Nec-1s

坏死性凋亡是一种程序性细胞死亡。受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1 (RIPK1,) 是一种关键的蛋白激酶，调控坏死性凋亡通路。RIPK1 可作为抑制剂的重要药物靶点。在本文概述了坏死性凋亡的途径以及 RIPK1 在其中所起的作用，并总结了针对 RIPK1 的药物研发进展。1 简介 坏死性凋亡是一种由多种死亡受体介导的受调控的细胞坏死。这种坏死形式可对抗病原体介导的感染，其形态学特征是细胞肿胀，随后质膜破裂。它可由配体与细胞内和细胞外受体（例如 TNF 受体、Toll 样受体、ZBP1/DAI）相互作用引发。caspase-8 的参与是决定细胞凋亡还是坏死性凋亡的关键因素。RIPK1 是细胞死亡信号转导的核心参与者，负责监督 NF-κB 通路的激活、细胞凋亡和坏死性凋亡。在各种细胞坏死机制中，TNF/TNFR1 介导的通路最受研究机构和机构的关注。值得注意的是，TNF 诱导的坏死性凋亡可在 Caspase-8 抑制存在和不存在的情况下发生。 TNF 与 TNFR1 结合后，TRADD 促进 RIPK1、E3 泛素连接酶、TRAF 2、TRAF5、cIAP1 和 cIAP2 组装，形成所谓的复合物 I。在后续过程中，RIPK1 通过 RIP 异构体相互作用基序与 RIPK3 协同作用，导致形成坏死复合物。RIPK3 在自身磷酸化激活后，会募集 MLKL。这导致 MLKL 由于 RIPK3 介导的磷酸化而发生构象变化。这种变化导致 4HB 结构域暴露，从而激活 MLKL。一旦被激活，MLKL 就会组装成寡聚体，形成更高级的聚集体，这些聚集体会移动到细胞膜并最终形成热点。当这些热点超过一定阈值时，细胞膜就会受损，最终导致细胞坏死性凋亡。 该通路的调控涉及多个组件。由外源性致病因子（例如病毒 RNA 或 DNA）诱导的坏死性凋亡，无需 RIPK1 参与即可介导。含有 RHIM 的蛋白质，例如 TRIF 或 ZBP1，也可以与 RIPK3 协同启动坏死性凋亡。坏死性凋亡的核心机制涉及 RIPK3 和 MLKL。 图 1 . TNF-α 驱动的坏死性凋亡特异性蛋白复合物的形成。 RIPK1，又称受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 l（Receptor-Interacting serine/threonine Protein Kinase l），是一种必需蛋白，具有激酶依赖性和支架双重功能(76 kDa)。RIPK1 的结构主要包含三个结构域：N 端丝氨酸/苏氨酸激酶结构域、中间结构域和 C 端死亡结构域(DD)。 中间结构域包含受体相互作用蛋白 (RIP) 同工型相互作用基序，称为 RHIM。RIPK1 的中间结构域在 NF-κB 的激活中起着至关重要的作用，并支持 RHIM 依赖的信号传导。RHIM 结构域的存在促进了 ripk1 与其他含有 RHIM 的蛋白质的相互作用，包括 RIPK3、TRIF、ZBP1。 RIPK1 的 C 端部分以死亡结构域 (DD) 为特征。该结构域具有多重作用。一方面，当与匹配的同源配体结合时，DD 通过 DD 介导的同型相互作用将 RIPK1 锚定到细胞质膜上的受体上。这种结合在 TNFR1、Fas、DR4 和 DR5 等受体中可见。另一方面，RIPK1 的 DD 可以与同样具有 DD 的蛋白质结合，从而形成胞内复合物，进而传播下游信号通路。这些相互作用的关键伙伴是 FADD 和TRADD。此外，RIPK1 形成同型二聚体的能力依赖于其 DD，这是促进反式 N 端激酶结构域自身磷酸化的关键步骤，从而导致其活化。 研究表明，RIPK1 的每个组成部分都具有不同的功能作用。具体而言，N 端丝氨酸/苏氨酸激酶结构域在诱导细胞死亡中起着关键作用，并有可能成为治疗分子的靶点，尤其是小分子抑制剂。 2. RIPK1 的调控 RIPK1 的活性受到一系列翻译后修饰 (PTM) 的复杂调节，包括泛素化、磷酸化和 Caspase-8 介导的精确切割等过程（ 图 2 ）。 图 2 . 翻译后修饰在 RIPK1 激活中的调控作用。 2.1 磷酸化 这些磷酸化关键位点包括激活 RIPK1、促使细胞走向坏死的自身磷酸化区域，以及由外部激酶形成的、抑制 RIPK1 活性的磷酸化位点。磷酸化主要由 TBK1、TAK1、IKK 和 MK2 介导。 已证明 TBK1 的缺失会增加细胞凋亡的敏感性。此外，在缺乏 TAK1 的情况下，骨髓衍生细胞会发生自发的 RIPK1 依赖性死亡。这些发现强调了 TAK1 作为 RIPK1 激酶活性抑制因子的作用。 IKK 对 RIPK1 S25 位点的磷酸化有助于直接抑制 RIPK1 活性并避免 RIPK1 依赖性细胞死亡。当 IKK 活性受到抑制时，S25 位点的假磷酸化（表现为 S25D 突变）可保护细胞免受 TNF 诱导的细胞毒性。 在 TNFR1 信号通路中，MR2 在 S321/336 位点（或人类 RIPK1 中的 S320/335 位点）磷酸化 RIPK1。这种磷酸化通过自身磷酸化抑制 RIPK1 活化，并抑制 RIPK1 与 FADD/Caspase-8 的结合，从而抑制 RIPK1 介导的细胞死亡。4.2 自身磷酸化 RIPK1 激酶结构域内 S166 位点的自身磷酸化是 RIPK1 激活的一个指标。S166 位点的自身磷酸化可能诱导 RIPK1 蛋白的构象转变，并可能促进其他位点的自身磷酸化，增强 RIPK1 激酶结构域的可及性，从而促进与其他底物或调节蛋白的相互作用。例如，S166 自身磷酸化可能促进 RIPK1 与含有死亡结构域的蛋白质（包括 FADD 和 RIPK3）之间的相互作用，这些蛋白质对于坏死小体的组装和细胞死亡信号的传播至关重要。4.3 泛素化 在复合物 I 中，RIPK1 经历各种泛素化修饰，包括 M1、K11、K48 和 K63 泛素化。这些修饰对于调控 RIPK1 激活至关重要。研究表明，特定的 E3 连接酶和泛素酶可以介导这些泛素修饰，进而增强或抑制 RIPK1 介导的细胞死亡。4.4 RIPK1 介导的细胞死亡的激活受各种泛素化调控 K622（人类）或 K612（小鼠）位点是 RIPK1 泛素化的关键。K622 位点的泛素化促进 RIPK1 同源二聚体与 RIPK1-TNFR1 复合物之间的相互作用，这些相互作用通过各自的死亡结构域介导，最终导致 RIPK1 的激活 。TNFα 刺激后，发生 M1 和 K63 泛素化的 RIPK1 细胞在发生 K612R 突变后，其泛素化水平降低。这表明 K622/K612 位点的泛素化可以增强 RIPK1 介导的细胞死亡，表明它们在 RIPK1 的整体泛素化调控中起着不可或缺的作用。4.5 泛素化下调 RIPK1 介导的细胞死亡 OPTN 是一种泛素结合蛋白，可降低 K48 泛素化，减缓 RIPK1 的降解并增强其稳定性。RIPK1 和复合物 I 其他组分上的 K63 多泛素链可作为 NF-κB 通路中关键激活因子（例如 TGF-β、TAK1、TAB1/2 和 NEMO）的锚点，从而进一步刺激 TAK1 和 IKK 复合物的活化。 各种 E3 连接酶，包括 TRAF2/5、cIAP1/2 和 LUBAC，可催化 RIPK1 上的多种泛素化事件。这促进了 TAK1 和蛋白质复合物（包括 NEMO（NF-κB 必需调节因子）和 IKK α/IKK β）的募集，从而激活 NF-κB 信号通路并间接减少细胞死亡。研究表明，K376（对应于人类 K377）可被 cIAP1/2 泛素化。该位点为 K-63 连接的多泛素链提供了一个对接点，并在 TAK1 和 IKK 复合物的募集过程中发挥作用。 Parkin 是一种特异性胞浆 E3 泛素连接酶，它绕过 cIAP1/2，促进 RIPK1 K376 位点的 K63 泛素化。TNF-α 暴露后，Parkin 加速募集各种信号分子（例如 TAK1、NEMO、Sharpin 和 A20）至 TNFR1 相关复合物 I。Parkin 泛素化后，RIPK1 的 IKK α/β 和 IκBα 磷酸化增强，从而激活 NF-κB 和 MAPKs 通路。这导致 p65 核转位，促进细胞存活，同时对抗 RIPK1 介导的细胞死亡。 3. RIPK1 与疾病 RIPK1 在各种正常器官中普遍表达。其表达部位包括肝脏和皮肤等。与 RIPK1 表达相关的疾病，包括肝损伤、皮肤病、癌症等（图 3 ）。 图 3 . 文章中提到的 RIPK1 相关疾病的分布。3.1 RIPK1 与肝损伤 细胞死亡在肝病进展中起着关键作用，肝脏中已发现细胞凋亡和坏死性凋亡。在这两种途径中，细胞凋亡往往是更主要的途径。大量研究已深入探讨了 RIPK1 和 RIPK3 在各种肝损伤模型中的作用，主要旨在阐明坏死性凋亡的作用。肝细胞主要表达死亡受体(DR)，多种疾病，包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病毒性肝炎、酒精性肝炎 、 胆汁淤积性肝病和自身免疫性肝病，均与肝细胞凋亡相关。 由于 RIPK1 激酶抑制剂 Nec-1 的发现，RIPK1 在肝病领域的应用引起了人们的关注。 体外研究表明，Nec-1 可以阻止多个器官系统的坏死性细胞死亡。Nec-1 在减轻对乙酰氨基酚 (APAP) 诱导的小鼠肝损伤以及增强肝细胞体外存活方面的有效性被视为有希望的。鉴于 APAP 过量时的主要细胞死亡模式是坏死性，Nec-1 的保护作用最初被解释为针对坏死性凋亡的证据。然而，Nec-1 对 RIPK1 或坏死性凋亡本身的特异性受到质疑。3.2 RIPK1 与皮肤病 银屑病是一种慢性皮肤病，在临床领域备受关注，尤其是 RIPK1 抑制剂作为潜在治疗药物正在临床试验中测试。因此，深入研究 RIPK1 如何调控银屑病的进展至关重要。 在一项具有里程碑意义的研究中，利用实验性银屑病小鼠模型深入研究了银屑病发病机制中固有的坏死反应。在 IMQ 诱导的小鼠银屑病皮肤中，RIPK1 和 MLKL 显著上调，这与在人类银屑病病变中观察到的所有表皮层中观察到的相同上调相一致。这种上调与坏死率增加相关。有趣的是，抑制 RIPK1 可在体外减少 RIPK1/RIPK3 介导的坏死。此外，使用 RIPK1 抑制剂 Nec-1s 可减轻 IMQ 诱导的银屑病皮炎小鼠的炎症反应。 临床上，银屑病治疗通常采用坏死性凋亡抑制剂，例如 Nec-1s 或 NSA。然而，GSK2982772（一种口服小分子，可抑制 RIPK1 激酶）的出现改变了这一现状。GSK2982772 具有优于 Nec-1s 的抑制作用和增强的药代动力学特性，能够通过结合 RIPK1巧妙地阻断各种 TNF 依赖性细胞反应。 此外，临床发现表明可能存在剂量反应关系，因为 GSK2982772 的全身浓度越高，PLSS 评分越明显降低，这暗示可能需要增加剂量才能获得更好的治疗效果。3.3 RIPK1 突变与免疫缺陷 RIPK1 基因表现出显著的遗传变异性。大多数致病性 RIPK1 突变与一种名为免疫缺陷 57 (IMD57) 的特定免疫缺陷类型有关。值得注意的是，IMD57 会伴随多种相关疾病，例如炎症性肠病、关节炎、复发性感染和淋巴细胞减少综合征。RIPK1 完全缺乏的患者表现为反复感染、早发性炎症性肠病和进行性多关节炎。3.4 RIPK1 与癌症 抗凋亡是癌症治疗中的一个根本挑战。当癌细胞逃避凋亡时，通常会导致化疗失败。绕过传统的凋亡途径来诱导癌细胞死亡是解决这种抗凋亡的一个颇具吸引力的策略。在此背景下，程序性细胞死亡的另一种形式——坏死性凋亡，成为一种绕过凋亡抗性的潜在途径，甚至可能在癌症治疗过程中增强抗肿瘤免疫力。 在某些恶性肿瘤中，例如胶质母细胞瘤、肺癌和胰腺癌，RIPK1 表达似乎增强。RIPK1 水平升高与不良预后相关，提示其在促进肿瘤发生方面可能发挥作用。相反，在其他癌症中，例如头颈部肿瘤，RIPK1 表达似乎较低，但这种下调似乎仍然会促进肿瘤进展。这些发现表明，RIPK1 和坏死性凋亡在癌症中发挥着微妙的作用。一方面，它们可能阻碍肿瘤的生长和进展；另一方面，它们也可能营造有利于肿瘤发生的环境。这种双重特性就像一把“双刃剑”。此外，坏死性凋亡引发的炎症反应可能会无意中促进肿瘤发生和转移。3.5 RIPK1 与神经退行性疾病 坏死性凋亡在神经炎症中起着关键作用，介导多种神经退行性疾病的发病机制，例如多发性硬化症 (MS)、肌萎缩侧索硬化症 (ALS)、帕金森病 (PD) 和阿尔茨海默病 (AD)。研究表明，靶向 RIPK1 可能有助于抑制各种细胞死亡途径并改善神经炎症。 病理性轴突变性常见于患有肌萎缩侧索硬化症 (ALS)、多发性硬化症 (MS)、阿尔茨海默症 (AD) 和帕金森病 (PD) 等神经退行性疾病的患者。少突胶质细胞变性和功能障碍是这些疾病中轴突变性的核心机制。RIPK1 在少突胶质细胞坏死性凋亡中起着至关重要的调节作用。因此，RIPK1 抑制剂（如 Nec-1s）可以预防少突胶质细胞变性，通过抑制 RIPK1 为神经退行性疾病提供潜在的治疗途径。3.6 RIPK1 与自身免疫性疾病 坏死性凋亡在许多自身免疫性疾病的发病机制中起着至关重要的作用。因此，抑制坏死性凋亡的中心调控因子 RIPK1，有望成为一种潜在的治疗方法。全基因组关联研究 (GWAS) 已确定约 100 个非 HLA 位点与类风湿关节炎 (RA) 相关。其中包括 TNF，其中特定的 SNP 和 TNFAIP3 水平降低与 RA 相关。RIPK1 抑制剂 GNE684 已显示出良好的前景，可改善啮齿动物胶原诱导性关节炎模型中的病理表现。 坏死性凋亡也与中性粒细胞凋亡（NETosis）有关，NETosis 是一种独特的中性粒细胞死亡形式，会导致中性粒细胞胞外陷阱 (NET) 的释放。这些 NET 参与补体激活，导致内皮损伤并引发自身免疫性血管炎。值得注意的是，RIPK1 的激活对于中性粒细胞 NETosis 至关重要。抑制 RIPK1 已在 NET 驱动疾病模型中显示出疗效，包括自身免疫性血管炎、静脉血栓形成和系统性红斑狼疮 (SLE)。 6. RIPK1 相关药物的最新研发进展 RIPK1 具有一个独特的疏水口袋，可以变构调节其活性。迄今为止，所有已鉴定的 RIPK1 抑制剂均通过与该口袋结合发挥作用。值得注意的是，RIPK1 抑制剂的化学类型包括吲哚乙内酰脲（例如 Nec-1）、苯并氧氮杂卓酮（例如 eclitasertib）、苯并氧氮杂卓酮（例如 eclitasertib）等。 在 CDDI 数据库中，识别出 774 个 RIPK1 相关药物；其中，344 个具有已知的药理特性，10 个正在积极开发中，目前尚无上市药物 。 图 4 . RIPK1 抑制药物研发的里程碑。 图 5 . 文中提到的 RIPK1 抑制剂结构。 (A) Necrostatin-1，最早发现、最典型的 RIPK1 抑制剂和最早发现、最典型的坏死性凋亡抑制剂； (B) Eclitasertib，目前进展最快的 RIPK1 相关药物，正在积极开发中； (C) GSK-963，一种已停止药物研究的抑制剂； (D) RIP1i，GSK-963 的类似物，具有更好的口服暴露和更好的药用潜力。 6.1 Necrostatin-1 Nec-1 由哈佛医学院的 Degterev 等人并开发（ 图 5A ），它既是首个 RIPK1 抑制剂，也是坏死性凋亡抑制剂的原型。Nec-1 抑制作用的发现显著影响了坏死性凋亡的定义。该抑制剂以剂量依赖性方式二聚化 RIPK1 激酶结构域，有效抑制过表达 RIPK1 的活性。在揭示 Nec-1 作用机制的同时，研究团队还探索了其构效关系 (SAR)。虽然某些烷基化类似物无效，但在吲哚环上用氧取代硫和引入氯原子等修饰可保持抑制剂的效力。有趣的是，吲哚环上的小基团取代增强了 Nec-1 的抑制能力。当前 Nec-1 被作为一种“工具化合物”，在各种药物临床前研究中充当对照。6.2 eclitasertib eclitasertib（又名 DNL-758 或 SAR-443122）是目前正在开发的最先进的 RIPK1 靶向药物。这种苯并氧氮卓酮化学型 RIPK1 抑制剂源自 Denali 并与赛诺菲合作开发，具有潜在的抗炎和免疫调节特性。遗憾的是，详细说明其确切机制的综合研究仍未发表。目前，赛诺菲正在进行 2 期临床试验，以探索其在治疗皮肤红斑狼疮、肌萎缩侧索硬化症和溃疡性结肠炎等疾病方面的疗效。6.3 RIP1i RIP1i由 Wang 等人与GSK合作开发，可与 RIPK1 的变构口袋结合，该口袋位于其 N 端和 C 端结构域之间，毗邻 ATP 结合位点。与其类似物 GSK-963（ 图 5C ）相比，RIP1i 具有更高的口服生物利用度，使其成为一种有前景的药物候选药物。在小鼠 6 周的口服治疗方案中，RIP1i 维持了持续的高血清浓度——这是 Nec-1 无法复制的。此外，RIP1i 表现出良好的体内耐受性，且无明显的病理学意义。 后续研究提出，RIPK1 激酶可能促进胰腺癌中巨噬细胞介导的适应性免疫耐受。然而，这一论断后来受到了质疑。2019 年，Harris 等人与GSK合作，开发了一种 RIP1i 与检查点抑制剂联合治疗胰腺导管腺癌的疗法。尽管这项研究已进入临床试验阶段(IND)，有资格进行临床试验，但最终于 2019 年底被放弃。                                            参考:10.3389/fimmu.2025.1480027   感谢点赞，及转发分享的朋友。  公众号开放转载，同样欢迎大家提出需求、留言与探讨。