11月7日维立志博与风险投资公司Aditum Bio宣布，基于维立志博CD3xCD19xBCMA三特异性T细胞衔接器（TCE）LBL-051成立新药研发公司Oblenio Bio，并达成了独家选择权及许可协议。
根据协议条款，维立志博将授予Oblenio在全球范围内开发、生产和商业化LBL-051的独家选择权和许可，并有权获得3500万美元的首付款和近期付款，总额最高达5.79亿美元的里程碑付款，以及未来产品的销售分成。此外，维立志博还将有权获得Oblenio的股权。
这是最近3个月内第5款出海的TCE（详见TCE vs CAR-T: 东风压倒西风），并且很有可能与其它四款TCE一样将用于自免疾病特别是系统性红斑狼疮（SLE）的临床开发。TCE已然成为业内的当红炸子鸡，引来众多药企纷纷布局。
其实业内对于TCE的研发至少已经有30年的历史了，FDA已经批准了9款TCE。如果说2014获批的Blincyto属于第1代TCE（不含Fc，半衰期短），近年获批的多款CD3双抗属于第2代TCE，那么目前处于临床开发的一些TCE则属于第3代TCE。
第3代TCE与前2代TCE最大的不同是在CD3的基础上引入了共刺激信号，而这一研发思路很大程度来源于我们在CAR-T研发中积累的经验（图1）。
图1. 三代CAR-T的结构示意图
1989年，基于scFv和CD3复合物(ζ链)胞内结构域融合的第1代CAR-T细胞被开发出来。但由于只含有激活受体CD3-ζ，第1代CAR-T细胞无法完全激活其活性，而且大多数实验在细胞扩增、体内存活时间、细胞因子分泌等方面存在不足，治疗效果不明显。
2010年，在第1代基础上，通过引入一个共刺激受体结构域（如CD28、4-1BB、DAP10等）开发出了第2代CAR-T细胞，第2代显著增强了CAR-T免疫活性激活，并提高了其作用持久性。
2012年出现的第3代CAR包含两个共刺激结构域，一个为CD28或4-1BB，另一个为OX40、CD28或4-1BB。但一系列临床前及临床试验表明第2代CAR比第3代CAR能更有效地激活下游信号并限制细胞因子的过度释放。
T 细胞的活化是免疫应答的核心，诱导 T 细胞活化、增殖及分化为效应 T 细胞需要双信号刺激：第一信号由 T 细胞受体（T-cell receptor, TCR）传导并由粘附分子增强；共刺激信号由抗原递呈细胞 (Antigen-Presenting Cell, APC) 表面共刺激分子和 T 细胞相应受体相互作用产生，可增强 TCR 信号。
Naive T细胞通过TCR识别MHC-抗原肽获得抗原识别第一信号后，必须有共刺激分子提供的第二信号（共刺激信号），T细胞才能被激活（图2）。没有第二信号，许多基因，尤其是编码IL-2的基因不发生转录激活，没有IL-2的作用，获得了抗原识别信号的T细胞不能进入增殖分化阶段，呈现无能状态，还可能导致凋亡。
图2. T细胞激活示意图
与CAR-T相似，引入共刺激信号的TCE可能增强T细胞的激活并获得长期的活性。
1、CD28
CD28是首个被靶向的共刺激受体，在T细胞表面表达，在APC刺激TCR后提供第二信号。一旦TCR和CD28都被激发，T细胞就开始分泌免疫刺激干扰素并释放穿孔素和颗粒酶来溶解肿瘤细胞（图2）。
赛诺菲是最早将CD28引入到CD3双抗的公司并至少将2款CD3/CD28/TAA三抗先后于2021年推进到临床阶段，分别是CD3/CD28/Her2（SAR443216）及CD3/CD28/CD38三抗（SAR442257）（图3）。
图3. 赛诺菲三抗示意图
但据赛诺菲2023年Q4财报显示，2款三抗的临床开发均已终止。在今年的ESMO年会上赛诺菲公开了CD3/CD28/Her2三抗的临床数据：未观察到客观响应（ORR=0%），疾病控制率为 35%（14/40），ADA发生率达到20%，除了疾病进展外，没有观察到 5 级 TEAEs，最大耐受剂量未达到。
另一家在CD28上广泛布局的MNC是再生元。但与赛诺菲不同，再生元更关注CD28/TAA双抗，并通过与CD3双抗、PD-1等药物联用，已在临床前展现出强劲潜力。目前其临床管线上有CD28/PSMA（REGN5678）、CD28/EGFR（REGN7075）、CD28/MUC16（REGN4018）、CD28/CD22（REGN5837），其中CD28/PSMA与CD3/PSMA目前在进行临床1期联合治疗前列腺癌。
2、4-1BB
4-1BB又称CD137，配体为4-1BBL，是一种Ⅱ型跨膜蛋白，主要表达于树突状细胞（DC）、B细胞和巨噬细胞表面。作为另一种第二信号，4-1BB和4-1BBL的结合可激活下游NF-κB/JNK/SAPK/p38 MAPK等通路，进一步产生共刺激信号诱导CD4+和CD8+T细胞的活性，促进T细胞的增殖（图4）。
图4. 4-1BB信号通路示意图
目前全球有十余款4-1BB/TAA双抗处于临床开发阶段，但截至目前均未取得令人满意的结果（详见百济神州4-1BB/GPC3双抗（BGB-B2033）恐怕注定要失败）。
也许将第一信号与第二信号相结合的CD3/4-1BB/TAA三抗才是正确的研发方向，罗氏目前有2款CD3/4-1BB/TAA三抗处于临床1期，分别是CD3/4-1BB/CLDN6（SAIL66）及CD3/4-1BB/DLL3（RG6524）。
2款三抗均是基于罗氏集团下属中外制药（Chugai）开发的CD3/4-1BB/TAA三抗平台而得，但在设计上却有着不同的考量。
尽管安进的CD3/DLL3双抗（Tarlatamab）在SCLC治疗上取得突破而于今年5月获得FDA批准上市（详见DLL3：王者归来？），但是对于T细胞浸润很少的一些实体瘤，即使CD3双抗激活了T细胞疗效也不足，所以在CD3基础上，中外制药希望同时激活4-1BB共刺激信号，来进一步增强T细胞的活性并延长效应时间。
于是中外制药就巧妙的通过对已有的CD3抗体设计得到的噬菌体合成库筛选出了一款“竞争性结合”双特异性Fab，既能结合CD3又能结合4-1BB但却不能同时结合（图5），这是为了避免同时激活不同T细胞上的CD3和4-1BB而导致T细胞之间的自相残杀。
图5.CD3/4-1BB “竞争性结合”双特异性Fab筛选示意图
然后将CD3/4-1BB“竞争性结合”双特异性Fab与CLDN6 Fab组装而成CD3/4-1BB/CLDN6三抗（图6A）并产生其Dual-Ig（Dual effectpr/receptor redirecting-Immunoglobulin）平台。
图6. CD3/4-1BB/CLDN6三抗（A）结构示意图与（B）亲和力
传统的抗体为Y字型结构，因为铰链区的存在，两个Fab相对比较灵活，因此其可以自由的结合抗原。而对于激动型抗体，抗体要发挥作用需要将受体二聚化甚至多聚化，因此抗体相对灵活的结构反而在一定程度上阻碍了受体的二聚化或者多聚化。
基于此，中外制药的研发人员在抗体两条重链CH1中引入二硫键，从而将抗体的两个Fab固定，以增强激动型抗体的效果从而产生了LINC-Ig（LINCed-Immunoglobulin）平台（图7）。
图7. LINC-Ig平台设计示意图及体外药效
于是将Dual-Ig与LINC-Ig结合就得到了CD3/4-1BB/DLL3（RG6524）三抗及Dual/LINC-Ig平台（图8A）。不难看出，之所以该三抗选择了Dual/LINC-Ig平台是基于不同Formats之间体外活性（图8B）及体内安全性的比较。此外，Dual/LINC-Ig平台在体内药效实验中明显优于安进的HLE-BiTE双抗TCE平台（图8C）。
图8. CD3/4-1BB/DLL3三抗（A）结构示意图（B）体外活性（C）体内活性
从亲和力角度来看，RG6524中的DLL3亲和力达5.49pM，而Tarlatamab中的DLL3亲和力为640pM，两者相差达116倍。而RG6524中的CD3亲和力为1.52uM，Tarlatamab中的CD3亲和力为14.9nM，两者相差达102倍（表1），暗示RG6524相较于Tarlatamab可能提供更大的治疗窗。
表1. RG6524亲和力分析
除了上面提到的2款三抗以外，罗氏还有1款CD19/4-1BBL双抗（RG6076）目前在与CD3/CD20双抗（Glofitamab）联合用于复发难治型非霍奇金淋巴瘤临床试验（图9）。
图9. RG6076联合Glofitamab作用机制
3、CD2/CD58
CD58又称淋巴细胞功能抗原3（lymphocyte-function antigen 3, LFA-3），是一种广泛分布于人体组织和细胞上的共刺激受体，其天然配体CD2主要表达于T/NK细胞表面。CD2与CD58相互作用通过提供必要的第二信号和辅助TCR介导的刺激进而促进T细胞活化（图10）。
图10. CD2/CD58共刺激信号通路
于2017年8月获FDA批准用于治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）的CD19 CAR-T Kymriah是FDA批准的第一款细胞治疗产品，诺华也因此积累了相当的经验。
诺华的研究人员在对Kymriah不响应或复发的患者癌细胞分析后发现CD58表达缺失与Kymriah不响应或复发高度相关，因此诺华开发了一款CD19/CD3/CD2三抗（PIT565）（图11A）目前在临床1期用于治疗B细胞血液瘤及SLE。11月1日，中国国家药监局药品审评中心（CDE）官网公示，诺华申报的1类新药PIT565临床试验申请获得受理。
事实上，PIT565更应该被称为CD19/CD3/CD58三抗，因为根据其发表专利（US20230071196）显示诺华使用的是经过蛋白工程改造的CD58（aa30-123; 引入一对链内二硫键以增强稳定性）（图11B）与CD3/CD19抗体融合而成CD19/CD3/CD58三抗。
图11. （A）PIT565结构示意图，（B）CD2/CD58蛋白结合域
10月31日，艾伯维与EvolveImmune Therapeutics宣布以总计6500万美元的前期费用和股权投资及高达14亿美元的期权费和里程金达成合作，双方将利用 EvolveImmune 专有的 EVOLVE TCE平台，针对多个靶点开发新型多特异性治疗型抗体。
EVOLVE TCE平台是一款CD3/CD2/TAA的三抗平台（图12），其研发管线包括EVOLVE-104（ULBP2/CD3/CD2三抗）、EVOLVE-105（CD20/CD3/CD2三抗）、EVOLVE-106（CD2/B7-H4/CD3三抗）等，预计将于2025年进行首次人体临床试验。
图12. EVOLVE TCE平台示意图
据EvolveImmune首席执行官Stephen Bloch博士称，“我们相信具有差异化的CD2共刺激策略的EVOLVE平台代表了潜在的下一代Best-in-Class TCE平台。”
由此推测，不同于诺华的策略，EVOLVE平台很有可能是通过CD2激动型抗体来促进CD2共刺激信号的产生。由于专利尚未公开，我们无法得知其CD2激动型抗体与CD58相比在亲和力及信号激活方面的差异。
11 月 8 日，Autolus Therapeutics 宣布，其新一代 CAR-T 疗法 Aucatzyl （ Obecabtagene autoleucel，obe cel）已获得美国 FDA 批准上市，用于治疗复发/难治型成人 B 细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）患者。
Aucatzyl是一种靶向 CD19 的 CAR-T 细胞疗法，采用具有fast off-rate的CD19 scFv（用以降低毒性）及4-1BB/CD3-ζ胞内信号结构域（图13A）。连同之前FDA批准的6款CAR-T（图13B），我们已经在CD28及4-1BB共刺激信号积累了丰富的研究数据。
图13. FDA批准的6款CAR-T比较
临床前研究显示尽管CD28和4-1BB拥有相同的下游信号通路，但是CD28活化引起的下游信号蛋白磷酸化水平显著高于4-1BB，也因此产生更高水平的效应分子，因而CD28 CAR-T具有更强的细胞效应功能。但是同时CD28 CAR-T也表达更高水平的耗竭标志物，这可以解释其为何存留时间更短。
在临床上，CD28/CD3 CAR-T在输注后的7天开始剧烈增殖，但很少能够持续存留60天以上。4-1BB/CD3 CAR-T在输注后7-14天达到峰值，之后可以持续存留数月。4-1BB/CD3 CARs有更大的线粒体质量，细胞更多表现为记忆表型，在慢性抗原刺激下可以长时间保留效应功能。
下一代TCE无论是治疗血液瘤、实体瘤还是自免疾病都需要避免T细胞耗竭而达到长期有效性，因此4-1BB相较于CD28也许是一个更好的共刺激信号。
至于CD2/CD58是不是一个更好的共刺激信号，目前还缺乏临床数据，让我们拭目以待。
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