Lefitolimod

摘要：近几十年来，疫苗一直是预防病原体传播和癌症的非凡资源。即使它们可以由单一抗原形成，但添加一个或多个佐剂是增强免疫信号对抗原反应的关键，从而加速并增加保护效果的持续时间和效力。它们的使用对于脆弱人群，如老年人或免疫功能低下的人尤其重要。尽管佐剂非常重要，但只是在过去的四十年里，对新型佐剂的寻找才有所增加，发现了新的免疫增强剂和免疫调节剂类别。由于涉及免疫信号激活的级联反应的复杂性，它们的作用机制仍然不甚了解，即使得益于重组技术和代谢组学，最近已经取得了显著的发现。本综述着重于研究中的佐剂类别、近期作用机制研究，以及纳米输送系统和可以化学操纵以创造新型小分子佐剂的新型佐剂类别。 1.引言 佐剂——根据该词的拉丁语词源（adjuvare，意为“帮助”）——被定义为添加到疫苗中以增强免疫系统对抗原的反应并延长其持续时间的物质。在疫苗开发中使用佐剂利用了这些物质可以提供的许多好处，例如减少每次接种剂量所需的抗原量和加强接种的频率，或通过延长其半衰期改善抗原成分的稳定性，从而增强其免疫原性。佐剂可以根据其作用机制、化学性质或来源（合成、天然、内源性）进行分类。佐剂超级家族包括许多不同的物质，特别是能够激活或增强免疫信号或传递系统的小分子或大分子。免疫增强剂是能够在成人或脆弱人群中激活免疫信号的化合物；其中包括模式识别受体（PRRs）的激动剂，如RIG-I样受体（RLR）、干扰素基因（STING）、Toll样受体（TLR）和NOD样受体（NLRs）。传递系统是能够改善和延长疫苗保护的佐剂，如乳液和纳米制剂，类似于脂质体、病毒样颗粒和病毒体。根据所需的免疫反应类型，抗原应与适当的佐剂或佐剂组合正确配制，以获得尽可能少的副作用的最佳反应。到目前为止，已经开发出适当的配方，特别是通过结合不同的佐剂家族，尤其是铝盐与脂质体或乳液。确定适当的佐剂组合可能极为重要，目前许多临床研究正在进行中，以研究它们在不同病理情况下的疗效，特别是在癌症方面。由于佐剂的应用范围从病原体到过敏、自身免疫性疾病和癌症，需要正确理解关键机制，以便只针对特定途径，避免潜在的毒性。即使疫苗试验遵循严格的指导方针，多年来也出现了许多关于其安全性的担忧，特别是在COVID-19疫苗接种活动期间。疫苗的潜在毒性有时归因于所含佐剂。最近还对最成熟和最安全的佐剂，如铝衍生物的潜在毒性表示担忧。即使铝含量在许可的佐剂中每剂从0.8到0.125毫克不等，但近年来出现了关于神经毒性和自闭症的担忧。相比之下，其他研究表明铝的神经毒性是在长期服用后发生的，监管机构将铝在食品中的可容忍周摄入量（TWI）限制在每公斤体重1毫克。有趣的是，有时佐剂由脂质构成，如纳米制剂的脂质体，或其他内源性无风险大分子。EMA和FDA已经批准了47种疫苗，但这些制剂中包含的大多数佐剂是最早的铝佐剂类成员，或脂质体制剂。这种选择可能是由于这些佐剂类的已知耐受性，以及寻找新化合物的相关成本。事实上，近年来发现了不同类别的小分子免疫增强剂；然而，与药物一样，这些化合物需要适当的、耗时的临床前和临床试验来评估它们的疗效和安全性。在最近和最有趣的类别中，报告了几种PRR激动剂，对成人群体具有有希望的结果。最近的研究表明，能够通过线粒体应激途径激活免疫反应的小分子具有通过PRR途径激活免疫反应的效力。本综述着重于作用机制，开发的佐剂类别，特别强调可以针对的新的途径，以创建新的佐剂。 2.佐剂作用机制 尽管佐剂通常用于数十亿剂疫苗的配方中，但其作用机制仍然不甚了解。因此，深入理解作用方式和参与免疫系统对病原体反应的免疫机制是开发新佐剂的关键步骤。最近，人们非常关注更深入地理解疫苗佐剂如何刺激免疫反应。由于最近在免疫学研究方面的进展，已经有可能阐明佐剂作用的一些机制，如储存效应和细胞因子和趋化因子的释放，免疫细胞在注射部位的动员，适应性免疫反应的诱导，增加抗原免疫原性，以及抗原呈递细胞（APCs）的激活。阐明佐剂发挥作用的所有机制将提供关于自适应免疫如何由先天免疫促进的关键信息，并有助于开发新的强效疫苗。可以使用广泛因素对佐剂进行分类，包括它们的物理化学特性、起源和作用模式；最受欢迎的分类方案将疫苗佐剂分为两组，传递系统和免疫刺激剂。另一类佐剂由粘膜佐剂组成，可以作为传递载体或免疫刺激化合物，如壳聚糖及其衍生物（N-三甲基和单-N-羧甲基壳聚糖）、霍乱毒素（CT）和热敏肠毒素（LTK3和LTR72）。表1中报告了新的传递系统佐剂。传统上，传递载体仅作为免疫刺激佐剂的储存库，以激活先天免疫系统的细胞。由于现在有证据表明一些传递机制可以激活先天免疫，这种分类不再准确。事实上，传递载体佐剂既作为抗原载体，又通过激活先天免疫系统引起局部促炎反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这些现象导致先天免疫细胞的激活，导致细胞因子和趋化因子的释放，这是免疫增强剂佐剂利用的相同作用模式。免疫佐剂（表1）是通过直接刺激先天免疫系统来增强抗体产生的免疫增强剂化合物。此外，作为免疫调节剂的佐剂可以刺激特定类型的细胞因子的产生，从而增强免疫系统的反应。例如，铝盐、弗氏佐剂和CpG寡脱氧核苷酸已被报道能够诱导产生和释放一些参与调节先天和适应性免疫的细胞因子，如干扰素（IFNs）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素（IL2和IL12）。已有几种细胞因子被报道作为免疫增强剂佐剂，刺激抗原特异性血清/粘膜抗体和细胞介导的免疫。在这类物质中，最知名的细胞因子佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN、趋化因子和一些白细胞介素（IL-1, IL-2, IL-12-IL-15, IL-18）[15]。此外，免疫刺激剂对于招募免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞（DCs））、激活APCs以及疫苗在注射部位的长期积累非常有用。最近的研究将Toll样受体（TLR）与自身免疫系统联系起来，发现了TLR激活先天免疫系统导致适应性免疫和炎症反应诱导的机制，确保了持久保护。 佐剂可以作为传递系统，捕获、吸附或聚集抗原，并随时间缓慢释放它们。这种被称为"贮存效应"（图1a）的机制发生在注射部位，佐剂通过防止由于肝脏清除导致的抗原移除，增强了疫苗的半衰期，并确保了免疫系统的持续刺激，从而产生高抗体滴度。多年来，许多通过贮存效应发挥作用的佐剂被描述出来，如脂质体、乳液（油包水和水包油）、病毒体，以及脂质或聚合物纳米颗粒（NPs）。其中一些已被开发来模拟病原体膜，以运输、保存和释放抗原，并同时增强其免疫原性功能。几种类型的脂质体，如传统的脂质体、多层囊泡（MLVs）或固体核心脂质体，也通过促进贮存效应发挥作用。油包水乳液，如完全弗氏佐剂（CFA），以及一些NPs也通过确保持久免疫反应的贮存效应发挥作用。 图1. (a) 贮存效应及细胞因子和趋化因子的募集。(b) 免疫细胞的募集和炎症体的激活。 颗粒佐剂可以通过利用几种机制诱导免疫反应，例如上调细胞因子和趋化因子的释放，诱导注射部位的炎症状态，激活炎症级联反应，并招募先天免疫细胞。例如，油包水（o/w）乳液MF59和AS03刺激免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞）的募集，这些细胞将抗原和佐剂运输到更接近的淋巴结。免疫细胞在注射部位的募集诱导半胱氨酸蛋白酶的激活，导致进一步释放趋化因子（IL-18、IL-33、IL-1β），吸引其他树突细胞并延长这一现象（图1b）。此外，MF59和AS03在注射部位增加了CCR2、白细胞募集趋化因子（例如CCL2、CCL3和CCL5）以及集落刺激因子3（CSF3）的表达。同样，明矾在注射后诱导局部促炎微环境，引发补体级联反应，导致从血液流中招募免疫细胞。炎症体是先天免疫系统的重要组成部分。它们是针对病原体的有效免疫反应所必需的。当炎症体被激活时，细胞分泌促炎细胞因子，如IL-18、IL-33和IL-1β，这些细胞因子增强适应性免疫反应（图1b）。炎症体是由工作成分组成的细胞质蛋白信号通路，如富含亮氨酸的重复（LRR）C末端或DNA结合域（HIN200）、caspase-1效应物和适配蛋白ASC，这些蛋白激活炎症caspases。粒细胞、T细胞和B细胞、单核细胞、肝细胞、神经元、小胶质细胞和朗格汉斯细胞都表达炎症体，负责识别病原体并启动先天免疫反应。当炎症体被激活时，它蛋白水解裂解前caspase 1，释放活性形式，将前IL-1β和前IL-18转化为活性物种。ILs从细胞释放后，启动炎症并诱导保护免受病原体侵害的免疫反应。此外，IL-18激活淋巴细胞并刺激T细胞和B细胞的增殖，自然杀伤细胞（NKs）的活性，以及IFN-γ、TNF、IL-1和IL-2的分泌。因此，作为炎症体激活剂的佐剂是增强和维持免疫反应强度的成功策略。这些佐剂通过类似的机制激活炎症体，包括溶酶体降解、cathepsin释放和活性氧（ROS）的形成。在炎症体激活剂中，可以找到如铝盐、壳聚糖、皂素、鞭毛蛋白和合成阳离子聚合物等佐剂。铝盐诱导溶酶体损伤，诱导参与炎症体形成的cathepsin B的产生，特别是NOD样受体蛋白3（NLRP3）；活性炎症体触发caspase-1并刺激细胞因子的释放。壳聚糖和由合成阳离子聚合物制成的纳米颗粒激活NLRP3炎症体，并增强多种白细胞介素（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A和TNF）、IFN和IgG滴度的分泌，增强细胞和体液免疫反应。 佐剂可以通过一系列机制增强疫苗的免疫反应，如贮存效应和刺激先天免疫。先天免疫代表了针对病原体的第一道防线。事实上，早期识别病原体是发展适应性免疫反应的关键步骤。佐剂可以通过激活细胞模式识别受体（PRRs），识别PAMPs和损伤相关分子模式（DAMPs），刺激抗原呈递细胞（APCs）。由于在先天免疫系统中的中心作用，PRRs代表了新佐剂的战略目标。在PRRs超家族中，区分为表面和内体受体的Toll样受体（TLRs）是很有前途的佐剂目标，因为它们可以诱导信号通路，从而诱导关键转录因子的产生，如核因子-B（NF-B）。佐剂也可以用于靶向内体PRRs，如寡聚化结构域样受体（NLRs）和视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）（图2a）。定位与它们的性质密切相关；事实上，血浆TLR识别病原体蛋白和脂质，而内体受体则由核酸激活。TLR通过MyD88途径诱导NF-kB，导致促炎细胞因子的释放。基于TLR的佐剂复制了感染期间产生的PAMPs，因此可以非常有效地对抗通常诱导PRRs的病原体或疾病。尽管PRR激动剂具有出色的免疫刺激性效果，但它们作为疫苗佐剂的使用受到高制造成本的限制，这代表了未来临床应用的限制。APCs，如树突细胞（DCs），表达各种PRRs，使它们能够识别多种病原体成分。当PRRs被PAMPs激活时，它们启动复杂的信号级联反应，导致细胞因子和趋化因子的产生，包括干扰素（IFNs），增强抗原呈递能力，以及DCs向淋巴组织的迁移，在那里它们与T细胞和B淋巴细胞相互作用，启动和塑造适应性免疫反应。成熟的DCs也可以刺激naive CD4+ T细胞分化为不同的T辅助（Th）亚群（例如，Th1和Th2细胞），帮助B细胞产生抗体。几种细胞因子调节Th细胞分化；例如，如IL-12、IL-15和IL-27等细胞因子调节naive CD4+ T淋巴细胞向Th1细胞的发展。总之，Th1细胞主要响应于细胞内病原体，如病毒和一些细菌，而Th2细胞主要响应于大型细胞外寄生虫。DCs还能够刺激naive细胞毒性CD8+ T细胞成为活化的CD8+ T细胞。这种现象称为“交叉呈递”，对于诱导针对外源性抗原的强大和持久的细胞免疫，以及有效预防病毒疾病和癌症是必要的。目前尚不清楚外源性抗原是如何在DCs中处理并呈现给MHCI上的CD8+ T淋巴细胞的；然而，已经提出了两种不同的机制。在细胞质途径中，抗原通过内体囊泡进入细胞质，并被蛋白酶体降解。在囊泡途径中，抗原在溶酶体隔室中被降解，独立于蛋白酶体活性。铝、皂素和TLR佐剂可以利用这种机制。 图2. (a) 表面和内体 TLR 激活。(b) 增强抗原呈递。由主要组织相容性复合物（MHC）在抗原呈递细胞（APCs）上呈递的抗原，是激活适应性免疫的关键步骤。许多佐剂，如明矾、乳液和纳米颗粒（NPs），被认为通过"靶向"抗原到APCs，增强MHC的抗原呈递功能。迄今为止，尚不清楚佐剂增加抗原呈递的机制是否有助于适应性免疫系统的发展。例如，明矾已被证明可以增强树突细胞对抗原的摄取，以及延长抗原呈递的持续时间。抗原大小似乎在调节抗原呈递效率方面很重要。在早期内体/吞噬体中发现了大的脂质囊泡，它们增加了抗原呈递，而在晚期溶酶体中发现了较小的囊泡，它们减少了抗原呈递。 3.佐剂类型  3.1.铝盐  基于铝的佐剂（ABA）最早发现于1926年，目前是全球疫苗中最常用的佐剂。最初使用的铝佐剂是硫酸铝钾，通常称为"明矾"，通过将抗原溶液和佐剂与碱直接沉淀制备而成（明矾沉淀疫苗）。今天，抗原被吸附到预先形成的铝盐凝胶上（直接吸附），在商业制剂的标准化和可重复性方面提供了更多的优势。目前，传统使用的明矾几乎完全被类氢氧化铝（Alhydrogel?，Croda，丹麦Frederikssund）和非晶磷酸铝（AdjuPhos?，Croda，丹麦Frederikssund）所取代。两种新型佐剂是硫酸铝羟磷酸盐（AAHS），目前用于某些人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗的配方和Imject? Alum（Pierce，Rockford，美国），由非晶碳酸铝和结晶氧化镁组成。在人类疫苗接种中，ABA主要用于针对破伤风、白喉、百日咳、脊髓灰质炎、甲型和乙型肝炎以及人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗。FDA批准的含有ABA的人类疫苗列表见表2。ABA也在兽医疫苗中广泛应用，用于预防细菌、病毒和寄生虫感染。 尽管使用历史悠久，但关于ABA（铝盐佐剂）免疫刺激特性背后的机制仍需进一步阐明。最初，ABA的佐剂特性首先归因于"贮存效应"。根据这一假设，抗原颗粒从不溶性盐颗粒中缓慢释放到体内，随着时间的推移，允许抗原对免疫系统的长期暴露和强化的免疫刺激，从而产生更高的抗体滴度。然而，最近的发现挑战了这一理论，证明抗原在接种部位的保留并不是免疫反应所必需的，而是接种部位炎症的程度才是佐剂效应的解释。因此，除了作为缓释系统外，ABA对免疫刺激还有其他主要影响，如先天免疫细胞的募集和激活、炎症介质的释放以及通过诱导Th2细胞激活适应性免疫。 给药后，先天炎症细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞（DC）和单核细胞，被招募到注射部位。尽管许多免疫佐剂的活性基于Toll样受体（TLR）信号，但铝盐显然不引起基于TLR的反应。与在细胞损伤后释放到细胞质中的不溶性单体尿酸钠（MSU）晶体的尿酸类似，已经显示ABA的颗粒性质促进了巨噬细胞的吞噬作用和APCs中抗原的摄取。此外，ABA的细胞毒性诱导了热休克蛋白（如hsp70）和其他DAMPs（如MSU形式的尿酸）的分泌。NLR家族含吡啉结构域3（NLRP3）是核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族（NLR）的成员，是一种细胞质模式识别受体（PRR），在调节先天免疫信号中起着至关重要的作用。NLRP3通过钾离子外流激活，作为膜完整性的感应器。当被ATP、石棉、硅石、铝佐剂或MSU等刺激触发时，NLRP3与适配蛋白凋亡相关斑点蛋白含有CARD（ASC）和非活性前caspase-1结合形成NLRP3炎症体多聚体复合物。前caspase-1的自蛋白解剪切为活性caspase-1，将促炎细胞因子前体pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-IL-33裂解为它们的活性和分泌形式。有假设认为，铝盐可能通过直接方式激活NLRP3炎症体，通过吞噬溶酶体损伤和随后的cathepsin B释放，或者通过MSU的间接释放。除了NLRP3介导的炎症外，哨兵细胞极化为活跃的巨噬细胞和APCs，增加了吞噬体活性氧物种（ROS）的产生，吞噬体酸化干扰和通过低氧诱导转录因子-1α（HIF-1α）的细胞代谢重编程，是最近揭示的对ABA免疫刺激特性有贡献的其他机制（图3）。 图 3. 基于铝的佐剂（ABA）的效果。 哨兵细胞激活为抗原呈递细胞（APCs）对适应性反应至关重要，从而将先天免疫与适应性免疫联系起来。ABA通过主要组织相容性复合体II类（MHCII）分子增加活化树突细胞上的抗原呈递。MHCII抗原呈递位点激活CD4+ T细胞，这些细胞分化并激活B细胞，进而主要产生IgG，推动体液免疫。铝盐优先增强抗体介导的免疫反应，通过TFH细胞和IL-4信号，结果产生IgG1并诱导Th2细胞分化，这些细胞通过IgE推动嗜酸性粒细胞炎症反应。与强烈的Th2反应相比，明矾对需要Th1细胞介导保护的感染效果较差。在小鼠研究中，已证明明矾间接抑制Th1反应，原因是IL-4激活。通过Th1反应产生的淋巴因子是补体固定IgG2a抗体的基本诱导因子，因此是巨噬细胞的刺激因子。此外，先天免疫系统的细胞可以发展适应性特性（“训练免疫”），并且铝佐剂可能涉及训练免疫的诱导。然而，NLRP3炎症体和caspase-1在抗体反应诱导中的作用仍然存在争议。经过近一个世纪的使用，铝盐仍然是疫苗佐剂的里程碑，因为它们具有确立的安全性和有效性记录。ABA非常耐受，并且仅报告了一些轻微的局部反应，如注射部位疼痛、肿胀、红斑，以及罕见的肉芽肿和过敏反应，这些反映了它们通过炎症体激活、促炎介质、吞噬细胞积累和抗体产生的作用模式。在一些免疫接种对象中还描述了接触性皮炎的罕见病例，注射后头痛、关节痛和肌痛以及持续性肿胀。有关铝佐剂长期毒性的辩论引起了广泛关注，包括如阿尔茨海默病（AD）、慢性自身免疫和多发性硬化症等影响。由佐剂引起的自身免疫综合征（ASIA）指的是一组不良效应，包括海湾战争综合征、巨噬细胞性肌筋膜炎、硅肺症和与佐剂暴露相关的接种后现象。此外，由于铝离子在AD的发病机制中被牵连，人们对ABA的生物持久性和潜在神经毒性提出了担忧，但这种相关性从未被证明。尽管需要进一步的知识来更新和确认ABA的安全概况，但作为佐剂的铝盐的风险-效益概况仍然极其积极，并确认它们作为疫苗佐剂的黄金标准。 3.2.STING激动剂佐剂 环状GMP-AMP合酶/干扰素基因刺激因子（cGAS/STING）途径是先天免疫系统胞质模式识别受体（PRRs）网络的一部分，监测细胞质以感知危险刺激。途径的刺激激活下游的核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子3（IRF3），增加I型干扰素（IFN-1）和其他促炎细胞因子的转录，从而增强抗原呈递和免疫反应。cGAS/STING在免疫调节中的关键作用使其成为免疫疗法的重要靶点，特别是与癌症相关的，并且是使用STING激动剂作为有前途的疫苗佐剂的理由。STING激动剂（图4）主要在肿瘤学和病毒学中应用，包括环状二核苷酸（CDNs）、非核苷小分子（NCDNs）、胞质双链DNA（dsDNA）、锰离子、可电离脂质和聚合物。如20,3-环状鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）、环状二聚鸟苷酸（c-di-GMP）或环状二聚腺苷酸（c-di-AMP）等环状二核苷酸是途径的天然激动剂，但它们由于高极性和由于外切核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPP1）酶降解导致的短半衰期，其药代动力学（PK）特性较差，大大限制了它们的使用。为了改善环状二核苷酸的PK特性，已经测试了如ADU-S100的磷酸衍生物，ENPP1抑制剂也是一个有前途的新策略。为了选择活性更好的候选物，寻找模仿CDNs和STING结合构象的刚性类似物的研究导致了一类新的激动剂，即大环桥接刺激剂（MBS），如E7766。为了克服环状二核苷酸的PK限制，研究还集中在NCDNs上，如黄酮类5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）和α-芒果苷，以及二聚酰胺苯并咪唑（diABZI）衍生物，这些在肿瘤免疫疗法和针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）方面取得了有希望的结果。 图 4. 小分子STING激动剂的二维结构 作为触发STING途径的一种方式，诱导细胞质双链DNA (dsDNA) 释放的策略也被采用，例如使用放疗、基于明矾的佐剂，以及化疗药物，如顺铂或多柔比星。无机锰被发现能激活cGAS，并通过增强第二信使cGAMP的产生，充当STING的间接激动剂。在其他激动剂类别中，我们列举了聚合物，如壳聚糖或PC7A，以及基于纳米粒子的可电离脂质。目前在临床试验中的STING激动剂总结在表3中。 cGAS/STING信号的触发因素是细胞质dsDNA，这是细胞损伤的重要标志。因此，cGAS作为直接的DNA受体，催化dsDNA转化为第二信使cGAMP，这诱导了STING的激活和寡聚化。STING寡聚体激活TANK结合激酶1 (TBK1)，它招募IRF3并通过NF-κB诱导I型干扰素刺激基因的转录。下游自噬的诱导和NLRP3炎症体的激活增加了病原体清除，并在自身免疫和炎症性疾病、衰老以及与肿瘤相关的炎症中具有重要意义。STING激动剂通常与环状二核苷酸有关，如cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们作为各种微生物的代谢产物被发现。 STING途径的激动剂能直接诱导树突细胞的成熟和MHCII分子的上调，增加抗原呈递、T细胞的启动，并通过炎症细胞因子间接促进前述效应。STING激动剂还增强适应性免疫反应，通过IgG1和IgG2的产生、脾脏生发中心的诱导以及记忆B细胞的刺激来增强体液免疫。此外，I型干扰素诱导CD4 T细胞分化为Th1和TFH细胞，显著帮助B细胞的启动，也促进CD8 T细胞的激活和增殖，这对抗击耐药肿瘤细胞很重要。通过STING刺激协调的多种免疫反应使得这一途径成为免疫疗法的一个有吸引力的靶点。尽管cGAS/STING的急性激活无疑对病原体和癌细胞有益处，但慢性激活可能导致由IFN驱动的系统性炎症，引发细胞因子风暴（细胞因子释放综合征），类似于败血症。除了可能诱发系统性炎症反应外，STING过度刺激引起的其他主要问题包括缺乏细胞和组织特异性以及淋巴细胞毒性。这些前提，加上具有挑战性的药代动力学特性，使得STING激动剂的全身给药情况复杂化，它们通常在肿瘤内给药。使用药物载体技术，如纳米粒子、基于脂质的载体和抗体至关重要，以实现更选择性的靶向，结合改善的传递和功效。尽管它们的药代动力学具有挑战性，且全身使用的疗效指数较窄，STING激动剂代表了一个非常有前途的佐剂类别，需要优化它们的制剂以进一步提高其佐剂性。 3.3.TLR配体 3.3.1.Toll样受体 市场上的大多数疫苗主要由单一佐剂组成，但通常保护性免疫反应并未达到有效使用疫苗的标准。因此，显著的Toll样受体（TLR）是先天免疫的关键组成部分，提供防御性炎症反应以抵御入侵的病原体。人类TLR包括10个成员（TLR1-10），可以跨越细胞表面（TLR1、2、4、5、6、10）或定位在内质网膜（TLR3、7、8、9）上，并参与不同PAMPs（表4）的识别。PAMPs的结合诱导TLR同二聚体（TLR3、4、5、7、8、9）或异二聚体（TLR1/2或TLR2/6）的形成，将两个toll/IL-1受体（TIR）结构域聚集在一起，允许适配蛋白MyD88（髓样分化初级反应-88）与复合物结合。TLR3是唯一结合不同适配蛋白的受体，即含有TIR结构域的适配蛋白-诱导干扰素-β（TRIF）蛋白。与其他TLR不同，TLR4信号可以通过涉及MyD88信号适配蛋白或TRIF的两条独立途径进行。一旦激活，TLR将增加免疫细胞的迁移并引发适应性免疫反应。 由于TLRs作为免疫增强剂，它们的激动剂可以用作疫苗佐剂。疫苗产生的免疫反应类型取决于由特定TLR及其适配蛋白激活的信号通路。虽然大多数TLR途径导致Th1免疫反应，TLR2诱导Th0、Th1或Th2反应，TLR3激活NF-κB途径。表1总结了疫苗配方中使用的几种TLR激动剂，TLR激动剂的结构报告在图5中，临床试验中的TLR激动剂在表5中。 3.3.2.TLR2激动剂 TLR2可以识别许多PAMPs，因为它们可以与TLR1和TLR6形成异二聚体。L-pampo是由PAM3CSK4（PAM3）、TLR1/2、聚(I:C)和TLR3构成的复杂系统，是一种有效的佐剂。它在乙型肝炎病毒（HBV）疫苗中使用，诱导细胞介导的免疫反应，增加CD4+ T细胞水平。目前，它正在作为使用RBD（受体结合域）、S1抗原和RBD-Fc作为病毒抗原的SARS-CoV-2疫苗的佐剂进行研究，已被证明能引发强烈的体液和细胞免疫反应。 TLR2识别细菌脂蛋白，因此，由细菌LPS衍生的合成脂肽作为疫苗佐剂被开发出来。MALP2（巨噬细胞激活脂肽2，图5）来源于支原体发酵，利用TLR2-MyD88信号通路激活免疫细胞。PAM2CSK4和PAM3CSK4是两种作为疫苗佐剂评估的TLR2激动剂，用于对抗利什曼病、疟疾和流感。由于它们的尺寸、化学复杂性和疏水性，TLR2激动剂通常不用于疫苗开发，即使在固相自动肽合成研究可以帮助发现新的更简单的衍生物。 图5.小分子Toll样受体激动剂的2D结构。TLR2激动剂（紫罗兰色上部） 面板）、TLR4 激动剂（青色，中间面板）、TLR 7/8 激动剂（绿色，下面板）。 3.3.3.TLR3激动剂 TLR3是内体受体，能够检测病毒dsRNA。聚(I:C)是一种结构类似于病毒RNA的佐剂。它能够诱导IFN-I和IFN-III的产生，并刺激Th1细胞因子反应。MVS途径（RIG-1和/或MDA5）的激活会导致人类毒性，因此开发了新的聚(I:C)衍生物，聚(ICLC)和聚(IC12U)。 聚(ICLC)是一种聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，能刺激干扰素的产生。它诱导炎症体和补体系统的表达，并在针对恶性疟原虫、HIV和癌症的疫苗候选中使用，显示出引发Th1反应的强能力。由于这种佐剂的高度免疫刺激性和对血清核酸酶的高抗性，设计了聚(IC12U)。这种新物质显示了尿嘧啶和鸟嘌呤残基的错配，导致毒性较低（不与MDA5结合），以及IFN-I的产生减少。 3.3.4. TLR4激动剂 TLR4通过MD-2（髓样分化因子-2）和CD14识别细菌脂多糖。LPS的免疫刺激性活性是由于脂质A区域，并且脂肪酸链的变化反映了不同的生物活性。Eritoran是一种TLR4-MD2激动剂。它是一种由脂质A衍生的合成物，其特点是含有四个脂质链，其中一个含有顺式双键。3-O-去酰基-40'-单磷酸脂质A（MPLA，图5）和葡萄糖基脂质A（GLA）表现出低致热性和强免疫增强特性。LeIF（利什曼原虫真核起始因子）和neoseptins（合成肽模拟化合物，图5）是两种非糖脂配体，它们不像LPS，但能够像天然配体一样激活TLR4。在THP-1细胞中筛选激活NF-κB途径的小分子化合物，发现了一种属于吡啶并吲哚类的特定TLR4激动剂（1Z105，图5）。1Z105被确定为安全的TLR4激动剂，其他研究目前正在进行中。TLR4可以激活一个强大的TRIF介导的细胞反应，其特征是多能CD8+/CD4+ T细胞的存在和对癌症和传染病的CTL活性增强。 3.3.5.TLR5激动剂 TLR5由多种免疫细胞表达，参与细菌鞭毛蛋白的识别。配体与TLR5的结合诱导炎症途径的激活，释放包括TNFα、IL-1β、IL-6和一氧化氮在内的炎症介质，引发Th1和Th2反应。当与抗原一起给予时，鞭毛蛋白诱导粘膜免疫反应，这对于保护免受呼吸和胃肠道感染至关重要。鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白已与PR8流感病毒（IPR8）、HA（H5N1）或禽流感病毒（AIV）H5N1抗原配方，证明它能引发强烈的免疫反应，包括IgA的产生。对鞭毛蛋白的修改导致了嵌合鞭毛蛋白或活细菌中的鞭毛蛋白抗原复合物，如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌、肠毒素大肠杆菌（ETEC）等，并在动物模型中使用。三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗正在进行临床试验阶段，其中两种针对流感病毒，一种针对鼠疫耶尔森菌。 3.3.6.TLR7/8激动剂 TLR7/8能够诱导Th1免疫反应，并产生高水平的I型干扰素、IL-12、TNF-α和IL-1β。TLR7/8和TLR9激动剂能够激活并促进cDCs（常规树突细胞）和浆细胞样树突细胞（pDCs）的克隆扩展，动员CD14+ CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。Imiquimod（R837，图5）目前已获批准并用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和日光角化病。另一种异喹啉衍生物resiquimod（R848）具有抗病毒和抗癌治疗用途，正在评估用于黑色素瘤治疗。已经开发了不同的结构相关的oxoadenine化合物，尽管需要其他临床前研究来证明它们的疗效。CL075是一种结构相关的杂环化合物，具有融合的喹啉-噻唑环。 3.3.7.TLR9激动剂 TLR9识别细菌DNA基序胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸，通过MyD88途径激活免疫系统。CpG是已被修改以防止蛋白酶降解并用作佐剂的分子基序。CpG-CDNs能在自然杀伤细胞、B细胞和pCCS中引起强烈的趋化因子、细胞因子和抗体产生，并引发强烈的Th1型免疫反应。CpG1018是一种能够引发Th1型免疫反应的寡核苷酸。CpG1018是过去20年中批准的四种新型佐剂之一。即使它的使用最初在Hepliisav-B疫苗中受到限制，但目前正在评估用于对抗黑色素瘤和SARS-CoV-2的疫苗。MGN1703属于TLR9激动剂，是一种包含CG基序并呈现线性结构的小DNA分子。它由中间的双链DNA部分构成，两侧是单链结构。它作为疫苗的佐剂在癌症疫苗中进行了测试，在那里它激活了先天和适应性免疫反应，仅有轻微或暂时的副作用。它目前正在作为免疫调节剂单独或联合用于治疗恶性肿瘤，如黑色素瘤、小细胞肺癌和结直肠癌的I/II期研究中进行评估。 3.4.CLR配体 C型凝集素受体（CLRs）是病原体和受损组织来源脂质的免疫传感器，参与激活先天和获得性免疫。免疫反应可以通过CLRs细胞信号通路和其他PRRs（如TLR）的串扰来引发，导致不同信号通路的激活和特定细胞因子的表达。CLR触发的佐剂包括Curdlan、PGA-45、海藻糖二硬脂酸酯（TDB）和海藻糖二肉豆蔻酸酯（TDM），它们诱导强烈的Th17和Th1反应。 Curdlan在铜绿假单胞菌疫苗中使用，并诱导高水平的IL-17A和CD44+ CD62L-CD69+ CD4+ TRM细胞产生。Curdlan还能够激活树突细胞（DCs）并增强基于DC的抗肿瘤免疫，因此正在评估用于抗肿瘤免疫疗法。由于Curdlan的高度疏水性，开发了部分氧化的Curdlan衍生物β-1,3-聚葡萄糖醛酸，PGA-45聚合物，它能够刺激IKK-β的磷酸化并降低磷酸化Akt的表达，表明PGA-45可以激活多种细胞表面受体，包括TLR4和dectin-1。 海藻糖-6,60-二肉豆蔻酸酯（TDM）及其合成类似物海藻糖-6,60-二硬脂酸酯（TDB），能够通过与C型凝集素受体Mincle结合来激活巨噬细胞和树突细胞。TDB在结核病亚单位疫苗的临床研究中。TDB还可以独立于Mincle发挥作用，通过PLC-γ1/钙/CaMKKβ/AMPK途径诱导小胶质细胞极化为M2表型，使这种佐剂成为治疗神经炎症性疾病的治疗剂。 3.5.RLR配体 视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）是病毒感染的传感器，诱导产生I型和III型干扰素和炎症细胞因子，激活参与先天和获得性免疫反应的信号通路。RLRs可以检测病毒和宿主RNA，导致抗病毒反应，但如果RLR途径被无控制地激活，也会导致免疫病理。聚(I:C)激活RLRs途径，因为它模仿细胞中的病毒入侵，导致MAVS-IRF3/7级联的激活和IFN-β和ISGs的产生。IFN-β的表达取决于聚(I:C)的长度；短序列在髓样细胞中诱导IFN-β表达，而长序列在成纤维细胞中诱导IFN-β表达。这意味着使用特定激动剂刺激RLR途径将导致细胞特异性IFN-β表达的诱导，特别是在成纤维细胞中，与单核细胞和巨噬细胞相比，可以赋予更强的抗病毒状态。 4.辅助佐剂和佐剂配方  市场上的大多数疫苗只包含一种佐剂，然而，保护性免疫反应通常不足以实现疫苗的有效性。为了增强疫苗的效果，开发了许多佐剂配方。佐剂和抗原可以一起传递，使用两种流行的方法之一，共价偶联或将抗原和佐剂包装在传递机制中。适当的佐剂组合选择可以导致对疫苗免疫反应的补充或协同改善。例如，AS04中的明矾和MPL的联合使用在乙型肝炎病毒（HBV）和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗中显示出比仅使用明矾盐的相同疫苗更好的免疫反应。 4.1.脂质体 脂质体是球形颗粒，可以包裹抗原和免疫刺激性分子，保护它们免受降解并将其传递给APCs。脂质体由可生物降解、生物相容、无毒的磷脂组成，允许灵活的结构修改，以实现可调节的特性，如大小、表面电荷、膜柔韧性和药物装载模式。作为疫苗佐剂传递系统（VADS）的脂质体使用带来了许多优点，如高安全性和强烈的免疫反应。市场上的脂质体配方包括Epaxal和inflixal，分别用于对抗甲型肝炎和季节性流感病毒。另一种基于脂质体的疫苗是GSK（GlaxoSmithKline）开发的Shingrix，已获得FDA批准，用于带状疱疹病毒的老年人预防。 4.2.乳液 作为疫苗佐剂开发的乳液可以分为两种主要形式，完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）。这两种佐剂都是油包水乳液，具有运输抗原和激活先天免疫系统的能力。CFA由矿物油、乳化剂和热杀死的结核分枝杆菌组成，促进免疫反应的刺激。然而，CFA可能会引起强烈、持久的局部炎症，并有在注射部位形成溃疡的潜力。IFA与CFA的成分相同，但不含有杀死的细菌M. tuberculosis。这种佐剂可以产生比没有它的相同疫苗更强大和持久的抗体反应。然而，IFA在疫苗配方中的使用受到其强烈副作用和毒性的限制，这是由高水平的非生物降解油和质量差引起的。 4.2.1.Montanide Montanide 是一个包括油包水和水包油乳液在内的大型家族，它已被用于兽医和人类疫苗中。MontanideTM 的生物可降解性质减少了与 IFA 类似物理结构的许多细胞毒性特征。在注射部位形成储存库，有助于抗原的逐渐释放，这是这种基于油的佐剂的作用机制的一部分。产生集中并防止恶化的抗原，并促进吞噬作用 。Montanide ISA 51 和 ISA 720 已在涉及癌症、艾滋病、疟疾或自身免疫疾病的疫苗的多项临床试验中使用。Montanide ISA 201 和 ISA 206 则被用于口蹄疫疫苗。 4.2.2.MF59 MF59 是一种水-油乳液佐剂，由角鲨烯组成，角鲨烯是一种生物可降解且与人体兼容的油，是人体的正常成分，在 pH 6.5 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中通过表面活性剂 Tween 80 和 Span 85 稳定，平均粒径小于 200 纳米。它首次在 1997 年在欧洲被批准用于人类疫苗（Fluad），现在已在超过 30 个国家的超过 1 亿人中使用。其作用机制类似于明矾盐，具有在注射部位的储存活性，刺激局部先天免疫反应。肌肉中 MF59 的给药激活了强大的细胞和体液免疫反应，释放 ATP 并上调细胞因子和趋化因子，这反过来促进了白细胞的募集、抗原摄取和迁移到淋巴结以激活 B 细胞和 T 细胞，结果比明矾盐更有效。MF59 具有可接受的安全性和良好的耐受性，自 1997 年以来已施用了数百万剂。 4.3.AS0佐剂系统 AS0 佐剂系统基于经典佐剂分子的组合，如明矾、乳液和脂质体。它们由葛兰素史克公司开发，以实现最大的佐剂效果和可接受的耐受性，结合免疫刺激分子，如 TLR 配体等。这些经典佐剂和免疫刺激剂的各种组合旨在针对目标人群（包括儿童、老年人和免疫功能低下的个体）的病原体个性化适应性免疫反应。 4.3.1.AS04 AS04 由 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL）组成，这是从革兰氏阴性细菌 Salmonella minnesota 分离出的脂多糖（LPS）的去毒形式，吸附在明矾盐上 。MPL 在保持较低毒性的同时，通过 TLR4 激活保留了 LPS 的免疫刺激性，当吸附在明矾上时。TLR4 在先天细胞上的信号传导介导了 AS04 的佐剂作用，与明矾的内在免疫调节特性相结合。我们可以在乙型肝炎病毒（HBV）Fendrix  和人乳头瘤病毒（HPV）Cervarix  疫苗中找到 AS04，与仅用明矾盐佐剂的相同疫苗相比，显示出更好的免疫反应。 4.3.2.AS03 AS03 是一种角鲨烯油包水乳液佐剂，与 MF59 类似，结合了表面活性剂聚山梨醇酯 80 和 α-生育酚（维生素 E），结果具有较低的反应原性并具有更好的安全性。2009 年，欧洲委员会批准了 AS03 佐剂疫苗 Pandemrix 的商业化，2013 年食品药品监督管理局授权了 AS03 佐剂流感 A（H5N1）单价疫苗 。它也用于 SARS-CoV-2 重组蛋白疫苗（CoV2 preS dTM）。α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性与 MF59 相比，促进了免疫增强反应，调节了某些细胞因子和趋化因子的表达，如 CCL2、CCL3、IL-6 和 GM-CSF。此外，AS03 通过刺激 NF-κB 激活免疫系统，这导致肌肉和引流淋巴结中细胞因子和趋化因子的释放，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03 可以促进 CD4+ T 细胞特异性免疫反应，这可能导致持久的中和抗体产生和更高水平的记忆 B 细胞 。为了增加其免疫原性，使用两种强效免疫刺激剂，QS-21（来自 Quillaja saponaria 的皂苷）和 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL），产生了 AS02。 4.3.3.AS01 AS01 佐剂是两种强效免疫刺激组分的组合，TLR4 配体也在 AS04 中使用（MPL）和分离纯化的皂苷部分（QS-21），在脂质体中配制。它用于带状疱疹疫苗 Shingrix 和疟疾疫苗 Masquirix 。临床前研究表明，QS-21 作为佐剂增强了抗体以及细胞介导的免疫反应 ，但作为疫苗中的单一组分佐剂，它的耐受性较差。在 AS01 中，脂质体中的胆固醇允许它结合 QS-21 并抑制其反应原性。MPL 通过 TLR4 激活先天免疫系统，而 QS-21 激活引流淋巴结中副皮质窦巨噬细胞（SSMs）中的 caspase 1。两种已建立的佐剂分子的结合引发了先天免疫的协同激活，结果大于独立组分的总和，激活了不是由任一组分单独触发的新途径，增加了表达 IL-2、IFNγ 和 TNF 的多能 CD4+ T 细胞。AS01 作为佐剂在带状疱疹疫苗中的使用已获批准，该疫苗用于老年人，具有高疗效，并在非洲有限的运动中实施的疟疾疫苗。 4.4.免疫刺激复合物 免疫刺激复合物是另一种具有强大佐剂活性的疫苗传递载体。它们是球形的，笼子状的自组装颗粒，大小约为 40 毫米。ISCOMs 由 Quillaja 皂苷、胆固醇、磷脂和抗原组成。没有抗原的颗粒被称为 ISCOM 基质。ISCOM 抗原可以是原生病毒的包膜蛋白、细胞膜蛋白或通过极性相互作用含有疏水域的肽 。ISCOMATRIX® 是使用与 ISCOMs 相同的材料开发出来的，但没有抗原，可以在疫苗配方中添加，使得使用更加多样化，并消除了疏水抗原的限制。树突状细胞（DCs）和 ISCOM 相互作用可以改善结合抗原的交叉呈递 。因此，有效地诱导了 CD4+ 和 CD8+ 抗原特异性 T 细胞反应。诱导细胞毒性 T 细胞、平衡的 Th1/Th2 反应和持久的抗体反应都是 ISCOM 疫苗的记录效果 。其他 ISCOM/ISCOMATRIX 疫苗已针对 HIV、HPV 和癌症利用抗原 NY-ESO-1 进行了临床试验。在所有情况下，研究都显示出良好的安全性和耐受性，以及诱导体液和细胞免疫反应。尽管具有这些特点，但由于一些皂苷在高浓度下具有毒性，因此对人类疫苗中使用 ISCOMs 的安全性问题已经阻止了其使用 。 4.5.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是与病毒大小相似的二十面体纳米颗粒（范围在20至800纳米之间），它们具有自我组装衣壳蛋白的能力。它们是非感染性颗粒，因为它们没有遗传物质。VLPs由具有重复表位的外部病毒壳组成，这些表位被免疫系统识别为非自身，并产生快速且持久的免疫反应，即使没有佐剂。它们可以通过使用不同的技术和细胞系统，如大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞或无细胞系统，由各种病毒类型生产。 历史上的VLPs制造方法包括一个称为“先组装后纯化”的多步骤方法。第一步包括衣壳蛋白在表达细胞载体内的自发组装。第二步则提供新形成颗粒的纯化。有时需要将VLPs拆解后再重新组装，以获得纯化的颗粒并提高质量。另一种VLPs的制造方法提供了使用无细胞体外组装，颠覆了传统的自我组装方法。特别是，体外系统被用作一个平台，在衣壳蛋白表达和纯化后诱导其自发组装，无需拆解新形成的VLPs。在市场上，两种重要的佐剂疫苗使用这种类型的纳米颗粒，即乙型肝炎（HBV）和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。当前的乙型肝炎疫苗是一种利用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA疫苗，包括用于预防乙型肝炎感染的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。这种疫苗已被证明至少可以提供10年的免疫力。 在HPV疫苗中，非包膜HPV病毒颗粒包含双链DNA（dsDNA）。L1和L2蛋白组成衣壳的主要和次要结构蛋白，具有二十面体对称性。酿酒酵母是目前用于表达L1蛋白的载体。VLPs和佐剂（AlP）的结合导致强烈的免疫反应和90%的宫颈癌保护。 4.6.病毒体 病毒体是一种药物传递系统，由病毒包膜和病毒或其他病原体的成分组成。它们由重组流感病毒包膜形成，包含血凝素（HA）、神经酰胺酶（NA）和磷脂，并且像VLPs一样缺乏病毒遗传物质。第一个基于病毒体的疫苗是在1975年开发的，这允许研究这种类型疫苗的有效性。自那以后，有两种疫苗已经上市，用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。 病毒体结构中HA的存在允许保持受体结合能力，增加免疫原性和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，病毒体在结合后不能在细胞中诱导感染。病毒体可以将抗原输送到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞反应，使它们成为完美的传递系统。然而，由于佐剂质量较差，病毒体在激活APCs和鼓励交叉呈递方面效果不佳。使用更强的佐剂可以克服这种固有限制。最近开发了一种基于病毒体的创新流感疫苗，结合了TLR4配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA。病毒体可以诱导强烈的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂相当。由于其极高的耐受性和安全性，这种传递系统已获得FDA批准用于人类。除了针对流感和甲型肝炎的两种基于病毒体的疫苗外，还有几种疫苗正在进行临床试验，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。 5.佐剂设计和开发的新见解 如前所述，在过去20年中，发现了新的免疫激活佐剂类别，能够增强免疫功能低下和老年人等脆弱人群的免疫反应。有几种佐剂类别可用，每种都有其自身的优势和劣势。油包水乳液等传递系统是有效且安全的系统，尽管有可能产生局部或系统性不良效应。最近的研究表明，PRR信号在几个人群中可以改变，降低了疫苗配方的保护效果。例如，防止胎儿排斥的免疫机制以及老年人中TLR途径的失调或遗传多态性的存在。出于所有这些原因，选择适当的佐剂配方对于提高效果而不降低风险-效益比至关重要。从化学角度来看，蛋白质数据银行存储库上有几种与特定配体共晶的蛋白质晶体结构，有助于通过计算机辅助药物设计寻找新化合物。报道的STING和TLR小分子激动剂的大多数结构是杂环化合物，模仿核苷酸。即使在这种情况下，也已经开发了许多具有不同应用的结构相关化合物，包括在癌症疾病中广泛应用的激酶抑制剂和作用机制不太明确的配体或人类辅因子的配体。另一个需要考虑的方面是存在用于合成肽的高通量全自动仪器。最近已经做出了努力来合成复杂的高分子量肽和糖蛋白。此外，已经开发了使用天然成分的新型复杂纳米配方，如来自昆虫的功能化聚合物。所有这些方面都非常有前景，并为佐剂发现的发展开辟了新的场景。 6.结论 佐剂是疫苗配方的关键组成部分的大家族。它们的使用在历史上最重要的疫苗接种活动中至关重要，包括脊髓灰质炎、猪流感和最近的COVID-19大流行。即使已经取得了良好的结果，但还需要更多的努力来增加疫苗对耐药病毒的保护，并减少额外加强针的需要。重组技术、DNA筛选和生物信息学研究已经阐明了新的机制和免疫信号通路的关键参与者。还需要更多的努力来识别更有效的佐剂，以对抗未来的大流行并增加对抗癌症的成功率。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：疫苗是预防传染病最重要的工具之一。随着时间的推移，针对抗原成分开发了许多不同类型的疫苗。佐剂是提高疫苗实践效果的关键元素，通过多种不同的方式发挥作用，特别是作为载体、储存库和免疫反应的刺激物。多年来，疫苗中包含的佐剂很少，铝盐是最常用的佐剂。然而，最近的研究关注了许多具有有效佐剂特性和提高安全性的新化合物。现代技术如纳米技术和分子生物学已经有力地进入了抗原和佐剂成分的生产过程，从而提高了疫苗的效果。微粒、乳液和免疫刺激物因其在疫苗生产中的巨大潜力而备受关注。尽管有关疫苗佐剂的潜在副作用的研究已经报告，如最近认识到的ASIA综合征，但疫苗的巨大价值仍然不容置疑。事实上，最近的新冠大流行凸显了疫苗的重要性，特别是在管理未来潜在大流行方面。在这个领域，对佐剂的研究可能在生产越来越有效的疫苗中发挥领导作用。 1.引言 疫苗无疑是人类历史上最显著的健康成就之一。在两个多世纪的时间里，疫苗使我们能够实现诸如天花的彻底根除、世界上许多地区脊髓灰质炎的消失，以及多个国家许多传染病的死亡率和发病率的大幅下降等非凡目标。在世界许多地区，疫苗政策是公共卫生的基石，非常重视为人群保证安全有效的疫苗。疫苗的效果不仅取决于抗原成分，还取决于经常用来以更有效方式刺激免疫系统的佐剂。佐剂被定义为添加到疫苗中以改善对抗原的免疫反应的成分。此外，佐剂还有多种好处，如减少每剂疫苗中的抗原量和接种次数，在某些情况下，它们增加了抗原成分的稳定性，延长了其半衰期，间接提高了其免疫原性。现在有多种类型的佐剂可用于疫苗制造（表1）。 佐剂可以根据不同的标准进行分类，如它们的物理化学性质、来源和作用机制。最常遵循的分类系统之一是基于它们的作用机制，将它们分为两个主要类别：递送系统（颗粒状）和免疫增强剂。还有一类佐剂是粘膜佐剂，这是一组与前述佐剂共享一些特征的化合物。在递送系统佐剂中，抗原与作为抗原载体的佐剂相关联。此外，它们能够通过激活先天免疫系统来诱导局部炎症反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。具体来说，抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这导致先天免疫细胞的激活，产生细胞因子和趋化因子。免疫增强剂直接激活相同的途径（图1）。 图1. 佐剂的作用机制。 添加佐剂对于老年人使用的疫苗特别有用，因为这类受试者中发生的免疫衰老生理现象，这是导致自然感染或人工刺激（疫苗接种）后免疫反应减少的原因。在这种情况下，佐剂的存在可以代表一个有效的工具，以克服疫苗使用中的这一限制。此外，佐剂对于亚单位疫苗特别有用，因为它们通常太弱，无法单独刺激强大的免疫反应。然而，并非所有疫苗都需要佐剂。例如，许可的结合脑膜炎球菌疫苗不含有佐剂，因为与蛋白质载体的结合本身能够刺激良好的免疫反应。目前许可的佐剂疫苗列于表2。 正如表中所示，EMA和FDA目前许可用于人类使用的绝大多数疫苗都包含铝盐作为佐剂。这一点很重要，因为这些佐剂是疫苗配方中最古老的，并且增加新佐剂的数量显然是必要的，以提高疫苗的安全性和有效性。由于这些原因，加强具有佐剂特性的新分子和因素的研究，增加体外和体内研究的数量是至关重要的。同时，新产品的批准可能会因监管挑战而延迟和成本高昂，这些挑战涉及佐剂的使用和研究、新细胞基质的使用，或者申请流程变更或转移。这个方面可能代表一个阻碍创新、增加成本和延迟疫苗可用性的障碍，特别是在资源匮乏的国家。 此外，COVID-19大流行凸显了拥有有效疫苗的重要性，以应对新大流行的潜在威胁。事实上，许可的针对COVID-19的RNA疫苗具有与用作编码RNA载体的脂质体组分相关的内在佐剂特性。然而，最新许可的COVID-19疫苗是基于一个经典平台，包含刺突蛋白，并以添加一种名为Matrix-M的新佐剂为佐剂，该佐剂含有皂皮树Molina提取物的A部分和C部分。 在选择疫苗佐剂时，应考虑许多方面，其中安全性无疑是第一。一个好的佐剂必须首先是安全的、耐受性好的、易于生产的；具有良好的制药特性（pH值、渗透压、内毒素水平等）和持久的货架寿命；最后，经济上可行。在不影响佐剂安全性的情况下尊重所有这些特性是困难的。因此，目前使用的疫苗中包含的疫苗佐剂非常少。 尽管疫苗取得了巨大的成就，但近几十年来对这些产品产生了很多担忧。一种反对疫苗的文化，被称为“疫苗犹豫”，已经在全球传播。这在COVID-19大流行期间得到了鼓励，一方面，它强调了疫苗接种作为对抗传染病的重要武器的重要性，但另一方面，它也凸显了一部分人口的犹豫行为。已经报告了这种态度的多种原因，但许多研究表明，对副作用的恐惧和对疫苗成分的不信任是最常报告的。特别是，佐剂是比其它成分更容易引起公众担忧的成分。实际上，当存在时，疫苗的副作用通常是轻微和短暂的，通常表现为注射部位的局部疼痛和红斑、轻微的全身不适和类似流感的症状。这些效果通常在疫苗接种后几小时或几天内消失。很少有过敏性反应或其他严重副作用的报告。 本综述的目的是检验当前使用的疫苗佐剂，并评估有关新佐剂的特性及可能的未来用途的正在进行的研究，突出科学文献中关于潜在关注点和副作用的证据。 2.递送系统 2.1.矿物盐铝盐 铝盐的佐剂特性在20世纪20年代被发现，自1926年以来这些化合物一直被用作疫苗佐剂。最初考虑将添加到生长介质中的铝盐用于诱导破伤风和白喉抗原的沉淀，以帮助它们的纯化。然而，很快就发现这些铝沉淀的抗原比可溶性的抗原具有更强的免疫原性。因此，铝盐是使用时间最长且最常包含在疫苗中的佐剂，约有三分之一的当前许可疫苗含有铝。因此，铝盐在疫苗佐剂中是安全性测试最多的。 人类通过不同来源接触铝，尤其是食物和空气。铝主要通过消化道和呼吸道被人体吸收，随后扩散，然后是三步消除过程，尽管这从未完全完成。吸入的铝少于3%，摄入的铝少于1%在生物体内扩散。然而，通过污染食物的摄取是人体中可发现的95%的铝的来源。世界卫生组织（WHO）规定，通过食物摄取的铝的最大水平应为1毫克/公斤/天（成人60至70毫克/天）。最后，铝可能包含在肠外溶液中，因此可以通过注射传播，通过血液和各种体液隔室在体内扩散。在这种情况下，为了避免铝的积累，其在肠外溶液中的水平应小于25微克/升。 一旦被生物体吸收，铝就在体内组织中扩散。大部分金属随后储存在骨骼、肝脏、肺和神经系统中。在患有慢性肾脏病的人群中，铝不能被消除并随时间积累，特别是在骨骼和神经系统中。在这类患者中，高水平的铝可以沉积在大脑中，导致脑病。铝穿透大脑在一项体内实验中得到了精确量化，该实验在大鼠中注射同位素铝-26（26Al）后进行。在生理条件下，铝对大脑的穿透力从每克脑组织的0.001%到0.005%不等，与其给药途径和化学形式无关。2010年，Goullé等人使用结合了电感耦合等离子体和质谱检测的技术，在20名未接触过金属且未接受过含铝或其他微量矿物质治疗的已故患者的人体组织中量化了铝的水平。以湿重表示的中值结果如下：肺=0.47微克/克，大脑=0.19微克/克，肝脏=0.15微克/克，心脏=0.10微克/克，肌肉=0.08微克/克，肾脏=0.06微克/克。 铝被生物体缓慢排泄，主要通过泌尿系统。一些铝永久沉积在人体中，随着接触水平和年龄的增长而增加。这种永久沉积的铝量在成人中估计为30至50毫克。 在疫苗中，铝以晶体状的氢氧化铝（AlH）或无定形的磷酸铝（AlP）的复合聚合物形式存在，形成聚集的纳米颗粒。AlH呈针状纳米颗粒（直径20纳米），而AlP在透射电子显微镜下呈网状。两种形式通常都溶于柠檬酸，但AlP比AlH更易溶。抗原通过静电相互作用和配体交换吸附在佐剂颗粒表面。铝盐/抗原结合增强了抗原呈递细胞（APCs）的抗原摄取和呈递。此外，铝盐刺激NLRP3炎症体的激活，导致IL-1β和IL-18的产生，随后局部炎症和APCs的招募。 许多疫苗使用吸附在AlH或AlP上的抗原（例如，针对破伤风和白喉、无细胞百日咳、乙型肝炎以及肺炎球菌和脑膜炎球菌疫苗），因为它们免疫原性差，随后需要增强免疫反应以引起有效的疫苗接种。在欧洲，疫苗中的铝量由欧洲药典设定为每剂最大1.25毫克铝。在美国，美国联邦法规将生物制品（包括疫苗）中的铝量设定为0.85毫克/剂。与主要以可溶性柠檬酸盐或氯化物形式存在于食物中的铝相比，用作佐剂的无机铝化合物溶解度差；这是它们佐剂作用的一部分。因此，由于在生理pH值下溶解度差，预期肌肉内或皮下注射疫苗中的铝的吸收率会非常慢。 为了评估肌肉内注射后铝的动力学，已经进行了一些体内研究。Flarend等人进行的一项实验研究基于肌肉内注射标记有26Al的AlH和AlP，铝的总剂量为0.85毫克，显示了28天内AlH的吸收率为17%，AlP的吸收率为51%。26Al的最大血清浓度（Cmax）增加为2微克/升，即正常值（30微克/升）的7%。基于这些结果，可以评估肌肉内注射铝盐疫苗佐剂后预期的铝Cmax增加，将等于0.04微克/升，即平均血液中铝水平5微克/升的0.8%。在这个实验中，还评估了大脑中的铝水平，浓度在10-8至10-7毫克/克之间，即10-5至10-4微克/克，因此<0.0001微克/克；这比人脑中平均浓度0.2微克/克低2000多倍。此外，一些研究评估了人类注射26Al-citrate后的铝排泄。一项相当旧的研究表明，在静脉注射26Al-citrate后，59%的注射剂量在一天内通过尿液排出，随后几天排泄速度较慢（第5天的平均保留率为27%），而一项较新的研究表明，在注射铝剂量8年后，保留率约为2%。 铝的毒性是由于体内液体和组织中金属水平的增加。这种增加尤其是由于消除能力的改变，特别是当肾功能受损时。接受血液透析的肾功能衰竭患者尤其有更高风险的铝水平和可能的神经毒性。肾脏移植能够解决铝过剩问题，可能还有相关的神经毒性。多年来，科学家一直在辩论铝神经毒性作为神经退行性疾病原因的可能角色，即使到目前为止，没有确切的证据显示，这个角色仍然是有争议的。 铝的神经毒性已在体外、离体和体内动物模型以及人类中进行了研究。一些体外研究在细菌上进行，显示没有致突变性。此外，使用对氧化突变原敏感的菌株，对铝的氧化作用模式产生了怀疑。其他体外研究在细胞系上进行，以评估不同形式的铝的可能遗传毒性。一些科学家致力于离体研究，使用来自多个供体的淋巴细胞，动物模型中的胚胎毒性研究，最后是各种体内研究。在所有这些研究中，最常用的技术是彗星试验和微核试验。值得注意的是，结果往往是不一致和矛盾的，可能存在方法上的缺陷。因此，到目前为止，尚不可能肯定地说，用作佐剂的铝盐（在推荐剂量下）可能具有毒性效应，尽管它们能够产生或多或少的强烈氧化应激。 2.2.乳液 这一类重要佐剂的始祖是完全和不完全弗氏佐剂。这两种佐剂都是水包油乳液，能够携带抗原并刺激先天免疫系统。完全弗氏佐剂（CFA）在其结构中包含热杀死的结核菌，这增强了对免疫反应的刺激，目前用于体内实验以在小鼠中诱导强烈的免疫激活和自身免疫（如葡萄膜炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎）。然而，CFA能够引起强烈、持久的局部炎症，可能导致动物显著疼痛，并可能在注射部位出现溃疡。不完全弗氏佐剂（IFA）不含结核菌，20世纪50年代作为人类流感疫苗的佐剂使用；与没有佐剂的相同疫苗相比，它能诱导更强、更持久的抗体反应。IFA的佐剂活性基于其作为油性抗原沉积的特性，从注射部位持续释放抗原。这同时增加了抗原的寿命，并强烈刺激局部先天免疫系统，伴有吞噬作用、白细胞的募集和浸润以及细胞因子的产生。然而，IFA在疫苗配方中的引入及其在人类中的常规使用受到其引起的强烈副作用的阻碍。特别是，由高剂量不可生物降解的油脂以及它们的质量差引起的毒性。2005年世界卫生组织进行的一项调查显示，大约一百万人使用IFA进行免疫接种，其中4万人出现了严重的副作用，如无菌脓肿。 2.2.1.MF59 MF59是一种水包油乳液，由角鲨烯、Span 85和Tween 80在pH 6.5的10 mM柠檬酸钠缓冲液中组成，平均粒径约为165纳米。这是第一个作为佐剂批准用于人类疫苗使用的水包油乳液，于1997年在意大利获批。目前，它包含在佐剂化的三价和四价（TIV和QIV）流感疫苗Fluad（Seqirus）中，最初只用于65岁以上的人群，但后来被批准用于其他流感风险群体，如幼儿和婴儿，在H1N1大流行疫苗期间，还批准用于孕妇和幼儿。已经证明，MF59的存在增加了流感疫苗在2岁以下儿童中的有效性。MF59还在乙肝疫苗中作为佐剂进行了测试，能够触发令人印象深刻的免疫反应，比铝佐剂诱导的反应更好。关于作用机制，MF59具有与铝盐相似的效果。在注射部位的沉积活性相当小，因为研究表明其半衰期为42小时。相反，MF59具有强大的能力，能够诱导细胞和体液免疫反应，包括产生高滴度的功能性抗体。MF59的存在刺激局部先天免疫细胞分泌趋化因子，如C-C基序趋化因子配体4（CCL4）、C-C基序趋化因子配体25（CCL2）、C-C基序趋化因子配体5（CCL5）和C-X-C基序配体8（CXCL8），这些趋化因子反过来驱动白细胞的募集、抗原的摄取和迁移到淋巴结，并触发适应性免疫反应。此外，有研究报告称，MF59能够增加调节白细胞跨内皮迁移的基因簇的表达，并随后招募MHCII+CD11b+细胞到注射部位，引发强烈的免疫反应。MF59安全且耐受性良好，这一点已通过在超过35个国家接种的数百万剂次证明。 2.2.2.AS03 AS03是一种水包油佐剂乳液，由表面活性剂聚山梨醇酯80和两种可生物降解的油脂组成，即角鲨烯和DL-α-生育酚在磷酸盐缓冲液中。这种佐剂已用于流感疫苗，诱导与MF59类似的免疫反应，以及在疟疾疫苗中。欧洲委员会于2009年授权AS03佐剂疫苗Pandemrix上市，而AS03佐剂的流感A（H5N1）单价疫苗于2013年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。然而，α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性似乎比MF59增强了免疫刺激。事实上，在6至35个月大的儿童中使用AS03佐剂流感疫苗，即使在接种后6个月，也显示出强烈的免疫反应。为了阐明DL-α-生育酚在AS03中的贡献，进行了一些研究，比较了AS03和缺乏DL-α-生育酚的相似乳液的效果。通过测量抗原摄取、免疫细胞募集和分泌的细胞因子水平，得出结论，缺乏DL-α-生育酚导致了较低的免疫反应和较低的抗体滴度。此外，已经显示AS03能够通过激活NF-κB来刺激免疫系统，这在肌肉和淋巴结中诱导细胞因子和趋化因子的分泌，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03可以刺激CD4+ T细胞特异性免疫反应，这可以决定持久的中和抗体产生和更高水平的记忆B细胞。AS03的成分进一步补充了两种强大的免疫刺激剂，QS-21（从皂皮树中提取的皂苷）和3-O-去酰基-40-单磷脂A（MPL），以增强其免疫原性，产生了AS02。 2.3.微粒 2.3.1.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是二十面体或杆状纳米颗粒（直径20-200纳米），由自组装的衣壳蛋白组成；长期以来，它们已被研究并用于疫苗开发。它们是非传染性颗粒，因为它们不包含任何遗传物质。它们是一类新疫苗（称为纳米疫苗）中最重要的代表之一，在疫苗开发中变得越来越重要。VLPs是智能纳米颗粒，因为它们由外部病毒壳层和重复表位组成，这些表位被免疫系统立即识别为非自身，产生强烈的免疫反应。这一特性与自然病毒共享，但并不伴有引起感染的有害能力。除了这些重复的结构基序外，VLPs在大小上与病毒相似（通常在20-800纳米之间），并经历了快速有效的处理，导致快速且持久的免疫反应的产生，即使在没有佐剂的情况下也是如此。VLPs可以根据有无包膜被分类为非包膜VLPs和包膜VLPs（eVLPs）。非包膜VLPs可以进一步分为单个或多个衣壳蛋白VLPs，以及单层、双层和三层VLPs。由乳头瘤病毒L1和L2蛋白形成的多衣壳非包膜VLPs是一个经典的例子，它们能够自组装形成微粒。eVLPs在组装和出芽过程中从宿主细胞获得其脂质膜。它们也分为单层、双层和多层。它们可以通过使用各种细胞系统的不同病毒类型通过不同的技术制造，其中包括大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞和无细胞系统。在细胞系统中制造VLPs采用一种称为“先组装后纯化”的多步骤方法，第一步利用衣壳蛋白在表达细胞载体内直接发生的自发组装能力。下一步包括新形成颗粒的纯化。有时，为了获得纯化的颗粒，在细胞组装后，需要解聚新颗粒，因此需要第二次重新组装它们。另一种制造方法使用无细胞体外组装处理系统，包括传统细胞方法的逆转。特别是，使用体外系统作为平台，在表达和纯化衣壳蛋白后诱导其自发组装，无需解聚新形成的VLPs。 目前，两种重要的佐剂疫苗使用纳米颗粒平台来诱导免疫：乙型肝炎和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。目前使用的乙型肝炎疫苗是一种含有乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的重组DNA疫苗，以VLPs的形式存在，用于预防乙型肝炎感染，并通过使用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA技术生产。每剂含有10微克/0.5毫升的VLPs（儿童剂量）或20微克/毫升（成人剂量），两者都吸附在氢氧化铝水合物上。该疫苗接种给婴儿、儿童和15岁以下的青少年，或在有高风险感染乙型肝炎的群体中，也显示出在乙型肝炎携带者母亲所生的新生儿中有出色的免疫原性（95-99%的有效性）。乙型肝炎疫苗似乎至少能提供10年的免疫力。 HPV疫苗也是基于VLP平台的疫苗。HPV病毒是非包膜的，包含双链DNA（dsDNA）。衣壳具有二十面体对称性，由主要和次要结构蛋白组成，即L1和L2蛋白。目前的九价HPV疫苗可预防九种不同的病毒基因型，这些基因型负责90%的宫颈癌和80-95%的生殖器癌症，建议从9岁开始对男性和女性都进行接种。九价HPV疫苗包含九种不同基因型的HPV（6, 11, 16, 18, 31, 45, 53, 58）的L1蛋白形成的VLPs，并通过重组DNA技术合成。VLPs的优势在于它们是不含病毒基因组的蛋白结构，是非传染性和非致癌性的。目前用于表达L1蛋白的载体是酿酒酵母。VLPs与佐剂（AlP）的结合使用允许出色的免疫反应，因此除了能够保护新生儿免受HPV 6和11的感染外，还能提供90%的宫颈癌保护。 2.3.2.病毒体 病毒体是一种与天然病毒结构非常相似的疫苗平台。在结构上，它们是由重组流感病毒包膜形成的VLPs，包含血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和磷脂（磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱），缺乏病毒遗传物质。1975年首次提出使用病毒体制造流感疫苗。自那以后，关于这种疫苗有效性的科学证据已经出现，同时有两种疫苗用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。Inflexal V是一种适合所有年龄组的佐剂流感疫苗，在健康和免疫功能低下的儿童、成人和老年人中都具有良好的疗效。它能够诱导B细胞反应并产生特异性抗体。病毒体保留了病毒HA的受体结合能力和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，它们在结合后无法在细胞中诱导感染。此外，这种结合能力使它们的免疫原性比亚单位和分裂病毒流感疫苗更高。病毒体作为一个完美的递送系统，能够将抗原转移到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。然而，由于它们的佐剂特性较弱，病毒体在激活APCs和促进交叉呈递方面效率不高。这种固有限制可以通过添加更强的佐剂来消除。例如，最近开发了一种新型基于病毒体的流感疫苗，该疫苗补充了Toll样受体4（TLR4）配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA-Ni吸附到膜中。体外实验表明，吸附了MPLA的病毒体能够比没有添加佐剂的病毒体更强地激活APCs。此外，用这些MPLA佐剂病毒体对小鼠进行体内免疫接种，结果诱导了特异性CTLs。 流感病毒体的制造包括使用洗涤剂八(乙二醇)-n-十二烷基单醚（C12E8）溶解病毒包膜，随后进行超速离心和去除病毒核衣壳。然后，使用疏水珠从上清液中去除洗涤剂，随后病毒膜脂质和包膜糖蛋白重新组装形成大约100-200纳米的颗粒。已经证明，这个过程能够生产出与野生型病毒融合特性非常相似的流感病毒体。流感病毒体通过受体介导的内吞作用进入细胞，然后与内体膜融合。不同的大分子可以封装在病毒体腔内，由于膜融合活性，能够到达目标细胞的细胞质。例如，已经证明，封装在病毒体中的DTA（白喉毒素的A亚单位）可以成功地运输到目标细胞的细胞质中，导致蛋白质合成的完全抑制。甚至质粒DNA也可以封装在由阳离子脂质形成的病毒体中。这种病毒体DNA可以用来有效地转染目标细胞。 病毒体递送系统和佐剂的显著优势在于它们能够通过疏水脂质相互作用将抗原吸附到它们的表面和腔室上。此外，与VLPs相比，病毒体在疫苗生产中更受青睐，因为后者由于其基于蛋白的结构而具有更有限的运动。此外，将抗原吸附到病毒体流动的磷脂双层表面刺激与宿主细胞受体的相互作用。FDA已经批准病毒体作为人类使用的纳米载体，因为它们具有非常高的耐受性和安全性。与亚单位疫苗相比，病毒体能够诱导强大的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂非常相似。 迄今为止，除了上述两种基于病毒体的流感和甲型肝炎疫苗外，还有几种基于病毒体的疫苗正在研究中，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。HIV病毒体疫苗在临床第一阶段显示出可接受的结果，可能很快就会上市。尽管疫苗可以通过肌肉内或皮下途径给药，但粘膜途径可能会引发更强的免疫反应，因为HIV传播的主要途径是通过粘膜组织。因此，强烈的粘膜抗体产生是抵御HIV感染的重要防御机制。一种基于HIV的病毒体疫苗是通过吸附一些HIV-1毒力抗原（如gp41和p1肽）并包括佐剂3M-052（一种增加病毒体膜刚性的热稳定佐剂）从流感病毒中制备的。在另一项研究中，一种热稳定的HIV-1病毒体疫苗由带有HA、NA、卵磷脂、脑磷脂和其他磷脂的流感病毒体组成，另外还包括3M-052、Toll样受体（TLR7/8）和糖分子海藻糖。 关于HPV，一些研究关注了基于病毒体的疫苗的效力，这些疫苗包含通过受体介导的内吞作用与宿主细胞膜融合的E6和E7蛋白。研究表明，重组HPV16 E7流感病毒体诱导了强烈的CTL反应，并防止了HPV16+转化癌症的发展。此外，用E7-病毒体免疫接种诱导了针对E7的IgG抗体反应。 3.免疫增强剂 3.1.TLR1/2激动剂 在TLR1/2激动剂中，L-pampo是一种强大的佐剂系统，由Pam3Csk4（Pam3）和多聚肌苷酸：多聚胞苷酸（polyI:C）组成，分别是强大的TLR1/2和TLR3激动剂。在Lee等人的研究中，L-pampo诱导了比氢氧化铝更强的针对HBV的抗体产生，并且还涉及细胞介导的免疫反应，如增加多功能CD4+ T细胞。此外，L-pampo也被研究作为针对SARS-CoV-2的强效佐剂。具体来说，SARS-CoV-2抗原（如受体结合域（RBD）和S1抗原或与L-pampo结合的RBD-Fc）刺激了比广泛使用的佐剂更强的针对SARS-CoV-2的体液和细胞免疫反应。 此外，细菌脂蛋白是TLR2识别的最强效的配体。已经表明，源自细菌脂蛋白的合成脂肽是B细胞和巨噬细胞的强激活剂，可以用作疫苗佐剂。来自发酵支原体的2 kDa巨噬细胞激活脂肽-2 (MALP-2) 通过TLR2-和MyD88依赖的信号传导途径激活免疫细胞。除了MALP-2，Pam2CSK4和Pam3CSK4是公认的TLR2激动剂，它们已被评估为针对利什曼病、疟疾和流感等传染病的治疗剂。 TLR3激动剂 在TLRs发现之前，合成的双链RNA polyriboisosinic:polyribocytidylic acid [poly(I:C)] 被发现具有很强的诱导IFN产生的能力。TLR3，一个检测病毒双链RNA的内质体受体，识别poly(I:C)，因为它在结构上模仿病毒RNA，从而诱导I型IFN和III型IFN的产生，并引发Th1细胞因子反应。由TLR3-poly(I:C)相互作用产生的I型IFN对于传统的树突状细胞(cDCs)有效地激活CD8 T细胞反应尤为重要。此外，poly(I:C)产生的I型IFN刺激T细胞的克隆扩增，增加效应T细胞的比例和抗原特异性B细胞的数量。基于所有这些原因，poly(I:C)已被广泛研究作为潜在的佐剂。然而，poly(I:C)对人类具有毒性。因此，科学家们的关注集中在poly(I:C)的衍生物上，如poly(ICLC)和poly(IC12U)，以及其他合成TLR3激动剂，如ARNAX、IPH 3102和RGC100。poly(ICLC)是聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，与poly(I:C)类似，能够刺激IFN的产生。然而，它对血清核酸酶表现出更高的抵抗力，同时具有更高的免疫刺激性。poly(ICLC)的一个有趣方面是其能够诱导先天免疫途径中其他几个遗传序列的表达，包括炎症体和补体系统，类似于活病毒疫苗。迄今为止，一些研究已将poly(ICLC)作为针对疟疾、HIV和癌症的疫苗候选物。已经表明，与其他TLR激动剂如LPS和CpG相比，poly(ICLC)能够引发更强的Th1免疫反应，这在疫苗接种中是一个积极方面。poly(IC12U)旨在通过尿嘧啶和鸟苷残基之间的不匹配来降低poly(I:C)的毒性。然而，尽管这种变化降低了毒性，但它产生的I型IFN比poly(I:C)少。与poly(I:C)和poly(ICLC)不同，已经表明poly(IC12U)能够结合TLR3但不结合MDA5。与poly(ICLC)类似，一些研究已将poly(IC12U)作为针对HIV、流感和癌症的疫苗中的佐剂。具有佐剂潜力的新型TLR3激动剂ARNAX是一种特异于TLR3的配体，特别生产出来以降低比poly(I:C)更低的毒性。poly(I:C)的毒性与其激活MAVS途径(激活RIG-I和/或MDA5)的能力有关。因此，Matsumoto等人开发了一种配体，包括GpC磷酸硫代寡脱氧核苷酸和双链RNA，该配体被TLR3识别并内化为内质体。该配体能够在不被MDA5检测的情况下激活TLR3，这是由于RNA链的相对较短长度。在小鼠模型中，该佐剂未能显著增加血清炎症细胞因子水平，但有利于DCs对抗原的交叉呈递，并引发Th1型反应。ARNAX研究的两个最重要领域是癌症免疫治疗和流感疫苗接种。 3.2.TLR4激动剂 作为疫苗佐剂研究的TLR4激动剂是AS01、AS02和AS04，它们都含有MPLA，即内质体TLR4的配体。具体来说，AS01已被用于开发针对疟疾、HIV和结核病的疫苗。AS01是一种结合佐剂系统，由MPLA和QS-21两种不同的免疫刺激性分子组成，它们被封装在脂质体结构中。QS-21是从皂皮树Molina的树皮中提取的天然三萜皂苷。这两种化合物使用脂质体作为载体，通过胆固醇依赖性内吞作用到达细胞。在细胞内，QS-21导致溶酶体不稳定，并促进蛋白激酶SYK的激活。MPLA连接内质体TLR4，诱导TRIF依赖性信号传导途径。单独使用QS-21具有重要且不利的溶血效应，诱导细胞死亡。然而，QS-21的溶血活性和随后的细胞死亡通过封装在脂质体中被消除。AS01激活caspase-1，从而促进NLRP3炎症体激活和APCs释放IL-1β以及IL-18。IL-18的释放导致IFN-γ的快速产生，特别是通过淋巴结中的自然杀伤细胞，从而促进DCs的成熟和Th1型免疫反应的诱导。 3.3.TLR5激动剂 TLR5是识别细菌鞭毛蛋白的受体，由多种免疫细胞表达。与配体的联系导致炎症途径的激活和许多炎症介质的释放，如TNF-α、IL-1β、IL-6和一氧化氮。此外，鞭毛蛋白能够引发Th1和Th2反应，与其他只能主要诱导Th1反应的TLR配体不同。此外，鞭毛蛋白通过激活NLRC4炎症体诱导IL-1β的产生和释放。鞭毛蛋白能够在TLR5或NLRC4非依赖模型中发挥佐剂活性，但效率低于野生型。事实上，当小鼠模型中两个受体都不出现时，佐剂能力大大降低，这表明至少需要一个受体来驱动免疫反应；两者的存在提供了最佳的免疫结果。已经表明，鞭毛蛋白在免疫功能低下的人中保持其佐剂能力，例如在HIV+患者中。Cui等人回顾了所有使用鞭毛蛋白作为佐剂的研究。最简单的方法是将其与抗原一起给药；这种简单的方法成功地诱导了对抗呼吸和胃肠道感染至关重要的粘膜免疫反应。已经进行了许多研究，特别是关于鞭毛蛋白作为流感疫苗佐剂的作用。在这些研究中，使用了与不同流感抗原结合的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白，其中包括灭活PR8流感病毒(IPR8)、HA(H5N1)和禽流感病毒(AIV) H5N1，对于每一种抗原，都获得了强大的免疫反应（特别是粘膜IgA产生）。鞭毛蛋白还可以成功地修改以获得嵌合鞭毛蛋白或与活性减弱细菌如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌和肠产毒性大肠杆菌(ETEC)中的抗原鞭毛蛋白复合物。此外，重组鞭毛蛋白-抗原融合蛋白的生产已在动物模型中作为佐剂疫苗用于传染病和癌症。迄今为止，至少有三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗处于临床试验阶段：两种针对流感病毒，一种针对鼠疫杆菌。 3.4.TLR7/8激动剂 一些研究表明，TLR7/8激动剂能够强烈诱导Th1免疫反应。配体与TLR7/8结合产生高水平的I型IFN、IL-12、TNF-α和IL-1β。此外，TLR7/8和TLR9激动剂是唯一能够激活并促进cDCs和浆细胞样树突状细胞(pDCs)克隆扩增的激动剂分子，同时动员CD14+CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。最重要的代表性TLR7/8激动剂是一些名为伊马替莫德(R837)和雷西莫德(R848)的合成小分子，它们属于咪唑喹啉类。伊马替莫德目前已获批准并许可用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和角化病，而雷西莫德已研究其抗病毒和抗癌治疗用途。 然而，这些小分子已被证明具有一些固有的局限性。特别是，它们可以从给药部位扩散开来，远离抗原，从而降低效果并引起全身副作用。因此，已经表明将这些分子直接结合到铝佐剂上能够提高疫苗的效力。一些先前的研究将咪唑喹啉类直接结合到HIV-1 Gag蛋白或整个灭活的流感病毒上，增加了Th1反应和抗原特异性T细胞的数量。此外，与合成聚合物支架、脂质-聚合物两亲物、聚乙二醇(PEG)、纳米凝胶、明矾和各种其他合成聚合物的结合显著增加了咪唑喹啉的传递，并改善了树突状细胞的成熟和抗原特异性T细胞。此外，先前使用咪唑喹啉与一种或多种其他TLR激动剂（如MPLA（TLR4）和MPLA + CpG ODN（TLR4和TLR9））混合的研究显示，这种组合增加了先天免疫反应，显著产生抗原特异性中和抗体并改善Th1反应。所有这些创新方面都突出了TLR7/8激动剂作为佐剂候选物的极好潜力。 3.5.TLR9激动剂 TLR9自然识别由未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸代表的细菌DNA基序，通过MyD88依赖途径驱动先天免疫系统的激活。这些分子基序已被用作具有特定修饰的合成佐剂，以防止被核酸酶降解。CpG-ODNs在自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞(pDCs)中引起强烈的化学因子、细胞因子和抗体产生，推动强烈的Th1型免疫反应。迄今为止，已经开发了属于三个类别（A-C）的三种不同类型的CpG-ODN配体，但只有属于类别B的分子已在临床试验中用作佐剂。CpG-B ODN定位于内质体并引起pDCs的成熟。此外，CpG-B ODN可以直接与B细胞相互作用以增强抗体产生。在小鼠模型中已经表明，作为佐剂的CpG-B ODN引起了相当持久的抗体产生，比铝佐剂或无佐剂疫苗更好。最近许可的CpG 1018，一种具有高化学稳定性和佐剂能力的寡核苷酸，能够引发Th1型免疫反应，用作乙肝疫苗Hepli-Sav-B中的佐剂。在Hepli-Sav-B中，CpG 1018提高了疫苗效力，只需要两剂的接种计划，相比之下传统乙肝疫苗需要三剂才能获得最佳保护。迄今为止，CpG 1018正在研究开发多种疫苗，包括针对黑色素瘤和COVID-19的疫苗。另一种CpG ODN，CpG 7909，也在临床评估中，并在HBV和疟疾疫苗接种中显示出令人鼓舞的结果。还开发了其他下一代TLR9激动剂。一个有效的代表是MGN1703，一种包含CG基序的小DNA分子，但其结构与CpG ODN不同。MGN1703由一段反向互补的DNA组成，中间是双链的，两侧是两个单链环，包括三个未甲基化的CG基序，形成一个哑铃形结构，与线性分子的CpG ODN形成对比。MGN1703已作为疫苗中的佐剂进行了测试，发现它能够激活先天和适应性免疫反应，副作用轻微或暂时。 4.佐剂的潜在副作用：ASIA综合征 尽管疫苗的安全性极佳，但近年来，人们对其可能的负面效应产生了新的关注，并在众所周知的上述副作用之外，描述了一种新的疾病实体。该实体是由佐剂引起的自身免疫/炎症综合征(ASIA)，首先由Shoenfeld等人提出。这种综合征包括一些免疫介导的疾病，很可能在遗传易感个体接触佐剂后发生。这种综合征的特征主要是产生自身抗体，并且一旦移除触发因素就会改善。在这种综合征的发作初期，一些外部因素，如感染性病原体或佐剂（例如尘埃、硅胶、铝盐等），作用于由特定HLA抗原介导的易发遗传背景，与自身免疫疾病(ADI)的发展相关。特别是，HLA-DRB1和PTPN22基因的同时存在已被证明是这些患者中最常见的自身免疫背景。根据最近的科学证据，一些病理状况，如结节病、Sjögren综合征(SS)、未分化结缔组织病(UCTD)、硅胶植入物不兼容综合征(SIIS)和免疫相关不良事件(irAEs)是ASIA综合征背景下的典型例子。除了疫苗中常见的佐剂外，许多其他物质如硅胶、石蜡、透明质酸、丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯也显示出佐剂特性。 根据Watad等人的说法，有两种类型的标准可以帮助诊断ASIA，分为主要和次要标准。主要标准包括在临床表现之前接触各种外源性刺激（感染、接触佐剂）以及出现典型的临床表现，如肌痛、肌炎、关节痛、关节炎、慢性疲劳、睡眠障碍、脱髓鞘、记忆丧失、发热和口干。次要标准包括自身抗体或针对佐剂的抗体的出现、特定HLA模式的存在（例如，HLA DRB1、HLA DQB1）以及自身免疫疾病的发展，即多发性硬化症或系统性硬化症。 一些先前的研究报告称，含有铝盐的疫苗有能力引发ASIA的发作。一个例子是由四价HPV疫苗（含铝盐）代表的，据报道在接种后几周内增加了易感个体自身免疫的风险，或乙肝疫苗。然而，Linneberg的一项重要研究关于铝盐的潜在副作用表明，接受皮下过敏免疫疗法的人多次接种含有氢氧化铝作为佐剂的过敏原，然后接受的铝量比三剂疫苗中包含的量高出约100倍，死亡率较低，并且比接受常规过敏疗法的对照组发展出更少的自身免疫疾病。科学家们的努力转向研究生物标志物以诊断ASIA或预测其易感性（除了前面已经提到的）。例如，ACE 1和IL-2受体在患有这种综合征的个体中增加了50%，维生素D的缺乏增加了ASIA的发病率（由于缺乏免疫调节效应）。强调易感性在ASIA的发作中似乎非常相关是很重要的，Watad等人通过分析500例ASIA综合征的病例很好地突出了这一点。这项研究表明，更高比例的女性个体、吸烟者以及那些以前有自身免疫疾病或家庭成员受影响的人患有ASIA。多基因自身免疫疾病在这些疾病中最常见，UCTD和Sjögren综合征的患病率最高，分别为38.8%和16.8%。在54.4%的自身抗体检测阳性的患者中，有48.2%是ANA阳性。考虑到自身免疫/炎症状态的发展背后有环境和遗传因素，这是显而易见的。暴露于疫苗接种和症状发作之间的中位时间为一周（2天至5年）；48.2%的人口在至少接触一次疫苗后出现临床症状。然而，除了这些科学证据外，一些研究显示接种佐剂疫苗和ASIA综合征之间没有关系。在这些研究中，已经表明疫苗接种和自身免疫之间的关联可能是由于混杂因素的存在和随机事件的结果，而不是真正的因果关系。疫苗接种或接触外来物质与潜在的自身免疫/炎症和免疫介导事件之间的可能联系不应该是降低疫苗接种覆盖率的“假神话”。 疫苗不良事件确实非常罕见。由于缺乏信息和强有力的数据，ASIA是一个恰当的总括术语，用来汇集与疫苗、硅胶或其他外来物质暴露作为共同根源的事件和表面上无关的反应。重要的是要强调，即使未来的研究显示佐剂和自身免疫之间存在真正的相关性，这也不会减少疫苗免疫实践所发挥的巨大且无可置疑的保护作用，它们提供了许多临床益处；事实上，疫苗已经有助于根除和控制许多可传播疾病，改善了人类生活质量。 5.结论 疫苗接种一直是并将继续是人类对抗传染病最有力的武器之一。多亏了这些有效且安全的预防工具，人类已经能够从世界许多地区根除人类历史上最可怕的敌人。最近COVID-19大流行很好地突出了疫苗接种的重要性，疫苗研究必须取得进一步进展，为未来的大流行做准备。疫苗的效果基于佐剂的基本属性和贡献。关于疫苗接种的未来，必须更加关注这些分子，以生产越来越安全有效的疫苗。这一领域的研究正在进行中，并且有几种产品正在研究中，以实现这一目标，造福人类。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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