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香港 2024年9月13日 /美通社/ -- 亚洲最大的中医健康产品博览会及中医学会议"中国香港ICMCM（International Conference of the Modernization of Chinese Medicine & H ealth Products）"于上月在中国香港会展中心圆满落下帷幕。在当天的会议上，KGC人参公社正官庄上海研发中心与中国中医学院Chunhui Zhao教授团队发表了有关红参抗氧化活性的共同研究成果，使红参备受瞩目。此外，中国康奥研究中心（研究负责人Yi Yang）也发表相关研究成果，研究显示，服用红参能够有效增强免疫力，并具有抗病毒效果。 亚洲最大的中医学会议“中国香港ICMCM”发布相关成果 博览会期间（8/15~8/16）还单独召开了中医学会议，中国国内外主要政府机构、学会、大学教授、研究员等人士参会，发表了有关健康原料、健康食品和新医药等领域的学术成果，其中包括针对"红参"抗氧化、抗病毒及增强免疫力功效进行的科研成果，使得红参备受瞩目。 " 正官庄 红参 " 被中 国 最大的 会 员 制超市 " 山姆 会 员 商店 " 评为 下半年有望 热卖 的 产 品 另外，在中国最大的会员制超市"山姆会员商店"的健康食品类目中，正官庄的红参产品十分畅销，备受中国消费者好评。"正官庄红参"被中国最大的会员制超市"山姆会员商店"评为下半年有望热卖的健康食品。 含有 红参 和 维 生素 C 等 营养 元素的 " 清 爽 红参 粉 " 在中 国 最大的 电 子商 务 平台 " 天猫 " 问 市 正官庄于9月4日在中国最大的电子商务平台"天猫"推出了可以海外直购的正官庄"清爽红参粉（Ginseng Snow Cool Stick）"产品。正官庄"清爽红参粉"中含有正官庄独家技术研发的去苦味红参、有助于护肤和排便的维生素C、苣菜粉末、木糖醇等辅料，为需要提神的下午时间注入活力。此外，产品采用"雪融"工艺，推出了入口即溶的清爽蜜桃味，味道清清爽爽，更加适合年轻人的口味和喜好。 另外，KGC人参公社正官庄正通过中国研发中心以科学数据为根据，宣传红参的功效和优秀成分，并对红参的功效进行多项研究，不断开发符合中国消费者需求的定制型产品，加速红参的国际化步伐。

摘要：在工业生物过程中，微生物代谢决定了产物产量，因此，我们对其控制的能力具有巨大的潜力，可以帮助我们朝着基于生物的经济方向发展。多组学数据的快速发展加速了我们对复杂代谢调控机制的系统性理解，这使我们能够开发出操纵它们的工具。在过去几年中，基于机器学习的代谢建模、源自成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的合成生物学工具，以及合成遗传电路已被广泛用于控制微生物的代谢、操纵基因表达，并构建用于生物生产的合成途径。本综述描述了代谢控制的最新发展，并着重讨论了代谢工程策略的趋势和挑战。 1.引言 工业感兴趣的化合物可以通过那些自然合成它们的微生物进行生物制造，但通常野生型菌株的生产水平较低。因此，通常需要进行代谢工程来优化通量，最终优化生物过程。尽管在某些情况下，基因的删除、替代或添加可能足以增加化合物的积累，但在大多数情况下，代谢的复杂性及其调控需要进一步设计。为了实现所需的代谢控制，迄今为止已经开发了一系列复杂的工具。在现有的多样化方法中，本文回顾了在过去几年中证明成功的三个领域：基于机器学习的模型、成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）工具和遗传电路。这三个领域特别重要，因为它们在克服开发高效细胞工厂的一些当前挑战方面具有潜力，例如我们对代谢调控的有限理解、菌株工程技术的局限性以及缺乏创建具有所需行为的新调控网络的能力。为了预测生物功能的适当控制，全细胞代谢模型和机器学习在我们缺乏实验数据时帮助我们更好地理解微生物生物过程，并指导了工程策略。此外，一旦在计算机中确定了所需的遗传靶标，就必须操纵微生物以优化它们的性能。这可以通过控制合成调控网络的机制来实现，这些网络也被称为遗传电路。这些电路根据应用的不同呈现不同程度的复杂性，其中一些设计了复杂的动态以优化目标化合物的合成。合成遗传电路的优势在于它们是可编程和自主的。它们的模块化特性赋予了它们稳定性和可预测性。结果，它们已经为生物生产、生物诊断、微生物群落调控和生物限制等不同领域做出了贡献。近年来，基于CRISPR的工具已成为调节代谢的首选，无论是独立使用还是作为遗传电路的一部分。CRISPR最初是作为一种原核生物免疫机制被发现的，它针对潜在有害的外源DNA或RNA进行靶向以使其沉默并避免损伤。这一发现后来被应用为DNA编辑技术，自那以后，它已成为生物技术中最强大和使用最广泛的工具之一。其作用机制涉及一种内切酶，通常是Cas12（也称为Cpf1）或Cas9。这些核酸酶在引导RNA（gRNA）的引导下引入双链断裂（DSB），该RNA靶向特定序列。随后的修复可以通过内源机制解决。此外，可以使用Cas12或Cas9的核酸酶缺乏版本来执行CRISPRa（激活）和CRISPRi（抑制），这些技术分别上调或下调基因表达。在这篇综述中，我们总结了机器学习在与代谢模型相关的当前进展，合成遗传电路领域的发展，以及使用CRISPR技术来控制代谢的情况。 2.基于机器学习的代谢建模 随着组学技术的发展，代谢模型不再局限于简单的基因-蛋白质-反应相互作用。基于约束的建模可以整合其他因素，如热力学、动态、基因表达矩阵、环境和遗传关系以及全细胞模型的代谢调控。机器学习的使用有潜力促进多组学数据分析和构建先进的代谢网络模型。在本文的这一部分，我们总结了机器学习在代谢建模中的应用。 2.1.模型驱动的生产改进 基于机器学习的代谢模型预测可以帮助识别目标基因，以改善代谢产物的生产，这在木糖醇的生产中已经得到证明（图1a和表1）。另一个例子是，两个机器学习算法的自动推荐工具（ART）和TeselaGen EVOLVE的训练集由开发的高通量生物传感器提供。然后，这些数据与基因组规模的代谢模型结合使用，用于预测生产色氨酸的最佳代谢途径。最终结果表明，这种混合方法分别将色氨酸的滴度和生产力提高了74%和43%。在另一项工作中，通过贝叶斯因子模型分析组学数据以设计代谢途径也是增加生物合成鼠李糖脂的有效选择。预测基因修饰菌株在不同生长条件下的表型对于适当开发代谢模型至关重要。作为提高目标产品产量的另一个例子，多组学模型和分析（MOMA）平台成功识别了八种不同菌株的关键代谢步骤，并导致异戊烯醇的产量几乎翻了一番，绝对滴度为920毫克/升（图1c）。 图1.基于机器学习的代谢模型的典型应用。(a) 模型驱动的生产促进。在大肠杆菌K-12 MG1655中，使用深度神经网络（DNN）和差分搜索算法（DSA）的新方法来预测最佳的基因敲除途径，以增加木糖醇产量。(b) 提高模型预测准确性。在29种细菌物种中，使用自动化代谢模型集成驱动的统计学习消除不确定性（AMMEDEUS）方法来改进基因重要性预测。(c) 探索潜在的代谢途径。在酿酒酵母中，使用机器学习方法来协调经验性交互数据和模型预测。 2.2.提高模型预测准确性 一旦建立了代谢模型，提高其准确性就成为一个主要挑战（表1）。为此，开发了自动代谢模型集成驱动（AMMEDEUS），它提供了在不同细菌中最小化模型预测和实验数据之间误差的能力（图1b）。机器学习算法，如正则化多项式逻辑回归（RMLR）、主要基本模式分析（PEMA）和遗传算法（GA），可以用来全面探索影响细胞代谢的途径，因此有潜力用于提高菌株性能。重要的是，机器学习一直在积极部署，将代谢模型与组学数据如基因组学、转录组学和蛋白质组学整合起来，这可以用于表征细胞生长和代谢。在大肠杆菌K-12 MG1665中，引入了一种通量耦合的代谢子网络特征，以使用基于向量机器的学习方法提高必需基因的预测准确性。按照这种方法，必需响应基因对的预测准确性提高到了94.28%。此外，开发了一个结合通量组学和转录组学数据的多视图神经网络，其预测准确性通过使用27个模型与机器学习方法进行了验证。最终，这个神经网络在同时分析基因调控与代谢通量之间的关系的同时，提高了模型的预测准确性。 2.3.探索潜在的代谢生物合成途径 通常，合成目标产品的代谢途径是未知的。探索潜在的代谢途径需要大量的组学数据和完善的平台分析。在这些情况下，代谢模型已被证明对预测可行的合成路线很有用。MFlux平台是通过非稳态通量分布分析构建的，它可以合理地基于细菌种类、底物类型、生长速率、氧气条件和培养方法预测通量组，以精确揭示代谢网络中未知的相互关系。此外，主要代谢通量模式分析（PMFA）可以通过结合代谢通量分析和主成分分析来解决在未定义的代谢网络中基因表达或通量数据的差异。实验结果表明，PMFA可以通过分析酿酒酵母代谢网络的培养数据，准确识别六条线粒体途径对氧气变化的响应（表1）。为了探索基因表达数据和代谢表型之间的未知信息，基于深度学习的基因表达潜在空间编码器（GEESE）训练β-变分自编码器（β-VAE），使用深度生成模型以识别未知环境中的代谢数据。为了探索基因之间的相互作用，机器学习方法（随机森林和逻辑回归，层次聚类（HC））被用来分析基因表观遗传相互作用谱。通过将遗传相互作用数据与模型融合，发现酿酒酵母中NAD生物合成途径的一个错误注释（图1c）。 3.用于控制代谢的CRISPR衍生合成生物学工具 CRISPR在代谢工程中的应用非常广泛，包括原核生物和真核生物，如细菌、酵母和丝状真菌。此外，CRISPR还可以帮助控制哺乳动物细胞培养的行为或通过工程植物细胞来提高作物的性能。除了用于创建删除、替代或点突变外，CRISPR技术还扩展了进一步的应用。例如，由于其能够在基因组中的特定位置引入双链断裂（DSB），CRISPR-Cas9已被用于低效率编辑过程中的反选择。这种效率可以通过将CRISPR与用于删除或替代的先前协议或与ssDNA重组工具如MAGE结合来提高。此外，CRISPR可以多路复用，实现多个基因的同时操纵。当需要同时编辑或调节多个基因以允许复杂的途径重构时，这一点特别有趣。多路复用是通过控制多个gRNA的表达，使用不同的技术处理gRNA阵列，如RNase III、核糖酶或内切酶Cys4来完成的。这些策略也已适应于广泛的微生物。 3.1.CRISPRi和CRISPRa Cas蛋白的额外修改扩大了CRISPR作为转录抑制工具CRISPRi或激活机制CRISPRa的可能性。CRISPRi和CRISPRa都基于使用去活化的Cas蛋白形式，通过移除核酸酶活性的点突变实现。CRISPRa允许在激活结构域结合到Cas蛋白时激活基因。例如，在原核生物中，当Cas9与RNAP omega亚基或噬菌体激活蛋白AsiA融合时，可以完成。实现CRISPRa的另一种可能性是将RNA招募支架结合到gRNA上，以诱导sigma54和sigma70启动子的激活。对于真核生物，有类似的CRISPRa策略，通过向Cas9添加融合蛋白，将其他蛋白连接到gRNA上，或同时使用这两种方法。CRISPRi允许通过将去活化的Cas蛋白靶向基因的启动子区域或其编码序列来抑制基因表达，这种效应可以通过融合抑制结构域来增强。它们的作用是阻止RNA聚合酶，从而减少基因表达。CRISPRi提供了调节选定基因表达的可能性，但也有助于基因组成像、DNA环化或表观遗传修饰。使用CRISPRi的条件性基因沉默允许研究某些代谢基因的功能，这些基因在完全删除时会变得有害。因此，它被用作代谢重构的重要工具。此外，可诱导的CRISPRi机制可用于实现通量的动态调节。为了提高Synechocystis sp. PCC 6803中的乳酸产量，使用CRISPRi靶向gltA基因，以将生长与生产解耦，因为在生长阶段的CO2摄取妨碍了生产。使用这种策略，可以交替这两个阶段，将乳酸积累增加到1克/升。这种使用CRISPRi的解耦策略可以有益于生物过程的可扩展性。在大肠杆菌中，特别是在静止期，动态控制基因gltA、zwf和fabI，提高了可扩展性的稳健性，并分别将木糖醇和柠檬酸产量增加到200克/升和125克/升。另一种可能性是将这种CRISPRi的条件性诱导转换为自主开关，让微生物自我调节其活性以获得最佳性能。例如，使用静止期启动子、蛋白质降解标签和CRISPRi技术，可以根据大肠杆菌的生长阶段抑制参与生产莽草酸和谷氨酸的基因，将其产量提高到21克/升和26克/升。 3.2.机器学习、组学数据和模型补充CRISPRi应用 gRNA的特异性决定了目标的成功率。这种特异性影响其识别互补序列的效率以及产生不期望的非目标效应的能力。为了平衡这两个参数，数据分析和机器学习已经帮助设计gRNA，专注于产生R环的能级（Nmin），R环是由gRNA及其目标形成的结构，这对于Cas蛋白的识别是必要的。因此，可以预测并提高gRNA的靶向和非靶向结合的概率（图2）。 图2.CRISPR技术在代谢工程中的应用。(a) gRNA和待编辑或沉默的目标形成的R环的表示，该环被Cas蛋白识别。(b) 将组学数据、模型、机器学习和CRISPR整合在一起，以实现有效控制代谢功能的提议工作流程。(c) CRISPRi如何解耦生长与生物生产，以实现过程的正确放大。 将组学数据与CRISPRi结合使用，已经实现了途径的过渡性调节，以增加某种化合物的产量或研究通量。例如，结合蛋白质组分析和选择性基因沉默，研究了Amycolatopsis balhimycina的抗生素生产。在抗生素生产期间和之前的蛋白质组分析比较蛋白质谱，揭示了可以抑制以重定向糖代谢至生产balhimycin的基因。除了用于生物生产优化外，多组学数据结合CRISPRi还被用于条件性基因沉默，研究大肠杆菌的一般代谢景观。对30株诱导CRISPRi的菌株的研究允许表征代谢网络中的稳健性和适应性缓冲。 此外，模型的使用可以帮助我们选择更好的目标基因，以增加产量。使用核心动力学模型，预测某些基因会影响铜绿假单胞菌中乙酰辅酶A的产生。通过使用CRISPRi对accA、accC和gltA进行条件性沉默后，与野生型相比，乙酰辅酶A含量增加了八倍。后来，工程菌株被用于生物反应器中合成聚(3-羟基丁酸)，产量比野生型增加了五倍。 4.合成遗传电路实现的可编程代谢控制 基于从电气工程领域借鉴的概念（如布尔逻辑门），合成遗传电路可以实现对细胞代谢的可编程、精细和复杂控制。 4.1.合成遗传电路的组成和工作原理 在合成遗传电路中，输入信号首先由生物传感器检测，然后进行信息计算和处理。之后，执行器产生输出信号以执行所需的生物学功能（图3a）。一方面，开环电路，由环境因素诱导，可以是手动控制的，如光和温度，或自发控制的，如细胞密度、氧气和pH的变化，可用于控制细胞代谢和形态（图3b）。另一方面，配备有响应中间代谢物或最终产物的生物传感器的闭环电路，可以对细胞代谢和生长进行自主和连续的反馈控制（图3b）。 图3.合成遗传电路实现的可编程代谢控制。(a) 用于代谢调控的合成遗传电路的典型结构。(b) 开环遗传电路与闭环遗传电路的比较。(c) 基于转录因子的合成遗传电路的设计和构建。 在执行所需的生物学功能之前，获取的信号需要通过分层逻辑操作电路进行处理和计算，这些电路由在DNA、转录、转录后或蛋白质水平上起作用的调节器组成。例如，借助已表征的抑制子基础非门，实现了遗传电路设计的自动化，从而允许构建作为数字显示器的复杂电路。另一个例子是，从工程激活剂-伴侣对生成了一组正交与门。使用这些转录逻辑门，可以连接多种输入，包括原料、溶解氧和副产物积累（图3c）。除了转录因子外，其他调节机制，包括转录后小RNA、反义转录和CRISPRi/a，也已连接到逻辑转导中。CRISPRi提供了一种简单而优雅的方法，可以制造如切换开关、振荡器和非相干前馈环等遗传装置，这证明了其实现复杂应用的潜力。此外，如基于蛋白酶的可控蛋白质降解等蛋白质水平调节，允许更快的动力学，并确保电路的及时响应。 4.2.合成遗传电路在微生物细胞工厂中的应用 合成遗传电路可用于控制改变和优化代谢通量的基因。通过使用代谢动态途径调节、生长和形态控制或群体控制，可以实现改进的微生物细胞工厂。 微生物工厂设计的一个关键挑战是平衡代谢通量的分布，以避免不需要的代谢物积累和生长耗尽。为了实现这一目标，采用了动态途径调节策略。例如，构建了由代谢响应生物传感器和基于CRISPRi的非门组成的双功能闭环反馈电路，目的是上调所需的合成途径并下调竞争反应。此外，这些电路成功地用于实现细胞内代谢通量的自主调节和动态控制，N-乙酰氨基葡萄糖滴度在15-L连续搅拌生物反应器中从81.7 g/L增加到131.6 g/L。 细胞的寿命也可以通过设计合成遗传电路来重新编程，以调节如细胞大小、代时间、耐压性等参数。例如，为了扩大大肠杆菌的细胞大小以增加聚乳酸-3-羟基丁酸的积累能力，通过开环双输出重组酶基础状态机（一个存在于多种状态中的系统，其中状态转换由输入控制）来工程化大肠杆菌的复制寿命。此外，他们还构建了一个开环多输出重组酶基础状态机，以改变大肠杆菌的顺序寿命，导致丁酸的最高滴度（29.8 g/L）。 抗压力电路也可以引入，以提高工程菌株在生产过程中的稳定性。例如，使用碱响应和酸响应启动子构建了自响应pH可调电路。此外，还提出了闭环成瘾电路，能够通过将生长相关基因和最终产物生物传感器联系起来，将生长和生产联系起来，以避免群体表型异质性和负面突变积累。例如，使用甲戊酸生物传感器来控制两个非条件必需基因的表达，并通过95代培养保留了高产量的甲戊酸生产，这相当于200立方米工业规模生产。此外，为了防止工程微生物泄漏到环境中，已经设计并引入了生物限制系统，这些系统可以通过电路阻止细胞生长。总之，通过这些遗传电路重新编程的代谢不仅赋予了微生物细胞工厂高效的生产能力，而且还确保了它们的稳健性、稳定性和安全性。 5.结论和未来展望 合成生物学的进步有助于代谢控制策略，并加速了高效微生物细胞工厂的发展。在这篇综述中，回顾了工程细胞代谢调控的最新发现，重点关注三个方面：代谢模型、CRISPR技术和遗传电路。虽然上述方法已被用于提高产量，但需要更多的努力来扩大它们的应用。我们仍然需要加深对生物系统的理解，并提高我们随意调节代谢的能力。我们期望工业微生物的全细胞模型的发展将使微生物细胞工厂的细胞内资源分配优化，最终提高生物生产。此外，人们很容易忽视，常用的基于CRISPR的代谢控制过程由于其复杂性需要精心调试。例如，可以在基于dCas9的电路上实施负反馈，以避免由于多个sgRNA之间的竞争导致的CRISPRi电路过载。此外，将异源合成遗传电路引入细胞底盘产生的负担不可忽视，需要研究和克服。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。