV-4-11细胞，并通过Annexin V/碘化丙啶（PI）染色来评估细胞凋亡情况。如图3A和B所示，化合物9e以剂量依赖的方式诱导MV-4-11细胞凋亡。此外，化合物9e还能有效阻断FLT3信号通路。这一现象通过用化合物9e处理MV-4-11细胞2小时，并利用Western blotting分析FLT3及其下游信号蛋白（ERK、AKT和STAT5）的磷酸化状态来研究。如图3C所示，化合物9e以剂量依赖的方式抑制了FLT3、ERK、AKT和STAT5的磷酸化，而没有影响它们的总蛋白水平。综合这些结果表明，化合物9e能够强烈诱导FLT3-ITD突变的AML细胞凋亡，并抑制FLT3激酶活性及其下游信号蛋白。结果表明，化合物9e在MV-4-11细胞中诱导的凋亡效应是通过抑制FLT3信号通路介导的。图片来源：ACS④激酶家族选择性鉴于化合物9e在体外展现出的特性，包括对FLT3-ITD激酶的强效抑制、对FLT3-ITD阳性AML细胞的显著抗增殖活性以及良好的药代动力学（PK）特性，研究者进一步对其激酶选择性进行了评估。在对414种人类激酶的单浓度（1 μM）测试中，结果显示化合物9e仅对其中12种激酶表现出超过80%的抑制率（见图4A和表S1），对FLT3-ITD激酶的抑制尤为显著，其IC50值为15.1 nM（见图4B）。值得注意的是，与其它FLT3抑制剂常见的非靶标激酶KIT相比，化合物9e对其抑制活性极低，IC50值高达1790 nM。这些结果凸显了化合物9e作为一种高选择性、强效的FLT3-ITD抑制剂的潜力。图片来源：ACS⑤结合模式探究通过分子对接模拟研究了化合物9e与FLT3激酶的结合情况。结果显示，化合物9e与FLT3激酶在DFG-out状态下具有与Quizartinib相似的ATP结合口袋（见图5）。研究发现，化合物9e与FLT3激酶之间的关键结合相互作用包括：化合物9e的脲基团的NH和C=O分别与FLT3激酶的Glu661和Asp829残基形成的两个氢键。此外，化合物9e的苯基团与FLT3激酶的芳香残基Phe691和Phe830之间发生了π-π堆积作用。化合物9e的叔丁基团与FLT3激酶的疏水口袋（包括Met665、Leu802、His809和Ile827残基）相互作用，而其3-吗啉丙氧基团则与FLT3激酶的溶剂可及区域相互作用。值得注意的是，化合物9e的苯基团并未与铰链区的Cys694残基形成经典的氢键，这表明其不太可能与其他激酶的铰链区形成氢键相互作用，这也与化合物9e相比其他FLT3抑制剂具有更少的非靶向效应以及更高的选择性相一致。图片来源：ACS⑥体内药效学与药动学化合物9e对主要的CYP450酶（包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4）没有显著的抑制作用，其IC50值均大于33.3 μM。此外，研究还考察了化合物9e在三位供体的人类肝细胞中诱导CYP亚型mRNA表达和活性的潜力，结果显示诱导因子小于2，且未观察到浓度依赖性，这表明化合物9e可能不会因代谢酶引起显著的药物相互作用，从而限制其临床应用。为了探究化合物9e在体内的抗肿瘤效果，研究者将人类MV-4-11 AML细胞（携带FLT3-ITD）植入NOD/SCID小鼠体内，并让这些小鼠口服20 mg/kg/天的化合物9e（见图6A）。经过8天的治疗，小鼠的肿瘤显著缩小了85.4%，而接受阳性对照药物Quizartinib（相同剂量）的小鼠肿瘤缩小了88.6%，且两组小鼠的体重没有显著变化（见图6A）。在治疗停止后的7天内，未观察到肿瘤反弹。随后，研究者在MV-4-11异种移植肿瘤模型中对化合物9e进行了剂量递增研究（见图6B）。荷瘤小鼠每天口服一次化合物9e，连续21天，并在之后的31天内监测肿瘤大小。结果显示，接受1.5 mg/kg或4.5 mg/kg剂量的化合物9e治疗的小鼠，肿瘤迅速且几乎完全消失，在31天的后续观察期内未发现肿瘤反弹（见图6B）。此外，未观察到体重减轻或其他毒性迹象。4.5 mg/kg和20 mg/kg的高剂量与1.5 mg/kg剂量方案相比，显示出相似的治疗效果，表明在MV-4-11异种移植肿瘤模型中，1.5 mg/kg剂量方案即可达到最佳治疗效果。在MOLM-13异种移植肿瘤模型中，化合物9e在0.5 mg/kg、1.5 mg/kg和4.5 mg/kg剂量下分别实现了39%、52%和94%的肿瘤生长抑制（TGI）（见图6C）。当化合物9e与阿糖胞苷（Ara-C，50 mg/kg）联合使用时，在同一MOLM-13异种移植肿瘤模型中，单独使用Ara-C的TGI为36%，而Ara-C与化合物9e（1.5 mg/kg/天）联合使用的TGI为80%，这进一步证实了化合物9e作为联合治疗药物的显著疗效。这些结果进一步支持了化合物9e的强抗肿瘤效果和低毒性。随后，研究者对接受化合物9e治疗、携带MV-4-11异种移植肿瘤的小鼠的血浆和肿瘤组织进行了检查，以探索化合物9e在体内的药代动力学（PK）和药效学（PD）特性。在PK特性方面，化合物9e在所有剂量下均在1小时内被吸收至血浆中。在单次口服0.5 mg/kg、1.5 mg/kg和4.5 mg/kg的化合物9e后，血浆中的Cmax和AUC0−t值分别为20.5 ng/mL、52.8 ng/mL和199 ng/mL，以及58.9 ng·h/mL、208 ng·h/mL和908 ng·h/mL，血浆和肿瘤组织显示出相似的特性（见图6D、E，表7）。值得注意的是，化合物9e在肿瘤组织中富集。结果表明，接受化合物9e治疗的小鼠血浆和肿瘤组织中的化合物9e浓度呈剂量依赖性，并且彼此之间有很好的相关性。在PD特性方面，以4.5 mg/kg的剂量给药3小时后，化合物9e实现了对FLT3和STAT5磷酸化的完全抑制，并且这种抑制效果可持续长达7小时（见图6F）。图片来源：ACS总结代表性化合物9e在激酶实验中展现出对FLT3-ITD的高抑制活性，IC50值为15.1 nM，并且对携带FLT3-ITD突变的MV-4-11和MOLM-13 AML细胞具有显著的抗增殖活性，IC50值分别为1.5 nM和1.4 nM。这些抑制活性与MV-4-11细胞中FLT3及其下游信号蛋白磷酸化的抑制密切相关。此外，化合物9e对其他非FLT3-ITD突变细胞无抗增殖活性，表明其具有较宽的安全窗口。化合物9e还表现出显著的激酶选择性，并能有效抑制由FLT3-ITD-TKD二次突变驱动的各种Ba/F3细胞的增殖，IC50值在2.9−302 nM之间。通过Annexin V/PI染色和Western blotting实验，研究者发现化合物9e以剂量依赖的方式诱导MV-4-11细胞凋亡，并通过抑制FLT3信号通路实现这一效果。分子对接模拟结果表明，化合物9e与FLT3激酶的结合模式与Quizartinib相似。此外，化合物9e在小鼠、大鼠、猴和犬中展现出良好的药代动力学特性，具有低清除率和分布容积。在NOD/SCID小鼠的MV-4-11（1.5 mg/kg，每日一次，肿瘤生长抑制[TGI] = 193.5%）和MOLM-13（4.5 mg/kg，每日一次，TGI = 94%）异种移植肿瘤模型中，化合物9e显示出显著的体内抗肿瘤效果。化合物9e的抗肿瘤效果呈剂量依赖性，且在血浆和肿瘤组织中的浓度与剂量密切相关。此外，化合物9e与阿糖胞苷（Ara-C）联合使用在MOLM-13异种移植肿瘤模型中增强了抗肿瘤活性。综合体外和体内研究结果，化合物9e被认为是一种有潜力的FLT3-ITD阳性AML治疗药物。化合物9e（Clifutinib）已在I期临床试验（NCT04827069）中显示出可管理的安全性，并已进入III期临床试验（NCT05586074），用于治疗复发/难治性FLT3-ITD阳性AML，相关数据即将公布。参考来源：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c03023 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓