Deoxypodophyllotoxin

“ 点击蓝字 关注我们 丹皮酚的药理作用及药代动力学研究进展 PPS  赵紫雅1，2，孙建国1，2，3* （1. 中国药科大学 江苏省药物代谢动力学研究重点实验室，江苏 南京210009；2. 中国药科大学多靶标天然药物全国重点实验室，江苏南京 210009；3. 中国医学科学院“ 中药复杂组分PK-PD结合研究 ”创新单元，北京 100730） 孙建国 博士，研究员，博士研究生导师，专业方向为药物代谢动力学，主要从事创新药物体内和体外吸收及代谢特性研究、药物相互作用研究 、生理药代动力学研究、中药药代动力学研究 。先后赴新西兰奥塔哥大学药学院和美国华盛顿大学药学院任访问学者，2010 年赴新西兰参加科技部组织的“ 中新科学家交流计划”，2011 年被评为江苏省“333高层次人才培养工程 ”第三梯队培养对象并获得政府留学奖学金 。担任 J Chromatogr B, Xenobiotica, Phytomedicine与《药学进展》《中国新药杂志》等杂志审稿人。 先后主持完成了4项江苏省自然科学基金资助项目，2项国家自然科学基金资助项目，1项国家重点研发计划资助项目，主持多项国家重大科研项目子课题，参加多项国家重大科研项目，近年来发表论文40余篇，其中以第一作者或通信作者发表的论文20余篇（SCI论文18篇），申请专利6项，授权4项。曾获国家科技进步奖二等奖1项，全国创新争先团队奖1项，江苏省科技进步奖一等奖3项。与企业共同合作获得新药临床批件5项，负责完成的药代动力学研究支持企业获得新药证书多项。 [摘要] 牡丹皮具有清泄心、肾、肝之火以及活血化瘀等功效，在中医临床中应用广泛。丹皮酚作为牡丹皮的核心活性单体，因其多靶点生物活性成为天然药物研究热点。药理学研究表明，丹皮酚通过调控炎症介质、细胞周期蛋白及氧化应激通路，在抗炎、神经保护、心血管保护、抗肿瘤等方面展现出多维度治疗潜力， 同时其药代动力学特征也逐步被揭示。基于国内外相关研究，系统总结了丹皮酚的药理作用及药代动力学研究进展， 旨在为丹皮酚的进一步研究和临床应用提供理论依据和新的思路。 丹皮酚分离自牡丹、芍药的干燥根皮以及徐长卿的根或全草[1]，是中药本草牡丹皮的主要活性成分。牡丹皮作为中国传统中药材，其应用历史可追溯至《神农本草经》和《本草纲目》，其中详细记载了牡丹皮清泄心、肾、肝之火以及活血化瘀的功效，并在经典方剂如仲景肾气丸中得到广泛应用。 随着现代科学技术的发展，牡丹皮的化学成分和药理作用研究取得了显著进展。丹皮酚作为牡丹皮中最重要的药效成分，已被证实具有广泛的药理活性[2-5]（见图1）。本文总结丹皮酚在抗炎、神经保护、心血管保护、抗肿瘤等方面的药理作用与相关机制以及其在药代动力学方面的研究进展，以期为深入探究丹皮酚在临床应用中的潜在价值提供参考。 1 丹皮酚的多靶点网络分析 笔者所在课题组基于中医药整体调节理论，深入解析了丹皮酚的多靶点作用特征。通过整合TCMSP与CTD数据库资源，构建了丹皮酚的分子相互作用网络图谱，对丹皮酚的潜在靶点进行系统性挖掘（见图2）。借助SwissTargetPrediction与UniProt数据库验证[6]，实验数据证实该成分具备与200余种人类蛋白靶点产生相互作用的潜力。利用STRING数据库进行的蛋白网络拓扑学分析表明，其核心作用节点覆盖核因子ĸB（nuclear factor-ĸB， NF-ĸB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein  kinase ， MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase ， PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B ，AKT）等重要信号转导系统，这些枢纽网络与炎症级联反应、氧化损伤修复及细胞增殖调控存在密切关联，目前已完整绘制其多维度作用网络框架。 通路富集解析显示，丹皮酚作用靶点显著聚集于肿瘤发生通路（hsa05200）、炎症调控模块（GO：0006954）及神经退行病理进程（hsa05010），揭示其通过多靶点协同产生治疗效应的分子基础（见图3）。这种“微量成分-广谱调控”的特性，可解释其在抑制炎症风暴、阻断氧化应激瀑布效应及干预细胞周期紊乱等方面的整合调节能力，与中医“异病同治”理论形成分子层面的呼应——通过核心信号节点的网络化调控，实现对不同病理状态的协同干预。这种作用模式为阐释传统药效物质基础的现代科学内涵提供了创新视角。 2 药理作用 2.1 抗炎作用 炎症[7]是一种由免疫细胞引起的复杂病理状况，其与很多疾病的发病机制相关。丹皮酚的抗炎活性已在多种疾病模型（包括动脉粥样硬化[8]、结肠炎[9]、神经炎症[10]等）中得到系统性验证。其作用机制涉及氧化应激调控、炎症信号通路干预及线粒体功能调节这3个层面。 研究表明[11]，丹皮酚不仅能够通过提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量发挥抗氧化作用，还可以通过清除体内自由基如羟基自由基(·OH）、超氧阴离子自由基（O2-·)和2,2-二苯基-1-苦基肼自由基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）等，治疗过度氧化造成的机体损伤。在张鹏等[12]进行的DPPH自由基清除实验中，丹皮酚通过接受自由基中的单电子，使其配对并消除自由基，从而降低自由基对细胞的损伤，且其抗氧化能力呈剂量依赖性。 丹皮酚通过调节血脂、降低血液黏稠度及减轻肝脏脂肪沉积，激活腺苷一磷酸激活的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase， AMPK）/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mamma-lian target of rapamycin ， mTOR）/自噬相关基因（autophagy-related gene ，ATG）通路并上调肉碱棕榈酰转移酶-1（carnitine palmitoyltransferase1， CPT 1）和沉默信息调节因子1（sirtuins 1 ，SIRT 1），抑制固醇调节元件结合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c ， SREBP-1c），从而缓解活性氧（reactive oxygen species ，ROS）介导的氧化应激[13]。其还可通过激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2 ， Nrf2）/Kelch样ECH关联蛋白1（Kelch-like ECH- associated protein 1 ， Keap1）/抗氧化反应元件（antioxidant response element ，ARE）信号通路增强细胞抗氧化能力[14]，并直接减少ROS生成[15]。线粒体形态异常会导致线粒体功能障碍和ROS过量，从而导致线粒体膜电位的丧失，同时线粒体损伤也会促使ROS过度产生[16]。研究表明[17]，丹皮酚可以抑制超氧化物产生、改善线粒体功能障碍，下调细胞凋亡相关蛋白的表达，缓解脂多糖（lipopolysaccharide ， LPS）引起的肝细胞损伤。丹皮酚[18]还可通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α , PGC-1α)对线粒体依赖性凋亡产生显著影响。酪蛋白酶途径[19]将线粒体损伤与酪蛋白酶激活联系起来，并作为线粒体膜功能损伤的指标。研究发现[20]，丹皮酚可以诱导线粒体膜去极化，并加剧了造血干细胞（hematopoietic stem cell ，HSC）中线粒体介导的细胞凋亡和激活酪蛋白酶级联反应，进而抑制HSC生长。 2.2 神经保护作用 丹皮酚在外周神经系统中发挥了重要的抗炎作用，其在许多中枢神经系统疾病中也发挥着显著作用。 糖尿病脑病（diabetic encephalopathy ，DE）作为糖尿病并发症中最常见的一种神经类疾病，其主要特征是认知功能受损，以及血糖水平升高引发的神经元损伤[21]。研究显示[22]，丹皮酚可减轻氧葡萄糖剥夺（oxygen and glucose deprivation ， OGD）所致的海马神经元的损伤。科学家在D-半乳糖诱导的脑老化模型中发现，丹皮酚可提升乙酰胆碱、谷胱甘肽（glutathione ， GSH）及Na+-K+-ATP酶活性，改善DE小鼠的学习和记忆功能。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor ， BDNF）和胰岛素样生长因子（insulin like growth factor ，IGF）水平的升高与神经营养系统认知障碍的病程进展风险呈负相关，二者可通过神经保护作用抑制认知功能衰退的进程。丹皮酚通过抑制大鼠海马体和皮质中酪蛋白酶-3的表达，并恢复BDNF和IGF的表达，从而增强认知功能保护[23]。丹皮酚也可以降低海马体的MDA和ROS水平，并下调糖尿病引起的阿尔茨海默病模型大鼠的促炎因子骨髓过氧化物酶（myeloperoxidase ，MPO）、TNF-α和IL-6表达，从而抑制星形细胞增殖[24]。 同时，丹皮酚可通过改善神经炎来保护中枢神经系统。在LPS诱导的小胶质细胞及小鼠巨噬细胞的慢性神经炎模型中[25]，丹皮酚可通过阻断c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase ，JNK）和NF-ĸB上游信号通路减少炎症因子TNF-α和IL-6的释放，降低一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和环氧合酶-2（cyclooxygenase-2 ， COX-2）的水平，从而降低NO和前列腺素E2（prostaglandin E2 ， PEG2）的表达，减轻神经炎。此外，丹皮酚一方面可通过激活肝激酶B1（liver kinase B1 ， LKB1）和苏氨酸172（threonine 172， Thr172）的磷酸化来促进AMPK的激活，从而抑制LPS和干扰素γ（interferon-γ, IFN-γ)诱导的诱导型NOS（inducible NOS ，iNOS）、COX-2和血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的增加；另一方面，可抑制糖原合成酶激酶3α/β（glycogen synthase kinase-3α/β , GSK-3α/β)和ROS的产生[26]（见图4）。 2.3 心血管保护作用 心血管疾病是全球范围内的主要死因之一。丹皮酚可通过以下几方面保护心血管：减少氧化应激、调节线粒体自噬、促进脂质代谢、抗血栓。 氧化应激由氧化-抗氧化失衡引发，导致ROS过度积累。心血管疾病中，低密度脂蛋白（low- density lipoprotein ，LDL）沉积于动脉内膜形成氧化型LDL（ox-LDL），刺激内皮细胞分泌炎性因子，诱导单核细胞黏附、迁移进入动脉内膜并转化为巨噬细胞，最终形成泡沫细胞，从而驱动动脉粥样硬化发展[27]。 Tang等[28]发现，丹皮酚通过调节SIRT1/叉头盒转录因子3a（FOXO3a）/NF-ĸB信号通路，在高葡萄糖/高棕榈酸处理的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell ， HUVEC）中可提高细胞生存能力、SOD活性，并抑制细胞凋亡及ROS和炎症细胞因子的产生。其中，FOXO3a是一种在调节氧化应激方面发挥着重要作用的转录因子。Yu等[29]发现，丹皮酚可下调miR-338-3p并增加一种通过催化DNA5-甲基胞嘧啶的氧化发挥作用的酶TET2表达，从而抑制小鼠的LDL诱导的血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）凋亡、炎症和氧化损伤。天冬氨酸-β-羟化酶（aspartate- β-hydroxylase ，ASPH）作为一种聂型跨膜蛋白，不仅可以增强细胞增殖、迁移和入侵，还可通过刺激血管生成和免疫抑制来促进肿瘤生长。Liu等[30]发现，丹皮酚通过调节miR-152-3p/ASPH信号通路，抑制了由ox-LDL诱导的小鼠VEC凋亡，并降低了IL-1β、IL-6和ROS的表达水平。乳腺癌易感蛋白1（breast cancer susceptibility protein 1 ，BRCA1）基因作为基因组稳定性的调节器，参与DNA的修复和转录。Zheng等[31]发现，在心肌缺氧/再氧（myocardial anoxia/reoxygenation）损伤后，丹皮酚可通过上调BRCA1的表达来改善抗氧化酶的活性，并减少ROS的产生。 自噬作为细胞内关键的质控系统，通过清除受损细胞器维持心肌稳态。丹皮酚通过精细调控自噬维持心肌稳态[32]。适度的自噬可以缓解心肌损伤，在阿霉素诱导的心肌病模型中，丹皮酚通过上调miR-1抑制PI3K/AKT/mTOR通路，适度增强自噬活性以减少心肌细胞凋亡[33]，同时激活Pink1/Parkin信号通路，促进模型大鼠的心肌线粒体自噬，减少缺氧引起的心肌细胞损伤[34]。然而，过度氧化应激会导致自噬关键启动因子Beclin-1过表达，细胞自噬被过度激活，促进细胞器的过度降解，导致细胞死亡。Beclin-1是一种Bcl-2相互作用蛋白，也是一种重要的自噬启动蛋白，可与其他自噬调节蛋白结合形成蛋白复合物，调控自噬水平。Tsai等[35]发现，丹皮酚通过上调Bcl-2蛋白，下调胱天蛋白酶-9/3及Beclin-1的表达，抑制自噬过度活化，改善心脏功能，从而改善心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury） 引起的心律失常。 LDL氧化过程中产生的过氧化脂可能会直接损害内皮细胞。丹皮酚可阻断LOX-1/ROS/p38/MAPK/NF-κB信号通路，抑制ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡[36]。此外，丹皮酚可通过上调miR-126、miR-30a表达以及下调miR-21表达[37]，来抑制单核细胞对ox-LDL损伤的血管内皮细胞的黏附。ox-LDL通过诱导血管平滑肌细胞和巨噬细胞泡沫化，在动脉粥样硬化的发展中起着关键作用，而该疾病的特征正是血管壁中的脂质沉积和炎症。泡沫细胞的形成主要是由巨噬细胞的胆固醇外流受损或巨噬细胞对ox-LDL的不受控制的摄取引起的。巨噬细胞膜上有几种类型的清道夫受体（scavenger  receptor，SR），其中A类SR（SR-A）和分化簇36（CD36）主要负责ox-LDL的吸收。然而，ATP结合盒转运体A1（ATP binding cassette transporterA1， ABCA1）、ATP结合盒转运体G1（ATP binding cassette transporter G1 ， ABCG1）和B类SR（SR-B）主要负责细胞内脂质外流[38]。Li等[39]发现，丹皮酚通过促进ABCA1依赖性胆固醇排放和抑制CD36依赖性ox-LDL的吸收，减少了RAW264.7巨噬细胞中胆固醇的积累，并在载脂蛋白E基因敲除（ApoE_/_）小鼠中上调HO-1表达，增强主动脉ABCA1的表达、抑制CD36的表达，从而缓解动脉粥样硬化病变。 VSMC的异常增殖、迁移和表型转变是VSMC功能障碍的突出表现，可导致新内膜的形成。血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor， PDGF）是一种强效生长因子，可以促进有丝分裂。其中，PDGF-BB可促进体外培养的VSMC的增殖和迁移，激活细胞信号级联反应，从而促进细胞生长。研究发现，针对PDGF-BB诱导的VSMC增殖，丹皮酚能以剂量依赖性方式阻滞细胞周期G0/G1至S期进程[40]。Chen等[41]发现，丹皮酚可减少高葡萄糖对VEC的损害，通过抑制VEC释放血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）和PDGF，阻断VSMC内Ras/Raf/ERK1/2信号通路进而抑制VSMC的增殖（见图5）。 2.4 抗肿瘤作用 丹皮酚在抗肿瘤中的研究主要涉及结直肠癌、胃癌、肝癌、口腔癌等方面。研究人员发现[42]，丹皮酚可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞周期停止、诱导参与凋亡的基因表达、启动细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。 细胞增殖[43]是生物体生长和发育的重要过程，同时也是许多疾病（如癌症）的基础。肿瘤的形成与细胞增殖存在着紧密的关系，肿瘤细胞具有不受控制的增殖能力，这是肿瘤生长和扩散的基础。因此，抑制肿瘤细胞增殖成为抗肿瘤治疗的关键策略之一。研究表明[44]，丹皮酚可阻滞细胞周期进程、促进凋亡相关基因表达、激活细胞程序性死亡，下调促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）分泌，从而抑制B16F10黑色素瘤转移，该机制与NF-κB通路的抗炎作用相似。同时，丹皮酚可下调基质金属蛋白酶-2/-9的蛋白表达，以浓度依赖的方式抑制人胃腺癌BGC823细胞的生长、迁移和入侵。 诱导肿瘤细胞发生周期阻滞是一种重要的抗肿瘤策略。许多外源性因素可引起细胞周期阻滞，从而发挥诱导细胞凋亡的作用。丹皮酚可诱导肿瘤细胞S期停滞进而引发凋亡，或阻断G0/G1期进程从而抑制肿瘤细胞的DNA复制及增殖[45]。Wnt/β-catenin信号通路[46]的异常激活可诱导参与细胞周期的胞核中的T细胞因子（T cell factor ，TCF）和淋巴样增强结合因子（lymphoid enhancer binding factor ，LEF）转录。研究人员进一步发现，丹皮酚通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活下调细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4 ，CDK4），并上调细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A（cyclin- dependent kinase inhibitor 1A ，p21），从而将细胞周期阻滞于G0/G1期。同时，在结直肠癌研究中，丹皮酚能将HCT116细胞阻滞在G0/G1期，并导致S期和G2/M期细胞比例减少，这与在其他癌细胞系中的发现一致[47]。 作为肿瘤治疗的研究热点之一，诱导肿瘤细胞凋亡主要涉及的基因有Bcl-2基因、Bax基因、Fas基因、Caspase基因等，其中Bcl-2是凋亡抑制基因中的关键调控因子，可延长细胞寿命，促进细胞增殖，从而抑制细胞凋亡。Bax具有促凋亡作用，是Bcl-2基因家族成员之一，其编码的蛋白可与Bcl-2蛋白形成异源二聚体。当Bax过量表达时，可抑制Bcl-2的功能，从而促进细胞凋亡[48]。Caspase-3是Caspase家族中与细胞凋亡相关的重要成员。研究表明[49]，丹皮酚可显著抑制Bcl-2表达，上调促凋亡蛋白Bax水平，使Bcl-2/Bax比值降低，同时激活Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9以促进细胞凋亡。研究证明[50]，丹皮酚通过促进细胞凋亡蛋白葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78， GRP78）、Caspase-3的表达及Ca2+的释放，引发线粒体功能障碍，进一步诱发细胞凋亡（见图6）。 3 丹皮酚的药代动力学研究 丹皮酚作为中药牡丹皮的核心活性单体，其多靶点药理活性已得到广泛研究。本文对丹皮酚在不同种属中的吸收、分布、代谢和排泄（absorption, distribution, metabolism and excretion ，ADME）特征进行了总结，并探讨基于生理的药代动力学模型（physiologically based pharmacokinetic model ，PBPK model，PBPK模型）在预测中的应用前景。研究显示，大鼠体内丹皮酚的生物利用度在灌胃（28.92%）、肌肉注射（68.68%）、鼻腔给药（52.37%）间存在显著差异。丹皮酚溶解度较低，生物利用度差，在热水中溶解，可能会随着蒸汽蒸发。因此，丹皮酚需要在干燥和密封的环境中适当保存。由于其酚醛羟基的存在，丹皮酚具有较弱的酸性和一定的还原性，易氧化。首过效应明显、半衰期短、生物利用度低，是造成丹皮酚临床应用受限的主要原因。 3.1 吸收  健康志愿者口服160mg丹皮酚后，消除半衰期（t1/2）和达峰时间（Tmax）均约为1h，血药峰浓度（Cmax）约为0.115mg·L-1（见表1）[51]。丹皮酚在肝微粒体中迅速代谢，30min的代谢残留含量仅为20.97%，丹皮酚在人工胃液和肠液中的t1/2分别是其在肝微粒体中的45倍和135倍[52]，这表明丹皮酚虽在胃肠道中稳定，但进入肝脏后会被迅速代谢，导致生物利用度降低，需通过优化剂型或调整给药途径来规避肝脏首过代谢。给大鼠静脉注射4mg·kg-1的丹皮酚[53]，其吸收迅速，代谢消除较快，半衰期较短，血药浓度-时间过程符合二房室模型。孙言才等[54]发现，对小鼠灌胃给药50mg·kg-1的丹皮酚7min后，在血浆中可检测到丹皮酚及其代谢产物，丹皮酚Tmax为（6.30±0.70）min，t1/2为（41.49±2.96）min。基于丹皮酚口服生物利用度低的问题，研究人员探索了其他给药途径：例如，在给大鼠肌肉注射丹皮酚（10mg·kg-1）后，通过高性能液相色谱测量血浆中丹皮酚的浓度，其t1/2为（59.85±10.23）min，Tmax为（7.50±2.74）min，给药后丹皮酚的生物利用度为68.68%[55]，但注射中使用的高浓度吐温80（Tween-80）和乙醇可对肌肉和血管产生强烈的刺激；另有研究发现，鼻腔内给药后，丹皮酚生物利用度可达到52.37%，高于灌胃给药的生物利用度。这些研究为优化丹皮酚的给药途径提供了新的方向。 3.2 分布 丹皮酚进入体内后迅速分布，其在体内的分布特点尚未得到全面阐述，但已有研究表明，丹皮酚可能通过血液循环到达全身各组织器官，发挥其药理作用。对小鼠灌胃给药65mg·kg-1的丹皮酚后，其在体内主要分布于肝中，其次是脾、小肠上端、肾、结肠、心、肺等组织[57]。利用HPLC-UV法测定大鼠不同组织中的丹皮酚浓度，发现灌胃给药194.4mg·kg-1的丹皮酚后，其在肝、肾中含量较高，在心、脾、肺和大脑均可检测到丹皮酚[58]。此外，有研究表明[59]，丹皮酚可通过血脑屏障，并在大脑的某些区域具有药理活性。以上研究为丹皮酚对肝脏的保护作用、在脾脏中的免疫调节作用以及对心脏和大脑氧化损伤的预防潜力提供了依据。丹皮酚的组织分布具有显著器官选择性。新型检测技术与靶向递送系统的结合，有望突破丹皮酚的分布限制，推动其临床转化。 3.3 代谢与排泄 丹皮酚在给大鼠经口使用后会迅速吸收和排泄。Yasuda等[60]在给大鼠经口使用丹皮酚后，首次在其尿液中鉴定出丹皮酚的5种代谢产物，即2,4-二羟基苯乙酮-5-O-硫酸酯（P1）、重乙酰苯酮-2-O-硫酸酯（P2）、2-羟基-4-甲氧基苯乙酮5-O-硫酸酯（P3）、丹皮酚-2-O-硫酸酯（P4）和重乙酰苯甲酮（P5）（见图7）。 研究表明，在丹皮酚灌胃5min后的大鼠的血浆中，可识别出4种代谢物P2~P5，且这些代谢物在灌胃后约20min达到最大血浆浓度，这表明丹皮酚可迅速代谢成P2~P5等代谢物。因此丹皮酚的口服生物利用度差可能是由于其在血液中存在首次代谢[61]。丹皮酚在体内的代谢消除也较快，其代谢途径包括被羟基化为2，5-二羟基-4-甲氧基乙酰苯酮并脱甲基化，以及被羟基化后再进行硫酸化这两种。胡欣彤[62]等研究发现，对大鼠灌胃给予牡丹皮提取物后，丹皮酚的代谢产物主要经尿液、胆汁和粪便排泄，且排泄量依次递减。 3.4 基于生理的药代动力学模型在丹皮酚研究中的应用潜力 PBPK模型是一种基于生理学参数动态模拟药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程的工具，目前已广泛应用于药物生物等效性研究[63]。 利用PBPK模型，可预测丹皮酚在不同给药途径下的生物利用度，用于指导纳米载体或脂质体开发[64]。同时，可整合丹皮酚在不同种属动物（如大鼠、犬）中的实验数据来预测人体药代动力学参数，评估种属间代谢差异对药效/毒性的影响，减少临床试验剂量探索成本[65]。丹皮酚具有多组织分布的药代动力学特征。基于此特征，可构建模型以预测其在血浆和脑组织的药物浓度，并评估其在心血管系统等特定组织中的潜在蓄积情况。此外，在药物相互作用与个体化用药方面，PBPK模型可用于预测丹皮酚与CYP450抑制剂/诱导剂联用时的血药浓度变化。如今，人工智能技术已被广泛应用于药物靶点识别、ADME预测及临床试验设计等药学领域[66]，并对PBPK建模产生深远影响。因此，结合机器学习优化PBPK模型参数，有望为丹皮酚的深入研究带来新的突破。 4 结语与展望 本文全面探讨了丹皮酚的核心药理活性及其作用机制。研究显示丹皮酚具有多维度生物活性，涵盖炎症调节、神经功能维护、心血管系统修复及肿瘤抑制等方面。然而，尽管丹皮酚各种药理作用均涉及抗氧化与抗炎等共性机制，但其在不同病理条件下的主导作用通路呈现明显特异性。 在炎症调控方面，丹皮酚可显著抑制ROS生成及炎症介质释放，在急性炎症模型的治疗中展现快速起效特点；在神经系统保护方面，丹皮酚可改善线粒体功能和促进神经营养因子合成，对慢性神经退行性病变有干预优势；在心血管保护方面，丹皮酚可修复血管内皮与调节脂质代谢，表现出组织特异性的保护作用；丹皮酚的抗肿瘤活性主要源于细胞周期阻滞和Caspase依赖性凋亡通路的激活。同时，丹皮酚“清热凉血、活血散瘀”的传统功效与现代分子机制存在显著关联性，其清热作用对应NF-ĸB介导的炎症因子抑制机制，而活血功能则通过血管内皮功能改善和脂代谢调节实现，这与现代医学对血瘀证病理特征的认识高度契合。 药代动力学研究揭示了给药途径对丹皮酚生物利用度的显著影响，这为其新型递药系统的开发提供了理论支撑。临床应用显示丹皮酚对发热性头痛、神经痛等急症及湿疹等皮肤病症具有明确疗效，但受限于其水溶性差、口服生物利用度低、稳定性差和室温下挥发性高等缺陷，丹皮酚除了抗炎活性（以软膏形式应用于皮肤炎症治疗）外，其他药理活性尚未得到临床应用。采用纳米脂质体包封、环糊精包合及经鼻给药等新型制剂技术可有效改善丹皮酚的稳定性和靶向性。 基于网络药理学分析，丹皮酚对“热毒血瘀”症候相关疾病有精准治疗的潜力。丹皮酚现有研究多集中于动物实验阶段，临床数据仍较匮乏，毒理学评价及长期用药安全性仍需深入探讨，未来研究或将聚焦代谢产物活性分析、种属差异性研究，以及智能化药代动力学模型在个体化给药中的应用探索。 参考文献: [1] Harada  M, Yamashita A.  Pharmacological studies on the root bark of Paeonia  moutan.   I. Central effects of  paeonol[J]. Yakugaku Zasshi, 1969, 89(9): 1205-1211. [2] 蒋鹤飞, 杨小四 . 丹皮酚抗炎作用实验研究进展 [J].  中国 医药科学, 2022, 12(5): 53-56, 137. [3] 刘阳欣, 赵锋, 康秉涛, 等 . 丹皮酚药理学研究进展 [J]. 陕西中医, 2020, 41(4): 550-552. [4] Wang Y,  Li B S,  Zhang Z H,  et al. Paeonol repurposing for cancer therapy: from mechanism to clinical translation[J]. BiomedPharmacother, 2023, 165: 115277. [5] Li M,  Cai O, Yu Y, et al. Paeonol inhibits the malignancy of apatinib-resistant gastric cancer cells via LINC00665/miR-665/ MAPK 1 axis[J]. Phytomedicine, 2022, 96: 153903. [6] Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissTargetPrediction: updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules[J]. Nucleic Acids Res, 2019, 47(W1): W357-W364. [7] Singh N, Baby D, Rajguru J, et al. Inflammation and cancer[J]. AnnAfr Med, 2019, 18(3): 121. [8] Yu W, Ilyas I, Aktar N,  et al. A review on therapeutical potential  of paeonol  in  atherosclerosis[J].  Front  Pharmacol, 2022, 13: 950337. [9] Zhao M,  Xie  X, Xu B, et  al. Paeonol alleviates  ulcerative colitis  in  mice  by  increasing  short-chain  fatty  acids  derived from Clostridium butyricum[J]. Phytomedicine, 2023,   120: 155056. [10] Himaya S W A,   Ryu B, Qian Z J, et al. Paeonol from Hippocampus kuda Bleeler suppressed the neuro-inflammatory responses in vitro via NF- κB and MAPK signaling pathways [J]. Toxicol In Vitro, 2012, 26(6): 878-887. [11] Su S Y, Cheng C Y, Tsai T H, et al. Paeonol attenuates H2O2- induced    NF- κB-associated amyloid precursor protein expression[J]. Am J Chin Med, 2010, 38(6): 1171-1192. [12] 张鹏, 程凤琦, 金圣奇, 等 . 丹皮酚的体内抗炎镇痛和体外抗氧化效果评价[J]. 中国兽医杂志, 2022, 58(6): 96-100. [13] Shen B, Wen Y, Li S, et al. Paeonol ameliorates hyperlipidemia and autophagy in mice by regulating Nrf2 and AMPK/mTOR pathways[J]. Phytomedicine, 2024, 132: 155839. [14] Zhang B,  Yu D,  Luo N,  et al.  Four active monomers from Moutan Cortex exert inhibitory effects against oxidative stress by activating Nrf2/Keap1 signaling pathway[J]. Korean J Physiol Pharmacol, 2020, 24(5): 373-384. [15] Wang X, Zhu G, Yang S, et al. Paeonol prevents excitotoxicity in rat pheochromocytoma  PC 12  cells  via  downregulation  of ERK  activation  and  inhibition of  apoptosis[J].  Planta  Med, 2011, 77(15): 1695-1701. [16] Zorov D B,  Juhaszova M,  Sollott S J. Mitochondrial reactive oxygen   species   (ROS) and ROS-induced ROS release[J]. Physiol Rev, 2014, 94(3): 909-950. [17]   Xu S, Xu J, Hao T, et al. Paeonol alleviates lipopolysaccharide- induced hepatocytes injury through alteration of mitochondrial function and NF-κB translocation[J]. Mol Med Rep, 2021, 24 (5): 779. [18] Wang D,  Du Y,  Xu H, et al. Paeonol protects mitochondrial injury and prevents pulmonary vascular remodeling in hypoxia [J]. Respir Physiol Neurobiol, 2019, 268: 103252. [19] 张愉宁, 张幻, 周颖, 等 . γ 射线照射导致心肌细胞坏死性凋亡和线粒体损伤[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2022, 36(1): 25-33. [20] Kong D, Zhang F, Wei D, et al. Paeonol inhibits hepatic fibrogenesis  via disrupting nuclear factor- κB pathway in activated stellate cells:  in vivo and in vitro studies[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2013, 28(7): 1223-1233. [21] 孙海鸥, 殷玉华, 姬秋和 . 糖尿病脑病 [J].  国外医学（ 内分泌学分册）, 2004, 24(2): 79-81. [22] Liu J, Feng L, Ma D, et al. Neuroprotective effect of paeonol on cognition deficits of  diabetic encephalopathy in streptozotocin-induced diabetic rat[J].  Neurosci Lett,   2013, 549: 63-68. [23] Shi X, Chen Y H, Liu H, et al. Therapeutic effects of paeonol on methyl-4-phenyl-1,  2,  3,  6-tetrahydropyridine/probenecid- induced Parkinson's disease in mice[J]. Mol Med Rep, 2016, 14 (3): 2397-2404. [24] Pourmohammadi S,  Roghani  M,  Kiasalari Z,  et  al.  Paeonol ameliorates   cuprizone-induced    hippocampal   demyelination and cognitive deficits through inhibition of  oxidative and inflammatory events[J]. J Mol Neurosci, 2022, 72(4): 748-758. [25] Nam K N,  Woo B C,  Moon S K,  et al.  Paeonol attenuates inflammation-mediated neurotoxicity and microglial activation [J]. Neural Regen Res, 2013, 8(18): 1637-1643. [26] Lin C,  Lin H Y, Chen J H, et al. Effects of paeonol on anti- neuroinflammatory responses in microglial cells[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(4): 8844-8860. [27] 赵瞳,涂梦婷,郑翠翠,等 . 巨噬细胞自噬调控动脉粥样硬化的研究进展[J]. 中国现代医生, 2024, 62(25): 117-120. [28] Tang H, Li K, Zhang  S, et al. Inhibitory effect of paeonol on apoptosis, oxidative   stress, and inflammatory response in human umbilical vein   endothelial   cells   induced   by   high glucose and palmitic acid induced through regulating SIRT 1/ FOXO3a/NF-κB pathway[J]. J Interferon Cytokine Res, 2021, 41(3): 111-124. [29] Yu Y, Yan R, Chen X, et al. Paeonol suppresses the effect of ox- LDL on mice vascular endothelial cells by regulating miR-338- 3p/TET2 axis in  atherosclerosis[J]. Mol Cell Biochem, 2020, 475(1/2): 127-135. [30] Liu Y, Wu H, Wang T, et al. Paeonol reduces microbial metabolite α -hydroxyisobutyric acid  to alleviate the ROS/ TXNIP/NLRP3 pathway-mediated endothelial inflammation in atherosclerosis mice[J].  Chin J Nat Med,   2023,   21(10): 759-774. [31] Zheng J,   Mao Z,   Zhang J,   et al.   Paeonol pretreatment attenuates  Anoxia-reoxygenation   induced   injury   in   cardiac myocytes via a BRCA 1 dependent pathway[J]. Chem Pharm Bull, 2020, 68(12): 1163-1169. [32] 邓静玉, 宁红娟, 杨超, 等 .  自噬在白色脂肪棕色化的作用 :潜在的心血管保护靶点 [J]. 中国心血管杂志 , 2020, 25(5): 489-491. [33] Wu J, Sun C, Wang R, et al. Cardioprotective effect of paeonol against  epirubicin-induced  heart  injury  via  regulating  miR-1 and PI3K/AKT pathway[J].  Chem Biol Interact,  2018,  286: 17-25. [34] 刘超, 王明娟, 范彦芳, 等 . 丹皮酚对大鼠心肌梗死后心脏功能的改善及其对 Pink1/Parkin 的影响[J]. 世界科学技术-中医药现代化, 2020, 22(5): 1428-1436. [35] Tsai C F,  Su H H, Chen K M, et al. Paeonol protects against myocardial ischemia/reperfusion-induced injury by mediating apoptosis and autophagy crosstalk[J]. Front Pharmacol, 2021, 11: 586498. [36] Bao M H, Zhang Y W, Zhou H H. Paeonol suppresses oxidized low-density lipoprotein induced endothelial cell apoptosis via activation of LOX-1/p38MAPK/NF-ĸB pathway[J]. J Ethnopharmacol, 2013, 146(2): 543-551. [37] Vellasamy S, Murugan D, Abas R, et al. Biological activities of paeonol  in cardiovascular diseases: a  review[J]. Molecules, 2021, 26(16): 4976. [38] Yu X H, Fu Y C, Zhang D W, et al. Foam cells in atheroscle- rosis[J]. Clin Chim Acta, 2013, 424: 245-252. [39] Li X,   Zhou Y,   Yu C, et al.   Paeonol suppresses lipid accumulation  in  macrophages  via upregulation of  the  ATP- binding cassette  transporter  A 1   and  downregulation   of  the cluster of differentiation 36[J].Int JOncol, 2015, 46(2): 764-774. [40] Kuo J J,  Wang C Y,  Lee T F,  et al. Paeoniae radix reduces PDGF-stimulated hepatic stellate cell migration[J]. Planta Med, 2012, 78(4): 341-348. [41] Chen J, Dai M, Wang Y. Paeonol inhibits proliferation of vascular smooth muscle cells stimulated by high glucose via ras-raf-ERK 1/2 signaling pathway in coculture model[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2014, 2014: 484269. [42] Zhang L,  Li D C, Liu L F. Paeonol: pharmacological effects and mechanisms of action[J]. Int Immunopharmacol, 2019, 72: 413-421. [43] 栾璐璐, 董珊珊, 王冉冉, 等 . 肿瘤细胞死亡对细胞增殖的双重调控[J]. 肿瘤药学, 2023, 13(5): 533-541. [44] Zhang L, Tao L, Shi T, et al. Paeonol inhibits B 16F 10 melanoma metastasis in vitro and in vivovia disrupting proinflammatory cytokines-mediated NF-ĸB and STAT3 path- ways[J]. IUBMB Life, 2015, 67(10): 778-788. [45] Li N, Fan L L, Sun G P, et al. Paeonol inhibits tumor growth in gastric cancer in vitro and in vivo[J].  World J Gastroenterol, 2010, 16(35): 4483-4490. [46] Geng X, Xiao L, Lin G F, et al. Lef/Tcf-dependent Wnt/beta- catenin signaling during Xenopus axis specification[J]. FEBS Lett, 2003, 547(1/2/3): 1-6. [47] Liu L H, Shi R J, Chen Z C. Paeonol exerts anti-tumor activity against colorectal cancer cells by inducing G0/G1  phase arrest and cell apoptosis via inhibiting the Wnt/β -catenin signaling pathway[J]. Int J Mol Med, 2020, 46(2): 675-684. [48] 宋文静, 陈小艳, 赵秀兰, 等 . 线粒体蛋白 Bcl-2 和Bax 在肿瘤发 生 中 作 用 的 初 步 探 讨 [J].  中 国 肿 瘤 临 床 , 2009, 36(24): 1409-1411. [49] Sun G P, Wang H, Xu S P, et al. Anti-tumor effects of paeonol in  a  HepA-hepatoma  bearing mouse model  via  induction  of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNF-alpha production[J]. Eur JPharmacol, 2008, 584(2/3): 246-252. [50] 牛琴, 钮红丽, 翟俊英, 等 . 丹皮酚通过内质网应激和线粒体损伤途径促进卵巢癌细胞凋亡 [J]. 广 州 中 医药大学学报 , 2020, 37(10): 1991-1998. [51] 武静, 王本杰, 魏春敏, 等 . HPLC 法测定丹皮酚血浓度及其胶囊与片剂人体生物等效性研究 [J]. 山东大学学报 (医学版), 2007, 45(7): 726-729. [52] Sun Y, Li L, Xie H, et al. Primary studies on construction and evaluation  of ion-sensitive in situ gel  loaded  with  paeonol- solid lipid nanoparticles for intranasal drug delivery[J]. Int J Nanomedicine, 2020, 15: 3137-3160. [53] 陈晓兰, 陆洋, 杜守颖, 等 . HPLC 测定丹皮中丹皮酚在大鼠体内血药浓度及药动学研究 [J]. 中 国 中药杂志 , 2010, 35 (21): 2826-2828. [54] 孙言才, 孙国平, 沈玉先, 等 . 丹皮酚在小鼠体内的药动学研究[J]. 中国医院药学杂志, 2006, 26(5): 543-545. [55] Ma L Y, Xu X D, Zhang Q, et al. Paeonol pharmacokinetics in the rat following i. m. administration[J].  Eur J Drug Metab Pharmacokinet, 2008, 33(3): 133-136. [56] Chen X, Lu Y, Du S, et al. In situ and in vivo study of nasal absorption of paeonol in rats[J]. Int J Mol Sci, 2010,  11(12): 4882-4890. [57] Hu X, Ding L, Cao S, et al. Pharmacokinetics, tissue distribution and excretion of paeonol and its major metabolites in rats provide a further insight into paeonol effectiveness[J]. Front Pharmacol, 2020, 11: 190. [58] 宋艺君, 杨史军, 王湘, 等 . 丹皮酚在肝癌前病变模型大鼠体内的组织分布研究 [J]. 中国现代中药 , 2017, 19(11): 1566- 1571. [59] 张涓, 张恩户 . 丹参酮聂A与丹皮酚配伍对大鼠脑缺血的保护作用[J]. 中国医院药学杂志, 2013, 33(6): 458-460. [60] Yasuda T, Kon R, Nakazawa T, et al. Metabolism of paeonol in rats[J]. JNat Prod, 1999, 62(8): 1142-1144. [61] Wu X, Chen H, Chen X, et al. Determination of paeonol in rat plasma by high-performance liquid chromatography and its application to pharmacokinetic studies following oral admini- stration of Moutan  cortex  decoction[J]. Biomed  Chromatogr, 2003, 17(8): 504-508. [62] 胡欣彤, 丁丽琴, 李巍, 等 . 大鼠 ig牡丹皮提取物后丹皮酚及其代谢产物的药动学研究 [J]. 中草药 , 2019, 50(24): 6017- 6023. [63] Peters S A. Evaluation of a generic physiologically based pharmacokinetic model for lineshape analysis[J]. Clin Pharmacokinet, 2008, 47(4): 261-275. [64] 马广立, 程翼宇 . 口服药物生物利用度预测研究进展 [J]. 药学学报, 2006, 41(10): 917-920. [65] Chen Y, Zhao K, Liu F, et al. Predicting antitumor effect of deoxypodophyllotoxin  in  NCI-H460 tumor-bearing mice on the basis of in vitro pharmacodynamics and a physiologically based pharmacokinetic-pharmacodynamic model[J]. Drug Metab Dispos, 2018, 46(6): 897-907. [66] 詹世鹏, 马攀, 刘芳 . 机器学习在治疗药物监测与个体化用药中的应用[J]. 中国药房, 2023, 34(1): 117. 本文引文格式： 赵紫雅, 孙建国. 丹皮酚的药理作用及药代动力学研究进展[J]. 药学进展, 2026, 50(3): 254-263. 美编排版：杨书惠 感谢您阅读《药学进展》微信平台原创好文，也欢迎各位读者转载、引用。本文选自《药学进展》2026年第 3 期。 《药学进展》杂志由教育部主管、中国药科大学主办，中国科技核心期刊（中国科技论文统计源期刊）。刊物以反映药学科研领域的新方法、新成果、新进展、新趋势为宗旨，以综述、评述、行业发展报告为特色，以药学学科进展、技术进展、新药研发各环节技术信息为重点，是一本专注于医药科技前沿与产业动态的专业媒体。 《药学进展》注重内容策划、加强组稿约稿、深度挖掘、分析药学信息资源、在药学学科进展、科研思路方法、靶点机制探讨、新药研发报告、临床用药分析、国际医药前沿等方面初具特色；特别是医药信息内容以科学前沿与国家战略需求相合，更加突出前瞻性、权威性、时效性、新颖性、系统性、实战性。根据最新统计数据，刊物篇均下载率连续三年蝉联我国医药期刊榜首，复合影响因子1.311，具有较高的影响力。 《药学进展》编委会由国家重大专项化学药总师陈凯先院士担任主编，编委由新药研发技术链政府监管部门、高校科研院所、制药企业、临床医院、CRO、金融资本及知识产权相关机构近两百位极具影响力的专家组成。 联系《药学进展》↓↓↓ 编辑部官网：pps.cpu.edu.cn； 邮箱：yxjz@163.com； 电话：025-83271227。 欢迎投稿、订阅！ 往期推荐 聚焦“第七届药学前沿学术论坛暨《药学进展》编委会会议” 聚力前沿赛道，共启学术新程：第七届药学前沿学术论坛在南京隆重启幕 承学术匠心，启时代新章：《药学进展》第七届编委会、第三届青年编委会成立大会在宁召开 聚焦“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”盛大启幕！院士专家齐聚杭城，绘就生物医药前沿赛道新蓝图“兴药强刊”青年学者论坛暨《药学进展》第二届青年编委会议成功召开“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”路演专场圆满收官！校企合作新旅程已启航 我知道你在看哟

本文通讯作者为台湾高雄医学大学（Kaohsiung Medical University）药物与应用化学系的Wei-Yu Lin教授以及美国北卡罗来纳州立大学（North Carolina State University）化学系的Wei-chen Chang教授。该研究于2026年发表于《美国化学会志》。一、研究背景：从鬼臼毒素到抗癌药物的生物合成之路 天然产物木脂素（lignans）家族中的明星分子(−)-podophyllotoxin（鬼臼毒素）自1880年从美洲盾叶鬼臼（Podophyllum peltatum）中分离以来，一直以其卓越的抗病毒、抗炎、抗疟疾和抗肿瘤活性吸引着药物化学家的目光。更重要的是，(−)-podophyllotoxin通过抑制微管聚合诱导细胞死亡，成为抗癌药物研发的关键先导化合物。其半合成衍生物etoposide（依托泊苷，3） 和teniposide（替尼泊苷，4） 已被列入世界卫生组织基本药物清单，广泛应用于小细胞肺癌、急性白血病和睾丸癌等恶性肿瘤的临床治疗。 (−)-Podophyllotoxin的生物合成途径涉及四个手性中心的精确构建以及一个由A、B、C、D四环和悬挂的E苯环组成的四环骨架。在从L-酪氨酸到(−)-yatein（RR-5）的多步转化之后，关键环化步骤由非血红素铁和α-酮戊二酸依赖型氧化酶（Fe/α-KG oxidase）——脱氧鬼臼毒素合酶（Deoxypodophyllotoxin Synthase, DPS） 催化，将(−)-yatein转化为deoxypodophyllotoxin（RRR-10）。DPS属于一个反应谱极为广泛的酶家族，其催化循环依赖于一个高活性的铁(IV)-氧代（ferryl）中间体，该中间体首先从底物中攫取一个氢原子，生成底物自由基和铁(III)-羟基复合物。通常情况下，“羟基回弹”（hydroxyl rebound）会导致羟基化产物，但DPS却巧妙地利用这一机制实现了C-C键的形成——即C7'自由基进攻B环C6位，完成四氢呋喃环（C环）的构建。 然而，此前多项研究（包括Li等人于2019年发表在Angew. Chem. Int. Ed.的工作以及Lazzarotto等人同年发表的研究）均报告称，DPS无法催化(+)-hydroxy-yatein（RRR-1）直接转化为(−)-podophyllotoxin（RRRR-2）。这一结论严重限制了DPS作为生物催化剂在鬼臼毒素及其衍生物（特别是etoposide前体）化学酶法合成中的应用。为何多了一个C10'羟基的底物就不能被DPS识别？是底物抑制、结合模式改变，还是之前的实验条件未能揭示其真实活性？这些悬而未决的问题构成了本研究的核心科学挑战。二、核心科学问题：立体化学、反应机理与底物耐受性的三重谜题 本文旨在系统解决以下三个关键科学问题：第一，(+)-hydroxy-yatein（RRR-1）究竟是不是DPS的底物？ 如果答案是肯定的，那么此前负面结果的实验条件（如底物浓度过高、细胞裂解液中的干扰因素）存在何种偏差？第二，DPS催化C7'-C6环化的立体化学路径是什么？ 是自由基加成、碳正离子Friedel-Crafts烷基化，还是协同过程？氢原子攫取具有怎样的立体选择性（pro-R还是pro-S）？第三，底物D环的立体构型如何调控环化与羟基化之间的竞争？ 为何天然底物(−)-yatein（RR-5）和(+)-hydroxy-yatein（RRR-1）主要发生环化，而它们的对映体却只发生羟基化？通过解答这些问题，研究者希望最终建立一个高效的化学酶法合成平台，实现(−)-podophyllotoxin及其类似物的大规模制备。三、研究结果：从底物重新发现到克级合成的完整证据链3.1 突破性发现：DPS确实催化(+)-hydroxy-yatein环化生成(−)-podophyllotoxin 研究者首先以对映选择性方式合成了(+)-hydroxy-yatein（RRR-1），采用L-脯氨酸介导的不对称羟醛缩合、化学选择性还原、酸催化环化等一系列步骤，最终以95.5%的对映体过量（er）获得目标分子。当在优化条件下（200 μM DPS, 1 mM RRR-1, 220 μM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂, 5 mM α-KG, 2 mM 抗坏血酸钠, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 室温, 有氧条件）孵育4小时后，HPLC分析显示RRR-1几乎完全消耗，并出现两个新产物峰。主要产物（占总峰面积94%）的LC-MS谱图显示分子式为C₂₂H₂₂O₈（[M+H]⁺计算值415.1393，实测415.1410），表明RRR-1发生了脱氢反应。通过大规模反应结合制备型TLC分离和NMR表征，该主要产物被确认为(−)-podophyllotoxin（RRRR-2）。这一结果直接推翻了此前文献中“DPS不能利用RRR-1”的结论。值得注意的是，在pH 9.0条件下孵育时，RRRR-2会缓慢异构化为其C8'差向异构体picropodophyllin（RSRR-2），同时还检测到一个分子量增加14 Da的次要产物，经NMR鉴定为苯甲酸酯衍生物RR-19，该化合物来自C7'酮中间体的分子内retro-Claisen缩合。 令人惊讶的是，当使用对映体底物(−)-hydroxy-yatein（SSS-1）时，DPS几乎不产生环化产物，而是主要生成C7'羟基化产物SSS-18。这揭示了一个关键现象：D环的立体构型（8'R,9'R,10'R vs. 8'S,9'S,10'S）对反应结果具有决定性影响——天然构型有利于环化，而对映体构型则导向羟基化。3.2 底物抑制的动力学证据：解释此前阴性结果的关键 为何之前的报道未能观察到环化活性？一个重要的线索来自底物浓度。此前研究使用的RRR-1浓度比本工作高出约10倍。研究者假设：DPS遵循有序顺序机制，即α-KG先于底物结合，产物先于琥珀酸解离。如果底物在琥珀酸尚未释放时结合到酶-琥珀酸复合物上，就会形成无效的“死端复合物”，从而导致底物抑制。晶体结构（PDB 7E38）中观察到琥珀酸与催化铁离子配位，且被底物“锁”在活性中心，这为上述假设提供了结构支持。 动力学实验证实了这一猜想。测量不同浓度RRR-1下的初始反应速率，发现在0.2 mM以上时，转化率显著下降。采用方程 v(s) = k_cat·e₀·s / (K_M + s + s²·K_S) 拟合，得到参数：k_cat = 0.13 ± 0.05 min⁻¹, K_M = 0.25 ± 0.13 mM, K_S = 5.7 ± 2.6 mM⁻¹，其中K_S显著非零（p=0.06），证实了底物抑制的存在。相比之下，天然底物(±)-yatein（5）在高达2 mM时仍表现出米氏动力学（k_cat = 0.37 min⁻¹, K_M = 0.35 mM），未出现明显抑制，但更高浓度下因底物沉淀而无法测定。C10'羟基的存在显著增强了底物抑制效应，这解释了为何前人使用高浓度RRR-1时未能检测到活性——酶实际上被底物“毒化”了。3.3 立体化学的精确解密：氢原子攫取的pro-S选择性与antarafacial C-C键形成 为了确定DPS攫取C7'上哪一个氢原子，研究者合成了m-二甲氧基类似物RRR-20（该类似物同样能被DPS环化，生成RRRR-21，且羟基化副产物比例增加，有利于中间体捕获）。更重要的是，他们制备了C7'位立体选择性氘代的RRR-20DR（pro-R位氘代）和RRR-20DS（pro-S位氘代）同位素标记物。 LC-MS分析显示了一个清晰而一致的模式：当使用RRR-20DR（pro-R氘代）时，环化产物RRRR-21和羟基化产物RSRR-22（C7'R构型）均保留了氘原子（分子量比未氘代对照增加1 Da）；而当使用RRR-20DS（pro-S氘代）时，这两个产物均失去了氘原子（分子量与未氘代对照相同）。这一结果无可辩驳地证明：DPS催化攫取的是C7'的pro-S氢原子。 更令人兴奋的是立体化学结论。由于攫取pro-S氢原子后形成的C7'自由基（或碳正离子）需要与C6形成新键，而最终产物中C7'的构型为R（即新键形成在原来pro-S氢原子被移除的那一面），这意味着C-H键断裂与C-C键形成发生在底物平面的异面（antarafacial），而不是同面（suprafacial）。这一发现推翻了此前基于模型研究提出的“同面取代”假设。研究者提出，反应可能经过电子转移形成C7'碳正离子（7），然后水分子或B环芳香环从反面进攻，从而发生异面取代。如果反应是纯粹的自由基环化（6→8→9），则通常预期同面或非立体特异性过程，难以解释观察到的严格antarafacial选择性。 3.4 D环立体构型如何决定反应命运：羟基化与环化的博弈 对于对映体底物SSS-20（即SSS-1的m-二甲氧基类似物），DPS催化不产生任何环化产物，而是生成C7'羟基化产物SRSS-22（主要）和RRSS-22（次要），比例约为9:1（与RRR-20反应中3:1的RSRR-22:SSRR-22比例形成鲜明对比）。这种羟基化主导的模式提示，当D环构型反转时，C7'中间体更倾向于发生羟基回弹而非环化。 进一步的实验揭示了更深层次的机制。研究者将四种可能的C7'羟基化差向异构体（RSRR-22, SSRR-22, SRSS-22, RRSS-22）分别与DPS孵育，发现只有RRSS-22能够被DPS高效脱氢生成C7'酮RSS-24，而其他三种差向异构体几乎没有反应。为什么？关键在于：C7'R构型的羟基化产物（如RSRR-22和RRSS-22）中，剩余的那个C7'氢原子恰好处于被DPS攫取的理想空间取向（即对应原始底物中pro-S氢的位置）。但RSRR-22（来自RRR-20）的D环为天然构型，可能由于活性口袋的约束而阻碍了第二次氧化；而RRSS-22（来自SSS-20）的D环为非天然构型，反而使得C7'R羟基被“锁定”在有利于第二次氢攫取的构象中，从而迅速转化为酮并发生retro-Claisen重排生成SS-23。这解释了为何在SSS-1反应中主要积累的是retro-Claisen产物SS-19而非简单的羟基化产物。 综合上述观察，研究者提出了一个统一的机理模型（图7）：DPS首先立体选择性地攫取C7'的pro-S氢原子，生成自由基25。随后，若底物为天然RRR构型，电子转移生成碳正离子26，并发生antarafacial的Friedel-Crafts烷基化，形成C6-C7'键，完成环化；若底物为对映体SSS构型，则碳正离子中间体因空间位阻无法有效进攻B环，转而由水分子从反面进攻，生成C7'R构型的羟基化产物。后者若为RRSS-22（即C7'R且D环非天然构型），则容易被DPS再次氧化生成酮并重排；若为SRSS-22（C7'S），则相对稳定，作为最终产物积累。3.5 晶体学结构揭示活性口袋的关键残基：F255A突变部分恢复环化活性 为了获得更直观的结构证据，研究者解析了DPS与钒(IV)氧化物（ferryl模拟物）、琥珀酸和(−)-hydroxy-yatein（SSS-1）的三元复合物晶体结构，分辨率为2.0 Å（PDB 9ZO1）。结构显示，底物SSS-1的D环被一个由Y82、F255、F257、L286、F290以及K187烷基链组成的疏水口袋所包围。其中，L163和H165位于C10'羟基3.5 Å范围内，而Y82的主链羰基与C10'羟基形成3.1 Å的氢键。K187的酰胺氮与D环羰基相距2.9 Å，暗示其可能通过氢键稳定底物取向。 基于此结构，研究者构建了多个点突变体。F255A突变体表现出最显著的表型变化：在SSS-1反应中，F255A不仅催化羟基化，还产生了可检测量的环化产物RSSS-2（即(−)-podophyllotoxin的非天然对映体？注意：SSS-1环化会生成RSSS-2，其C环构型与天然产物相反），羟基化、环化和酮产物的比例约为4:2:1。这一结果令人振奋——通过单个苯丙氨酸突变为丙氨酸，部分缓解了非天然D环与疏水口袋之间的空间冲突，使得原本被“锁死”在羟基化路径上的底物重新获得了环化的能力。这证明了活性口袋的几何约束是决定环化vs.羟基化竞争的关键因素，也为未来通过蛋白质工程改造DPS以拓宽底物范围、提高环化效率提供了明确的指导。3.6 实用化突破：冻干全细胞催化实现克级(−)-podophyllotoxin合成 从基础机理到实际应用，研究者建立了一个极其简便且高效的化学酶法合成流程。他们将过表达His₆-tagged DPS的E. coli BL21(DE3)细胞冻干并粉碎成细粉，该冻干粉在4°C下稳定保存超过4个月。初始筛选条件：1 mM RRR-1, 40 g/L DPS细胞粉, 1 mM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂, 5 mM α-KG, 2 mM 抗坏血酸钠, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 室温有氧孵育5小时，得到63%的RRRR-2产率。有趣的是，将细胞粉负载量降低到10 g/L反而实现了100%底物转化（基于LC-UV积分），这可能是因为过高细胞浓度增加了溶液粘度，限制了氧气扩散。 在最佳条件下，研究者进行了0.5克规模的放大反应：0.5 g RRR-1, 10 g/L DPS细胞粉（共使用12 g细胞粉），1 mM Fe(II), 5 mM α-KG, 2 mM 抗坏血酸钠，50 mM Tris pH 7.5，室温摇床过夜。最终分离得到0.41 g纯的(−)-podophyllotoxin（RRRR-2），分离产率高达82%，且为唯一产物，未检测到副产物picropodophyllin或retro-Claisen重排产物。这一结果标志着DPS真正成为一个实用的生物催化剂。3.7 底物范围扩展：通往etoposide前体的化学酶法路线 研究者进一步探索了该全细胞催化体系对底物E环修饰的耐受性。化合物RRR-20（m-二甲氧基类似物）、32和34均能以中等产率转化为相应的环化鬼臼毒素衍生物。尤为重要的是，化合物40被特意设计为E环对位烯丙基保护的衍生物——烯丙基可在温和条件下正交脱保护，暴露出3,5-二甲氧基-4-羟基苯基模式，这正是合成etoposide和teniposide所必需的关键结构单元。化合物40成功被DPS催化环化，为etoposide的化学酶法全合成铺平了道路。相比之下，化合物36和38（可能具有更庞大的取代基或不同的电子效应）未检测到环化产物，显示出DPS对E环修饰有一定的选择性限制。 四、总结与展望 本研究通过系统的有机合成、酶学动力学、立体化学同位素标记、蛋白质晶体学以及全细胞催化工程，彻底澄清了脱氧鬼臼毒素合酶（DPS）的催化机制与底物谱。核心发现包括：（1）DPS确实能够催化(+)-hydroxy-yatein（RRR-1）环化生成(−)-podophyllotoxin（RRRR-2），此前阴性结果源于高底物浓度引起的抑制效应；（2）氢原子攫取具有严格的pro-S立体选择性，C-C键形成采用antarafacial途径，支持碳正离子介导的Friedel-Crafts烷基化机理；（3）D环的天然构型（8'R,9'R,10'R）通过与活性口袋残基（特别是F255）的协同疏水作用，使C7'中间体处于环化有利构象；而非天然构型则导向羟基化；（4）基于结构指导的F255A突变可部分恢复对映体底物的环化活性；（5）建立了一个操作简便、可放大的冻干全细胞催化体系，实现了克级(−)-podophyllotoxin的82%分离产率，并成功应用于etoposide前体的合成。 这一工作不仅为理解非血红素铁/α-KG依赖型氧化酶的C-C键形成机制提供了新的范式（尤其是antarafacial取代与立体选择性氢攫取的偶联），更展示了一条从简单前体到复杂木脂素药物的实用化学酶法路线。鉴于(−)-podophyllotoxin及其衍生物在临床肿瘤治疗中的不可替代地位，DPS及其工程化变体有望成为绿色制药工艺中的重要 biocatalyst。未来的方向包括：通过定向进化进一步拓宽E环底物范围、消除底物抑制、提高环化与羟基化的选择性比，以及实现一锅多酶级联反应从简单氨基酸直接合成鬼臼毒素。 原文链接： https://doi.org/10.1021/jacs.6c03159