Birinapant

01 文章介绍 主要研究机构与主导团队 研究由美国得克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心、阿肯色大学医学科学中心和杜克大学医学中心联合完成，并有维克森林大学医学院团队参与。 论文第一作者为王正宇，Bo-Syong Pan、Rajesh Kumar Manne和Jungang Chen等共同参与研究。得克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心及阿肯色大学医学科学中心Hong-Yu Li团队提出研究构想，Hong-Yu Li、Hui-Kuan Lin和Zhiqiang Qin为共同通讯作者。研究涵盖药物化学、靶点捕获、蛋白质组学、细胞内吞机制、PROTAC优化和小鼠移植瘤验证。研究导语 2025年6月，美国多家研究机构在《Cell》发表研究，发现膜蛋白CD36可以结合PROTAC，并通过EEA1/Rab5相关内吞通路促进其进入细胞。研究团队利用生物素化探针捕获、质谱鉴定、基因敲低与回补、细胞内药物定量及移植瘤实验，证明CD36影响SIM1-Me、MZ1和临床期PROTAC ARV-110的摄取与药效。作者进一步提出“化学内吞药物化学”策略，通过可切割前药修饰增强MZ1与CD36的相互作用，使代表性分子MZ1-C14-Na的水溶性提高超过1,300倍、细胞摄取提高超过20倍，并在小鼠移植瘤中增强抗肿瘤作用。该研究把膜受体介导的药物摄取纳入PROTAC优化，但其适用范围和人体转化价值仍需进一步验证。 02 研究背景与问题 传统小分子药物设计通常遵循“类药五规则”，即较小的分子尺寸、适当的脂溶性和有限的氢键数量更有利于被动跨膜。PROTAC由靶蛋白配体、连接子和E3连接酶配体组成，分子量常超过800道尔顿，结构复杂且极性较高，理论上不利于被动扩散。然而，部分PROTAC不仅能够进入细胞，还能实现口服暴露并进入临床试验，说明被动扩散不能完整解释其跨膜过程。 这一机制空白直接限制了PROTAC药物化学。研究者通常通过降低极性、增加脂溶性或调整分子构象改善渗透，但这些改变可能同时降低水溶性、代谢稳定性或靶点结合能力。由于缺少明确的膜摄取机制，PROTAC优化经常需要在渗透、溶解度、稳定性和药效之间反复权衡。 受体介导的内吞是细胞吸收脂质和生物大分子的常见方式。CD36是一种分布于肠道、脂肪组织、肌肉及多种肿瘤细胞表面的膜蛋白，能够识别长链脂肪酸等结构多样的配体。作者因此尝试回答三个问题：CD36是否也是PROTAC的膜受体，CD36介导的内吞是否真正影响PROTAC药效，以及能否通过增强PROTAC与CD36的相互作用，主动改善大分子的细胞摄取。 03 核心方法与研究流程 PROTAC膜受体的发现 作者以BRD4-VHL型PROTAC MZ1为结构基础，保留BRD4配体、VHL配体和聚乙二醇连接子，并接入生物素，构建BRD4-VHL-biotin探针。研究将探针固定在链霉亲和素磁珠上，与LNCaP前列腺癌细胞膜组分孵育，再通过质谱鉴定结合蛋白，并用免疫印迹和竞争实验复核。 研究还合成了SIM1-Me和ARV-110的生物素化探针，并以表面等离子体共振测定不同PROTAC与纯化人CD36的结合。ARV-110是靶向雄激素受体、募集CRBN的临床期PROTAC，在本研究中用于验证已有临床分子是否也受CD36摄取机制影响，而不是本研究新发现的候选药。CD36依赖性验证 作者在LNCaP和22Rv1前列腺癌细胞及HCC1806三阴性乳腺癌细胞中利用短发夹RNA降低CD36表达，并通过外源CD36回补验证结果。细胞分别接受SIM1-Me、MZ1或ARV-110处理，随后检测BRD4或雄激素受体降解、细胞内药物浓度、细胞活力和克隆形成能力。 为追踪内吞过程，团队将BODIPY荧光基团接到多种PROTAC或其结构片段上，获得分子量超过1,000道尔顿的荧光探针。研究在CD36、EEA1或Rab5敲低细胞中观察探针进入细胞的情况，从而判断CD36及早期内体通路是否参与摄取。 动物层面使用携带CD36正常或敲低LNCaP细胞的移植瘤小鼠，给予ARV-110每千克5毫克、腹腔注射、隔日一次，共两周，比较肿瘤生长和雄激素受体降解。该实验用于验证CD36对临床期PROTAC体内药效的影响。化学内吞药物化学优化 作者选择细胞渗透相对有限的BRD4降解剂MZ1作为母体分子，在其VHL配体羟基位置通过可被细胞内酯酶切割的酯键，接入带负电荷、正电荷或疏水性的侧链。设计得到MZ1-C14-Na、MZ1-C12-NB等前药型衍生物，目的是先增强分子与CD36结合和内吞，进入细胞后再释放活性MZ1。 评价流程依次包括CD36结合、BRD4降解动力学、UPLC-MS细胞内药物定量、前药转化率、水溶性、细胞增殖抑制和小鼠移植瘤药效。代表性分子分别进入HCC1806三阴性乳腺癌和22Rv1前列腺癌移植瘤模型，每千克5纳摩尔、腹腔注射、隔日给药。 论文没有使用人工智能完成PROTAC设计。作者仅使用人CD36晶体结构进行计算对接，解释不同侧链可能形成的盐桥、氢键或疏水相互作用，主要结论来自化学探针、遗传学、细胞实验和动物验证。 04 主要发现 1. CD36能够直接结合不同类型的PROTAC BRD4-VHL-biotin探针从LNCaP细胞膜组分中捕获到CD36，同时检出网格蛋白重链、Rab5A及多种囊泡运输相关蛋白。免疫印迹进一步确认探针与膜CD36结合，加入母体PROTAC MZ1或SIM1-Me后可产生剂量依赖的竞争，说明结合并非单纯来自生物素标签。 表面等离子体共振结果显示，三价BRD4 PROTAC SIM1-Me与CD36的解离常数为63.6微摩尔，优于CD36天然配体棕榈酸的247.0微摩尔。MZ1与CD36的解离常数为9.6微摩尔，ARV-110则达到5.9微摩尔。ARV-110虽采用CRBN配体，与VHL型PROTAC结构不同，仍能与CD36结合，说明这种识别并不局限于一种E3连接酶或单一PROTAC骨架。 2. CD36敲低显著降低PROTAC进入细胞和降解靶蛋白的能力 在LNCaP细胞中降低CD36表达后，SIM1-Me诱导的BRD4降解和ARV-110诱导的雄激素受体降解均明显减弱。经6小时处理并洗脱后，UPLC-MS显示SIM1-Me和ARV-110的细胞内积累量分别下降5.6倍和19.6倍。重新表达CD36后，药物摄取和靶蛋白降解能力得到恢复。 药效变化与摄取变化一致。SIM1-Me和ARV-110在对照LNCaP细胞中的IC90分别为0.07和1.22微摩尔；CD36敲低后，达到90%细胞生长抑制所需浓度分别升高15.8倍和423.3倍。MZ1也表现出CD36依赖性，而紫杉醇的细胞毒性基本不受CD36敲低影响，说明并非所有大分子或抗肿瘤药都依赖这一通路。 3. ARV-110的体内药效依赖肿瘤细胞中的CD36 作者建立了表达对照短发夹RNA或两条不同CD36短发夹RNA的LNCaP移植瘤模型，每组5只小鼠。ARV-110按照每千克5毫克、腹腔注射、隔日一次的方案连续治疗两周。在CD36表达正常的移植瘤中，ARV-110显著抑制肿瘤生长并降低肿瘤组织中的雄激素受体水平；在CD36敲低肿瘤中，ARV-110未产生显著的肿瘤生长抑制，雄激素受体降解也受到明显阻断。 这一结果支持CD36参与ARV-110的体内摄取与药效，但不能据此认定CD36是人体患者中决定ARV-110应答的唯一因素。论文分析的96例前列腺癌组织芯片显示CD36表达存在差异，但没有将患者CD36水平与ARV-110临床疗效进行直接匹配，因此CD36作为预测性生物标志物目前仍属于待验证假设。 4. CD36内吞并不限于PROTAC，但存在明显的分子和细胞背景差异 荧光探针实验显示，分子量在1,128至2,145道尔顿范围内的SIM1-Me和ARV-110衍生探针可在30分钟内进入LNCaP细胞；敲低CD36、EEA1或Rab5后，荧光摄取明显受阻。探针还与早期内体标志物EEA1共定位，支持CD36通过早期内体通路促进内化。 研究进一步测试了分子量约543至2,245道尔顿的一系列大分子或高极性药物。除SIM1-Me、ARV-110和MZ1外，rapalink-1、雷帕霉素、navitoclax、birinapant、tubacin和多柔比星的细胞毒性也因CD36敲低而下降。相反，紫杉醇在LNCaP、HCC1806和22Rv1细胞中均未表现出明显CD36依赖性。该结果说明CD36可能是多类超越传统类药规则分子的摄取通道，但并非一个适用于所有大分子的普遍受体。 5. 靶向CD36的前药修饰提高MZ1摄取、溶解度和移植瘤药效 在MZ1衍生物中，带负电侧链的MZ1-C14-Na和带中性疏水侧链的MZ1-C12-NB表现较突出。MZ1与CD36的解离常数为9.6微摩尔，低渗透对照MZ1-C4为65.4微摩尔；MZ1-C12-NB的解离常数为2.8微摩尔。细胞内药物定量显示，MZ1-C14-Na和MZ1-C12-NB的细胞内总浓度分别为母体MZ1的22.3倍和7.7倍，CD36敲低则分别使其摄取下降25.3倍和7.7倍。两种前药进入细胞1小时后均有超过60%转化为MZ1。 MZ1-C14-Na的水溶性达到61.5毫克每毫升，相比MZ1的0.045毫克每毫升提高超过1,300倍。HCC1806细胞中，MZ1的IC90为0.81微摩尔，MZ1-C14-Na为0.05微摩尔，活性提高16.2倍；22Rv1细胞中，MZ1和MZ1-C12-NB的IC90分别为1.85和0.08微摩尔。 在HCC1806移植瘤中，每组5只小鼠接受每千克5纳摩尔、隔日腹腔给药一周，MZ1-C14-Na比MZ1更明显地抑制肿瘤生长并降低BRD4水平，未引起明显体重下降。在22Rv1移植瘤中，每组4只小鼠接受相同剂量、隔日给药三周，MZ1-C12-NB也比MZ1产生更强的肿瘤生长抑制和BRD4降解，实验期间未见明显体重或行为变化。 05 研究价值、局限与总结 研究价值与研发阶段 这项研究发现的不是一个新的肿瘤驱动靶点，而是可能影响PROTAC细胞摄取和药效的膜受体。CD36因此具有三方面潜在价值：作为大分子药物渗透的机制靶点，作为PROTAC药物化学优化的辅助结合位点，以及作为患者药物应答分层的候选生物标志物。 作者提出的“化学内吞药物化学”改变了传统渗透优化思路。传统方法通常希望分子通过脂质膜被动扩散，而该策略通过增加带电或疏水侧链，提高分子与CD36结合并触发内吞；进入细胞后，可切割酯键释放原始PROTAC。以MZ1-C14-Na为例，这种设计同时提高了水溶性和细胞摄取，部分缓解了“增加水溶性往往降低被动渗透”的药物化学矛盾。 MZ1-C14-Na和MZ1-C12-NB已经完成CD36结合、细胞摄取、前药释放、靶蛋白降解、细胞增殖和小鼠移植瘤验证，属于临床前概念验证分子，不是已经确定的临床候选药。研究中的ARV-110本身为已有临床阶段PROTAC，但本文没有开展新的患者治疗试验，仅利用其验证CD36摄取机制。 研究没有使用人工智能发现CD36或设计候选分子。生物素探针捕获、质谱、基因敲低与回补、UPLC-MS和动物实验构成主要证据链；计算对接仅用于解释代表性衍生物与CD36的可能结合方式。新策略主要缩短的是大分子渗透机制验证和结构优化环节，而不是替代完整的药代和安全性开发。数据和材料开放情况 原始免疫印迹、表面等离子体共振、细胞活力、动物实验以及化合物合成和表征数据已存入Mendeley Data。全局蛋白质组和代谢组数据已提交至jPOSTrepo。显微成像数据可向通讯作者申请。 论文没有报告原创代码。研究产生的质粒和稳定细胞系尚未存入公共资源库，但作者表示可应要求提供。正文与补充材料包含化合物合成、CD36结合、细胞摄取、蛋白降解和动物实验方法。研究局限 首先，研究主要使用LNCaP、22Rv1和HCC1806三种癌细胞系。CD36介导内吞的具体过程可能受细胞类型、CD36修饰状态和配体结构影响，不能据此认定CD36是所有组织、所有PROTAC或所有超大分子的主要摄取受体。 其次，CD36敲低并未完全阻断所有PROTAC摄取。残余摄取可能来自不完全敲低、其他膜受体或被动扩散。SIM1-Me在EEA1敲低后的药效下降甚至强于CD36敲低，提示可能还存在其他进入早期内体的摄取通路。 第三，论文在这些前列腺癌和乳腺癌细胞中观察到EEA1/Rab5及网格蛋白相关内吞，但其他研究曾报道CD36可通过小窝蛋白相关途径内化。因此，下游内吞通路可能由细胞背景或配体类型决定，当前机制不能直接推广到肠道、肝脏、血脑屏障等组织。 第四，MZ1-C14-Na和MZ1-C12-NB的动物实验规模较小，每组仅4至5只小鼠，观察时间为1至3周。安全性主要依据体重和行为没有明显变化，未包括血液学、生化指标、组织病理、免疫毒性或长期毒理，不能据此确认这些分子具有完善的安全窗口。 第五，研究尚未提供优化分子的血浆暴露、组织分布、生物利用度、代谢稳定性和排泄数据。MZ1-C14-Na水溶性大幅提高，可能增加肾脏排泄；CD36在肠道、肝脏、肌肉和肾近端小管等正常组织中也有表达，可能带来意料之外的组织分布或毒性。 第六，CD36作为ARV-110疗效预测标志物目前缺少临床验证。96例前列腺癌组织仅显示CD36表达存在差异，没有患者接受ARV-110后的应答数据，不能把CD36表达与临床敏感性建立确定的预测关系。总结 这项研究提出了一条此前未被充分认识的PROTAC摄取路径：CD36可以结合多种大分子或高极性药物，并通过早期内体系统促进其进入细胞。CD36敲低降低了SIM1-Me、MZ1和ARV-110的细胞摄取、靶蛋白降解及体内外药效，为部分PROTAC为何能够突破传统分子尺寸和极性限制提供了机制解释。 更具药物研发意义的是，作者把这一机制转化为可操作的前药优化策略。MZ1-C14-Na和MZ1-C12-NB证明，增强CD36结合有可能同时改善溶解度、细胞摄取和抗肿瘤作用。下一步仍需在更多组织与PROTAC骨架中验证普适性，建立CD36内吞的定量评价体系，并补充药代、组织分布、长期毒理和临床样本关联，才能判断“化学内吞药物化学”能否成为稳定可复用的候选药开发路线。

点击蓝字 关注我们 乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，患者来源的乳腺癌类器官（hMOs）正成为研究化疗耐药与程序性细胞死亡（PCD）抵抗的转化医学工具。坏死性凋亡（necroptosis）是一种裂解性、高免疫原性的细胞死亡方式，可绕过凋亡抵抗并激活抗肿瘤免疫，但仍缺乏理想的人源化模型来系统研究。近日，德国van Wijk研究团队在《Signal Transduction and Targeted Therapy》（IF 52.7）发表研究，利用转移性乳腺癌患者来源hMOs建立了刻画PCD与炎症信号的转化平台。该团队此前已证实LUBAC参与调控胰腺类器官中的坏死性凋亡，本研究通过Smac mimetics诱导凋亡、并在联合泛caspase抑制剂Emricasan模拟凋亡抵抗后，诱导hMOs转向坏死性凋亡；结合单细胞CITE-seq、活死染色及细胞因子检测，刻画了坏死性凋亡相关的炎症性干扰素signature及其对NK细胞活化的影响。研究发现，坏死性凋亡可触发I/II型干扰素应答signature显著上调及炎症介质释放，并使NK细胞出现干扰素相关预激活特征；LUBAC抑制剂HOIPIN-8可有效减弱上述过程，提示Smac mimetic诱导的坏死性凋亡是潜在的乳腺癌免疫治疗策略。 01 研究亮点 Research Highlights 模型创新：搭建患者来源转移性乳腺癌类器官平台，保留患者来源肿瘤/转移病灶异质性与分子特征，可模拟凋亡抵抗、坏死性凋亡及炎症反应，填补传统细胞系与动物模型间的转化研究空白，支持个体化药敏筛选。 通路验证：证实Smac模拟物诱导凋亡的基础上，caspase抑制可触发RIPK1-RIPK3-MLKL介导的坏死性凋亡，为凋亡耐药乳腺癌提供非caspase依赖的治疗新路径。 免疫突破：首次在患者源类器官中发现坏死性凋亡激活干扰素信号通路，上调炎症因子分泌并诱导NK细胞活化，为肿瘤免疫联合治疗提供机制依据。 靶点发现：结果提示LUBAC介导的线性泛素化参与调控MLKL磷酸化下游的坏死性凋亡执行过程，其抑制剂HOIPIN-8可延缓细胞死亡、降低炎症介质表达和分泌，为进一步开发调控坏死性凋亡强度的药理学策略提供线索。 02 研究内容 Research Content 该研究的核心结果围绕“建立平台—表征donor特征—诱导凋亡—诱导坏死性凋亡并药理学逆转—检测炎症及干扰素信号—验证NK细胞活化”展开： 1. 建立用于刻画转移性乳腺癌hMOs中PCD和炎症的转化研究流程 一句话总结：建立了三例来自转移性乳腺癌患者的hMOs（donor#1/#2/#3），并通过形态学、免疫荧光和单细胞CITE-seq完成基线表征，为后续PCD和炎症研究搭建了标准化平台。 实验设计：三例hMOs来自HUB生物样本库（donor#1为luminal B型，donor#2、#3为luminal A型），在模拟肿瘤微环境的化学成分明确培养基中稳定培养，并通过明场成像、免疫荧光（CK8/CK14、Ki-67、E-cadherin）及scCITEseq进行基线表征。 关键结果 ▸ 形态差异（图1a）：三例hMOs在明场显微镜下成像，donor#1和donor#3呈紧密圆形结构，donor#2呈松散的“葡萄状”形态，三者扩增速率也各不相同。这种形态异质性与既往报道的乳腺癌类器官特征一致，反映了不同患者肿瘤的个体化差异，为后续比较donor间药物敏感性奠定了背景。 ▸ 管腔型来源确认：免疫荧光显示三例hMOs均表达管腔细胞标志物CK8、不表达基底细胞标志物CK14；图1b的Ki-67染色显示donor#2阳性细胞比例最高，与其松散、增殖较快的形态一致。Ki-67水平可作为衡量各donor基线增殖活性的参考指标，便于后续解释药物处理后的活力变化。 ▸ E-cadherin表达（图1c）：免疫荧光显示donor#1和donor#3呈E-cadherin阳性，donor#2几乎不表达。结合讨论部分，E-cadherin缺失常伴随ROS升高和TGF-β信号增强，而培养基中的抗氧化剂及TGF-β抑制剂（A83-01、Noggin）可能进一步支持了donor#2（E-cad阴性）的高增殖表型，提示E-cadherin表达水平与增殖能力之间存在潜在关联。 ▸ 单细胞图谱：scCITEseq经UMAP降维分析共识别出22个细胞群（图1d）；MKI67和CDH1表达的小提琴图（图1e）显示donor#3 MKI67表达最低、donor#2几乎不表达CDH1，与免疫荧光结果一致。22个细胞群的存在表明即使同一donor的hMOs内部也具有显著的细胞异质性，这种异质性正是患者来源类器官相较传统细胞系的核心优势，验证了该平台在单细胞分辨率下刻画hMOs异质性的能力。 图1 建立用于刻画原代BC hMOs中PCD和炎症的转化研究流程。a hMOs形成后用Zeiss SteREO Discovery.V8明场显微镜成像，比例尺250 µm。b、c hMOs固定后分别进行Ki-67（b，品红）或E-cadherin（c，品红）免疫荧光染色，并用Hoechst33342（青色）复染；经CUBIC-2透明化后用Zeiss LSM780共聚焦显微镜成像，比例尺100 µm，放大图25 µm。d 对照处理（1.5% DMSO处理24小时）的hMOs进行scCITEseq，合并所有数据后进行UMAP分析。e scCITEseq数据中MKI67和CDH1表达水平的小提琴图。 2. 转移性hMOs表达管腔型乳腺癌标志物，并呈现donor特异性表达signature 一句话总结：三例hMOs均具有管腔型乳腺癌特征，但GATA-3表达水平及缺氧/MYC/雌激素等关键信号通路存在显著donor差异，形态特征与分子特征高度对应。 实验设计：通过免疫荧光检测GATA-3、CD49f表达，并对scCITEseq数据进行hallmark基因集GSEA分析（合并数据集分析+各donor独立分析）。 关键结果： ▸ GATA-3表达（图2a）：免疫荧光显示GATA-3在donor#2中表达最高且呈核定位，donor#1中度表达，donor#3几乎检测不到GATA-3阳性细胞。结合第4-5节坏死性凋亡结果，GATA-3表达较高的donor对Birinapant/Emricasan诱导的坏死性凋亡更敏感，提示GATA-3表达水平可能是预测PCD（尤其是坏死性凋亡）敏感性的潜在生物标志物，但仍需更多研究验证。 ▸ CD49f表达与验证：CD49f（ITGA6）免疫荧光（图2b）显示三例hMOs均可检测到蛋白表达，但scCITEseq中mRNA水平整体偏低；图2c同时验证了GATA3表达趋势与免疫荧光结果一致。CD49f蛋白与mRNA表达水平不完全一致，提示该标志物在蛋白质层面的检测可能更适合用于hMOs的表型鉴定。 ▸ 合并数据集通路分析（图2d）：三例donor的对照组scCITEseq数据合并后进行hallmark GSEA，缺氧信号通路和p53通路显著上调。缺氧信号与乳腺癌进展（糖酵解、血管生成、转移）密切相关，这一结果与hMOs来源于转移性病灶的背景相符，提示这些类器官保留了来源转移性乳腺癌病灶的部分转移相关分子特征。 ▸ donor特异性通路：各donor独立分析显示donor#1以MYC信号为主；donor#2表现为缺氧/糖酵解/TNF-α-NF-κB信号；donor#3以雌激素应答为主，与培养基含β-雌二醇一致。这种donor间通路差异凸显了乳腺癌的个体化分子异质性，是患者来源类器官支持“个体化”药物评估的分子基础。 ▸ 形态-分子对应：紧密形态的donor#1/#3呈现MTORC1信号增强（与不良预后相关），松散形态的donor#2以缺氧/糖酵解为主要特征，进一步印证了形态与分子特征间的对应关系。MTORC1信号常与乳腺癌不良预后及致癌作用相关，提示donor#1/#3在分子层面可能代表预后相对较差的亚组，为后续比较其PCD敏感性提供了重要背景。 图2 转移性hMOs呈现管腔型BC亚型特征及donor特异性表达signature。a、b hMOs固定后进行GATA-3（a，品红）或CD49f（b，品红）免疫荧光染色，并用AF647™-鬼笔环肽（黄色）和Hoechst33342（青色）复染，CUBIC-2透明化后用Zeiss LSM780成像，比例尺100 µm。c scCITEseq数据中GATA3和ITGA6表达的小提琴图，验证了免疫荧光结果。d 对scCITEseq数据用hallmark基因集进行GSEA分析，合并所有donor对照（1.5% DMSO）数据，展示上调最显著的信号通路（横轴为–log₁₀校正q值，柱状图按DEG数量着色，虚线为显著性阈值q=0.05）。 3. Smac mimetics诱导cIAP1/2降解，并导致转移性hMOs产生donor特异性的细胞活力下降 一句话总结：四种Smac mimetics均可降解cIAP1并诱导caspase-3切割（凋亡激活），但BV6效果最强且donor非依赖，其余三种药物对细胞活力的影响则因donor而异。 实验设计：用BV6、Birinapant（TL32711）、ASTX-660（Tolinapant）和LCL-161分别处理hMOs 24小时，通过Western blot检测cIAP1/2、XIAP及caspase-3，并用CellTiter-Glo活力检测及活/死染色评估细胞死亡。 关键结果： ▸ 基线表达（图3a未处理/对照泳道）：Western blot显示三例hMOs中cIAP1、XIAP表达均较低，caspase-3表达最高，且donor#1与donor#3之间存在统计学差异；MLKL mRNA水平三donor相近。基线cIAP1/XIAP水平均较低，研究随后通过泛caspase抑制剂Emricasan人为模拟caspase依赖性凋亡受阻状态，为比较凋亡与坏死性凋亡提供实验条件。 ▸ IAP降解与凋亡激活（图3a）：四种Smac mimetics均诱导cIAP1降解，与donor背景无关；cIAP2仅donor#3表达并被显著降解；XIAP降解以BV6最明显；所有药物均以donor非依赖方式诱导caspase-3切割。IAP降解会稳定NIK并激活非经典NF-κB通路，进而诱导TNF-α等促炎基因表达，构成“凋亡-炎症”正向反馈环，为第6节观察到的炎症因子上调提供了机制基础。 ▸ 细胞活力（图3b）：CellTiter-Glo检测显示BV6使三例donor活力均下降35%–50%，效应最强且一致；其他药物呈donor特异性，如LCL-161使donor#1/#2活力下降约15%，但donor#3无明显作用。BV6和Birinapant均为双价Smac mimetic、作用更强，而单价的ASTX-660和LCL-161效果较弱，提示药物结构（双价vs单价）与效价相关；BV6相比Birinapant更强的效应也与其对cIAP1/XIAP更低的解离常数（Kd）相符。 ▸ 细胞死亡（图3c）：活/死染色定量显示BV6使死细胞数量较DMSO对照增加4–24倍，其他Smac mimetics增幅相对较小。值得注意的是，Birinapant、ASTX-660和LCL-161诱导的caspase-3切割程度与BV6相近，但细胞死亡幅度明显更小，提示caspase-3切割本身并不能完全预测最终的死亡结局，二者之间可能存在额外的调控环节或时间窗口差异。 ▸ Birinapant处理后通路特征（图3d）：donor#1呈TNF-α信号为主，donor#2呈MYC信号为主，donor#3呈雌激素应答为主；合并数据集亦显示MYC信号显著上调。c-MYC过表达可增强细胞对凋亡的敏感性、形成正向反馈环，可能部分解释了donor间对Smac mimetic响应程度的差异。 ▸ 通路特征（Birinapant处理后）：donor#1呈TNF-α信号为主，donor#2呈MYC信号为主，donor#3呈雌激素应答为主；合并数据集亦显示MYC信号显著上调。 图3 Smac mimetics诱导原代hMOs中cIAP1/2降解及donor特异性细胞活力下降。hMOs分别用10 µM BV6、Birinapant、ASTX-660、LCL-161或0.4% DMSO处理。a Western blot检测各处理24小时后cIAP1、cIAP2、XIAP、cleaved caspase-3及全长caspase-3，vinculin为内参。b CellTiter-Glo®活力检测，相对未处理对照标准化（N=3）。c 荧光活/死染色定量，相对未处理对照标准化（N=3）。d 基于hallmark GSEA分析各donor经Birinapant处理后最上调的通路（编码方式同图2d）。统计均采用单因素ANOVA+Tukey检验。 4. Smac mimetics在患者来源乳腺癌hMOs中诱导PCD 一句话总结：Birinapant单药诱导经典凋亡（cleaved caspase-3阳性），联合泛caspase抑制剂Emricasan（BiE）后则转向坏死性凋亡信号（细胞肿胀+pRIPK1阳性），三例donor均可检测到坏死性凋亡相关上游信号（donor #1/#2表现出更完整的坏死性凋亡执行，donor #3受MLKL低表达限制）；BV6效应类似但起效更快。 实验设计：聚焦BV6和Birinapant（细胞活力影响最强，且Birinapant已进入临床），联合或不联合泛caspase抑制剂Emricasan处理hMOs，通过明场延时成像、活/死染色及免疫荧光（cleaved caspase-3、pRIPK1）评估PCD模式。 关键结果： ▸ Birinapant单药诱导经典凋亡：明场延时成像（图4a）显示12小时后细胞从紧密结构脱离、形态变松散，18小时出现凋亡小体样囊泡；该组在免疫荧光中检测到cleaved caspase-3阳性（图4c）。该结果确认了hMOs对Smac mimetic诱导凋亡的敏感性，为后续比较凋亡与坏死性凋亡两种死亡模式提供了对照基线。 ▸ BiE联合处理诱导坏死性凋亡（图4a、4d）：18小时时整体更紧实，但出现明显细胞肿胀；图4d显示三例donor的BiE组均检测到pRIPK1阳性，确认坏死性凋亡的发生。既往研究显示许多乳腺癌细胞线本身不表达RIPK1/RIPK3/MLKL、对坏死性凋亡不敏感，本研究首次证明患者来源hMOs可表达并磷酸化这三种关键蛋白，确立了原代类器官作为研究乳腺癌坏死性凋亡的有效模型，pRIPK1阳性可作为坏死性凋亡的生物标志物。 ▸ 活/死染色与对照（图4b）：FdA/PI/Hoechst染色显示BiE组PI阳性死细胞数量显著高于Birinapant单药组；阿霉素72小时处理作为阳性对照呈现相似的细胞死亡形态。阳性对照验证了活/死染色体系本身对细胞死亡的检测灵敏度，使BiE组与Birinapant单药组之间的死亡差异更具说服力。 ▸ donor#3的特殊性（图4c）：未处理条件下也检测到一定程度的caspase-3切割，可能与其较低的增殖速率有关。这提示donor#3整体的基础细胞应激水平可能较高，也可能与第5节中donor#3 MLKL本底水平低、坏死性凋亡执行受限的发现存在内在联系。 ▸ BV6效应：与Birinapant相似但6小时即起效，PI信号更强，提示效价更高；BV6单药诱导caspase-3切割，BV6联合Emricasan则诱导pRIPK1。BV6更快的起效时间与第3节中其对cIAP1/XIAP更高亲和力的结论相互印证，进一步支持BV6是本研究中诱导PCD效价最强的Smac mimetic。 图4 Smac mimetics在原代hMOs中诱导PCD。a 用Zeiss Z1 Axioimager宽场显微镜对未处理、对照（1.5% DMSO）及10 µM Birinapant或BiE（10 µM Birinapant+10 µM Emricasan）处理的hMOs每30分钟拍摄明场延时图像（共24小时），展示0、6、12、18、24小时时间点。b 24小时活体成像后，对同一批hMOs进行FdA（活细胞，绿色）、PI（死细胞，红色）及Hoechst33342（所有细胞核，蓝色）染色并再次成像。c、d 按(a)处理24小时的hMOs固定后分别进行cleaved caspase-3（c，品红）和S166磷酸化RIPK1（d，pRIPK1，品红）免疫荧光染色，并用AF647™-鬼笔环肽（黄色）和Hoechst33342（青色）复染，CUBIC-2透明化后用Zeiss LSM780成像。a、d为donor#1代表性图像，比例尺100 µm。 5. 对LUBAC及坏死性凋亡效应分子的药理学调控可挽救Birinapant和Emricasan诱导的hMOs PCD 一句话总结：RIPK1抑制剂Nec-1s可阻断BiE诱导的RIPK1/RIPK3/MLKL磷酸化并挽救坏死性凋亡；MLKL抑制剂NSA不影响这些磷酸化，但通过阻断MLKL寡聚化、膜转位和坏死性孔形成等下游执行过程减少细胞死亡；LUBAC抑制剂HOIPIN-8作用于磷酸化下游、挽救作用较弱；donor#3因MLKL本底低，坏死性凋亡执行受限。 实验设计：在BiE处理的hMOs中分别加入Nec-1s、NSA或预处理HOIPIN-8，通过明场延时成像、活/死染色、CellTiter-Glo及Western blot（pRIPK1/pRIPK3/pMLKL）评估挽救效果，并对HOIPIN-8预处理组进行hallmark基因表达分析。 关键结果： ▸ 形态与活力挽救：明场延时成像（图5a）显示联合Nec-1s、NSA或HOIPIN-8后不再出现坏死性凋亡相关形态改变；donor#1的CellTiter-Glo检测（图5c）显示Nec-1s和NSA显著挽救活力下降，HOIPIN-8挽救作用相对较弱。Nec-1s和NSA的有效挽救进一步验证了第4节观察到的细胞死亡确实由RIPK1-MLKL通路介导，证明该平台可用于坏死性凋亡相关药物的功能学验证。 ▸ 细胞死亡挽救：活/死染色（图5b）及其定量（图5d）显示三种抑制剂均使死细胞数量明显减少，趋势与活力数据一致。形态学（图5a/b）与定量学（图5c/d）数据相互印证，共同构成挽救实验的完整证据链。 ▸ 磷酸化机制（图5e）：Western blot显示BiE可在donor#1、#2中诱导RIPK1/RIPK3/MLKL磷酸化；Nec-1s阻断三者磷酸化；NSA不影响磷酸化（作用于MLKL膜转位下游）；HOIPIN-8同样不影响磷酸化（与团队此前胰腺类器官研究一致，作用于MLKL磷酸化下游）。NSA和HOIPIN-8均不影响磷酸化却仍能挽救细胞死亡，提示二者作用于磷酸化下游的执行环节（如MLKL膜转位/寡聚化），这一“作用于MLKL磷酸化下游”的结论在乳腺癌hMOs中得到了重复验证，提示其具有跨组织的普适性。 ▸ donor#3的特殊性：活力和死亡指标无明显变化，但仍可检测到pRIPK1/pRIPK3，提示坏死性凋亡上游信号被激活，但MLKL本底水平低限制了下游执行。这表明坏死性凋亡的“上游信号激活”与“下游执行（细胞死亡）”是可分离的两个过程，MLKL表达本底水平可能是决定坏死性凋亡能否真正执行的限制性因素，为未来基于MLKL表达预筛选潜在响应患者提供了思路。 ▸ HOIPIN-8诱导ROS通路：前六大上调基因中包含GCLM、GCLC、LUCAT1（抗氧化反应相关）；上调LUCAT1的细胞同时表现为脂肪酸代谢上调、糖酵解下调；HOIPIN-8特异富集的3个细胞簇（cluster 4/14/17）中，cluster 4还伴随UCHL1上调（与化疗耐药相关）。这提示HOIPIN-8在抑制坏死性凋亡的同时，可能通过氧化应激和代谢重编程对乳腺癌细胞的化疗敏感性产生潜在影响，是该类药物未来应用中需要关注的维度。 图5 对LUBAC和坏死性凋亡效应分子的药理学调控可挽救Birinapant和Emricasan诱导的hMOs PCD。a 用宽场显微镜对BiE处理联合1s（30 µM necrostatin-1s）、NSA（20 µM necrosulfonamide）或H（30 µM HOIPIN-8，预处理30分钟）的hMOs每30分钟拍摄明场延时图像（共24小时）。b 24小时活体成像后，同一批hMOs进行FdA/PI/Hoechst33342染色并再次成像。a、b为donor#1代表性图像，比例尺100 µm。c donor#1 hMOs的CellTiter-Glo®活力检测，相对未处理对照标准化。d 活/死染色定量，相对未处理条件标准化（N=3）。e donor#1 hMOs磷酸化及总RIPK1、RIPK3、MLKL的Western blot，vinculin为内参，展示至少三次独立实验的代表性结果。统计均采用单因素ANOVA+Tukey检验。 6. 坏死性凋亡诱导转移性hMOs分泌炎症介质 一句话总结：坏死性凋亡（BiE）显著上调TNF、CXCL10等炎症基因，并增加TNF-α和IP-10（CXCL10）分泌；IL-6、IL-8也呈相似变化趋势。同时，BiE诱导I型/II型干扰素应答通路，并上调多个ISGs。HOIPIN-8预处理可降低坏死性凋亡相关炎症因子/趋化因子的表达和分泌。 实验设计：通过RT-qPCR检测TNF、CXCL10、CXCL1、ICAM1 mRNA水平，CBA法检测上清中TNF-α、IP-10、IL-6、IL-8浓度，并对scCITEseq数据进行donor特异性ISG表达分析及hallmark通路富集分析。 关键结果： ▸ mRNA水平（图6a）：RT-qPCR显示BiE处理使三例donor的TNF和CXCL10显著上调；HOIPIN-8预处理可将其降至接近未处理（donor#1）或Birinapant单药水平（donor#2/#3）；CXCL1、ICAM1呈相似趋势但donor间差异更大。HOIPIN-8能将坏死性凋亡诱导的TNF/CXCL10表达逆转至接近基线水平，证实LUBAC活性是坏死性凋亡相关炎症基因转录的重要驱动因素之一。 ▸ 细胞因子分泌（图6b）：CBA检测显示BiE显著增加TNF-α及IP-10分泌，IL-6、IL-8呈相似变化模式；HOIPIN-8预处理可将各指标降至接近未处理水平。分泌型IP-10已知可作用于周围细胞和肿瘤微环境，影响免疫细胞的浸润、分化和功能，因此其在坏死性凋亡条件下的显著释放，是连接“肿瘤细胞死亡”与“免疫微环境重塑”的关键分子事件。 ▸ 干扰素signature（图6c）：scCITEseq的UMAP图显示坏死性凋亡条件下ISGs（MX1、IFIT1、ISG15、OAS3、STAT1）以donor非依赖方式高表达。与下一条通路富集结果共同构成坏死性凋亡诱导干扰素signature的直接证据。 ▸ 通路富集（图6d）：各donor及合并数据集的hallmark分析均显示IFN-γ和IFN-α应答通路、TNF-α/NF-κB信号显著激活——首次将坏死性凋亡与I/II型干扰素信号在乳腺癌类器官中建立起联系。这意味着坏死性凋亡不仅是一种“细胞自毁”过程，还主动驱动了一套类似抗病毒应答的转录程序，这正是其能够进一步激活NK细胞（见第7节）的分子基础。 图6 坏死性凋亡诱导转移性hMOs分泌炎症介质。a HOIPIN-8（30 µM）预处理的hMOs经10 µM Birinapant（Bi）和10 µM Emricasan（E）处理24小时后TNF和CXCL10 mRNA表达水平，以RPII、18S-rRNA、TBP、RPL13为内参标准化，结果以log2(倍数变化)表示（N=3）。b FACS-based CBA法检测各处理组hMOs上清液中TNF-α和IP-10浓度（N=3）。c 经Birinapant+Emricasan处理24小时后，scCITEseq数据中各donor上调最显著的6个基因的UMAP图，炎症及干扰素相关基因用浅蓝色圈出。d 各donor经BiE处理后scCITEseq数据的hallmark GSEA分析，展示诱导最强的5条通路（编码方式同图2d）。统计均采用单因素ANOVA+Tukey检验。 7. 坏死性凋亡hMOs诱导NK细胞反应 一句话总结：坏死性凋亡hMOs的条件培养液可上调NK-92 MI细胞中IRF9、IFIT1及一定程度的IFNG的表达（donor#2来源效果最显著），但细胞毒性标志物（NCR1/PRF1/GZMB）未见明显变化，提示NK细胞处于“预激活”而非完全活化状态。 实验设计： 将NK-92 MI细胞与对照或坏死性凋亡（BiE）hMOs的条件培养液共培养4小时，通过RT-qPCR检测NK细胞活化标志（IRF9、IFIT1、IFNG）及细胞毒性标志（NCR1、PRF1、GZMB）的mRNA表达。 关键结果： ▸ NK细胞活化标志物：将NK-92 MI细胞与对照或坏死性凋亡（BiE）hMOs的条件培养液共培养4小时后，RT-qPCR显示IRF9（图7a）和IFIT1（图7b）表达上调，IFNG（图7c）也有一定程度升高，其中donor#2来源的条件培养液效果最显著。IRF9是ISGF3复合体的组成部分，有助于NK细胞在病毒感染等情境下的存活，其上调提示坏死性凋亡分泌物可能通过类似“抗病毒”的信号模式对NK细胞起到预激活作用。 ▸ 细胞毒性标志物：NCR1（图7d）、PRF1（图7e）和GZMB（图7f）在对照与坏死性凋亡条件培养液处理组之间未见显著差异。从“基因表达预激活”到“功能性细胞毒性”之间可能存在时间窗口或需要额外信号，未来可考虑延长共培养时间或采用类器官-免疫细胞共培养体系进一步验证。 ▸ 结论：上述结果提示NK细胞处于活化早期的“预激活”（priming）状态，而非完全细胞毒性激活；该实验为坏死性凋亡hMOs释放的可溶性因子能够旁分泌调节NK细胞状态提供了证据。乳腺癌微环境中免疫抑制性细胞（如肿瘤相关巨噬细胞）占比可达50%且与不良预后相关，本研究提示诱导坏死性凋亡有潜力部分激活免疫细胞、缓解这种免疫抑制状态，为坏死性凋亡联合免疫治疗策略提供了实验依据。 图7 坏死性凋亡hMOs诱导NK细胞反应。NK细胞经hMOs条件培养液处理4小时后，IRF9（a）、IFIT1（b）、IFNG（c）、NCR1（d）、PRF1（e）、GZMB（f）的mRNA表达水平，相对未处理条件及内参基因TBP、RPL13、RPII标准化，结果以log2(倍数变化)表示（N=3），单因素ANOVA+Tukey检验。 03 研究意义 Research Significance 类器官模型的转化价值：建立患者来源转移性乳腺类器官平台，保留了原发肿瘤的分子特征与增殖特性，可模拟凋亡耐药、坏死性凋亡及炎症级联反应，支持个体化药物筛选，填补了体外细胞实验与动物模型间的转化研究缺口。 坏死性凋亡突破凋亡耐药困境：证实Smac模拟物可有效诱导乳腺癌细胞凋亡；当 caspase 通路被抑制时，肿瘤细胞可通过RIPK1-RIPK3-MLKL轴转向坏死性凋亡，且该效应可被特异性抑制剂逆转，为凋亡耐药的转移性乳腺癌提供了非caspase依赖的治疗新方向。 坏死性凋亡介导干扰素免疫激活：首次在患者来源乳腺癌类器官中发现，坏死性凋亡可显著上调干扰素刺激基因与I/II型干扰素信号，促进促炎因子分泌，进而激活NK细胞活化通路，为“坏死性凋亡诱导联合免疫治疗”的策略提供了机制支撑。 线性泛素化的靶点价值：证实LUBAC抑制剂HOIPIN-8可作用于MLKL磷酸化下游，延缓坏死性凋亡发生并降低炎症介质表达和分泌；结合作者既往研究，HOIPIN-8可能通过影响MLKL膜定位等过程发挥作用。这为进一步探索如何药理学调控坏死性凋亡强度、降低过度炎症反应提供了潜在靶点线索。 扫描二维码可下载原文 大橡科技肿瘤类器官药物评价 大橡科技依托自主创新的类器官芯片平台与标准化肿瘤类器官样本库，打造精准药物评价解决方案。平台可高度还原肿瘤微环境与异质性，突破传统模型局限，高效支持小分子、抗体、ADC、CGT等多种类型候选药物的敏感性检测与耐药机制研究，助力药企快速筛药，降低研发成本与临床转化风险；依托平台标准化培养体系与稳定的检测流程，为临床个体化用药提供精准导航，全面推动肿瘤药物研发与精准医疗落地。小分子药物 更多研究案例，点击下方链接：客户文章解读｜PARP抑制剂耐药了怎么办？中国团队最新发现，铜离子或是破局关键 GUT重磅｜突破肠毒性-疗效困境！类器官共培养精准筛选小分子，革新免疫治疗副作用管理 《Cell》详细解读｜首个针对生物分子凝聚体（液-液相分离）机制的抗食管癌药物，类器官参与验证 抗体、ADC药物 更多研究案例，点击下方链接：类器官新机制：为何HER2低表达的尿路上皮癌仍对靶向治疗敏感？ STTT（IF52.7）皮摩尔级锁定！PDOX模型验证抗CD155纳米抗体携药直捣肺腺癌 肿瘤克星：类器官研究为ADC药物研发按下“快进键” CGT药物 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