(CV-8102) - 药物靶点：RIG-I x TLR7 x TLR8_在研适应症：腺样囊性癌，皮肤鳞状细胞癌，皮肤黑色素瘤_专利_临床

概要

基本信息

药物类型

mRNA疫苗

别名

靶点

RIG-I x TLR7 x TLR8

作用机制

RIG-I刺激剂(维甲酸诱导基因I刺激剂)、TLR7激动剂(Toll样受体7激动剂)、TLR8激动剂(Toll样受体8激动剂)

治疗领域

肿瘤皮肤和肌肉骨骼疾病

在研适应症

腺样囊性癌皮肤鳞状细胞癌皮肤黑色素瘤+ [1]

非在研适应症

结直肠癌

原研机构

CureVac SE

在研机构

CureVac NV

非在研机构

Immatics Biotechnologies GmbH

CureVac SE

最高研发阶段临床1期

首次获批日期-

最高研发阶段(中国)-

特殊审评-

序列信息

Sequence Code 263419486

关联

3

项与 CV-8102 相关的临床试验

NCT03291002 / Active, not recruiting临床1期

Phase I Study of Intratumoral CV8102 in Patients With Advanced Melanoma, Squamous Cell Carcinoma of the Skin, Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck, or Adenoid Cystic Carcinoma

This study evaluates intratumoral administration of CV8102 in patients with advanced melanoma, squamous cell carcinoma of the skin, squamous cell carcinoma of the head and neck, or adenoid cystic carcinoma.
Patients will receive CV8102 as single agent or in combination with SoC anti-PD-1 therapy.

开始日期2017-09-25

申办/合作机构

CureVac NV

[+2]

NCT03203005 / Completed临床1/2期IIT

A Phase I/II Trial of IMA970A Plus CV8102 Following a Single Pre-vaccination Infusion of Cyclophosphamide in Patients With Very Early, Early and Intermediate Stage of Hepatocellular Carcinoma After Any Standard Treatments

This study is being carried out in order to evaluate a new cancer vaccine called IMA970A combined with CV8102, a new adjuvant for the treatment of liver cancer (hepatocellular carcinoma). It will be investigated whether IMA970A and CV8102 is safe and can trigger an immune response against the tumor, which may prevent the tumor (cancer) from recurring or spreading or may even lead to tumor shrinkage following the standard treatments the patients have previously received.

开始日期2017-09-18

申办/合作机构

National Cancer Institute

[+2]

NCT02238756 / Completed临床1期

Phase I Safety and Tolerability Trial of Single and Repeat Doses of the RNA-based Adjuvant CV8102 Alone and in Combination With a Licensed Rabies Virus Vaccine in Healthy Adults

The purpose of this clinical trial is to investigate the safety and tolerability of IM administered CV8102 and an IM administered combination of CV8102 and rabies vaccine in humans.

开始日期2014-09-01

申办/合作机构

CureVac NV

100 项与 CV-8102 相关的临床结果

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100 项与 CV-8102 相关的转化医学

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100 项与 CV-8102 相关的专利（医药）

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5

项与 CV-8102 相关的文献（医药）

2022-11-02·Cancer immunology, immunotherapy : CII

Local immunotherapy with the RNA-based immune stimulator CV8102 induces substantial anti-tumor responses and enhances checkpoint inhibitor activity.

Article

作者: Johannes Lutz ; Michael Meister ; Mohamed Habbeddine ; Katja Fiedler ; Aleksandra Kowalczyk ; Regina Heidenreich

Immunotherapy has revolutionized cancer treatment in recent years. Although currently approved checkpoint inhibitors (CPIs) yield remarkable anti-tumoral responses in several cancer types, a substantial proportion of patients do not benefit from such therapies. Local activation of innate immune signaling pathways is a promising approach to overcome the immunosuppressive tumor microenvironment, induce anti-tumor immunity, and improve the efficacy of CPI therapies. Here, we assessed the mode of action and efficacy of the RNA-based innate immune stimulator CV8102 for local immunotherapy in preclinical models. Intratumoral (i.t.) administration of CV8102 activated innate immune responses in the tumor microenvironment and draining lymph nodes, resulting in a dose-dependent anti-tumoral response. Combining i.t. CV8102 with systemic anti-programmed death protein 1 (PD-1) treatment further enhanced anti-tumoral responses, inducing tumor infiltration and activation of CD8⁺ T cells. The resulting memory response prevented tumor growth in rechallenged animals and impaired the growth of non-injected distal tumors. Therefore, i.t. CV8102 delivery is a promising approach for local cancer immunotherapy, especially in combination with CPIs. Clinical testing of CV8102 is ongoing (NCT03291002).

2022-04-14·Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research1区 · 医学

Phase I/II multicenter trial of a novel therapeutic cancer vaccine, HepaVac-101, for hepatocellular carcinoma.

1区 · 医学

Article

作者: Markus W Löffler ; Stefania Gori ; Francesco Izzo ; Andrea Mayer-Mokler ; Paolo Ascierto ; Alfred Königsrainer ; Yuk Ting Ma ; Bruno Sangro ; Sven Francque ; Luisa Vonghia ; Alessandro Inno ; Antonio Avallone ; Jörg Ludwig ; Diego Duarte Alcoba ; Christian Flohr ; Katrin Aslan ; Regina Mendrzyk ; Heiko Schuster ; Marco Borrelli ; Danila Valmori ; Tanguy Chaumette ; Regina Heidenreich ; Cecile Gouttefangeas ; Greta Forlani ; Maria Tagliamonte ; Caterina Fusco ; Roberta Penta ; Mercedes Iñarrairaegui ; Ulrike Gnad-Vogt ; Carsten Reinhardt ; Toni Weinschenk ; Roberto S Accolla ; Harpreet Singh ; Hans-Georg Rammensee ; Luigi Buonaguro

PURPOSE:

Immunotherapy for hepatocellular carcinoma (HCC) shows considerable promise in improving clinical outcomes. HepaVac-101 represents a single-arm, first-in-man Phase I/II multicenter cancer vaccine trial for HCC (NCT03203005). It combines multi-peptide antigens (IMA970A) with the TLR7/8/RIG I agonist CV8102. IMA970A includes 5 HLA-A*24 and 7 HLA-A*02 as well as 4 HLA-DR restricted peptides selected after mass spectrometric identification in human HCC tissues or cell lines. CV8102 is an RNA-based immunostimulator inducing a balanced Th1/Th2 immune response.

EXPERIMENTAL DESIGN:

82 patients with very early to intermediate stage HCCs were enrolled and screened for suitable HLA haplotypes and 22 put on study treatment. This consisted in a single infusion of low-dose cyclophosphamide followed by 9 intradermal coadministrations of IMA970A and CV8102. Only patients with no disease relapse after standard of care treatments were vaccinated. Primary endpoints of HepaVac-101 clinical trial were safety, tolerability and antigen-specific T-cell responses. Secondary or exploratory endpoints included additional immunological parameters and survival endpoints.

RESULTS:

The vaccination showed a good safety profile. Transient mild-to-moderate injection-site reactions were the most frequent IMA970A/CV8102-related side effects. Immune responses against {greater than or equal to}1 vaccinated HLA class I tumor-associated peptide (TAA) and {greater than or equal to}1 vaccinated HLA class II TAA were respectively induced in 37% and 53% of the vaccinees.

CONCLUSION:

Immunotherapy may provide a great improvement in treatment options for HCC. HepaVac-101 is a first-in-man clinical vaccine trial with multiple novel HLA class I- and class II-restricted TAAs against HCC. The results are initial evidence for safety and immunogenicity of the vaccine. Further clinical evaluations are warranted.

2021-06-01·Annals of translational medicine4区 · 医学

Current status of intralesional agents in treatment of malignant melanoma.

4区 · 医学

Review

作者: Misam Zawit ; Umang Swami ; Hassan Awada ; Joyce Arnouk ; Mohammed Milhem ; Yousef Zakharia

Prognosis of metastatic melanoma has undergone substantial improvement with the discovery of checkpoint inhibitors. Immunotherapies and targeted therapies have improved the median overall survival (OS) of metastatic melanoma from 6 months to more than 3 years. However, still about half of the patients die due to uncontrolled disease. Therefore, multiple strategies are currently being investigated to improve outcomes. One such strategy is intralesional/intratumoral (IT) therapies which can either directly kill the tumor cells or make the tumor more immunogenic to be recognized by the immune system. Talimogene laherparepvec (T-VEC), an oncolytic virus, is the first FDA approved IT therapy. This review focuses on the current status of IT agents currently under clinical trials in melanoma. Reviewed therapies include T-VEC, T-VEC with immune checkpoint inhibitors including ipilimumab and pembrolizumab or other agents, RP1, OrienX010, Canerpaturev (C-REV, HF10), CAVATAK (coxsackievirus A21, CVA21) alone or in combination with checkpoint inhibitors, oncolytic polio/rhinovirus recombinant (PVSRIPO), MAGE-A3-expressing MG1 Maraba virus, VSV-IFNbetaTYRP1, suicide gene therapy, ONCOS-102, OBP-301 (Telomelysin), Stimulation of Interferon Genes Pathway (STING agonists) including DMXAA, MIW815 (ADU-S100) and MK-1454, PV-10, toll-like receptors (TLRs) agonists including TLR-9 agonists (SD-101, CMP-001, IMO-2125 or tilsotolimod, AST-008 or cavrotolimod, MGN1703 or lefitolimod), CV8102, NKTR-262 plus NKTR-214, LHC165, G100, intralesional interleukin-2, Daromun (L19IL2 plus L19TNF), Hiltonol (poly-ICLC), electroporation including calcium electroporation and plasmid interleukin-12 electroporation (pIL-12 EP), IT ipilimumab, INT230-6 (cisplatin and vinblastine with an amphiphilic penetration enhancer), TTI-621 (SIRPαFc), CD-40 agonistic antibodies (ABBV-927 and APX005M), antimicrobial peptide LL37 and other miscellaneous agents.

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项与 CV-8102 相关的新闻（医药）

2024-02-08

·生物制品圈

中国人用狂犬病疫苗的百年发展

摘要：1885年，巴斯德发明了狂犬病疫苗，约30年后狂犬病疫苗被引入我国。从20世纪20年代起，我国人用狂犬病疫苗历经了从动物脑组织疫苗到Vero细胞和人二倍体细胞疫苗等发展过程。我国人用狂犬病疫苗的生产工艺不断发展创新，疫苗质量不断提高。至2022年，我国人用狂犬病疫苗的年产量已达2000万人份，跃升成为生产和使用大国。另外，我国狂犬病发病率也降至0.0111/10万。不过，我国离达成2030年消除狂犬病的目标还有一定距离。1简介狂犬病是由狂犬病毒引起的一种急性传染病，人兽都可以感染，又称恐水病、疯狗病等。狂犬病一旦发病，其进展速度很快，病死率几乎为100%，可防不可治，需及时进行规范的暴露后预防处置。该病可以说是人类病死率最高的急性传染病。现全球有100多个国家和地区有狂犬病流行，大部分发生在亚洲和非洲的发展中国家，每年造成约5.9万例死亡，是致死人数最多的动物源性传染病之一。其中，亚洲国家的狂犬病病例数居世界首位，估计年死亡例数达3万例，由于部分亚洲国家狂犬病病例可能存在漏报，实际死亡例数可能更多。我国是狂犬病流行地区。2021年我国共有116个县报告157例狂犬病病例，已经达到了狂犬病控制阶段。本文主要对中国人用狂犬病疫苗发展历程以及相关研究新进展进行了梳理和概括。图1. 2015-2021年中国狂犬病报告病例数及病例分布省份数（来源：Zoonoses）2发展历程20世纪20年代开始，中国人用狂犬病疫苗历经动物脑组织疫苗、加佐剂PHK细胞疫苗、浓缩加佐剂PHK细胞疫苗、浓缩纯化加佐剂PHK细胞疫苗、浓缩纯化无佐剂PHK细胞疫苗、无佐剂Vero细胞浓缩纯化疫苗和无佐剂人二倍体细胞浓缩纯化疫苗等发展历程，生产工艺逐步成熟、稳定。另外，由于mRNA 技术的发展，国内已有机构着手mRNA狂犬病疫苗的研发。图2.人狂犬病疫苗发展历程2.1 动物脑组织狂犬病疫苗中国在1925年前后引进Semple法生产狂犬病疫苗，所用毒种为巴斯德株。所谓Semple法，是1911年由在印度的英国人SEMPLE首创，其将感染狂犬病固定毒羊脑组织研磨成10%组织悬液，加入1%石碳酸，于37 ℃灭活24-40 h，将灭活后悬液加等量生理盐水稀释成5%脑组织悬液，内含0.50%石碳酸，疫苗为完全无感染性活病毒。1931年，北平卫生署猎杀了一只狂犬病犬，袁浚昌从其脑中分离出狂犬病病毒。中央防疫处的齐长庆和李严茂通过兔脑将这种狂犬病病毒从街毒训化为固定毒，当时称之为中国株，后定名为北京株，31代以后用于制造狂犬病疫苗。1933年，中央防疫处生产狂犬病疫苗即改用中国株（即北京株），上海有些药厂用巴斯德株。虽然全国都采用感染狂犬病病毒兔或羊脑组织，研磨成匀浆后以石碳酸灭活Semple法生产，但所用动物种类、石碳酸灭活时间、效价检定标准都未能统一。1950年全国调整了生物制品生产单位，1951年又有了法规草案，人用狂犬病疫苗生产工艺及质量要求全国才有了统一标准。1957年北京生物制品研究所（简称北京所）和武汉生物制品研究所（简称武汉所）对羊脑疫苗及兔脑疫苗作了比较，证实前者比后者保护指数更好。因此，以后生产的疫苗均为羊脑疫苗，其免疫效果据长春生物制品研究所（简称长春所）资料是肯定的。由于全国对犬管理加强，50 年代后期狂犬病病例已很少，全国仅有个别省、自治区有病例报告，年发病例为50-400例。人用狂犬病疫苗生产量亦随之减少。1958-1967年，全国仅武汉所、兰州生物制品研究所（简称兰州所）、长春所3个生物制品研究所生产人用狂犬病疫苗。随后，由于养狗失控，狂犬病病例逐年增加，至19世纪80年代每年报告病例可达万例。疫苗需求量供不应求，上海生物制品研究所（简称上海所）、北京所、成都生物制品研究所（简称成都所）相继恢复生产。1949 年以来，中国Semple疫苗质量不断提高，对预防和降低狂犬病起到了一定作用，但也出现过脑组织引起变态性脑脊髓炎病例，并有免疫失败病例发生的情况。20世纪70年代前，中国的人用狂犬病疫苗有2 种剂型，一种是添加蔗糖、明胶等保护剂制成的冻干制剂，另一种是Semple法生产的含0.50%石碳酸液体制剂。2 种剂型均含有 5%灭活狂犬病病毒羊脑组织，但 Semple 法羊脑组织疫苗不良反应严重，又需要连续注射14针，至20世纪70年代末逐渐被细胞培养的狂犬病疫苗所取代。2.2 原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗为解决神经组织（动物脑）狂犬病疫苗接种人体后的神经合并症和效价低问题，中国有关单位于20世纪60年代开始研制原代细胞培养人用狂犬病疫苗。2.2.1 原制加佐剂地鼠肾细胞疫苗1965年，武汉所林放涛等即开始研究用 PHK 细胞培养狂犬病病毒，并成功培育出aG株。经过多次传代和实验，aG株在豚鼠脑和PHK细胞上生长稳定，被确定为疫苗株。其实武汉所早期计划用 aG 株生产减毒活疫苗，但因安全问题，于1972 年改为生产灭活疫苗，并成立狂犬病灭活疫苗研究课题，由卢孝曾任组长。20世纪60年代，长春所褚菊仁、兰州所梁名奕及卫生部药品生物制品检定所（中国药品生物制品检定所前身）俞永新等先后参加协作共同研制，经过15年成功研发出原制加佐剂PHK细胞灭活疫苗。该疫苗于1980年开始生产和应用，年产量已超过100万剂，总体预防效果良好。但存在一些免疫失败案例，原因之一是抗原量偏低，疫苗效价只有1.3 IU/剂，不符合 WHO 标准(≥2.5 IU/剂）。中国狂犬病细胞疫苗取得成功，得到国际同行的高度重视。1984 年林放涛、卢孝曾应邀参加南斯拉夫国际狂犬病疫苗会议并进行相关报告，其还得到了与会代表国际著名狂犬病专家 WIKTOR、SUREAU 和 BEAR 等的高度赞扬。2.2.2 浓缩佐剂地鼠肾细胞疫苗1993年，我国原卫生部决定生产疫苗效价≥2.5 IU/剂的浓缩或纯化佐剂疫苗，替代未经浓缩的佐剂疫苗，以提高疫苗质量。随后各生产单位开始大量生产浓缩佐剂疫苗。但由于未纯化，该类疫苗含有一定杂蛋白，不良反应增强。陈学奎等以豚鼠为实验动物模型，将PHK细胞狂犬病浓缩疫苗成品致敏豚鼠后，以疫苗内不同成份静脉注射，结果证实，PHK细胞成份是引起过敏重要物质，过敏严重程度随制品浓缩倍数增大而增大。2.2.3 浓缩纯化佐剂地鼠肾细胞疫苗由于人用浓缩狂犬疫苗效果不稳定、不良反应大，自2000年10月1日起，我国停止生产人用浓缩狂犬病疫苗，并注销该品种的批准文号。原已投产并合规的浓缩疫苗在2001年9月30日前仍可销售使用，逾期则视为销售假药。因此，国家药监局决定纯化狂犬病疫苗的生产和使用。1998年，辽宁生物技术公司等多家疫苗公司取得纯化佐剂疫苗生产文号。纯化疫苗是在浓缩佐剂疫苗原生产工艺基础上，对病毒收获液先浓缩再纯化。虽然在3或5剂完全免疫后的中和抗体阳转率为100%，但当时监管部门没有要求生产企业提供免疫后10-14 d GMT 数据，所以对这种疫苗早期抗体应答情况不清。林海祥等通过小鼠实验证实加铝佐剂疫苗免疫后4d和7d中和抗体滴度明显低于不含铝佐剂疫苗免疫后抗体水平。因此，有必要研制无佐剂纯化疫苗。2.2.4 浓缩纯化无佐剂地鼠肾细胞疫苗2000年后，河南普新生物工程有限公司（现改名为“河南远大生物制药有限公司”）率先生产无佐剂人用狂犬病疫苗，试生产时用1批原液分别添加和不添加 AL(OH)3佐剂制备2种疫苗。选取17-67岁的健康志愿者，按5针法程序进行安全性和有效性观察。结果显示，无佐剂纯化狂犬病疫苗组局部不良反应低于佐剂纯化狂犬病疫苗组，且无佐剂苗免疫后具有快速产生中和抗体的优点。同时，参考国际上所有暴露后免疫用疫苗都是不加佐剂的疫苗，因此中检所多次提出并经国家药品监督管理局同意，决定生产无佐剂狂犬病疫苗替代佐剂疫苗。无佐剂狂犬病疫苗生产工艺与加佐剂狂犬病疫苗类似，不同之处在于半成品配制阶段不加Al(OH)3 佐剂。目前仍有 2 家疫苗企业在国内生产和销售浓缩纯化无佐剂 PHK 细胞狂犬病疫苗，2019-2021年的批签发量分别为 63 万、 105 万、 64 万人份。2.3 Vero细胞狂犬病疫苗Vero细胞被WHO认可并推荐为疫苗生产用细胞基质，其优势在于易传代增殖、可在生物反应器中大规模扩增、能模式化培养和在限定代次内细胞特性保持稳定，受到广大科研工作者和生产人员青睐。中国在开展PHK细胞培养人用狂犬病疫苗升级换代同时，也在紧跟国际前沿，积极开展采用Vero细胞进行狂犬病疫苗的研发和生产。在中国，可在Vero细胞上生产狂犬病疫苗的疫苗株有aG、CTN-1、PV和PM株等。2.3.1 用aG株生产的Vero细胞疫苗20 世纪 90年代前后，李宏玲、曾蓉芳、顾悦翔等曾经用aG株在Vero细胞上传代适应，结果显示aG株在Vero细胞上的病毒滴度可以满足疫苗生产需要。1990 年，上海所曾蓉芳等报告用 aG株在 Vero细胞适应后获得高滴度的RFD株。1997年，曾蓉芳等又报告在生物反应器内用Vero细胞培养 RFD株获得高滴度狂犬病病毒，病毒滴度可达6.0-8.0lgLD50/mL，病毒原液纯化后得到狂犬病疫苗，小量试制工艺基本可行。2014年，吴金妍等报告了这项工作的后续，2003-2005年开展的临床试验结果显示，与对照组相比，试验组不良反应发生率和中和抗体阳转率差异无统计学意义（r>0.05）。这项研究临床结果比较理想，但未见该疫苗后续上市报道。1992年，长春所顾悦翔等报告利用微载体悬浮培养技术在Vero细胞上开展aG株适应工作，但aG株适应较缓慢，没有取得突破性进展。2009年，袁彦宝等获得aG株在Vero细胞的适应株（4aG-V株）。2011年，郭秀侠等报告3aG株在Vero细胞上适应传代成功。经过前后逾30年的技术积累和科研攻关，2021年长春所获得冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）生产批件并开始批签发。2.3.2 用CTN-1株生产的Vero细胞疫苗CTN-1株由中检所建株和保存，CTN-1株传代历史如下：1956 年自山东淄博一名死于狂犬病病人脑组织分离到原始病毒，命名为CTN-S1 株，经小鼠脑内连续传代56次后变为固定毒，命名为CTN-M 株；后经人二倍体细胞 KMB- 17连续传代50次，在Vero细胞上适应30代即为CTN-1株。1989年，李宏玲等开展了CTN-1株在Vero细胞上适应传代的初步探索。1995年，董关木等证实CTN-1株可在Vero细胞上快速适应，病毒滴度可达7.0 lgLD50/mL以上。后又将CTN-1 56代毒种继续在KMB- 17细胞传代至108代，病毒滴度高达6.5-7.0 lgLD50/mL，原计划用于制备人二倍体细胞狂犬病疫苗，但因病毒培养技术和生产条件不足而未成功。石磊泰等首次对中国狂犬病疫苗生产株 CTN-1进行了全基因组序列测定和比对分析。1998-2001 年，沈阳生物工程公司和沈阳安迪生物高科技公司从中检所获得CTN-1毒种后，开始用CTN-1在Vero细胞培养内进行适应和生产工艺研究。2009年，武汉所把450名健康志愿者随机分为2组，试验组300人接种CTN-1株生产的冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞），对照组150人接种进口冻干无佐剂人用狂犬病纯化疫苗，采用5针法免疫程序，观察并记录每针次免疫后局部和全身不良反应，采用快速荧光灶抑制试验（rapidfluorescence focus inhibition test, RFFIT）检测血清中和抗体。结果显示，该冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）具有良好的安全性和有效性，目前该疫苗已于2017 年开始批签发。2018 年，大连雅立峰生物制药有限公司对CTN- 1株生产的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）进行安全性和有效性评价，后该疫苗也于2017年开始批签发。2023年，华兰生物疫苗股份有限公司用CTN-1株生产的冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）正式获得药品注册证书。此外，2021年1月，江苏金迪克生物技术股份有限公司用CTN-1株生产的冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）完成Ⅲ期临床试验。2022年12月，广州瑞贝斯药业有限公司用CTN-1株在Vero细胞上培养的冻干人用狂犬病疫苗进入Ⅲ期临床试验。2.3.3 用其他毒株生产的Vero细胞疫苗 2002年，辽宁成大生物技术有限公司引进巴斯德狂犬病病毒PV株和相关生产技术，采用微载体以灌流式培养，连续收获病毒液的生物反应器技术，成功研制无佐剂Vero细胞纯化疫苗。该公司的人用狂犬病疫苗除了在国内使用，还出口到泰国、菲律宾和埃及等“一带一路 ”沿线国家。2022年，山东亦度生物技术有限公司使用PV株在Vero细胞上培养的冻干人用狂犬病疫苗也在国内开始批签发。2017-2018 年，安徽智飞龙科马生物制药有限公司用PM株在Vero细胞上生产的冻干人用狂犬病疫苗获得临床试验批件。2022年5月，成都柏奥特克生物科技股份有限公司用rPV株生产的无血清冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）完成Ⅲ期临床试验现场工作。2023 年8月，上海荣盛生物药业股份有限公司公司用 PM 株在Vero细胞生产的冻干人用狂犬病疫苗完成部分Ⅲ期临床试验。2023年9月，江苏康润生物科技有限公司自主研发的冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）生产注册申请获得国家药品监督管理局批准，取得药品注册批件。该疫苗毒株来源于美国疾病预防控制中心(CDC)，是国际广泛使用的毒株。Vero细胞来源于美国ATCC，为WHO和美国FDA推荐认可的细胞株。其是国内首家采用核酸酶去除Vero细胞DNA，并获得发明专利。三期临床试验研究证明安全有效。2.4 人二倍体细胞狂犬病疫苗2014年，成都康华生物制品股份有限公司创新使用微载体，在生物反应器中规模化生产的二倍体人用狂犬病疫苗在中国获批上市。相对于国外同类产品采用的细胞工厂培养技术，微载体能提高细胞密度和培养基利用率。生物反应器全自动化控制培养条件及全封闭管路系统，即使不添加抗生素，也能有效控制污染，同时还降低了批间差异，提高了培养规模和效率，更为重要的是，产品质量更稳定、均一、可控。2010年，北京民海生物科技有限公司开始与法国赛诺菲巴斯德公司合作，用PM株和MRC-5细胞生产冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞），经过多年本土化研究和实施，该疫苗已于 2023年9月在中国获批上市。2017-2018年，安徽智飞龙科马生物制药有限公司用PM株在MRC-5细胞上生产的冻干人用狂犬病疫苗（人二倍体细胞）获得临床试验批件。2022年10月，成都所用PM株生产的冻干人用狂犬病疫苗（2BS细胞）开始Ⅲ期临床试验。2.5 原代鸡胚细胞狂犬病疫苗2010年以来，深圳卫光生物制品股份有限公司科研人员基于CTN-1株已有成果开展了创新性工作，首先将 CTN-1株在Vero细胞连续10代，收获的毒种在鸡胚上传1代，鸡胚传代收获的毒种再在鸡胚细胞上进行连续传代。在鸡胚细胞适应性传代过程中，毒株致病性显著下降，传至15代时采用小鼠法检测病毒滴度，动物已无典型狂犬病症状（无动物死亡，无动物出现弓背、耸毛、狂躁不安等症状）。27代后改为乳鼠法及细胞免疫荧光法进行病毒滴度检测。随着在鸡胚细胞上传代次数增加，毒株适应性及稳定性逐步增强，在鸡胚细胞上传至33代时，细胞免疫荧光法检测病毒滴度可达7.0lgLD50/mL 以上，33代毒株定名为CTNCEC25。目前，CTNCEC25 株鸡胚细胞人用狂犬病疫苗正在注册申报中。2017 年，上海青赛生物科技股份有限公司从国外引进Flury株研发鸡胚成纤维细胞人用狂犬病疫苗获得国内临床试验批件，目前正在开展Ⅲ期临床研究。图3.四种狂犬疫苗对比（来源：中泰证券研究所）3研发新进展3.1 关于佐剂开发高效、低毒、安全、廉价的新型狂犬病疫苗佐剂是目前狂犬病疫苗研究的重要方向之一。皮卡佐剂是一种TLR3激动剂，能够激活有效的抗原提呈细胞，如树突状细胞，从而产生更强大的适应性免疫。Kalimuddin等对健康成人进行的II期开放标签随机研究,进一步证实了加速免疫程序(第0d和第3d双剂注射,第7d单剂注射)下皮卡佐剂狂犬病疫苗的安全性和免疫原性。CV8102是一种TLR7/8/RIGI激动剂RNA佐剂。首次人体试验研究显示,CV8102单独或与狂犬病疫苗联合接种时，主要引起1级或 2级局部或全身反应 ,无相关严重不良反应发生。25-50mgCV8102与狂犬病疫苗联合接种可显著增强狂犬病疫苗的免疫原性。50mgCV8102剂量下,14名受试者中有2人出现严重但自限性的流感样症状。3.2 关于新型疫苗近年来狂犬病新型基因工程疫苗研究获得长足进步 ,不断涌现出新型疫苗，且相关临床试验也显示出良好的安全性和免疫原性：3.2.1 基于mRNA编码的针对抗原的疫苗2017年在医学权威杂志Lancet上发表了一项研究报告了一种基于鱼精蛋白的mRNA疫苗(CV7201) 在健康成人中的I期临床试验结果。这项首次在健康人群开展的临床研究结果表明，CV7201在使用无针装置免疫时可以诱导产生针对病毒抗原的功能性抗体，但使用带针注射器免疫时不能产生有效的免疫反应。3.2.2 猴腺病毒载体狂犬病候选疫苗ChAdO×2RabG是一种用猴腺病毒作载体的狂犬病候选疫苗，2022年一项首次人体研究旨在评估其在健康成人中的安全性和免疫原性。该研究中ChAdO×2RabG显示出可接受的安全性和耐受性,并具有令人鼓舞的免疫原性，支持进一步的临床评估。3.2.3 新型重组纳米颗粒狂犬病病毒糖蛋白疫苗2021年，印度研究人员研发了一种新型重组纳米颗粒狂犬病病毒糖蛋白疫苗。随机、对照、多中心、III期临床研究中，800名受试者按2：1的比例随机接种疫苗(第0d、3d、7d接种3剂)和对照疫苗(第0d、3d、7d、14d和28d接种5剂)。结果显示，新型3剂重组狂犬病病毒糖蛋白疫苗进行模拟暴露后预防接种，在安全性和免疫原性方面不劣于WHO通过资格预审的5剂疫苗。4结语近年来，人用狂犬病疫苗的研究取得了很大的进展，狂犬病负担较重的国家（尤其是亚洲国家）也推动了狂犬病疫苗的开发。但距离世界卫生组织（WHO）、世界动物卫生组织（OIE）、世界粮农组织（FAO）和全球狂犬病控制联盟（GARC）共同提出的2030年消除犬传人的狂犬病的目标仍有一定差距。而疫苗至今仍是消灭狂犬病最有效的方法。目前，尽管禽胚培养疫苗和细胞培养疫苗，如基于原代地鼠肾细胞、鸡胚细胞、人二倍体细胞和Vero细胞培养的人狂犬病疫苗是临床上使用率最大的狂犬病疫苗类型。但基于新型佐剂和mRNA技术平台的狂犬病疫苗将会是目前最有希望替代传统疫苗的类别。参考资料：[1]石磊泰,俞永新.中国人用狂犬病疫苗的百年发展[J/OL].微生物学免疫学进展,2024,(01):1-8[2024-02-04].http://kns.cnki.net/kcms/detail/62.1120.R.20240116.1738.010.html.[2]随海田,郭星,张倩等.人用狂犬病疫苗及其应用研究进展[J].中国人兽共患病学报,2023,39(12):1158-1164.[3]中华预防医学会狂犬病预防控制工作委员会, 中国医学救援协会动物伤害救治分会. 狂犬病暴露前预防专家共识 [J] . 中华医学杂志, 2023, 103(39) : 3103-3111. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20230411-00583.[4]赵鹭，左静，刘海文. 人用狂犬病疫苗研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2022, 45(6): 349-353. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

疫苗信使RNA

2023-08-29

·生物制品圈

mRNA癌症疫苗：研究进展、趋势和挑战

摘要患者对信使核糖核酸(mRNA)疫苗表现出良好的耐受性，编码分子的选择是灵活多样的。这些疫苗可以被设计成表达包含多个表位的全长抗原，而不受主要组织相容性复合体(MHC)的限制，相对容易控制，并且可以快速批量生产。美国食品药品监督管理局(FDA)于2021年批准了辉瑞和BioNTech生产的首个基于mRNA的新型冠状病毒病(COVID-19)疫苗，引发了mRNA疫苗研发热潮。基于上述特点和mRNA疫苗的发展，尤其是近五年来，mRNA肿瘤疫苗已成为研究热点，发展迅速。本文从抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用、不同给药途径和临床前评价等方面对mRNA肿瘤疫苗的研究进展进行了分析，以反映mRNA肿瘤疫苗的发展趋势和面临的挑战。关键词：mRNA，癌症疫苗，肿瘤相关抗原，新抗原，mRNA递送载体，佐剂，给药途径。1.mRNA疫苗和mRNA癌症疫苗1961年，Brenner等人首次发现mRNA，它是基因作为蛋白质表达所必需的关键中间分子，含有与氨基酸(蛋白质的基本单位)相对应的密码子信息。1990年，Wolff等人首次证明，通过肌肉注射编码相应蛋白的纯RNA，可以在小鼠体内有效表达特定蛋白[如氯霉素乙酰转移酶和荧光素酶(Luc)]；具体来说，βgLucβgAn RNA的蛋白表达以剂量依赖性和时间依赖性的方式发生；这项工作还提出了mRNA疫苗的概念。2020年，美国食品和药物管理局(FDA)紧急批准了Pfizer--BioNTech/BNT162b2和Moderna/mRNA-1273生产的两种基于mRNA的疫苗，用于预防2019年冠状病毒病(COVID - 19)。2021年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了Pfizer-BioNTech(上市名称为Comirnaty)生产的首个COVID-19疫苗，激发了mRNA疫苗的研发热情，并对mRNA癌症疫苗的突破产生了期待。迄今为止，研究人员已将mRNA用作疫苗平台[例如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、冠状病毒、病毒抗原(狂犬病病毒糖蛋白、寨卡病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的蛋白质)，细菌病原体(结核分枝杆菌)和癌症]和蛋白质替代平台(例如factor IX、卵泡抑素、鸟氨酸经甲氨基甲酰基酶和促红细胞生成素)，用于疾病的预防和治疗。mRNA疫苗具有许多共同特征。与质粒脱氧核糖核酸(DNA)和病毒载体存在因基因插入和/或感染而导致突变的风险不同，mRNA进入细胞质后可直接翻译成蛋白质；因此，mRNA疫苗是非整合的、非传染性的、耐受性良好的。mRNA也在细胞中短暂表达，允许重复接种。mRNA转录物中编码单位的选择是灵活多样的，允许编码抗原和免疫调节分子来诱导和调节适应性和先天免疫应答，并且含有多个表位的编码全长抗原可以由MHC Ⅰ类(MHC-Ⅰ)和Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子呈现，而不受MHC限制。体外转录(IVT) mRNA的生产不需要细胞，防止了蛋白质或病毒的污染，并允许快速、经济和容易的大规模生产。mRNA癌症疫苗利用编码肿瘤抗原或免疫调节分子的mRNA递送相应的蛋白，结合相关的递送载体和佐剂，诱导抗肿瘤应答。图1显示了mRNA癌症疫苗的发展时间表。抗肿瘤T细胞是介导这些疫苗治疗效果的主要预期效应细胞，图2总结了抗肿瘤T细胞产生和作用的机制。RNA在疫苗位点被DCs摄取，翻译并加工成抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物并呈递到细胞表面。活化的DCs到达引流淋巴结，呈递的抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物与淋巴结内分化簇8 (CD8)+/CD4+ T细胞(第一信号)表面的T细胞受体(TCR)结合，导致T细胞活化和增殖，共刺激信号分子[如CD80/CD86, OX40配体(OX40L)]与受体(如CD28, OX40)在T细胞(第二信号)和细胞因子[如干扰素(IFN) I，白细胞介素12 (IL-12)， IL-1]与T细胞上的细胞因子受体结合(第三信号)。此外，CD4+ T细胞分泌的IL-2可促进CD8+ T细胞扩增。活化的T细胞在趋化因子[如CC -趋化因子受体7，CC -趋化因子配体(CCL) 5，CXC -趋化因子配体9/10]的作用下向肿瘤组织迁移并浸润，最大限度地发挥其分泌的效应器[如IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、穿孔素、颗粒酶]的抗肿瘤作用。内源性抗原主要通过MHC-Ⅰ分子呈递激活细胞毒性CD8+ T细胞，外源性抗原主要通过MHC-Ⅱ分子呈递激活辅助CD4+ T细胞。细胞毒CD8+ T细胞通常对靶细胞具有很强的直接杀伤作用，这些细胞是癌症疫苗预期诱导的主要效应细胞。2.mRNA癌症疫苗在临床前和临床研究中的进展疫苗的核心作用是提供能被人体免疫细胞识别的抗原，从而引发免疫反应。抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用以及给药途径是疫苗设计中需要考虑的关键因素。表1总结了这些因素的进展在临床前和临床设置。表2总结了2016年至2021年期间使用基于mRNA的癌症疫苗的临床试验。2.1.选定抗原或靶标2.1.1.肿瘤相关抗原研制肿瘤疫苗的第一步是抗原的选择，抗原应具有较高的肿瘤特异性，并能诱导强而可控的抗肿瘤T细胞反应。肿瘤抗原根据其组织分布、表达水平和中枢耐受状态可分为TAAs和TSAs。TAAs在肿瘤中普遍过表达，在正常组织中也有表达，肿瘤特异性弱，中枢耐受性强，免疫原性弱，主要包括组织分化抗原和癌胚抗原。TAAs的中枢免疫耐受是利用这些抗原开发癌症疫苗的主要挑战。使用多个(如2-6个)共享TAAs的组合已成为临床开发靶向mRNA癌症疫苗的趋势。所选择的TAAs通常在相关肿瘤中广泛表达，当与不同的载体或佐剂结合时，可以诱导抗肿瘤免疫反应。2009年，Weide等人对鱼精蛋白(RNActive®)保护mRNA癌症疫苗进行了1/2期临床研究，采用GM-CSF作为佐剂，编码6种TAAs (Melan-A、酪氨酸酶、gp100、MAGE-A1、MAGE-A3和生存素)。这种疫苗是皮内注射。该疫苗显著降低了免疫抑制细胞(如外周血中的Foxp3+/CD4+调节性T细胞(Tregs)和骨髓抑制细胞)，并增加了一部分患者的特异性T细胞。1例接受治疗的患者完全缓解，未发生大于Ⅱ级的不良反应(NCTO0204607)。2011年，Fotin-Mleczek等人对编码卵白蛋白(OVA)/PSMA/STEAP和PSMA的蛋白蛋白复合物mRNA癌症疫苗进行了临床前研究。结果表明，双组分mRNA肿瘤疫苗可通过TLR7诱导自佐剂作用，平衡适应性免疫反应，并具有持续的抗肿瘤作用(NCT00831467,NCT00923312)。2014年，Fotin-Mleczek 等人研究表明，蛋白复合OVA -编码mRNA的癌症疫苗与临床前放疗联合使用具有较强的协同抗肿瘤作用。编码4-5种前列腺特异性抗原[如CV9103 (NCT00831467)和CV9104 (NCT01817738)]或5-6种黑色素瘤和非小细胞肺癌TAAs[如CV9201 (NCT00923312)和CV9202 (NCT03164772)]的蛋白复合物肿瘤疫苗正在临床试验中。BN111是一种mRNA癌症候选疫苗，编码4种TAAs (NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE)的固定组合，这些TAAs在黑色素瘤中普遍存在，并作为RNA -脂质复合物制剂(Lipo - MERIT)递送。BNT111单独或联合免疫检查点PD-1抑制剂可诱导不可切除黑色素瘤患者持续和强抗原特异性CD4+ / CD8+ T细胞反应和客观反应。超过5%的患者发生了相关不良事件，大多数不良反应为1-2级(NCT02410733)。基于这些结果，BNT111已获得FDA快速通道指定用于临床转化治疗晚期黑色素瘤(NCT04526899)。Lipo-MERIT mRNA癌症疫苗编码3个针对OC的TAAs (NCT04163094)， 5个针对PC的TAAs[如BNT112 (NCT04382898)]，或针对HNSCC和HNC的共享癌症抗原的固定组合[BNT113 (NCT04534205)]，目前正在临床试验中。AML和骨髓瘤mRNA肿瘤疫苗的临床翻译也呈现出从单一TAA的应用[如WT1 (NCTO0834002、NCT00965224、NCTO1291420)]到多个TAA的联合应用[如WT1、PRAME、CMV pp65、癌睾丸抗原7、MAGE-A3 (NCTO1734304、NCT02405338、NCT01995708)]的趋势。研究发现，在43%的化疗后缓解的AML患者中，经WT1 mRNA电穿孔的DCs可预防或延迟复发(NCT00965224)，改善的总生存率(OS)率或临床反应与诱导WT1特异性CD8+ T细胞反应(NCTO0965224, NCTO1291420)相关。TLR7 /8成熟DCs转染编码WT1、PRAME和CMV pp65的RNA可防止在完全缓解的AML患者亚群中复发(NCTO1734304)。mRNA肿瘤疫苗也在朝着个体化和精确化方向发展，初步趋势是从应用自体肿瘤[如AML (NCT00514189-已终止)、前列腺癌(NCT01197625)、NCT01278940、NCT008464562、NCT00961844-已终止]或肿瘤干细胞[如OC (NCT01334047-已终止)]衍生mRNA向采用个体化TAA 面板 (NCT01334047、NCT02709616、NCT02808364、NCT02808416)发展。负载完整肿瘤mRNA的DCs可以诱导针对肿瘤内广泛抗原的T细胞反应，甚至是患者独有的抗原(NCT01278940)。研究发现，用癌症干细胞衍生mRNA转染的树突状细胞可诱导患者产生免疫应答，并显示出有希望的初步安全性结果(NCT00846456)。含有3-13种不同TAA mRNA的个性化TAA面板脉冲DCs与良好的OS相关，并且治疗的患者没有出现Ⅲ/Ⅳ级不良事件(NCT02709616, NCT02808364, NCT02808416)。来源于自体肿瘤细胞或肿瘤干细胞的mRNA包含肿瘤细胞中的所有蛋白。这个策略简单可行，但其靶向性和有效性有待提高，同时也要考虑安全性。图1 mRNA癌症疫苗发展的时间轴。缩写：CART，电荷改变可释放转运体；CLAN，阳离子脂质辅助纳米颗粒；DCs,树突状细胞；DOTAP/DP7-C，1,2-二醇-3-三甲基丙烷氯/胆固醇改性阳离子肽DP7；LCP NPs，脂质/钙/磷酸（LCP）纳米颗粒；LPC，阳离子脂质体/鱼精蛋白复合物；LNPs，脂质纳米颗粒；Mann,甘露聚糖；PGCP NPs，聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA）/G0-C14/神经酰胺聚（乙二醇）（PEG）(PGCP) NPs；PSA，前列腺特异性抗原；ssPAlmE-PALA，脂质纳米颗粒和a-螺旋阳离子肽“KALA”；triMN-LPR，阳离子脂质体(L)-一种阳离子聚合物(P)-mRNA (R)，称为脂多聚体（LPR），通过A-D-甘露聚糖苷（triMN）的三天线功能化。2.1.2.肿瘤特异性抗原TSAs通常是由肿瘤细胞基因组中的非同义突变形成的肿瘤新抗原；这些抗原在正常细胞中不表达，具有很强的肿瘤特异性和免疫原性，中枢耐受性较弱。TSAs与抗肿瘤免疫反应之间的相关性已在多项研究中得到证实。对来自癌症基因组图谱的18个实体肿瘤数据中的数千个RNA序列的分析显示，每个肿瘤中新抗原的数量与T细胞细胞毒性活性相关基因的表达呈正相关。对来自癌症基因组图谱的515例患者的6个位点的RNA-seq数据分析表明，高水平的免疫原性突变表位与患者生存率的提高有关。具有高水平免疫原性突变的肿瘤具有更高水平的CD8A、PD-1和CTLA4。对619例结-直肠癌样本的全外显子序列分析表明，肿瘤中高水平的新抗原与肿瘤浸润淋巴细胞的增加和生存率的提高相关。在子宫内膜癌中也证实了新抗原水平与肿瘤浸润淋巴细胞数量之间的关系。此外，发现具有高水平新抗原的肿瘤比具有低水平新抗原的肿瘤具有明显的同质性。突变负荷大于每百万碱基10个体细胞突变的肿瘤(相当于表达基因中150个非同义突变)更容易形成免疫原性新抗原，而突变负荷小于每百万碱基1个体细胞突变的肿瘤不太可能形成免疫原性新抗原。大多数肿瘤的突变负荷为每百万碱基1-10个体细胞突变，通常可以形成T细胞识别的新抗原。Rajasagi等人利用全外显子测序和HLA -肽预测结合算法(即NetMHCpan)分析了13种不同肿瘤(2488个样本)的预测突变HLA-结合肽，结果表明每个肿瘤都可以产生数万到数千个新抗原，这表明新抗原在大多数肿瘤中是常见的。图2 mRNA癌症疫苗的作用机制图mRNA癌症疫苗的流行趋势是向个体化和精密度发展，旨在开发使用多种(20种)新抗原的mRNA癌症疫苗[如，IVAC MUTANOME (NCTO2035956)、IVAC_W_brel_uID和IVAC_W_brel_uID/IVAC_M_uID (NCT02316457)、RO7198457(NCT03289962、NCT04161755、NCT03815058、NCT04486378)、mRNA-4157 (NCT03313778、NCT03897881)、NCI4650/mRNA4650 (NCT03480152)、NCT03468244、NCT03908671]。2015年，Kreiter等人通过外显子组测序和MHC-Ⅱ表位预测结合算法分析了小鼠肿瘤细胞(如黑色素瘤细胞系B16F10、结肠癌细胞系CT26和乳腺癌细胞系4T1)中的突变肽，并制备了编码这些突变肽的RNA疫苗，在临床前评估它们的抗肿瘤作用。多新表位RNA在体内有效诱导T细胞应答，抑制小鼠肿瘤的生长和转移，大部分免疫原性突变体被CD4+ T细胞识别；即使RNA只编码一个新表位(如B16-M30)，也能诱导更强的T细胞反应，并控制小鼠B16F10黑色素瘤的生长。Zhang等人对DOTAP/DP7-C脂质体进行了临床前研究，DOTAP/DP7-C脂质体作为载体和佐剂，装载了编码小鼠LLC细胞系LL2 (DOTAP/DP7-C/LL2)五种肿瘤新抗原的mRNA。DOTAP/DP7-C/LL2显著抑制原位和皮下LL2肿瘤的生长，刺激抗原特异性淋巴细胞反应。2017年，Sahin 等人发现基于RNA的多重新表位疫苗可诱导黑色素瘤患者的抗原特异性多克隆T细胞免疫反应；选择的新表位中有60%具有免疫原性，这些新表位诱导的主要T细胞反应是CD4+ T细胞反应，肿瘤转移明显减少，约75%的患者无进展生存期为27个月(NCT02035956)。2020年，Cafri等人发现编码20种新抗原的NCI4650/mRNA-4650可在胃肠道肿瘤患者中诱导新抗原特异性T细胞反应；选择的新抗原中有21%是免疫原性的，来自患者的新抗原特异性T细胞中有59%是CD4+ T细胞(NCT03480152)。虽然mRNA的制备是快速和经济的(良好生产规范级RNA可在3周内制备)，但肿瘤新抗原的筛选和鉴定可能需要很长时间和昂贵，并且在疫苗制备过程中患者的病情可能发生变化，导致研究人员错过了患者的最佳治疗机会。基于高通量和生物信息学技术对基因深度测序和大数据集蛋白质组学分析的参数，治疗性肿瘤新抗原肽疫苗、RNA疫苗和融合DC -肿瘤细胞疫苗的制备时间分别约为160天、114天、103(89-160)天和10天。新抗原的筛选和鉴定速度直接影响mRNA新抗原疫苗的临床疗效，是mRNA新抗原疫苗面临的一大挑战。同时，肿瘤新抗原预测的准确性有待提高。表1 mRNA癌症疫苗在临床前和临床设置的概述2.1.3.免疫调节分子与肿瘤抑制基因编码CD70、CD40配体和组成活性TLR4的mRNA(命名为TriMix, NCT03788083)；编码人OX40L、IL-23和IL-36γ的mRNA(命名为mRNA-2752, NCT02872025，NCTO3739931)；和编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA(命名为SAR441000/BNT131、NCT03871348)是编码免疫调节分子的三种具有代表性的mRNA癌症疫苗，这类疫苗还包括编码TLR7/8激动剂和RIG-1激动剂的mRNA疫苗(CV8102/ RNA佐剂®、NCT03291002、NCT03203005)；mRNA编码OX40L [mRNA-2416 (NCT03323398)]；mRNA编码IL-12[MEDI1191 (NCT03946800)， BNT151 (NCT04455620)]；mRNA编码IL-12和IL-7 (BNT152, BNT153，NCT04710043)；和编码BisCCL2/5i的mRNA。一些研究表明，编码免疫调节分子(如TriMix，mRNA-2752，BNT131和mRNA编码BisCCL2/5i)和肿瘤抑制基因(如PTEN或p53编码mRNA)的mRNA癌症疫苗作为单一疗法也具有抗肿瘤作用，通常与多种肿瘤抗原(如MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶、gp100、生存素、hTERT和新抗原)和免疫检查点抑制剂(如抗PD-1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合用作辅助治疗。2012年，Van Lint等人发现，结节内注射TriMix和TAA(如TRP2/WT1/P1A) mRNA可诱导DCs成熟并原位启动抗原特异性T细胞。与不加佐剂的荧光素酶(FLuc) mRNA脉冲DCs相比，TriMix显著降低了DCs中FLuc的表达，且LPS、单磷酰脂质A、聚(I:C)诱导的降低作用更强；而TriMix可以产生免疫刺激环境来改善T细胞反应，优于LPS。2016年Bialkowski等人发现HPV16-E7-TriMix mRNA可诱导CD8+ T淋巴细胞向肿瘤粘膜迁移，控制肿瘤生长。当与顺铂联合使用时，HPV16-E7-TriMix mRNA通过下调髓源性抑制细胞(MDSCs)和Tregs的数量来抵抗免疫抑制微环境，导致生殖道肿瘤完全消退。在多种小鼠肿瘤模型中，瘤内注射TriMix已被肿瘤浸润的树突状细胞吸收，然后呈交给肿瘤引流淋巴结的T细胞，诱导抗肿瘤T细胞反应和抗肿瘤作用。2013年和2016年，Wilgenhof等人发现，与TriMix共电孔的DCs和编码四种与HLA Ⅱ靶向信号(DCLAMP)(命名为TriMixDC-MEL)相关的黑色素瘤相关抗原(MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶或gp100)之一的mRNA，在预处理的晚期黑色素瘤患者中具有良好的耐受性，并在两名患者(NCT01066390)中引起完全缓解和部分缓解。TriMixDC-MEL联合免疫检查点抑制剂(ipilimumab)在预先治疗的晚期黑色素瘤患者(NCTO1302496)中耐受并诱导高度持久的肿瘤反应。2020年，De Keersmaecker等人研究表明，在相当一部分晚期黑色素瘤患者中，TriMixDC-MEL和ipilimumab联合使用可诱导有效的CD8+ T细胞反应，并与患者的临床反应相关(NCTO1302496)。2019年Hewitt发现，在瘤内注射包裹在LNPs中的编码IL- 23、IL-36γ和OX40L的三联体mRNA，可以激活并招募多种免疫细胞(例如DCs和T细胞)进入肿瘤，从而诱导依赖于Batf3的交叉呈递DCs和细胞毒性CD8+ T细胞的持久抗肿瘤免疫。该疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用，在体内抗免疫检查点抑制剂模型中具有强大的抗肿瘤作用。2021年，Hotz等人发现BNT131联合抗PD -1抗体可显著提高荷瘤小鼠(如B16和MC38荷瘤小鼠)的生存率。2021年，Wang等人发现编码BisCCL2/5i LNPs的mRNA与编码PD-1配体抑制剂LNPs的mRNA联合可显著延长荷瘤(如原发性肝癌、结直肠癌和胰腺癌的肝转移)小鼠的生存期，且BisCCL2/5i可促进这些肿瘤对PD-1配体抑制剂的敏感性。表2 2016-2021年期间关于mRNA癌症疫苗的临床试验一些临床前研究表明，使用编码肿瘤抑制基因(如PTEN和p53)的mRNA治疗肿瘤是可行的。2018年，Islam等人研究发现，负载抑癌基因PTEN编码mRNA的聚脂包被多聚脂杂交NPs(如mRNA- pgcp NPs)可在体外和体内有效转染PTEN基因缺失的前列腺癌细胞，并通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶Akt通路促进癌细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长。2021年，Lin等人发现肿瘤抑制基因PTEN编码mRNA NPs可诱导PTEN突变的黑色素瘤细胞和PTEN缺失的前列腺癌细胞自噬和死亡。PTEN-mRNA NPs上调免疫抑制TME中的CD8+ T细胞和促炎细胞因子(如IL-12、TNF-α和IFN-γ)，下调Tregs和MDSCs，并与抗PD -1抗体联合对这些肿瘤产生有效的抗肿瘤作用。2019年，Kong 等人研究发现肿瘤抑制基因p53-编码mRNA NPs可促进p53缺失型肝细胞和NSCLC细胞对哺乳动物雷帕霉素抑制剂靶点(依维莫司)的敏感性，且p53-mRNA NPs与依维莫司联用在体外和体内肝癌和NSCLC模型中具有显著的协同抗肿瘤作用。编码p53和肿瘤抗原(如生存素、hTERT、新抗原)的mRNA癌症疫苗目前正处于临床试验阶段(NCTO0978913、NCT02316457)。2.1.4. mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂的联合研究肿瘤发展过程中对TAAs的中枢免疫耐受和外周免疫耐受(如免疫检查点通路，TME)是癌症疫苗面临的两大挑战。两者都会影响癌症疫苗的效力和持续时间。为了靶向中枢免疫耐受，多个TAAs或多个TSAs的组合是mRNA癌症疫苗发展的主要趋势。为了靶向外周免疫耐受，将mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用是mRNA癌症疫苗应用的另一个主要趋势。2018年，Liu等人对负载MUCI mRNA的LCP NPs联合抗-CTLA-4抗体治疗TNBC进行了临床前评估，结果表明LCP-mRNA NPs作为单一疗法或联合治疗的一部分(LCP-mRNA NPs + 抗-CTLA-4)可显著抑制肿瘤生长，且联合治疗的抑制效果明显强于LCP-mRNA NP单疗法。Wang等人研究表明，同时装载编码黑色素瘤相关抗原TRP2的mRNA和靶向PD-L1的小干扰RNA的LCP NPs可以在体外和体内有效地将mRNA传递到DCs中，并促进DCs的成熟。靶向PD-L1的小干扰RNA下调DCs中PD-L1的表达，增强抗肿瘤免疫和抗肿瘤作用，疫苗有效抑制肿瘤生长。2019年，Verbeke等人研究表明，单独使用Galsomes mRNA的体内抗肿瘤作用不明显，这种治疗可以增加免疫微环境中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、不变性NKT (iNKT)、NK和M1肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的数量；这些作者还发现，治疗对PD-1/PD-L1通路的负调控可能会限制其抗肿瘤作用。与单独接种疫苗相比，结合OVA mRNA Galsomes和抗PD-L1抗体显著增加脾脏iNKT细胞数量，降低脾脏DC细胞上PD-L1水平和脾脏增生iNKT细胞上PD-1水平，显著提高抗肿瘤效果。此外，Oberli等人表明，含有编码单一肿瘤抗原(例如gp100或TRP2)的mRNA的lnp和使用这两种抗原的序贯治疗在体内均具有显著的抗肿瘤作用；但两种方法的抗肿瘤作用无显著性差异。2.2.抗原或目标的表达2.2.1. mRNA分子的药效学用于制备疫苗的mRNA主要包括常规的非复制mRNA和病毒衍生的自扩增mRNA。mRNA的IVT是制备分子的主要技术，利用噬菌体RNA聚合酶(如T3、T7或SP6 RNA聚合酶)和含有目标抗原序列的线性化DNA模板。非复制性IVT mRNA的基本结构包括一个编码目标蛋白的开放阅读框(ORF)、一个位于5'和3'非翻译区(UTRs)两侧的7-methylgaunosine 5'帽和一个3' poly(A) 尾。5'帽和3'poly(A)可以在IVT过程中添加，也可以在初始IVT后酶促添加。自我扩增的mRNA包含两个ORFs，一个编码目标抗原序列，另一个编码病毒复制机制，从而实现持久的细胞内RNA扩增。一种由编码CEA的甲病毒复制子组成的mRNA疫苗(称为AVX701)正在临床试验中(NCTO0529984, NCTO1890213)。与蛋白质或肽疫苗不同，mRNA癌症疫苗产生效果的第一步是编码蛋白的序列信息可以翻译成功能蛋白。影响翻译过程的因素包括正调节因素、负调节因素和双向调节因素。正调控因子总结如下:①5′帽及其修饰物[如抗反向帽类似物CleanCap]可招募真核翻译起始因子4E，促进核糖体识别和翻译起始，消除mRNA序列中的游离磷酸基团，显著增强mRNA的稳定性。②poly(A)序列及其修饰(如长度’)可以减缓RNA外切酶的降解过程，从而增加稳定性，延长体内半衰期，提高mRNA的翻译效率。③UTR优化[例如，由a-珠蛋白和β-珠蛋白衍生的3' UTR序列，AU和GU-富集序列；3' UTR中的稳定元素；5' UTR中的GCC-(A/G)- CCAUGG，短而松散的5' UTR135]和ORF的密码子优化(如尿苷的缺失，G:C含量的富集，同义频繁密码子，具有较高转移RNA丰度的密码子)可以提高mRNA的稳定性和蛋白质翻译。表达载体中的表位通过不同的序列和信号肽(例如，内核/溶酶体信号分选片段和跨膜-细胞质结构域)连接，以增加IVT，提高抗原在细胞内加工和呈递的靶向性。④核苷修饰[如假尿嘧啶(Ψ)、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基胞苷(5meC)和n -乙酰胞苷修饰转录后RNA]和纯化IVT-mRNA(如Mg2+31、温度、高压液相色谱和快速蛋白液相色谱)以减少双链RNA的污染，可以降低分子的先天免疫激活，增加蛋白质翻译。与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA (5meC, Ψ)可显著促进小鼠FLuc的表达。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用明显强于LCP(未修饰mRNA)。负调控因素包括:①细胞外RNases酶能快速降解裸mRNA。②IVT产生的双链RNA杂质可以结合细胞质中的模式识别受体(PRRs)[如RIG - Ⅰ，黑色素瘤分化相关蛋白5 (一种RIG -Ⅰ受体)，蛋白激酶RNA激活(也称为真核翻译起始因子2 alpha激酶2)，2'-5'-寡腺苷酸合成酶]和内体(如TLR3)来激活特定途径[如RIG -Ⅰ /MAD5→线粒体抗病毒信号蛋白→IFN Ⅰ，(IFN Ⅰ→)蛋白激酶RNA激活→真核翻译起始因子2alpha， (IFN Ⅰ→)2′5′-寡聚腺苷酸合成酶→核糖核酸酶L, TLR3→含有Toll/IL-1受体结构域的适配器诱导IFN-β→IFN Ⅰ]，可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解。双向调节因子包括未修饰的单链RNA作为病原体相关分子模式(PAMP)，它可以结合内体中的PRRs[如TLR7, TLR8]来激活特定途径(TLR8→髓样分化因子88→促炎细胞因子；TLR7→骨髓分化因子88→干扰素调节因子7→IFN Ⅰ)。一方面，mRNA可以激活先天免疫反应(DC成熟和激活)，进而激活适应性免疫反应(T和B细胞免疫反应);另一方面，过早和过度激活IFN Ⅰ可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解，促进DC和T细胞凋亡。过度强烈的炎症反应也会引起毒副作用。在T细胞中，Ⅰ型IFN受体信号的激活先于TCR信号的激活，可作为促进免疫应答的真正第三信号。Udhayakumar等人表明，与含有未修饰mRNA的RALA mRNA纳米复合物相比，含有Ψ-和 5meC-修饰mRNA的mRNA纳米复合物诱导了有效的抗原特异性细胞毒性T细胞反应，并且具有优越的疗效，修饰的(5meC，Ψ) mRNA纳米复合物通过抑制IFN-β活化显著降低了Ⅰ型IFNs对CTLs的抑制作用，并有效诱导了CTLs。相比之下，Oberli等人表明，未修饰mRNA LNP疫苗在外周血中诱导的CD8 T细胞应答(7.8%)比核苷修饰mRNA (5meC，Ψ) LNP疫苗(1.0%)强得多，并表明Ⅰ型干扰素是保护性CD8 T细胞应答所必需的。这些相互矛盾的结果可能与双向调节因素有关。2.2.2.疫苗抗原表达方法根据抗原的表达，疫苗可分为多肽或蛋白质疫苗、细胞疫苗(如肿瘤细胞疫苗、DC疫苗和工程细胞疫苗)、核酸疫苗(如DNA和RNA疫苗)和病毒载体疫苗。肽或蛋白疫苗是广泛使用的疫苗类型。抗原肽的序列定义明确，易于控制。肽疫苗包括短肽疫苗和长肽疫苗。短肽疫苗有一些缺点，包括蛋白质水解导致抗原降解和免疫反应持续时间较短，短肽可以结合许多核细胞表面的MHC Ⅰ分子，这些核细胞作为非专业抗原呈递细胞APCs)，通常不含共刺激信号，导致抗原耐受和T细胞功能障碍。长肽疫苗通常含有20-30个氨基酸，可激活CD4+和CD8+ T细胞。蛋白质疫苗也能诱导T细胞反应；然而，长肽通常比蛋白质更有效地被APCs内化和加工。长肽疫苗的缺点包括对酶降解的敏感性、快速清除和注射部位吸收不足。细胞疫苗主要包括癌细胞疫苗和DC疫苗。癌细胞疫苗是用自体或异体灭活的全细胞及其衍生物(如细胞裂解物、DC融合衍生物、表达TSAs或免疫增强因子的修饰全细胞和肿瘤衍生mRNAs)，它们通常包含细胞的所有抗原，在疫苗设计和生产之前不需要费力地鉴定，从而导致相对快速的制备和某些个性化特征。然而，使用癌细胞的方法不能准确地测定和控制相应的肿瘤抗原，质量控制困难，而且癌细胞往往含有较少的特异性抗原，导致免疫原性较弱和潜在的致癌性。DCs是最有效的APCs，在连接先天和适应性免疫反应中起着核心作用。DC疫苗一般使用自体DC作为载体来表达和呈递抗原。1996年，Boczkowski等人证明了使用肿瘤来源的mRNA癌细胞脉冲DCs的可行性。2017年之前，在大约24项临床试验中，mRNA癌症疫苗使用DCs作为载体。然而，DC疫苗的制备工艺复杂，生产昂贵，质量控制困难。此外，患者必须具有相对正常的免疫功能，没有化疗或其他治疗引起的骨髓抑制，并提供大量功能性DCs，导致可用疫苗数量有限。核酸疫苗是用编码抗原的核酸(如DNA、RNA)制备的。mRNA疫苗的特点已在本文第1部分进行了描述。与mRNA相比，DNA必须进入细胞核才能翻译成相应的抗原，这有插入突变引起的潜在风险，可能比mRNA更不安全。总的来说，核酸对降解敏感，不稳定，半衰期短，导致裸核酸被APCs吸收的效率较低。新的载体和给药途径。用于提高核酸的吸收和呈递效率(下文讨论)。有限的研究表明mRNA癌症疫苗与肽或蛋白癌症疫苗相比具有抗肿瘤优势。用体外合成的鸡OVA RNA脉冲的DCs比用OVA肽脉冲的DCs在体外刺激OVA特异性的初级CTL反应更有效。在原位治疗性肿瘤模型中，DOTAP/DP-C/mRNA编码5种新抗原在诱导脾脏产生活化T细胞(CD3+ CD8+ IFN-γ+)方面明显强于DOTAP/DP-C/突变肽。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用显著强于LCP (TRP2肽/CpG)。编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs提高MC38-S荷瘤小鼠存活率的能力明显强于相应的蛋白处理。肽抗原通常只含有一个表位，而mRNAs编码的全长抗原含有多个表位，可以诱导T细胞靶向这些表位，产生更强的抗肿瘤作用。病毒载体疫苗是利用病毒作为表达或呈递抗原的载体制备的。目前，被广泛研究的病毒载体包括痘病毒、腺病毒和疱疹病毒。出于安全考虑，采用复制缺陷病毒或减毒病毒。痘病毒可包含多个基因，复制和转录仅限于细胞质，插入突变的风险较低，表达产物可呈现MHC Ⅰ和Ⅱ。非禽类痘病毒可以诱导宿主产生免疫反应，从而使其只能使用一种或最多两种疫苗。重组鸟痘病毒可以多次接种，其病毒外壳蛋白不能在哺乳动物细胞中产生，并且病毒不能诱导宿主产生免疫反应来中和病毒。重组腺病毒载体易于设计，作为疫苗和基因治疗药物的载体已显示出实用性；然而，它们的免疫原性会影响疫苗的效果。疱疹病毒有广泛的宿主范围；可感染神经细胞、外周血单核细胞和DCs；并且具有复制周期短、容量大、安全性相对较好的特点。此外，其他载体，如细菌和酵母，在临床前研究中显示出作为疫苗载体的潜力。总的来说，免疫原性、致癌性、传染性、包装能力有限和病毒载体生产困难是广泛应用的挑战。2.3.mRNA癌症疫苗的载体开发具有良好的安全性、靶向性、稳定性、自佐剂效应、负载能力和通用性的mRNA递送载体，能够高效、持续地递送和呈递抗原，激活APCs，是mRNA肿瘤疫苗领域的一个基本方向。mRNA肿瘤疫苗在临床前采用的载体如表3所示。mRNA癌症疫苗中使用的主要载体之一是脂质体及其衍生物。1995年，Conry等人显示了编码人CEA复合物的脂质体mRNA的体液免疫原性，首次在临床前研究中证实了mRNA癌症疫苗的概念验证。甘露糖可以与DCs表面表达的甘露糖受体结合，利用靶向DCs的载体促进mRNA的高效传递和转染。2011年，Perche等人研究表明，携带mRNA的Man11-LPR100转染DCs的效率是无糖LPR100的4倍，并且在体内具有更好的抗肿瘤作用。由于甘露糖与其受体之间的结合力较弱，增加载体表面甘露糖的密度可能是提高甘露糖修饰LPR递送效率的有效途径。2018年，Le Moignic 等人研究表明，与单甘油三酯- LPR相比，三甘油三酯- LPR可以更有效地诱导抗原转染，通过在注射部位诱导局部炎症反应，将更多的DCs招募到引流淋巴结，并更有效地诱导抗原特异性免疫反应。2018年，Wang 等人利用甘糖醇偶联物(MPn-CHs)制备了DCs靶向脂质体(MPn-LPs)作为mRNA载体，结果表明MP1000-LPs负载mRNA (MP1000-LPX)具有良好的转染效率，MP1000-LPX主要通过增强DCs上甘糖受体(如CD206)的表达来增强mRNA的表达。2020年，Son等人研究表明，采用多糖包被二氧化硅纳米颗粒制备的Mann -capsules可以通过Dectin-2或TLR-4激活骨髓源性树突状细胞(BMDC)，且Mann -capsules促进BMDC分化和成熟的能力明显强于PEI或脂质体；此外，PEI和脂质体具有高毒性。LNPs似乎是一种很有前途的mRNA癌症疫苗载体。LNPs的成分主要包括可电离脂质，促进mRNA的自组装和内体释放；磷脂，支持脂质双层结构；胆固醇，一种稳定剂；脂质锚定聚乙二醇，延长配方的半衰期。还考虑了筛选和鉴定这些媒介的高通量技术。2017年，Oberli 等人构建并优化了LNP库，发现含有编码肿瘤抗原的mRNAs(如gp100和TRP2)与LNPs作为佐剂结合，可有效诱导抗原特异性CD8+ T细胞，抑制肿瘤生长，延长小鼠OS。2018年，McKinlay等人对基于两亲性CARTs的mRNA载体库进行了高通量筛选研究，结果表明，与单一CART或脂质体 2000相比，双CART可将体外淋巴细胞mRNA转染效率提高9倍；体外mRNA转染效率为80%，小鼠淋巴细胞mRNA转染效率为1.5%。2019年，Miao等人建立了一种高通量的可电离类脂质构建技术，可在一天内合成数千种脂质制剂，并使用DCs(如HeLa细胞、BMDCs或骨髓源性巨噬细胞)高通量评估LNPs的转染效率。结果表明，mRNA LNPs通过干扰素基因通路的胞内刺激物诱导APC成熟，增强抗肿瘤作用。2021年，Meng等人发现含有CpG核心的VLVPs可以促进DC成熟和抗原呈递、抗原特异性CD8+ T细胞在淋巴器官中的增殖和肿瘤中的T细胞浸润，并减少免疫抑制细胞(如肿瘤相关骨髓源性抑制细胞和表达精氨酸酶1的抑制性DCs)。以LNPs为载体的mRNA癌症疫苗[如编码新抗原的mRNA-4157 (NCTO3313778、NCTO3897881)和编码突变蛋白的V941 (NCT03948763)]目前正处于临床试验阶段。多阳离子肽鱼精蛋白和DCs是mRNA癌症疫苗中采用的另外两种主要载体。鱼精蛋白和DCs的特点及其作为mRNA癌症疫苗载体的研究进展分别见第2.1.1节和2.2.2节。鱼精蛋白可以保护mRNA不被血清RNA酶降解，促进mRNA的传递。此外，鱼精蛋白可与脂质体联合使用(例如，阳离子脂质体-鱼精蛋白，LPC和VLVP)。2000年，Hoerr等人发现脂质体包裹的浓缩RNA-肽复合物可诱导抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应，裸RNA和蛋白蛋白保护的RNA在体内均可诱导特异性免疫反应，而受保护的RNA在体外稳定时间较长。Mai等人的研究表明，携带细胞角蛋白19编码mRNA的LPC经鼻递送可诱导小鼠APC成熟和强烈的细胞免疫反应，并降低肿瘤的生长。载体对疫苗的效力有关键影响。Phua等人表明，在没有NP载体的情况下，鼻内接种裸mRNA不能诱导抗肿瘤免疫反应。然而，临床前和临床研究都在综合考虑所选靶点、佐剂和递送方法的基础上证明了裸mRNA的可行性和有效性。发现FLT3可增强结内裸RNA的抗肿瘤作用。结内HPV16-E7-TriMix裸mRNA和瘤内TriMix裸mRNA均可诱导有效的抗肿瘤T细胞反应。结节内裸mRNA多重新表位疫苗诱导有效的抗原特异性T细胞免疫应答(NCT02035956)。2.4.佐剂在mRNA癌症疫苗的临床前研究中开发的一类主要佐剂[如LPS73, poly(I:C), Td, CpG]是PAMPs，它通过PAMP-PRR途径激活DCs，然后调节先天和适应性免疫反应。作为一种强效的回忆抗原，Td可通过CCL3106促进DC迁移，提高抗肿瘤作用。LPS辅助处理进一步提高了CD8+ T细胞水平和LNP mRNA诱导细胞的抗肿瘤活性。mRNA- CART联合CpG的体内抗肿瘤作用明显强于mRNA-CART和裸mRNA与CpG的联合，也强于mRNA-CART与TLR7配体或CD80 /86 mRNA的联合。大多数新型载体(如脂质样材料C1、DOTAP/ DP7-C、Mann-capsule、LNPs)兼具载体和佐剂的特性，其中一些载体具有佐剂的功能，类似于PAMPs。Mann -capsule通过Dectin-2或TLR-4激活BMDCs，葡聚糖-capsule通过CD206、CD209或巨噬细胞诱导的C型凝集素激活BMDCs。DP7-C、DOTAP和mRNA分别通过TLR2、TLR4和TLR7激活DCs。DOTAP/DP7C诱导DC成熟和抗原呈递的能力明显强于DOTAP、poly(I:C)和CpG。Cl或C1 mRNA可通过TLR4依赖的核因子κB信号通路促进BMDC活化，C1- OVA mRNA的体内抗肿瘤作用是TLR4依赖的CpG，因为VLVP中含有的佐剂，可以提高疫苗的效果，阻止PD-1在T细胞中的表达。然而，这些类PAMP佐剂可能影响mRNAs的翻译效率和降解，并具有潜在的毒性，如2.2.1节所述。开发既不影响mRNA翻译效率，又能积极调节多种先天和适应性免疫反应，促炎作用相对温和，毒性较低的新型佐剂已成为重要方向。TAA mRNA的免疫原性可以通过GM-CSF mRNA的共递送而增强。FLT3配体可促进浆细胞样DCs、经典DCs和NK细胞的扩增；诱导T辅助1型微环境；增强肿瘤内T细胞浸润及裸RNA的抗肿瘤作用。mRNA LNPs可通过刺激干扰素基因依赖性激活Ⅰ型IFN，诱导APC成熟，限制全身细胞因子表达，增强抗肿瘤作用。用于mRNA Galsomes的佐剂α-GC可通过DCs呈递激活iNKT细胞。活化的iNKT细胞可与DCs发生双向正调节作用，可正向调节NK细胞和免疫抑制细胞(如MDSCs和M1 TAMs)，不影响mRNA翻译效率，促进直接和间接的抗肿瘤作用。编码免疫共刺激分子的mRNA可用作佐剂(见2.1.3节)。TriMix (NCT01066390, NCTO1302496)；mRNA-2752 (NCT02872025)；mRNA编码人OX40L (mRNA-2416, NCT03323398)；编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA (BNT131，NCTO3871348)；编码IL-12的mRNA (MEDI1191，NCT03946800)；和mRNA编码的TLR7 /8激动剂和RIG-1-兴奋剂(RNA佐剂®)，NCT03291002，NCT03203005]正在临床试验中作为辅助治疗与免疫检查点抑制剂联合使用。表3 在临床前环境中用于mRNA癌症疫苗的递送系统概述2.5.给药途径给药途径直接影响疫苗的效力，mRNA癌症疫苗通常采用的给药途径包括静脉注射、皮内、皮下、肌肉注射、结内和肿瘤内给药。静脉注射允许更大的疫苗量和直接将疫苗输送到淋巴器官，但也有更大的系统性毒性风险。皮下注射疫苗的真皮含有APCs(如，DCs和巨噬细胞)以及血管和淋巴血管，但主要由致密结缔组织组成，导致通过皮内途径给药时疫苗量很小。皮内给药也可导致注射部位的不良反应(例如，肿胀、疼痛、红斑和瘙痒)。皮下注射疫苗的皮下区域含有比真皮更少的APCs；然而，它主要由脂肪组织的松散网络组成，允许通过皮下途径注射更大的注射量，从而引起更少的局部副作用(如疼痛)。肌肉注射疫苗的肌肉含有致密的血液网络，可以帮助招募和再循环不同类型的免疫细胞(如，浸润性APCs)到注射部位。肌内给药比皮内给药的注射量大，局部副作用也比皮内和皮下给药轻。结内注射疫苗的淋巴结含有多个APCs，结内给药具有较高的递送效率，允许小剂量的疫苗，但涉及复杂的程瘤内给药主要用于编码免疫共刺激分子的mRNA疫苗(例如TriMix, CV8102, mRNA-2752, mRNA-2416, BNT131和MEDI1191)作为免疫辅助治疗，也允许小剂量的疫苗，涉及复杂的程序。准确预测特定疫苗的最佳给药途径是困难的，建议通过直接比较研究来选择疫苗的最佳给药途径。结内注射的Luc-RNA在体内的转染效率优于皮内或皮下注射。经静脉注射OVA RNA复合DOTAP-DOPE诱导的CTLs杀伤作用优于皮内或皮下注射(静脉注射＞皮内注射＞皮下注射)。结内递送OVA mRNA联合TriMix诱导的抗原特异性T细胞的体内细胞毒性明显强于皮内递送疫苗。皮内接种E7 mRNA单糖化-LPR诱导的抗原特异性T细胞应答明显强于皮下接种。通过CART有效地将mRNA传递到APCs中(次要淋巴细胞APCs优先通过静脉注射靶向，而局部APCs通过皮下注射靶向)。肿瘤内三次给药的编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs的抗肿瘤作用显著优于同种药物的皮内或皮下给药；然而，在同一剂量下，通过这些途径的抗肿瘤效果没有显著差异，这表明对肿瘤疫苗的给药效果也与给药频率有关。鼻黏膜富含APCs和免疫细胞，临床前研究表明经鼻内注射的mRNA癌疫苗初步有效。鼻内接种mRNA纳米颗粒和鼻内递送LPC mRNA均可诱导抗肿瘤免疫应答。3.mRNA癌症疫苗的挑战和趋势迄今为止，已有数百种癌症疫苗进行了临床评估，美国食品和药物管理局(FDA)批准了三种治疗性癌症疫苗[卡介苗 (TheraCys®)，一种牛分支杆菌减毒活株，用于治疗非肌肉浸润性膀胱癌；Sipuleucel-T (Provenge®)，一种用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的DC疫苗；以及用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤性疱疹病毒疫苗(talimogene laherparepvec, T-VEC) (Imlygic®)和两种预防性癌症疫苗(HPV疫苗和乙型肝炎病毒疫苗)。影响mRNA肿瘤疫苗研制的因素主要包括分子本身的内在因素和外部因素[如对肿瘤抗原的中枢耐受性(见第2.1.1节)、肿瘤和HLA的异质性以及肿瘤免疫微环境]。这些因素深刻地影响了mRNA癌症疫苗的发展。从内在因素来看，研究人员通过改进mRNA的结构和序列，改进mRNA的制备和纯化技术(见第2.2.1节)，开发新的传递载体(见第2.3节)，在一定程度上提高了mRNA癌症疫苗的有效性。肿瘤异质性的本质是肿瘤细胞的基因组异质性，导致抗原异质性，这是影响抗肿瘤T细胞反应产生的关键因素，也是开发个性化癌症疫苗的主要原因。HLA异质性主要是指个体间HLA分子类型的不同，导致个体间这些分子对肿瘤抗原的结合区域或结合亲和力存在差异，从而影响抗肿瘤T细胞反应的产生和强度。HLA异质性是由HLA等位基因在不同民族和地区人群中的多态性引起的。HLA Ⅰ等位基因包括9-11个常见超型，其覆盖率为90%。HLA-A loci (HLA-A等位基因：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101和A*2402)占HLA-Ⅰ等位基因的60%，HLA-B loci (HLA-B等位基因：B*0702、B*0801、B*2705、B*3501和B*5701)占这些等位基因的35%以上。TME由免疫细胞、间充质细胞以及多种细胞因子和组织因子组成，在肿瘤发生和免疫逃逸中起重要作用。大质量内的间质压力可减少大分子(如抗体)和效应细胞(如T细胞)的扩散。大多数实体瘤也缺乏T细胞共刺激分子。TME通常含有免疫抑制细胞，包括CD4+Tregs, MDSCs，抑制性CD8+T细胞，M2 TAMs和调节性NK/NKT细胞。这些免疫抑制细胞和TME中的肿瘤细胞可以释放大量可溶性的免疫抑制因子，包括转化生长因子β、IL-10、PD-L1、吲哚胺2,3-双加氧酶和血管内皮生长因子等，进入微环境。考虑到肿瘤和HLA的异质性，肿瘤新抗原疫苗的开发在理论上比TAA定向疫苗具有更强的特异性抗肿瘤作用和更弱的毒副作用，一直是癌症疫苗研究的主要热点(见2.1.2节)。鉴于肿瘤免疫微环境，开发基于免疫的联合疗法(例如，与佐剂或免疫检查点抑制剂联合)已成为癌症疫苗应用的一个关键趋势(见第2.1.4和2.4节)。4.讨论产品的临床前评价是进入临床转化的前提，合理的评价可以提高预测临床结果的可靠性。临床前评价所采用的参数、技术和方法是疫苗质量标准的重要组成部分。疫苗的临床前评价应充分阐明疫苗的作用和机制，而mRNA肿瘤疫苗临床前评价的重点是确定抗原特异性T细胞反应的产生(如T细胞的数量和活化)和效果(如T细胞的杀伤作用和抗原亲和力)。一般来说，在临床前评估中，定量的体外和体内试验用于评估mRNA癌症疫苗的效果和机制。根据目前对抗原特异性T细胞免疫应答的认识，评价参数主要包括①鉴定疫苗的理化特性；②mRNA转染APC的效率(如结合与摄取、内化与转运、表达与分布)；③APCs的分化、成熟和抗原提呈；④疫苗免疫刺激；⑤细胞免疫原性(如CTL的产生、增殖和靶细胞杀伤)；⑥体液免疫原性；⑦抗肿瘤作用及相关机制；⑧初步毒性（如细胞毒性、内脏毒性和溶血）。诸如颗粒大小、电荷、对mRNA的结合能力和负载率、稳定性(如时间、温度和血清稳定性)、聚乙二醇化和硬度等因素可影响抗原递送(如淋巴引流)。Son等人研究表明，尺寸为~220 nm的Mann-capsules具有良好的变形能力，通过50 nm孔膜后的回复率约为30%。与基于蛋白质或肽的疫苗不同，mRNA疫苗开发的第一步是确保mRNA序列中编码的信息能够有效地翻译成相应的蛋白质或肽。mRNA的体外和体内转染效率是mRNA疫苗临床前评价的重要参数，提高mRNA的转染效率是提高mRNA疫苗药效学的关键途径。然而，APCs的体外转染效率可能存在差异，DOTAP/ DP7 - 增加了绿色荧光蛋白mRNA在APCs(包括293T、JAWSII、DC2.4和BMDCs)中的体外转染效率分别为84.87±3.21%、12.23±1.35%、28.49±2.46%和14.51±2.35%。为了验证mRNA在体外和体内的转染效率，我们以多种APCs作为体外转染模型，在体内检测不同器官的多种APCs的mRNA转染效率。增强绿色荧光蛋白(FLuc)是实验中常用的转染蛋白。染料标记的mRNA或疫苗载体已广泛用于转染研究。共聚焦显微镜和流式细胞术常用于评估细胞内微转染(如递送、摄取和翻译)，共聚焦显微镜可更直观、准确地评估mRNA的翻译效率，交互式视频信息系统可用于评估全身或局部大转染(如分布、淋巴引流)。用于体内抗肿瘤活性评价的肿瘤模型主要包括治疗性或预防性皮下、原位和肺转移肿瘤模型，所建立的体内肿瘤模型应准确模拟人体病理。Bialkowski等人的研究表明TC-1肿瘤的TME可因肿瘤接种部位(即皮下、肺部和生殖道)的不同而有显著差异，这直接影响了E7-TriMix mRNA疫苗的抗肿瘤效果。在选择用于临床前评估的细胞或动物模型时，物种特异性是需要考虑的重要因素。为了获得更准确的评价信息，可以建立人源化动物模型。通过静脉注射人外周血单个核细胞(HLA-A2型)的CD34+造血干细胞建立的人源化小鼠，进入免疫缺陷NOD/ shi-scid IL-2Rγnull小鼠或C57BL/6小鼠，建立体内肿瘤模型(如结果表明，转染修饰的人CD133 mRNA的DCs处理人源化小鼠模型的中位生存期大于60天，转染修饰的小鼠CD133 mRNA的DCs处理同源小鼠肿瘤模型的中位生存期为38天。肿瘤疫苗理论上具有抗肿瘤复发和转移的作用，可以建立多种体内肿瘤模型进行评价，阐明这些疫苗在预防或治疗肿瘤转移或复发方面的优势。有效的抗肿瘤反应需要多个免疫细胞的协同作用，而不是单个细胞的作用。目前，大多数肿瘤疫苗的重点是诱导CD8+T细胞，但CD4+T细胞等免疫细胞在诱导和维持免疫记忆、增强CTLs的肿瘤杀伤作用中也发挥着重要作用。采用NKT配体(如α-GC)作为佐剂的mRNA Galsomes通过iNKT细胞诱导抗肿瘤作用。在含有CD4+和CD8+T细胞的培养系统中转染CD133 mRNA的DCs比仅含有CD4+或CD8+T细胞的培养系统中的DCs更有效地激活T细胞并杀死肿瘤靶细胞。也有人担心mRNA癌症疫苗的安全性和副作用。修饰后的mRNA可与血清蛋白结合形成血管闭塞，具有潜在的毒性。DOTAP/DP7-C mRNA具有良好的血清稳定性和较低的细胞毒性；然而，Lipo2000和PEI25K具有很强的细胞毒性。最后，我们期待mRNA癌症疫苗的成功临床转化。参考资料：He Q, Gao H, Tan D, Zhang H, Wang JZ. mRNA cancer vaccines: Advances, trends and challenges. Acta Pharm Sin B. 2022 Jul;12(7):2969-2989. doi: 10.1016/j.apsb.2022.03.011. Epub 2022 Mar 23. PMID: 35345451; PMCID: PMC8942458.

信使RNA疫苗上市批准紧急使用授权加速审批

2023-08-29

·生物制品圈

mRNA癌症疫苗：研究进展、趋势和挑战

摘要患者对信使核糖核酸(mRNA)疫苗表现出良好的耐受性，编码分子的选择是灵活多样的。这些疫苗可以被设计成表达包含多个表位的全长抗原，而不受主要组织相容性复合体(MHC)的限制，相对容易控制，并且可以快速批量生产。美国食品药品监督管理局(FDA)于2021年批准了辉瑞和BioNTech生产的首个基于mRNA的新型冠状病毒病(COVID-19)疫苗，引发了mRNA疫苗研发热潮。基于上述特点和mRNA疫苗的发展，尤其是近五年来，mRNA肿瘤疫苗已成为研究热点，发展迅速。本文从抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用、不同给药途径和临床前评价等方面对mRNA肿瘤疫苗的研究进展进行了分析，以反映mRNA肿瘤疫苗的发展趋势和面临的挑战。关键词：mRNA，癌症疫苗，肿瘤相关抗原，新抗原，mRNA递送载体，佐剂，给药途径。1.mRNA疫苗和mRNA癌症疫苗1961年，Brenner等人首次发现mRNA，它是基因作为蛋白质表达所必需的关键中间分子，含有与氨基酸(蛋白质的基本单位)相对应的密码子信息。1990年，Wolff等人首次证明，通过肌肉注射编码相应蛋白的纯RNA，可以在小鼠体内有效表达特定蛋白[如氯霉素乙酰转移酶和荧光素酶(Luc)]；具体来说，βgLucβgAn RNA的蛋白表达以剂量依赖性和时间依赖性的方式发生；这项工作还提出了mRNA疫苗的概念。2020年，美国食品和药物管理局(FDA)紧急批准了Pfizer--BioNTech/BNT162b2和Moderna/mRNA-1273生产的两种基于mRNA的疫苗，用于预防2019年冠状病毒病(COVID - 19)。2021年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了Pfizer-BioNTech(上市名称为Comirnaty)生产的首个COVID-19疫苗，激发了mRNA疫苗的研发热情，并对mRNA癌症疫苗的突破产生了期待。迄今为止，研究人员已将mRNA用作疫苗平台[例如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、冠状病毒、病毒抗原(狂犬病病毒糖蛋白、寨卡病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的蛋白质)，细菌病原体(结核分枝杆菌)和癌症]和蛋白质替代平台(例如factor IX、卵泡抑素、鸟氨酸经甲氨基甲酰基酶和促红细胞生成素)，用于疾病的预防和治疗。mRNA疫苗具有许多共同特征。与质粒脱氧核糖核酸(DNA)和病毒载体存在因基因插入和/或感染而导致突变的风险不同，mRNA进入细胞质后可直接翻译成蛋白质；因此，mRNA疫苗是非整合的、非传染性的、耐受性良好的。mRNA也在细胞中短暂表达，允许重复接种。mRNA转录物中编码单位的选择是灵活多样的，允许编码抗原和免疫调节分子来诱导和调节适应性和先天免疫应答，并且含有多个表位的编码全长抗原可以由MHC Ⅰ类(MHC-Ⅰ)和Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子呈现，而不受MHC限制。体外转录(IVT) mRNA的生产不需要细胞，防止了蛋白质或病毒的污染，并允许快速、经济和容易的大规模生产。mRNA癌症疫苗利用编码肿瘤抗原或免疫调节分子的mRNA递送相应的蛋白，结合相关的递送载体和佐剂，诱导抗肿瘤应答。图1显示了mRNA癌症疫苗的发展时间表。抗肿瘤T细胞是介导这些疫苗治疗效果的主要预期效应细胞，图2总结了抗肿瘤T细胞产生和作用的机制。RNA在疫苗位点被DCs摄取，翻译并加工成抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物并呈递到细胞表面。活化的DCs到达引流淋巴结，呈递的抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物与淋巴结内分化簇8 (CD8)+/CD4+ T细胞(第一信号)表面的T细胞受体(TCR)结合，导致T细胞活化和增殖，共刺激信号分子[如CD80/CD86, OX40配体(OX40L)]与受体(如CD28, OX40)在T细胞(第二信号)和细胞因子[如干扰素(IFN) I，白细胞介素12 (IL-12)， IL-1]与T细胞上的细胞因子受体结合(第三信号)。此外，CD4+ T细胞分泌的IL-2可促进CD8+ T细胞扩增。活化的T细胞在趋化因子[如CC -趋化因子受体7，CC -趋化因子配体(CCL) 5，CXC -趋化因子配体9/10]的作用下向肿瘤组织迁移并浸润，最大限度地发挥其分泌的效应器[如IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、穿孔素、颗粒酶]的抗肿瘤作用。内源性抗原主要通过MHC-Ⅰ分子呈递激活细胞毒性CD8+ T细胞，外源性抗原主要通过MHC-Ⅱ分子呈递激活辅助CD4+ T细胞。细胞毒CD8+ T细胞通常对靶细胞具有很强的直接杀伤作用，这些细胞是癌症疫苗预期诱导的主要效应细胞。2.mRNA癌症疫苗在临床前和临床研究中的进展疫苗的核心作用是提供能被人体免疫细胞识别的抗原，从而引发免疫反应。抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用以及给药途径是疫苗设计中需要考虑的关键因素。表1总结了这些因素的进展在临床前和临床设置。表2总结了2016年至2021年期间使用基于mRNA的癌症疫苗的临床试验。2.1.选定抗原或靶标2.1.1.肿瘤相关抗原研制肿瘤疫苗的第一步是抗原的选择，抗原应具有较高的肿瘤特异性，并能诱导强而可控的抗肿瘤T细胞反应。肿瘤抗原根据其组织分布、表达水平和中枢耐受状态可分为TAAs和TSAs。TAAs在肿瘤中普遍过表达，在正常组织中也有表达，肿瘤特异性弱，中枢耐受性强，免疫原性弱，主要包括组织分化抗原和癌胚抗原。TAAs的中枢免疫耐受是利用这些抗原开发癌症疫苗的主要挑战。使用多个(如2-6个)共享TAAs的组合已成为临床开发靶向mRNA癌症疫苗的趋势。所选择的TAAs通常在相关肿瘤中广泛表达，当与不同的载体或佐剂结合时，可以诱导抗肿瘤免疫反应。2009年，Weide等人对鱼精蛋白(RNActive®)保护mRNA癌症疫苗进行了1/2期临床研究，采用GM-CSF作为佐剂，编码6种TAAs (Melan-A、酪氨酸酶、gp100、MAGE-A1、MAGE-A3和生存素)。这种疫苗是皮内注射。该疫苗显著降低了免疫抑制细胞(如外周血中的Foxp3+/CD4+调节性T细胞(Tregs)和骨髓抑制细胞)，并增加了一部分患者的特异性T细胞。1例接受治疗的患者完全缓解，未发生大于Ⅱ级的不良反应(NCTO0204607)。2011年，Fotin-Mleczek等人对编码卵白蛋白(OVA)/PSMA/STEAP和PSMA的蛋白蛋白复合物mRNA癌症疫苗进行了临床前研究。结果表明，双组分mRNA肿瘤疫苗可通过TLR7诱导自佐剂作用，平衡适应性免疫反应，并具有持续的抗肿瘤作用(NCT00831467,NCT00923312)。2014年，Fotin-Mleczek 等人研究表明，蛋白复合OVA -编码mRNA的癌症疫苗与临床前放疗联合使用具有较强的协同抗肿瘤作用。编码4-5种前列腺特异性抗原[如CV9103 (NCT00831467)和CV9104 (NCT01817738)]或5-6种黑色素瘤和非小细胞肺癌TAAs[如CV9201 (NCT00923312)和CV9202 (NCT03164772)]的蛋白复合物肿瘤疫苗正在临床试验中。BN111是一种mRNA癌症候选疫苗，编码4种TAAs (NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE)的固定组合，这些TAAs在黑色素瘤中普遍存在，并作为RNA -脂质复合物制剂(Lipo - MERIT)递送。BNT111单独或联合免疫检查点PD-1抑制剂可诱导不可切除黑色素瘤患者持续和强抗原特异性CD4+ / CD8+ T细胞反应和客观反应。超过5%的患者发生了相关不良事件，大多数不良反应为1-2级(NCT02410733)。基于这些结果，BNT111已获得FDA快速通道指定用于临床转化治疗晚期黑色素瘤(NCT04526899)。Lipo-MERIT mRNA癌症疫苗编码3个针对OC的TAAs (NCT04163094)， 5个针对PC的TAAs[如BNT112 (NCT04382898)]，或针对HNSCC和HNC的共享癌症抗原的固定组合[BNT113 (NCT04534205)]，目前正在临床试验中。AML和骨髓瘤mRNA肿瘤疫苗的临床翻译也呈现出从单一TAA的应用[如WT1 (NCTO0834002、NCT00965224、NCTO1291420)]到多个TAA的联合应用[如WT1、PRAME、CMV pp65、癌睾丸抗原7、MAGE-A3 (NCTO1734304、NCT02405338、NCT01995708)]的趋势。研究发现，在43%的化疗后缓解的AML患者中，经WT1 mRNA电穿孔的DCs可预防或延迟复发(NCT00965224)，改善的总生存率(OS)率或临床反应与诱导WT1特异性CD8+ T细胞反应(NCTO0965224, NCTO1291420)相关。TLR7 /8成熟DCs转染编码WT1、PRAME和CMV pp65的RNA可防止在完全缓解的AML患者亚群中复发(NCTO1734304)。mRNA肿瘤疫苗也在朝着个体化和精确化方向发展，初步趋势是从应用自体肿瘤[如AML (NCT00514189-已终止)、前列腺癌(NCT01197625)、NCT01278940、NCT008464562、NCT00961844-已终止]或肿瘤干细胞[如OC (NCT01334047-已终止)]衍生mRNA向采用个体化TAA 面板 (NCT01334047、NCT02709616、NCT02808364、NCT02808416)发展。负载完整肿瘤mRNA的DCs可以诱导针对肿瘤内广泛抗原的T细胞反应，甚至是患者独有的抗原(NCT01278940)。研究发现，用癌症干细胞衍生mRNA转染的树突状细胞可诱导患者产生免疫应答，并显示出有希望的初步安全性结果(NCT00846456)。含有3-13种不同TAA mRNA的个性化TAA面板脉冲DCs与良好的OS相关，并且治疗的患者没有出现Ⅲ/Ⅳ级不良事件(NCT02709616, NCT02808364, NCT02808416)。来源于自体肿瘤细胞或肿瘤干细胞的mRNA包含肿瘤细胞中的所有蛋白。这个策略简单可行，但其靶向性和有效性有待提高，同时也要考虑安全性。图1 mRNA癌症疫苗发展的时间轴。缩写：CART，电荷改变可释放转运体；CLAN，阳离子脂质辅助纳米颗粒；DCs,树突状细胞；DOTAP/DP7-C，1,2-二醇-3-三甲基丙烷氯/胆固醇改性阳离子肽DP7；LCP NPs，脂质/钙/磷酸（LCP）纳米颗粒；LPC，阳离子脂质体/鱼精蛋白复合物；LNPs，脂质纳米颗粒；Mann,甘露聚糖；PGCP NPs，聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA）/G0-C14/神经酰胺聚（乙二醇）（PEG）(PGCP) NPs；PSA，前列腺特异性抗原；ssPAlmE-PALA，脂质纳米颗粒和a-螺旋阳离子肽“KALA”；triMN-LPR，阳离子脂质体(L)-一种阳离子聚合物(P)-mRNA (R)，称为脂多聚体（LPR），通过A-D-甘露聚糖苷（triMN）的三天线功能化。2.1.2.肿瘤特异性抗原TSAs通常是由肿瘤细胞基因组中的非同义突变形成的肿瘤新抗原；这些抗原在正常细胞中不表达，具有很强的肿瘤特异性和免疫原性，中枢耐受性较弱。TSAs与抗肿瘤免疫反应之间的相关性已在多项研究中得到证实。对来自癌症基因组图谱的18个实体肿瘤数据中的数千个RNA序列的分析显示，每个肿瘤中新抗原的数量与T细胞细胞毒性活性相关基因的表达呈正相关。对来自癌症基因组图谱的515例患者的6个位点的RNA-seq数据分析表明，高水平的免疫原性突变表位与患者生存率的提高有关。具有高水平免疫原性突变的肿瘤具有更高水平的CD8A、PD-1和CTLA4。对619例结-直肠癌样本的全外显子序列分析表明，肿瘤中高水平的新抗原与肿瘤浸润淋巴细胞的增加和生存率的提高相关。在子宫内膜癌中也证实了新抗原水平与肿瘤浸润淋巴细胞数量之间的关系。此外，发现具有高水平新抗原的肿瘤比具有低水平新抗原的肿瘤具有明显的同质性。突变负荷大于每百万碱基10个体细胞突变的肿瘤(相当于表达基因中150个非同义突变)更容易形成免疫原性新抗原，而突变负荷小于每百万碱基1个体细胞突变的肿瘤不太可能形成免疫原性新抗原。大多数肿瘤的突变负荷为每百万碱基1-10个体细胞突变，通常可以形成T细胞识别的新抗原。Rajasagi等人利用全外显子测序和HLA -肽预测结合算法(即NetMHCpan)分析了13种不同肿瘤(2488个样本)的预测突变HLA-结合肽，结果表明每个肿瘤都可以产生数万到数千个新抗原，这表明新抗原在大多数肿瘤中是常见的。图2 mRNA癌症疫苗的作用机制图mRNA癌症疫苗的流行趋势是向个体化和精密度发展，旨在开发使用多种(20种)新抗原的mRNA癌症疫苗[如，IVAC MUTANOME (NCTO2035956)、IVAC_W_brel_uID和IVAC_W_brel_uID/IVAC_M_uID (NCT02316457)、RO7198457(NCT03289962、NCT04161755、NCT03815058、NCT04486378)、mRNA-4157 (NCT03313778、NCT03897881)、NCI4650/mRNA4650 (NCT03480152)、NCT03468244、NCT03908671]。2015年，Kreiter等人通过外显子组测序和MHC-Ⅱ表位预测结合算法分析了小鼠肿瘤细胞(如黑色素瘤细胞系B16F10、结肠癌细胞系CT26和乳腺癌细胞系4T1)中的突变肽，并制备了编码这些突变肽的RNA疫苗，在临床前评估它们的抗肿瘤作用。多新表位RNA在体内有效诱导T细胞应答，抑制小鼠肿瘤的生长和转移，大部分免疫原性突变体被CD4+ T细胞识别；即使RNA只编码一个新表位(如B16-M30)，也能诱导更强的T细胞反应，并控制小鼠B16F10黑色素瘤的生长。Zhang等人对DOTAP/DP7-C脂质体进行了临床前研究，DOTAP/DP7-C脂质体作为载体和佐剂，装载了编码小鼠LLC细胞系LL2 (DOTAP/DP7-C/LL2)五种肿瘤新抗原的mRNA。DOTAP/DP7-C/LL2显著抑制原位和皮下LL2肿瘤的生长，刺激抗原特异性淋巴细胞反应。2017年，Sahin 等人发现基于RNA的多重新表位疫苗可诱导黑色素瘤患者的抗原特异性多克隆T细胞免疫反应；选择的新表位中有60%具有免疫原性，这些新表位诱导的主要T细胞反应是CD4+ T细胞反应，肿瘤转移明显减少，约75%的患者无进展生存期为27个月(NCT02035956)。2020年，Cafri等人发现编码20种新抗原的NCI4650/mRNA-4650可在胃肠道肿瘤患者中诱导新抗原特异性T细胞反应；选择的新抗原中有21%是免疫原性的，来自患者的新抗原特异性T细胞中有59%是CD4+ T细胞(NCT03480152)。虽然mRNA的制备是快速和经济的(良好生产规范级RNA可在3周内制备)，但肿瘤新抗原的筛选和鉴定可能需要很长时间和昂贵，并且在疫苗制备过程中患者的病情可能发生变化，导致研究人员错过了患者的最佳治疗机会。基于高通量和生物信息学技术对基因深度测序和大数据集蛋白质组学分析的参数，治疗性肿瘤新抗原肽疫苗、RNA疫苗和融合DC -肿瘤细胞疫苗的制备时间分别约为160天、114天、103(89-160)天和10天。新抗原的筛选和鉴定速度直接影响mRNA新抗原疫苗的临床疗效，是mRNA新抗原疫苗面临的一大挑战。同时，肿瘤新抗原预测的准确性有待提高。表1 mRNA癌症疫苗在临床前和临床设置的概述2.1.3.免疫调节分子与肿瘤抑制基因编码CD70、CD40配体和组成活性TLR4的mRNA(命名为TriMix, NCT03788083)；编码人OX40L、IL-23和IL-36γ的mRNA(命名为mRNA-2752, NCT02872025，NCTO3739931)；和编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA(命名为SAR441000/BNT131、NCT03871348)是编码免疫调节分子的三种具有代表性的mRNA癌症疫苗，这类疫苗还包括编码TLR7/8激动剂和RIG-1激动剂的mRNA疫苗(CV8102/ RNA佐剂®、NCT03291002、NCT03203005)；mRNA编码OX40L [mRNA-2416 (NCT03323398)]；mRNA编码IL-12[MEDI1191 (NCT03946800)， BNT151 (NCT04455620)]；mRNA编码IL-12和IL-7 (BNT152, BNT153，NCT04710043)；和编码BisCCL2/5i的mRNA。一些研究表明，编码免疫调节分子(如TriMix，mRNA-2752，BNT131和mRNA编码BisCCL2/5i)和肿瘤抑制基因(如PTEN或p53编码mRNA)的mRNA癌症疫苗作为单一疗法也具有抗肿瘤作用，通常与多种肿瘤抗原(如MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶、gp100、生存素、hTERT和新抗原)和免疫检查点抑制剂(如抗PD-1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合用作辅助治疗。2012年，Van Lint等人发现，结节内注射TriMix和TAA(如TRP2/WT1/P1A) mRNA可诱导DCs成熟并原位启动抗原特异性T细胞。与不加佐剂的荧光素酶(FLuc) mRNA脉冲DCs相比，TriMix显著降低了DCs中FLuc的表达，且LPS、单磷酰脂质A、聚(I:C)诱导的降低作用更强；而TriMix可以产生免疫刺激环境来改善T细胞反应，优于LPS。2016年Bialkowski等人发现HPV16-E7-TriMix mRNA可诱导CD8+ T淋巴细胞向肿瘤粘膜迁移，控制肿瘤生长。当与顺铂联合使用时，HPV16-E7-TriMix mRNA通过下调髓源性抑制细胞(MDSCs)和Tregs的数量来抵抗免疫抑制微环境，导致生殖道肿瘤完全消退。在多种小鼠肿瘤模型中，瘤内注射TriMix已被肿瘤浸润的树突状细胞吸收，然后呈交给肿瘤引流淋巴结的T细胞，诱导抗肿瘤T细胞反应和抗肿瘤作用。2013年和2016年，Wilgenhof等人发现，与TriMix共电孔的DCs和编码四种与HLA Ⅱ靶向信号(DCLAMP)(命名为TriMixDC-MEL)相关的黑色素瘤相关抗原(MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶或gp100)之一的mRNA，在预处理的晚期黑色素瘤患者中具有良好的耐受性，并在两名患者(NCT01066390)中引起完全缓解和部分缓解。TriMixDC-MEL联合免疫检查点抑制剂(ipilimumab)在预先治疗的晚期黑色素瘤患者(NCTO1302496)中耐受并诱导高度持久的肿瘤反应。2020年，De Keersmaecker等人研究表明，在相当一部分晚期黑色素瘤患者中，TriMixDC-MEL和ipilimumab联合使用可诱导有效的CD8+ T细胞反应，并与患者的临床反应相关(NCTO1302496)。2019年Hewitt发现，在瘤内注射包裹在LNPs中的编码IL- 23、IL-36γ和OX40L的三联体mRNA，可以激活并招募多种免疫细胞(例如DCs和T细胞)进入肿瘤，从而诱导依赖于Batf3的交叉呈递DCs和细胞毒性CD8+ T细胞的持久抗肿瘤免疫。该疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用，在体内抗免疫检查点抑制剂模型中具有强大的抗肿瘤作用。2021年，Hotz等人发现BNT131联合抗PD -1抗体可显著提高荷瘤小鼠(如B16和MC38荷瘤小鼠)的生存率。2021年，Wang等人发现编码BisCCL2/5i LNPs的mRNA与编码PD-1配体抑制剂LNPs的mRNA联合可显著延长荷瘤(如原发性肝癌、结直肠癌和胰腺癌的肝转移)小鼠的生存期，且BisCCL2/5i可促进这些肿瘤对PD-1配体抑制剂的敏感性。表2 2016-2021年期间关于mRNA癌症疫苗的临床试验一些临床前研究表明，使用编码肿瘤抑制基因(如PTEN和p53)的mRNA治疗肿瘤是可行的。2018年，Islam等人研究发现，负载抑癌基因PTEN编码mRNA的聚脂包被多聚脂杂交NPs(如mRNA- pgcp NPs)可在体外和体内有效转染PTEN基因缺失的前列腺癌细胞，并通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶Akt通路促进癌细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长。2021年，Lin等人发现肿瘤抑制基因PTEN编码mRNA NPs可诱导PTEN突变的黑色素瘤细胞和PTEN缺失的前列腺癌细胞自噬和死亡。PTEN-mRNA NPs上调免疫抑制TME中的CD8+ T细胞和促炎细胞因子(如IL-12、TNF-α和IFN-γ)，下调Tregs和MDSCs，并与抗PD -1抗体联合对这些肿瘤产生有效的抗肿瘤作用。2019年，Kong 等人研究发现肿瘤抑制基因p53-编码mRNA NPs可促进p53缺失型肝细胞和NSCLC细胞对哺乳动物雷帕霉素抑制剂靶点(依维莫司)的敏感性，且p53-mRNA NPs与依维莫司联用在体外和体内肝癌和NSCLC模型中具有显著的协同抗肿瘤作用。编码p53和肿瘤抗原(如生存素、hTERT、新抗原)的mRNA癌症疫苗目前正处于临床试验阶段(NCTO0978913、NCT02316457)。2.1.4. mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂的联合研究肿瘤发展过程中对TAAs的中枢免疫耐受和外周免疫耐受(如免疫检查点通路，TME)是癌症疫苗面临的两大挑战。两者都会影响癌症疫苗的效力和持续时间。为了靶向中枢免疫耐受，多个TAAs或多个TSAs的组合是mRNA癌症疫苗发展的主要趋势。为了靶向外周免疫耐受，将mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用是mRNA癌症疫苗应用的另一个主要趋势。2018年，Liu等人对负载MUCI mRNA的LCP NPs联合抗-CTLA-4抗体治疗TNBC进行了临床前评估，结果表明LCP-mRNA NPs作为单一疗法或联合治疗的一部分(LCP-mRNA NPs + 抗-CTLA-4)可显著抑制肿瘤生长，且联合治疗的抑制效果明显强于LCP-mRNA NP单疗法。Wang等人研究表明，同时装载编码黑色素瘤相关抗原TRP2的mRNA和靶向PD-L1的小干扰RNA的LCP NPs可以在体外和体内有效地将mRNA传递到DCs中，并促进DCs的成熟。靶向PD-L1的小干扰RNA下调DCs中PD-L1的表达，增强抗肿瘤免疫和抗肿瘤作用，疫苗有效抑制肿瘤生长。2019年，Verbeke等人研究表明，单独使用Galsomes mRNA的体内抗肿瘤作用不明显，这种治疗可以增加免疫微环境中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、不变性NKT (iNKT)、NK和M1肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的数量；这些作者还发现，治疗对PD-1/PD-L1通路的负调控可能会限制其抗肿瘤作用。与单独接种疫苗相比，结合OVA mRNA Galsomes和抗PD-L1抗体显著增加脾脏iNKT细胞数量，降低脾脏DC细胞上PD-L1水平和脾脏增生iNKT细胞上PD-1水平，显著提高抗肿瘤效果。此外，Oberli等人表明，含有编码单一肿瘤抗原(例如gp100或TRP2)的mRNA的lnp和使用这两种抗原的序贯治疗在体内均具有显著的抗肿瘤作用；但两种方法的抗肿瘤作用无显著性差异。2.2.抗原或目标的表达2.2.1. mRNA分子的药效学用于制备疫苗的mRNA主要包括常规的非复制mRNA和病毒衍生的自扩增mRNA。mRNA的IVT是制备分子的主要技术，利用噬菌体RNA聚合酶(如T3、T7或SP6 RNA聚合酶)和含有目标抗原序列的线性化DNA模板。非复制性IVT mRNA的基本结构包括一个编码目标蛋白的开放阅读框(ORF)、一个位于5'和3'非翻译区(UTRs)两侧的7-methylgaunosine 5'帽和一个3' poly(A) 尾。5'帽和3'poly(A)可以在IVT过程中添加，也可以在初始IVT后酶促添加。自我扩增的mRNA包含两个ORFs，一个编码目标抗原序列，另一个编码病毒复制机制，从而实现持久的细胞内RNA扩增。一种由编码CEA的甲病毒复制子组成的mRNA疫苗(称为AVX701)正在临床试验中(NCTO0529984, NCTO1890213)。与蛋白质或肽疫苗不同，mRNA癌症疫苗产生效果的第一步是编码蛋白的序列信息可以翻译成功能蛋白。影响翻译过程的因素包括正调节因素、负调节因素和双向调节因素。正调控因子总结如下:①5′帽及其修饰物[如抗反向帽类似物CleanCap]可招募真核翻译起始因子4E，促进核糖体识别和翻译起始，消除mRNA序列中的游离磷酸基团，显著增强mRNA的稳定性。②poly(A)序列及其修饰(如长度’)可以减缓RNA外切酶的降解过程，从而增加稳定性，延长体内半衰期，提高mRNA的翻译效率。③UTR优化[例如，由a-珠蛋白和β-珠蛋白衍生的3' UTR序列，AU和GU-富集序列；3' UTR中的稳定元素；5' UTR中的GCC-(A/G)- CCAUGG，短而松散的5' UTR135]和ORF的密码子优化(如尿苷的缺失，G:C含量的富集，同义频繁密码子，具有较高转移RNA丰度的密码子)可以提高mRNA的稳定性和蛋白质翻译。表达载体中的表位通过不同的序列和信号肽(例如，内核/溶酶体信号分选片段和跨膜-细胞质结构域)连接，以增加IVT，提高抗原在细胞内加工和呈递的靶向性。④核苷修饰[如假尿嘧啶(Ψ)、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基胞苷(5meC)和n -乙酰胞苷修饰转录后RNA]和纯化IVT-mRNA(如Mg2+31、温度、高压液相色谱和快速蛋白液相色谱)以减少双链RNA的污染，可以降低分子的先天免疫激活，增加蛋白质翻译。与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA (5meC, Ψ)可显著促进小鼠FLuc的表达。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用明显强于LCP(未修饰mRNA)。负调控因素包括:①细胞外RNases酶能快速降解裸mRNA。②IVT产生的双链RNA杂质可以结合细胞质中的模式识别受体(PRRs)[如RIG - Ⅰ，黑色素瘤分化相关蛋白5 (一种RIG -Ⅰ受体)，蛋白激酶RNA激活(也称为真核翻译起始因子2 alpha激酶2)，2'-5'-寡腺苷酸合成酶]和内体(如TLR3)来激活特定途径[如RIG -Ⅰ /MAD5→线粒体抗病毒信号蛋白→IFN Ⅰ，(IFN Ⅰ→)蛋白激酶RNA激活→真核翻译起始因子2alpha， (IFN Ⅰ→)2′5′-寡聚腺苷酸合成酶→核糖核酸酶L, TLR3→含有Toll/IL-1受体结构域的适配器诱导IFN-β→IFN Ⅰ]，可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解。双向调节因子包括未修饰的单链RNA作为病原体相关分子模式(PAMP)，它可以结合内体中的PRRs[如TLR7, TLR8]来激活特定途径(TLR8→髓样分化因子88→促炎细胞因子；TLR7→骨髓分化因子88→干扰素调节因子7→IFN Ⅰ)。一方面，mRNA可以激活先天免疫反应(DC成熟和激活)，进而激活适应性免疫反应(T和B细胞免疫反应);另一方面，过早和过度激活IFN Ⅰ可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解，促进DC和T细胞凋亡。过度强烈的炎症反应也会引起毒副作用。在T细胞中，Ⅰ型IFN受体信号的激活先于TCR信号的激活，可作为促进免疫应答的真正第三信号。Udhayakumar等人表明，与含有未修饰mRNA的RALA mRNA纳米复合物相比，含有Ψ-和 5meC-修饰mRNA的mRNA纳米复合物诱导了有效的抗原特异性细胞毒性T细胞反应，并且具有优越的疗效，修饰的(5meC，Ψ) mRNA纳米复合物通过抑制IFN-β活化显著降低了Ⅰ型IFNs对CTLs的抑制作用，并有效诱导了CTLs。相比之下，Oberli等人表明，未修饰mRNA LNP疫苗在外周血中诱导的CD8 T细胞应答(7.8%)比核苷修饰mRNA (5meC，Ψ) LNP疫苗(1.0%)强得多，并表明Ⅰ型干扰素是保护性CD8 T细胞应答所必需的。这些相互矛盾的结果可能与双向调节因素有关。2.2.2.疫苗抗原表达方法根据抗原的表达，疫苗可分为多肽或蛋白质疫苗、细胞疫苗(如肿瘤细胞疫苗、DC疫苗和工程细胞疫苗)、核酸疫苗(如DNA和RNA疫苗)和病毒载体疫苗。肽或蛋白疫苗是广泛使用的疫苗类型。抗原肽的序列定义明确，易于控制。肽疫苗包括短肽疫苗和长肽疫苗。短肽疫苗有一些缺点，包括蛋白质水解导致抗原降解和免疫反应持续时间较短，短肽可以结合许多核细胞表面的MHC Ⅰ分子，这些核细胞作为非专业抗原呈递细胞APCs)，通常不含共刺激信号，导致抗原耐受和T细胞功能障碍。长肽疫苗通常含有20-30个氨基酸，可激活CD4+和CD8+ T细胞。蛋白质疫苗也能诱导T细胞反应；然而，长肽通常比蛋白质更有效地被APCs内化和加工。长肽疫苗的缺点包括对酶降解的敏感性、快速清除和注射部位吸收不足。细胞疫苗主要包括癌细胞疫苗和DC疫苗。癌细胞疫苗是用自体或异体灭活的全细胞及其衍生物(如细胞裂解物、DC融合衍生物、表达TSAs或免疫增强因子的修饰全细胞和肿瘤衍生mRNAs)，它们通常包含细胞的所有抗原，在疫苗设计和生产之前不需要费力地鉴定，从而导致相对快速的制备和某些个性化特征。然而，使用癌细胞的方法不能准确地测定和控制相应的肿瘤抗原，质量控制困难，而且癌细胞往往含有较少的特异性抗原，导致免疫原性较弱和潜在的致癌性。DCs是最有效的APCs，在连接先天和适应性免疫反应中起着核心作用。DC疫苗一般使用自体DC作为载体来表达和呈递抗原。1996年，Boczkowski等人证明了使用肿瘤来源的mRNA癌细胞脉冲DCs的可行性。2017年之前，在大约24项临床试验中，mRNA癌症疫苗使用DCs作为载体。然而，DC疫苗的制备工艺复杂，生产昂贵，质量控制困难。此外，患者必须具有相对正常的免疫功能，没有化疗或其他治疗引起的骨髓抑制，并提供大量功能性DCs，导致可用疫苗数量有限。核酸疫苗是用编码抗原的核酸(如DNA、RNA)制备的。mRNA疫苗的特点已在本文第1部分进行了描述。与mRNA相比，DNA必须进入细胞核才能翻译成相应的抗原，这有插入突变引起的潜在风险，可能比mRNA更不安全。总的来说，核酸对降解敏感，不稳定，半衰期短，导致裸核酸被APCs吸收的效率较低。新的载体和给药途径。用于提高核酸的吸收和呈递效率(下文讨论)。有限的研究表明mRNA癌症疫苗与肽或蛋白癌症疫苗相比具有抗肿瘤优势。用体外合成的鸡OVA RNA脉冲的DCs比用OVA肽脉冲的DCs在体外刺激OVA特异性的初级CTL反应更有效。在原位治疗性肿瘤模型中，DOTAP/DP-C/mRNA编码5种新抗原在诱导脾脏产生活化T细胞(CD3+ CD8+ IFN-γ+)方面明显强于DOTAP/DP-C/突变肽。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用显著强于LCP (TRP2肽/CpG)。编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs提高MC38-S荷瘤小鼠存活率的能力明显强于相应的蛋白处理。肽抗原通常只含有一个表位，而mRNAs编码的全长抗原含有多个表位，可以诱导T细胞靶向这些表位，产生更强的抗肿瘤作用。病毒载体疫苗是利用病毒作为表达或呈递抗原的载体制备的。目前，被广泛研究的病毒载体包括痘病毒、腺病毒和疱疹病毒。出于安全考虑，采用复制缺陷病毒或减毒病毒。痘病毒可包含多个基因，复制和转录仅限于细胞质，插入突变的风险较低，表达产物可呈现MHC Ⅰ和Ⅱ。非禽类痘病毒可以诱导宿主产生免疫反应，从而使其只能使用一种或最多两种疫苗。重组鸟痘病毒可以多次接种，其病毒外壳蛋白不能在哺乳动物细胞中产生，并且病毒不能诱导宿主产生免疫反应来中和病毒。重组腺病毒载体易于设计，作为疫苗和基因治疗药物的载体已显示出实用性；然而，它们的免疫原性会影响疫苗的效果。疱疹病毒有广泛的宿主范围；可感染神经细胞、外周血单核细胞和DCs；并且具有复制周期短、容量大、安全性相对较好的特点。此外，其他载体，如细菌和酵母，在临床前研究中显示出作为疫苗载体的潜力。总的来说，免疫原性、致癌性、传染性、包装能力有限和病毒载体生产困难是广泛应用的挑战。2.3.mRNA癌症疫苗的载体开发具有良好的安全性、靶向性、稳定性、自佐剂效应、负载能力和通用性的mRNA递送载体，能够高效、持续地递送和呈递抗原，激活APCs，是mRNA肿瘤疫苗领域的一个基本方向。mRNA肿瘤疫苗在临床前采用的载体如表3所示。mRNA癌症疫苗中使用的主要载体之一是脂质体及其衍生物。1995年，Conry等人显示了编码人CEA复合物的脂质体mRNA的体液免疫原性，首次在临床前研究中证实了mRNA癌症疫苗的概念验证。甘露糖可以与DCs表面表达的甘露糖受体结合，利用靶向DCs的载体促进mRNA的高效传递和转染。2011年，Perche等人研究表明，携带mRNA的Man11-LPR100转染DCs的效率是无糖LPR100的4倍，并且在体内具有更好的抗肿瘤作用。由于甘露糖与其受体之间的结合力较弱，增加载体表面甘露糖的密度可能是提高甘露糖修饰LPR递送效率的有效途径。2018年，Le Moignic 等人研究表明，与单甘油三酯- LPR相比，三甘油三酯- LPR可以更有效地诱导抗原转染，通过在注射部位诱导局部炎症反应，将更多的DCs招募到引流淋巴结，并更有效地诱导抗原特异性免疫反应。2018年，Wang 等人利用甘糖醇偶联物(MPn-CHs)制备了DCs靶向脂质体(MPn-LPs)作为mRNA载体，结果表明MP1000-LPs负载mRNA (MP1000-LPX)具有良好的转染效率，MP1000-LPX主要通过增强DCs上甘糖受体(如CD206)的表达来增强mRNA的表达。2020年，Son等人研究表明，采用多糖包被二氧化硅纳米颗粒制备的Mann -capsules可以通过Dectin-2或TLR-4激活骨髓源性树突状细胞(BMDC)，且Mann -capsules促进BMDC分化和成熟的能力明显强于PEI或脂质体；此外，PEI和脂质体具有高毒性。LNPs似乎是一种很有前途的mRNA癌症疫苗载体。LNPs的成分主要包括可电离脂质，促进mRNA的自组装和内体释放；磷脂，支持脂质双层结构；胆固醇，一种稳定剂；脂质锚定聚乙二醇，延长配方的半衰期。还考虑了筛选和鉴定这些媒介的高通量技术。2017年，Oberli 等人构建并优化了LNP库，发现含有编码肿瘤抗原的mRNAs(如gp100和TRP2)与LNPs作为佐剂结合，可有效诱导抗原特异性CD8+ T细胞，抑制肿瘤生长，延长小鼠OS。2018年，McKinlay等人对基于两亲性CARTs的mRNA载体库进行了高通量筛选研究，结果表明，与单一CART或脂质体 2000相比，双CART可将体外淋巴细胞mRNA转染效率提高9倍；体外mRNA转染效率为80%，小鼠淋巴细胞mRNA转染效率为1.5%。2019年，Miao等人建立了一种高通量的可电离类脂质构建技术，可在一天内合成数千种脂质制剂，并使用DCs(如HeLa细胞、BMDCs或骨髓源性巨噬细胞)高通量评估LNPs的转染效率。结果表明，mRNA LNPs通过干扰素基因通路的胞内刺激物诱导APC成熟，增强抗肿瘤作用。2021年，Meng等人发现含有CpG核心的VLVPs可以促进DC成熟和抗原呈递、抗原特异性CD8+ T细胞在淋巴器官中的增殖和肿瘤中的T细胞浸润，并减少免疫抑制细胞(如肿瘤相关骨髓源性抑制细胞和表达精氨酸酶1的抑制性DCs)。以LNPs为载体的mRNA癌症疫苗[如编码新抗原的mRNA-4157 (NCTO3313778、NCTO3897881)和编码突变蛋白的V941 (NCT03948763)]目前正处于临床试验阶段。多阳离子肽鱼精蛋白和DCs是mRNA癌症疫苗中采用的另外两种主要载体。鱼精蛋白和DCs的特点及其作为mRNA癌症疫苗载体的研究进展分别见第2.1.1节和2.2.2节。鱼精蛋白可以保护mRNA不被血清RNA酶降解，促进mRNA的传递。此外，鱼精蛋白可与脂质体联合使用(例如，阳离子脂质体-鱼精蛋白，LPC和VLVP)。2000年，Hoerr等人发现脂质体包裹的浓缩RNA-肽复合物可诱导抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应，裸RNA和蛋白蛋白保护的RNA在体内均可诱导特异性免疫反应，而受保护的RNA在体外稳定时间较长。Mai等人的研究表明，携带细胞角蛋白19编码mRNA的LPC经鼻递送可诱导小鼠APC成熟和强烈的细胞免疫反应，并降低肿瘤的生长。载体对疫苗的效力有关键影响。Phua等人表明，在没有NP载体的情况下，鼻内接种裸mRNA不能诱导抗肿瘤免疫反应。然而，临床前和临床研究都在综合考虑所选靶点、佐剂和递送方法的基础上证明了裸mRNA的可行性和有效性。发现FLT3可增强结内裸RNA的抗肿瘤作用。结内HPV16-E7-TriMix裸mRNA和瘤内TriMix裸mRNA均可诱导有效的抗肿瘤T细胞反应。结节内裸mRNA多重新表位疫苗诱导有效的抗原特异性T细胞免疫应答(NCT02035956)。2.4.佐剂在mRNA癌症疫苗的临床前研究中开发的一类主要佐剂[如LPS73, poly(I:C), Td, CpG]是PAMPs，它通过PAMP-PRR途径激活DCs，然后调节先天和适应性免疫反应。作为一种强效的回忆抗原，Td可通过CCL3106促进DC迁移，提高抗肿瘤作用。LPS辅助处理进一步提高了CD8+ T细胞水平和LNP mRNA诱导细胞的抗肿瘤活性。mRNA- CART联合CpG的体内抗肿瘤作用明显强于mRNA-CART和裸mRNA与CpG的联合，也强于mRNA-CART与TLR7配体或CD80 /86 mRNA的联合。大多数新型载体(如脂质样材料C1、DOTAP/ DP7-C、Mann-capsule、LNPs)兼具载体和佐剂的特性，其中一些载体具有佐剂的功能，类似于PAMPs。Mann -capsule通过Dectin-2或TLR-4激活BMDCs，葡聚糖-capsule通过CD206、CD209或巨噬细胞诱导的C型凝集素激活BMDCs。DP7-C、DOTAP和mRNA分别通过TLR2、TLR4和TLR7激活DCs。DOTAP/DP7C诱导DC成熟和抗原呈递的能力明显强于DOTAP、poly(I:C)和CpG。Cl或C1 mRNA可通过TLR4依赖的核因子κB信号通路促进BMDC活化，C1- OVA mRNA的体内抗肿瘤作用是TLR4依赖的CpG，因为VLVP中含有的佐剂，可以提高疫苗的效果，阻止PD-1在T细胞中的表达。然而，这些类PAMP佐剂可能影响mRNAs的翻译效率和降解，并具有潜在的毒性，如2.2.1节所述。开发既不影响mRNA翻译效率，又能积极调节多种先天和适应性免疫反应，促炎作用相对温和，毒性较低的新型佐剂已成为重要方向。TAA mRNA的免疫原性可以通过GM-CSF mRNA的共递送而增强。FLT3配体可促进浆细胞样DCs、经典DCs和NK细胞的扩增；诱导T辅助1型微环境；增强肿瘤内T细胞浸润及裸RNA的抗肿瘤作用。mRNA LNPs可通过刺激干扰素基因依赖性激活Ⅰ型IFN，诱导APC成熟，限制全身细胞因子表达，增强抗肿瘤作用。用于mRNA Galsomes的佐剂α-GC可通过DCs呈递激活iNKT细胞。活化的iNKT细胞可与DCs发生双向正调节作用，可正向调节NK细胞和免疫抑制细胞(如MDSCs和M1 TAMs)，不影响mRNA翻译效率，促进直接和间接的抗肿瘤作用。编码免疫共刺激分子的mRNA可用作佐剂(见2.1.3节)。TriMix (NCT01066390, NCTO1302496)；mRNA-2752 (NCT02872025)；mRNA编码人OX40L (mRNA-2416, NCT03323398)；编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA (BNT131，NCTO3871348)；编码IL-12的mRNA (MEDI1191，NCT03946800)；和mRNA编码的TLR7 /8激动剂和RIG-1-兴奋剂(RNA佐剂®)，NCT03291002，NCT03203005]正在临床试验中作为辅助治疗与免疫检查点抑制剂联合使用。表3 在临床前环境中用于mRNA癌症疫苗的递送系统概述2.5.给药途径给药途径直接影响疫苗的效力，mRNA癌症疫苗通常采用的给药途径包括静脉注射、皮内、皮下、肌肉注射、结内和肿瘤内给药。静脉注射允许更大的疫苗量和直接将疫苗输送到淋巴器官，但也有更大的系统性毒性风险。皮下注射疫苗的真皮含有APCs(如，DCs和巨噬细胞)以及血管和淋巴血管，但主要由致密结缔组织组成，导致通过皮内途径给药时疫苗量很小。皮内给药也可导致注射部位的不良反应(例如，肿胀、疼痛、红斑和瘙痒)。皮下注射疫苗的皮下区域含有比真皮更少的APCs；然而，它主要由脂肪组织的松散网络组成，允许通过皮下途径注射更大的注射量，从而引起更少的局部副作用(如疼痛)。肌肉注射疫苗的肌肉含有致密的血液网络，可以帮助招募和再循环不同类型的免疫细胞(如，浸润性APCs)到注射部位。肌内给药比皮内给药的注射量大，局部副作用也比皮内和皮下给药轻。结内注射疫苗的淋巴结含有多个APCs，结内给药具有较高的递送效率，允许小剂量的疫苗，但涉及复杂的程瘤内给药主要用于编码免疫共刺激分子的mRNA疫苗(例如TriMix, CV8102, mRNA-2752, mRNA-2416, BNT131和MEDI1191)作为免疫辅助治疗，也允许小剂量的疫苗，涉及复杂的程序。准确预测特定疫苗的最佳给药途径是困难的，建议通过直接比较研究来选择疫苗的最佳给药途径。结内注射的Luc-RNA在体内的转染效率优于皮内或皮下注射。经静脉注射OVA RNA复合DOTAP-DOPE诱导的CTLs杀伤作用优于皮内或皮下注射(静脉注射＞皮内注射＞皮下注射)。结内递送OVA mRNA联合TriMix诱导的抗原特异性T细胞的体内细胞毒性明显强于皮内递送疫苗。皮内接种E7 mRNA单糖化-LPR诱导的抗原特异性T细胞应答明显强于皮下接种。通过CART有效地将mRNA传递到APCs中(次要淋巴细胞APCs优先通过静脉注射靶向，而局部APCs通过皮下注射靶向)。肿瘤内三次给药的编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs的抗肿瘤作用显著优于同种药物的皮内或皮下给药；然而，在同一剂量下，通过这些途径的抗肿瘤效果没有显著差异，这表明对肿瘤疫苗的给药效果也与给药频率有关。鼻黏膜富含APCs和免疫细胞，临床前研究表明经鼻内注射的mRNA癌疫苗初步有效。鼻内接种mRNA纳米颗粒和鼻内递送LPC mRNA均可诱导抗肿瘤免疫应答。3.mRNA癌症疫苗的挑战和趋势迄今为止，已有数百种癌症疫苗进行了临床评估，美国食品和药物管理局(FDA)批准了三种治疗性癌症疫苗[卡介苗 (TheraCys®)，一种牛分支杆菌减毒活株，用于治疗非肌肉浸润性膀胱癌；Sipuleucel-T (Provenge®)，一种用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的DC疫苗；以及用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤性疱疹病毒疫苗(talimogene laherparepvec, T-VEC) (Imlygic®)和两种预防性癌症疫苗(HPV疫苗和乙型肝炎病毒疫苗)。影响mRNA肿瘤疫苗研制的因素主要包括分子本身的内在因素和外部因素[如对肿瘤抗原的中枢耐受性(见第2.1.1节)、肿瘤和HLA的异质性以及肿瘤免疫微环境]。这些因素深刻地影响了mRNA癌症疫苗的发展。从内在因素来看，研究人员通过改进mRNA的结构和序列，改进mRNA的制备和纯化技术(见第2.2.1节)，开发新的传递载体(见第2.3节)，在一定程度上提高了mRNA癌症疫苗的有效性。肿瘤异质性的本质是肿瘤细胞的基因组异质性，导致抗原异质性，这是影响抗肿瘤T细胞反应产生的关键因素，也是开发个性化癌症疫苗的主要原因。HLA异质性主要是指个体间HLA分子类型的不同，导致个体间这些分子对肿瘤抗原的结合区域或结合亲和力存在差异，从而影响抗肿瘤T细胞反应的产生和强度。HLA异质性是由HLA等位基因在不同民族和地区人群中的多态性引起的。HLA Ⅰ等位基因包括9-11个常见超型，其覆盖率为90%。HLA-A loci (HLA-A等位基因：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101和A*2402)占HLA-Ⅰ等位基因的60%，HLA-B loci (HLA-B等位基因：B*0702、B*0801、B*2705、B*3501和B*5701)占这些等位基因的35%以上。TME由免疫细胞、间充质细胞以及多种细胞因子和组织因子组成，在肿瘤发生和免疫逃逸中起重要作用。大质量内的间质压力可减少大分子(如抗体)和效应细胞(如T细胞)的扩散。大多数实体瘤也缺乏T细胞共刺激分子。TME通常含有免疫抑制细胞，包括CD4+Tregs, MDSCs，抑制性CD8+T细胞，M2 TAMs和调节性NK/NKT细胞。这些免疫抑制细胞和TME中的肿瘤细胞可以释放大量可溶性的免疫抑制因子，包括转化生长因子β、IL-10、PD-L1、吲哚胺2,3-双加氧酶和血管内皮生长因子等，进入微环境。考虑到肿瘤和HLA的异质性，肿瘤新抗原疫苗的开发在理论上比TAA定向疫苗具有更强的特异性抗肿瘤作用和更弱的毒副作用，一直是癌症疫苗研究的主要热点(见2.1.2节)。鉴于肿瘤免疫微环境，开发基于免疫的联合疗法(例如，与佐剂或免疫检查点抑制剂联合)已成为癌症疫苗应用的一个关键趋势(见第2.1.4和2.4节)。4.讨论产品的临床前评价是进入临床转化的前提，合理的评价可以提高预测临床结果的可靠性。临床前评价所采用的参数、技术和方法是疫苗质量标准的重要组成部分。疫苗的临床前评价应充分阐明疫苗的作用和机制，而mRNA肿瘤疫苗临床前评价的重点是确定抗原特异性T细胞反应的产生(如T细胞的数量和活化)和效果(如T细胞的杀伤作用和抗原亲和力)。一般来说，在临床前评估中，定量的体外和体内试验用于评估mRNA癌症疫苗的效果和机制。根据目前对抗原特异性T细胞免疫应答的认识，评价参数主要包括①鉴定疫苗的理化特性；②mRNA转染APC的效率(如结合与摄取、内化与转运、表达与分布)；③APCs的分化、成熟和抗原提呈；④疫苗免疫刺激；⑤细胞免疫原性(如CTL的产生、增殖和靶细胞杀伤)；⑥体液免疫原性；⑦抗肿瘤作用及相关机制；⑧初步毒性（如细胞毒性、内脏毒性和溶血）。诸如颗粒大小、电荷、对mRNA的结合能力和负载率、稳定性(如时间、温度和血清稳定性)、聚乙二醇化和硬度等因素可影响抗原递送(如淋巴引流)。Son等人研究表明，尺寸为~220 nm的Mann-capsules具有良好的变形能力，通过50 nm孔膜后的回复率约为30%。与基于蛋白质或肽的疫苗不同，mRNA疫苗开发的第一步是确保mRNA序列中编码的信息能够有效地翻译成相应的蛋白质或肽。mRNA的体外和体内转染效率是mRNA疫苗临床前评价的重要参数，提高mRNA的转染效率是提高mRNA疫苗药效学的关键途径。然而，APCs的体外转染效率可能存在差异，DOTAP/ DP7 - 增加了绿色荧光蛋白mRNA在APCs(包括293T、JAWSII、DC2.4和BMDCs)中的体外转染效率分别为84.87±3.21%、12.23±1.35%、28.49±2.46%和14.51±2.35%。为了验证mRNA在体外和体内的转染效率，我们以多种APCs作为体外转染模型，在体内检测不同器官的多种APCs的mRNA转染效率。增强绿色荧光蛋白(FLuc)是实验中常用的转染蛋白。染料标记的mRNA或疫苗载体已广泛用于转染研究。共聚焦显微镜和流式细胞术常用于评估细胞内微转染(如递送、摄取和翻译)，共聚焦显微镜可更直观、准确地评估mRNA的翻译效率，交互式视频信息系统可用于评估全身或局部大转染(如分布、淋巴引流)。用于体内抗肿瘤活性评价的肿瘤模型主要包括治疗性或预防性皮下、原位和肺转移肿瘤模型，所建立的体内肿瘤模型应准确模拟人体病理。Bialkowski等人的研究表明TC-1肿瘤的TME可因肿瘤接种部位(即皮下、肺部和生殖道)的不同而有显著差异，这直接影响了E7-TriMix mRNA疫苗的抗肿瘤效果。在选择用于临床前评估的细胞或动物模型时，物种特异性是需要考虑的重要因素。为了获得更准确的评价信息，可以建立人源化动物模型。通过静脉注射人外周血单个核细胞(HLA-A2型)的CD34+造血干细胞建立的人源化小鼠，进入免疫缺陷NOD/ shi-scid IL-2Rγnull小鼠或C57BL/6小鼠，建立体内肿瘤模型(如结果表明，转染修饰的人CD133 mRNA的DCs处理人源化小鼠模型的中位生存期大于60天，转染修饰的小鼠CD133 mRNA的DCs处理同源小鼠肿瘤模型的中位生存期为38天。肿瘤疫苗理论上具有抗肿瘤复发和转移的作用，可以建立多种体内肿瘤模型进行评价，阐明这些疫苗在预防或治疗肿瘤转移或复发方面的优势。有效的抗肿瘤反应需要多个免疫细胞的协同作用，而不是单个细胞的作用。目前，大多数肿瘤疫苗的重点是诱导CD8+T细胞，但CD4+T细胞等免疫细胞在诱导和维持免疫记忆、增强CTLs的肿瘤杀伤作用中也发挥着重要作用。采用NKT配体(如α-GC)作为佐剂的mRNA Galsomes通过iNKT细胞诱导抗肿瘤作用。在含有CD4+和CD8+T细胞的培养系统中转染CD133 mRNA的DCs比仅含有CD4+或CD8+T细胞的培养系统中的DCs更有效地激活T细胞并杀死肿瘤靶细胞。也有人担心mRNA癌症疫苗的安全性和副作用。修饰后的mRNA可与血清蛋白结合形成血管闭塞，具有潜在的毒性。DOTAP/DP7-C mRNA具有良好的血清稳定性和较低的细胞毒性；然而，Lipo2000和PEI25K具有很强的细胞毒性。最后，我们期待mRNA癌症疫苗的成功临床转化。参考资料：He Q, Gao H, Tan D, Zhang H, Wang JZ. mRNA cancer vaccines: Advances, trends and challenges. Acta Pharm Sin B. 2022 Jul;12(7):2969-2989. doi: 10.1016/j.apsb.2022.03.011. Epub 2022 Mar 23. PMID: 35345451; PMCID: PMC8942458.

信使RNA疫苗上市批准紧急使用授权加速审批

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适应症	最高研发状态	国家/地区	公司
肝细胞癌	临床2期	西班牙更多	National Cancer Institute 更多
腺样囊性癌	临床1期	西班牙更多	CureVac SE 更多
黑色素瘤	临床1期	俄罗斯更多	CureVac SE 更多
结直肠癌	临床1期	德国更多	CureVac SE 更多
头颈部鳞状细胞癌	临床1期	德国更多	CureVac SE 更多

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研究	分期	人群特征	评价人数	分组	结果	评价	发布日期


NCT03203005 (Pubmed \| Clin Cancer Res) 人工标引	临床1/2期	肝细胞癌	22	Cyclophosphamide+IMA 970 A+CV 8102	獵餘築獵願鏇蓋積鹹憲(簾齋鑰襯齋糧夢淵顧獵) = against ≥1 vaccinated HLA class I tumor-associated peptide (TAA) and ≥1 vaccinated HLA class II TAA were respectively induced in 37% and 53% of the vaccinees 廠觸積構鹽鹹網築襯蓋 (顧淵蓋窪遞遞選醖鬱築 ) 更多	积极	2022-06-13
NCT03291002 (CV-8102-008, ESMO2021) 人工标引	临床1期	HR阳性/HER2低表达实体瘤	58	CV8102	(鏇獵衊膚襯衊鹽遞範範) = 壓襯願壓築壓觸繭壓顧積襯醖夢繭簾網願餘襯 (積壓夢網艱蓋夢鹹窪製 ) 更多	积极	2021-09-16
				anti-PD-1 antibodies+CV8102	(鏇獵衊膚襯衊鹽遞範範) = 觸膚壓蓋餘淵淵簾餘範積襯醖夢繭簾網願餘襯 (積壓夢網艱蓋夢鹹窪製 ) 更多
NCT03291002 (CV-8102-008, Accesswire) 人工标引	临床1期	难治性黑色素瘤 PD-1	40	CV8102	(憲艱醖獵艱鹽願簾選窪) = 夢網製淵鹽憲鹹繭窪襯遞憲顧鬱醖鏇鑰繭餘鹹 (鏇壓鑰餘齋鏇鹹構觸淵 )	积极	2022-11-11
				anti-PD-1 antibodies+CV8102	(憲艱醖獵艱鹽願簾選窪) = 獵齋窪觸淵壓憲齋夢鹹遞憲顧鬱醖鏇鑰繭餘鹹 (鏇壓鑰餘齋鏇鹹構觸淵 )