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欢迎大家关注公众号和视频号！ 引言 之前在视频号直播的时候，大家就很关心做降解剂的优势与缺点的问题。这个问题确实非常重要！我也总是反复提到每个靶点都有适合它的药物类型，不应该为了开发降解剂而去开发降解剂。 看到Insilico的这篇文章的时候，仿佛看到了以前我在抗肿瘤项目中的一些共性问题，好多细节我都拿来说。这篇文章很值得大家去阅读和思考。例如PKMYT1这个靶点，Insilico的团队想开发成PROTAC，这就面临很多选择。首先，选择什么warhead，什么E3 binder，什么linker，设定TPP的标准是什么？DC50、Dmax以及细胞的IC50达到什么程度是理想的？做单纯的降解剂还是做降解+抑制的双重机制药物？蛋白组学怎么选择细胞系等等。 所以，这篇文章建议大家好好去读，数据和逻辑非常详细，是一篇教学性的文章。1. Insilico为什么要做PKMYT1这个靶点的PROTAC？ 这个问题非常宏大，也很难去回答，但是我们一定要回答。首先第一个问题：文章作者认为PKMYT1是CCNE1（细胞周期蛋白E1）扩增以及FBXW7和PPP2R1A基因有害突变的癌症的合成致死靶点。并且PKMYT1抑制可正交地破坏G2/M检查点，并在CCNE1扩增或过表达的情况下诱导合成致死，这可能规避与CDK2靶向疗法相关的毒性和耐药风险。这是靶点和疾病生物学的基础问题，回答这个靶点值不值得做，做什么适应症。 第二个问题：为什么要做这个靶点的PROTAC？这个就要从小分子药物出发谈一谈抑制剂对这个靶点开发的局限性以及降解剂通过降解蛋白可以比抑制强的地方。就我们目前的认知而言，激酶类型的靶点在药效上是很难PK得过抑制剂的，只能从克服耐药突变或者提高选择的角度出发了。作者认为目前的PKMYT1毒性大，疗效一般，所以开发PROTAC似乎可以提高选择性来达到减毒增效的目的。 降解剂的作用机制决定了三元复合物形成效率、泛素化效率以及最终降解这几个事件都是很难随即发生的。这重重难关也决定了降解脱靶蛋白比靶蛋白要难很多，所以选择性自然要比抑制剂好。2. PROTAC的warhead怎么来的？ 对于PROTAC而言，没有比拿来主义更靠谱、更简单的事情了。有高亲和力、成药性好的抑制剂就直接拿来用，这没什么问题。但是大多数情况下，还是需要对现成的warhead进行结构优化的。 Insilico团队选择了已获批准的广谱激酶抑制剂达沙替尼当作warhead起始分子。达沙替尼分子延伸至溶剂暴露区域，并与残基Gln196形成氢键。尽管达沙替尼中缺乏酚羟基，但其后口袋中的结构水分子与周围残基保持稳定的氢键，这表明PKMYT1抑制剂可以从铰链区后口袋中的两个保守水分子相互作用延伸至溶剂区域。 因此，团队利用RP-6306和达沙替尼的联合特性进行分子设计。将PKMYT1与RP-6306的复合物结构（PDB：8D6E）作为结构生成的起点。利用Chemistry42平台进行人工智能驱动的生成（图 1a，左上）。该策略包括铰链区的片段替换和溶剂区的定向片段生长，使用了超过40个人工智能驱动的生成模型，共生成2023个分子，随后对其进行聚类、重新对接和可视化检查，以评估其蛋白质-配体相互作用。 最终，基于预测的相互作用和整体潜力，并考虑合成的可及性和类药性，选择了一种分子（化合物1 ）进行合成。随后，利用 Chemistry42 平台中的 Golden Cubes 工具包评估了这些新型分子的脱靶概率。尽管活性相对较低，但化合物1被认为是一种新的先导化合物化学类型，可用于进一步的结构活性关系 (SAR) 研究。 上图的信息很多，化合物1经过SAR的探索，去除溶剂区中的甲基哌嗪并对核心环进行生物等排取代，得到化合物2，其对 PKMYT1 的 IC50 值提高至19 nM，靶点亲和力进一步提高。 鉴于化合物2与先前报道的 PKMYT1 抑制剂相比具有独特的结构，团队解析了其与PKMYT1复合物的X射线共晶结构，分辨率为2.4Å。在吡啶环上引入氰基后，氰基与保守的水分子形成氢键，产生空间位阻阻止自由旋转，并作为吸电子基团增强铰链区的结合，从而得到化合物3。手性拆分后，对映体纯化合物3表现出更高的渗透性（顶端至基底方向的通量为5.46 × 10⁻⁶cm / s）和更低的外排率（ER=1.28），同时回收率（48.1%）和水溶性（25.8 μM）也得到改善。值得注意的是，PKMYT1亲和力提高了10倍，从而显著增强了细胞效力。然而，该化合物在大鼠体内的高清除率（63.6 mL/min/kg，图 1a）和低口服生物利用度（6%）需要进一步修饰。ADMET 预测工具预测嘧啶甲基易发生氧化代谢。大鼠的肝血流量差不多是55 mL/min/kg，化合物3体内清除率已经大于肝血流量，这个分子肯定是代谢不稳定，所以接着改代谢稳定性。 化合物4是通过将溶剂区的甲基替换为氨基而得到的，从而获得了良好的渗透性、水溶性、阻转异构体旋转稳定性和代谢稳定性（CLp 17.7 mL/min/kg，图1a），以及在大鼠体内的口服生物利用度（51.9%），并且在 468 种激酶组分析中表现出优异的激酶选择性。 到此，warhead的优化算是告一段落了，化合物4作为warhead理论上也要去检测一下hERG抑制以及DDI。3. PROTAC D1 的设计与发现 经验是个好东西，特别是别人都在用的经验。所以在E3连接酶的选择上，没什么好说的，直接用CRBN的binder就行。因为目前临床上的PROTAC有90%左右都是CRBN，而且可口服的概率比VHL大很多。 所以Insilico直接就目标明确地选择了CRBN进行PROTAC设计。同时，也构建PKMYT1-PROTAC-CRBN的虚拟三维三元复合物模型。 在对接构象中，PKMYT1结合物与CRBN结合物之间的距离为8Å，对应于约8至10个原子的连接链长度。我们使用完全由碳原子组成的连接链生成虚拟的3D PROTAC分子，并以此为基础进行迭代修饰。 鉴于大多数口服生物利用度高的PROTAC含有半刚性连接链，他们选择不合成含有线性碳连接链的PROTAC，线性连接体仅作为后续连接体生成和设计的起点。团队分别选择了两种E3受体结合剂来那度胺和沙利度胺用于后续的连接体设计。在分析生成的连接体片段后，他们选择了其中的哌啶基亚甲基哌嗪基连接体来构建化合物D1，该化合物首先被选用于合成和评估（图 1f）。 直接选择这两种度胺作为binder去计算是性价比最高的，但是后续不建议直接拿来用，还是要进行度胺的改造，把neosubstrate改掉，提高降解选择性，改善代谢稳定性，并且改造一个能识别野生型大小鼠和犬的CRBN binder。 化合物D1对PKMYT1和CRBN表现出极高的结合亲和力，并在HCC1569细胞中显著降解PKMYT1（DC50为1.0 nM），对pCDK1的抑制IC50为29 nM，其效力几乎是仅含抑制剂的化合物4的三倍（图 1g），我得说一下，最好是30倍，甚至是100倍，才能在药效上体现出比抑制剂更好的价值，3倍还是不够的。 化合物D1在HCC1569细胞中浓度高达1μM时，蛋白组学显示未降解GSPT1、IKZF1/3或CK1α，表明其对参与正常组织发育和疾病进展的已知CRBN新生底物具有高度选择性。尽管化合物D1在小鼠体内表现出中等的清除率（CLp 40.7 mL/min/kg）和可接受的口服生物利用度（60 mg/kg时为67.0%），但其溶解度差（FeSSIF <1.56 μM）和血浆蛋白结合率高（PPB Fu 0.6%），因此需要进一步的结构修饰。 4. 先导化合物PROTAC D16的诞生 常规而言，做PROTAC需要一个问题一个问题去解决。不能一口吃一个胖子。从第一个D1分子到最后的D16分子，中间有很多可以讨论的点。首先，从结构上来说，沙利度胺和来那度胺需要改，我上面提到了理由，这里就不赘述了。其次是linker也要改，把代谢稳定性、半衰期、生物利用度提高。 最后，化合物D16的CRBN结合剂表现出优异的化学稳定性，在酸性条件（pH 1-2）下暴露24小时后仍保留97%的活性，且手性柱色谱法未检测到外消旋化现象。此外，化合物D16在模拟胃液（SGF）条件下也表现出令人满意的稳定性，12小时内仍保持87%的活性，足以满足口服给药的要求。 另外，大家不要只关注DC50，要多关注Dmax。还要关注最后的体外药效IC50，这个异常重要。从Dmax上看，D16算不上很优秀，需要提高到95%以上才行。 在我眼里，降解剂面临较大的竞争局面，活性要追求极致才行，我相信insilico的团队也会继续优化Dmax的，最好在细胞杀伤的IC50做到pM，Dmax做到95%以上。5. PROTAC D16-M1P2 参与并降解 PKMYT1 通过手性超临界流体色谱 (SFC) 分离，从D16中得到四种非对映异构体。非对映异构体D16-M1P2表现出更优异的PKMYT1降解效率（DC50 为0.7 nM，Dmax 为90%），同时对pCDK1的抑制作用也最强（IC50为9.0 nM），因此成为最佳先导化合物。可以看出，每次试验的Dmax还是有波动，到了人体研究就更是如此，需要我们谨慎看待每次试验数据。 6. D16-M1P2 表现出双重降解和抑制作用 当我看到这段话的时候，心里是喜忧参半的。说到降解和抑制双重作用，不得不提一些经典的降解剂，比如目前在3期临床的AR PROTAC BMS-986365(CC-94676)、NDA审批中的ER PROTAC分子ARV-471也有抑制的作用，还有获批的SERD药物也是。 由于PROTAC的warhead就是抑制剂，所以大部分PROTAC还是会带一些抑制活性。但是假如要提高选择性的话，最好不要有太强的抑制活性，不然脱靶也就来了。所以，我自己是很慎重的看待抑制+降解的这种降解剂的。我更愿意开发单纯降解作用的降解剂，药物很安全，而且降解就可以很好的阻断下游通路，无需再通过额外的抑制发挥作用。 不出意外，insilico的这个D16-M1P2也是抑制+降解的作用。为了明确PKMYT1降解和抑制的贡献，研究团队分析了CRBN非相互作用类似物D16-NMe-M1P2以及D16-M1P2。D16-NMe-M1P2在处理 24 小时后仍保持与D16-M1P2（IC 50为 7.6 nM，EC 50为 12.0 nM）相似的 PKMYT1 酶抑制和细胞内靶点结合（EC 50为 8.0 nM）。在HCC1569细胞中，可以看出D16还是保持着一定程度的对pCDK1（T14）的抑制作用（图 4f）。 7. D16-M1P2的选择性研究 7.1 激酶选择性 接下来，研究人员对D16-M1P2的特异性进行了表征，发现所测试的403种激酶中，仅有4种（包括PKMYT1）在1000 nM浓度下抑制率超过65%（是其酶促IC50的130倍）（图 5a）。相比之下，PKMYT1配体4和RP-6306分别与11种和46种非靶标激酶结合（图 1a），表明PROTAC的选择性显著提高。 对 BRAF、RAF1 和 SRC 这三个脱靶靶点的进一步验证表明，D16-M1P2对 PKMYT1 的选择性比对其他三个激酶高 50 倍以上（IC50分别为 485.3 nM、373.1 nM 和 398.5 nM， 图 4d ；图5b ）。值得注意的是，RP-6306 对 PKMYT1 的选择性比对 BRAF、RAF1 和 SRC 的选择性低不到 10 倍（IC50分别为1.5 nM和 15.3 nM、4.4 nM 和 6.4 nM ），这可能是其在临床试验中出现剂量限制性毒性的原因之一。这些结果表明D16-M1P2具有优异的激酶选择性。 7.2 蛋白降解选择性 作者对HCC1569 细胞在 10 nM 和 100 nM D16-M1P2处理8小时后的蛋白质组进行了分析。我们的分析定量了 132,593 个独特的肽段，这些肽段代表 8,177 种蛋白质。PKMYT1 在 10 nM 和 100 nM 处理下均显著降低（图 5c），去除假阳性数据后，再次证明D16-M1P2对 PKMYT1 具有高度特异性。 目前，我建议选择非肿瘤细胞系进行蛋白组学研究，毕竟安全性的评估主要针对的是非肿瘤组织。最常用的是人的PBMC细胞，肿瘤细胞和正常细胞的蛋白表达应该是不太一样的。另外，孵育浓度建议大于DC90，D16-M1P2用100nM是不是已经是hook effect浓度了？kymera他们的KT-621用的浓度是100倍的DC90，但是最好不要用出现hook effect的浓度，。此外，孵育时间的选择可以再长一些，比如24小时。 8. D16-M1P2的体内CDX药效 首先，研究人员对11种肿瘤细胞系进行了细胞生长抑制实验，这些细胞系分别携带CCNE1扩增、FBXW7或PPP2R1A的有害改变，或不携带上述任何改变，并用D16-M1P2或RP-6306进行处理。结果显示， D16-M1P2对携带CCNE1扩增、FBXW7突变或PPP2R1A缺失的细胞的选择性平均比野生型细胞高12倍（IC50分别为177 nM和2121 nM）。 然后，他们选择了CCNE1扩增的HCC1569肿瘤进一步评估了D16-M1P2与RP-6306的体内疗效。这个结果算不上太好，阳性药在更低的剂量下可以达到同样肿瘤抑制效果。PD的研究也证实了阳性抑制剂也能有效抑制下游通路。 这个结果说明什么问题？我们的化合物的活性优化还没有结束，只有降解和细胞杀伤抑制的浓度足够低，才能体现出药效上的优势，或者说激酶这种类型的靶点太适合小分子抑制剂了，要做降解剂需要慎重一些。 我们需要用到IVIVE的方法，在做完体外药效和动物PK的时候，可以预估我们的药物究竟多少剂量可以起效，和阳性药物有多少优势。这也是我们需要下功夫的地方。 参考文献 1. Wang Y, Wang X, Liu T, Wang C, Meng Q, Meng F, Yu J, Liu J, Fan Y, Gennert D, Pun FW, Aliper A, Ren F, Zhang M, Cai X, Ding X, Zhavoronkov A. Discovery of a bifunctional PKMYT1-targeting PROTAC empowered by AI-generation. Nat Commun. 2025 Nov 28;16(1):10759. doi: 10.1038/s41467-025-65796-8. PMID: 41315240; PMCID: PMC12663101. 公众号合作CRO（火热招募中）： 蛋白降解选择性 惟妙生物 惟妙生物的蛋白组学平台在研究TPD药物（PROTAC、分子胶）在人和动物细胞上的蛋白降解谱上有丰富的经验。 了解平台详情，请点进下方图片进入超链接： 【深度技术解析】：定量蛋白质组学在降解剂中的应用】： 2025-11-13 CNS药效 1. 圣研生物 圣研（天津）生物科技有限公司具有多年神经类药物药效评估的经验，可提供模型鼠造模及繁育服务以及行为学研究、渐冻症、AD、PD、SMA动物药效学评价。 了解平台详情，请点进下方图片进入超链接： 如有测试需求，请联系高老师：15001299642 小鼠鞘内给药及滴鼻给药案例展示 2025-11-13 DMPK 1. 湖南科技有限公司专注于药物DMPK研究。 公司打造了一系列特色性的PK研究平台：如吸入制剂、眼科药物PK、 Protac药物PK 、 CNS药物PK/PD、透皮制剂PK、微透析采样技术，多肽、ADC/PDC药物生物分析及药动药代研究等平台。 了解平台详情，请联系BD刘老师：15000447082 注：公众号持续招募药物研发领域的合作方，例如类器官平台、体外药效、毒理等合作伙伴，有意者请添加下方微信，欢迎大家和我合作。 加入读者交流群： 请大家加微信入群（需备注姓名+擅长领域+单位）： 公众号合作：产品宣传及软文插入，或者寻找项目（请有意者加我微信沟通：15210922780）