LE-SN38

一位热心股民，将创新脂质体公司告上法庭。 美国伊利诺伊州北达科他州最高法院于2010年3月31日发布的判决书详细记录了事件始末，甚至成为了因退市而淡出公众视线的NeoPharm, Inc.（下称“NeoPharm”）难能可贵的参考资料。毕竟，这家创新脂质体公司因为技术过于前沿以及生不逢时而鲜少出现在当今关于药物递送技术领域的讨论中。 根据判决书，原告在2001年10月31日至2002年4月19 日期间（以下简称“诉讼期间”）购买了被告NeoPharm普通股的人，原告认为NeoPharm、John N. Kapoor、James M. Hussey和Imran Ahmad（统称“被告”）就NeoPharm的实验药物LEP（脂质体封装紫杉醇）做出虚假和误导性陈述。法院裁定，被告的简易判决动议将部分获得批准，部分被驳回。被告的排除动议将遭到驳回，并允许被告在审判前的动议中对其方法提出任何质疑。 简而言之，股民认为NeoPharm的脂质体技术名不副实，要求公司拿出说法。 自原告购买股票到地方最高法院发布完整判决书的十年，也正是生物医药技术在探索中的十年。走过世纪之交的NeoPharm三度易名，历经重组动荡，最后仅有技术留存，供行业后来者继续研究、完善，为创新药物递送系统领域的发展提供灵感与路径指引。 诞生于脂质体技术高速发展期的新秀，一度被临床结果拖累 NeoPharm成立于1990年，于世纪之交在纳斯达克完成上市。原名为OncoMed Inc.，核心脂质体技术获得乔治城大学授权。公司成立时期正值经济、高效的抗真菌和抗癌药物脂质体产品先后投入市场，极大推动脂质体研究与发展的时期。 脂质纳米材料具有独特的亲水、亲油“两亲性”，使得在同一药物里同时添加亲油亲水药物和活性成分成为了可能。但是，科研人员也发现，脂质纳米材料“两亲性”是一把“双刃剑”，它在为载药提供了便利的同时，也增加了量产的难度。因此，脂质纳米材料制备工艺复杂，导致很难去除杂质，中间体及产品难于纯化，因而很难实现量产。也正因技术瓶颈明显，尽管NeoPharm已经有多种药物处于临床开发的不同阶段，但尚未将任何药物推向市场。 但NeoPharm坚信NeoPharm脂质体抗癌剂的市场潜力和销售前景。1998年6月，NeoPharm的 LEP（脂质体封装紫杉醇）和首款脂质体产品脂质体封装阿霉素双双启动临床试验，以验证除了减少传统抗癌疗法的副作用外，脂质体抗癌剂还可以克服化疗的多重耐药性问题。 然而好景不长。2005年至2007年三年合计，NeoPharm的营业亏损总计约9000万美元，甚至公司一度未提交2008年年终财务报告。为此，NeoPharm在2007年末开始实施重组计划，包括聘用新的管理团队、减少现金消耗并精简组织机构。 2009年NeoPharm从纳斯达克退市，并在场外交易市场上市。公司股票一度飙至每股12美元，但在2009年时仅徘徊在30美分左右。《克莱恩报》（Crain's Chicago Business）指出，自2006年该公司宣布一种被市场认为很有前途的脑癌药物的临床试验结果令人失望以来，其股价一直在稳步下跌。 另一边，新团队拼搏势头正足。2010年1月4日，NeoPharm宣布向FDA提交了一份新药研究申请，用于治疗一种致命的肺部疾病特发性肺纤维化，并声明，提交该申请对 NeoPharm 来说是一个“重要里程碑”。 NeoPharm启动的正是IL13-PE的I期临床研究，将以吸入式气雾化液体的形式注入患者肺部。公司随后在6至8个地区开展研究，招募患者32名旨在评估该药物的安全性和最大耐受剂量，以及其对晚期特发性肺纤维化患者的疗效。同年6月，FDA就授予IL13-PE孤儿药资格，用于治疗特发性肺纤维化。受此鼓舞的NeoPharm立刻启动II期临床。 2010年1月6日，NeoPharm公布了LEP（脂质体包裹紫杉醇）治疗转移性乳腺癌患者的 II 期数据。该项试验以Taxol®（即百事美施贵宝紫杉醇）为主要活性成分，在印度的5个试点进行。 其中，16名受试者（46%）肿瘤反应，包括15名部分反应和1名完全反应；10名受试者（29%）病情稳定（平均持续时间为6个周期；范围为2-10 个周期）；9 名受试者（25%）病情有进展。此外，LEP耐受性良好，仅1名受试者（3%）出现3级感觉性多发性神经病，2名受试者（6%）出现3级中性粒细胞减少症，这也是Taxol®（即百事美施贵宝紫杉醇）和 Abraxane®的两种常见毒性。此外，未观察到不良事件或预防性预用药出现的其他输液反应。  人工合成心磷脂， 专攻肿瘤治疗痛点 Neopharm的核心技术在于制备脂质体时采用了一种人工合成的心磷脂——四豆蔻酰甘油心磷脂。由于心磷脂的独特性质，它可以和它可以和亲脂性药物强烈作用强烈作用，将药物稳定地嵌在脂质体膜中，从而提高了药物及制剂在体内外的稳定性。处方中除了心磷脂外还使用了DOPC（作为脂质体制备当中常用的药用辅料）和胆固醇，药脂比大约1：18，制剂粒径150~200nm，包封率可达95%。 ● 心磷脂 Neopharm基于这一专利技术开发了4个产品：LE-SN38、LE-rafAON（反义核酸）、LEM（米托蒽醌脂质体，mitoxantrone）和LEP（紫杉醇脂质体，paclitaxel）。 ● SN-38脂质体LE-SN38 SN38是依利替康（irinotecan）的活性代谢产物，由于SN-38不能溶于常用的药用溶剂，所以无法直接给药，且作为活性代谢产物的SN-38因稳定性等原因应用一直大受限制，而将SN-38 制成脂质体之后，可以解决上述问题。 ● rafAON脂质体LE-rafAON LE-rafAON包裹的是抗c-raf的反义寡核苷酸。LE-rafAON可以抑制肿瘤产生的Raf-1 蛋白，进而抑制肿瘤生长并提高肿瘤对放疗和化疗的敏感性。 ● 米托蒽醌（mitoxantrone）脂质体LEM 米托蒽醌是细胞周期非特异性药物，其抗肿瘤谱较广，临床适用于急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌等各类适应证，本有着巨大的应用前景。但骨髓抑制等不良反应，限制了其临床应用。Neopharm旗下的包载米托蒽醌脂质体（LEM）由冻干脂质与米托蒽醌盐（商品名为Novantrone）混合制成。该产品旨在提高游离诺凡特罗的安全性和有效性。 LEM于2001年进入临床I期，编号为NCT00024492。该试验招募了晚期实体瘤患者（40名参与者），静脉注射LEM。血液药代动力学和肿瘤观察的结果于2004年完成，起初，公司没有公布结果。后续消息显示，因LEM在体内快速释放，引起偶发性感染，临床从而宣告失败。 ● 紫杉醇（paclitaxel）脂质体LEP LEP公开的制备方法重量比为1.8∶9.0∶3.0 ∶0.1∶1的心磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂、维生素E和紫杉醇，加热溶解于叔丁醇中，然后通过0.22μm滤膜，分装并冷冻干燥。临床使用时加入生理盐水，随后水化1小时，其后将小瓶振荡十分钟，最后在水浴超声振荡器中以最大频率超声十分钟。此外，LEP需2-8℃ 保存，且配置后室温避光条件下稳定性达24小时。   尚未开花成果的“遗产”， 被卷入另一场官司 2010年时，尽管手握专利技术平台，并有临床结果尚且的管线在持续推进，但Neopharm的资金状况还是支撑不住了。原因与后来的外泌体先驱Codiak的相似：作为一种背负巨大期待的新型技术，仅仅有良好的安全性结果或是疗效中规中矩，是远远不足以填补市场需求和资本厚望的。正所谓“非正面就是负面”，何况Neopharm确实有明显失利的管线。 没过多久，Neopharm等来了自己的退场方式。 同年10月，专注于疼痛和肿瘤学的药物开发公司Insys Therapeutics（下称Insys）宣布将以反向合并的方式收购 NeoPharm，初始股票价值1.35亿美元。私人控股的 Insys 股东将通过预计于11完成的交易最终获得NeoPharm 95%的股份。此后，Insys将成为NeoPharm的全资子公司，但Insys的高管和董事将在合并完成后接替从NeoPharm辞职的领导团队，因此，合并后的公司保留Insys的名字。 Insys与NeoPharm的联系源于John N. Kapoor，他是制药业资深人士和投资者，于2002 年创立了Insys，同时还是NeoPharm董事会主席，此前关于NeoPharm的判决书上也出现过他的名字。 合并后的公司拥有专注于疼痛和肿瘤学的研发管线。最初，公司将NeoPharm针对转移性乳腺癌的管线LEP-ETU推进到的 III 期试验。与此同时，Insys还将同时致力于芬太尼舌下喷雾剂的NDA提交，芬太尼舌下喷雾剂是Insys的主打产品，已于2010年2月完成了一项III 期随机、双盲、安慰剂对照的多中心研究，作为突破性癌症疼痛的治疗方法。而NeoPharm技术平台的加入将有望升级Insys的舌下喷雾给药技术。 遗憾的是，NeoPharm的脂质体技术并未进一步发扬光大。而则Insys专注销售Subsys（芬太尼舌下喷雾剂）和Syndros（屈大麻酚口服溶液、Dronabinol）等产品。 2019年，Insys因涉嫌贿赂医生给病人开出让人上瘾的止痛剂——芬太尼舌下喷剂，助长阿片类药物泛滥，面临多项刑事与民事指控。经过联邦陪审团15天的审议，美国司法部5月宣布，对该公司处罚高达2.25亿美元（约合人民币15.6亿元）的罚款，前董事长和4名员工还要面临最高20年有期徒刑。这是21世纪以来，全世界第一个因为给医生巨额回扣被抓而破产的中大型药企。该案件一经曝光即备受美国各大媒体关注，频频登上报刊头条。 随后，Insys如预料一样破产，对其诉讼却还在继续。而NeoPharm领先的技术平台因“遇人不淑”，在美国陷入死寂。  十年磨一剑， 大洋彼端率先诞生“全球首个” 而NeoPharm的未竟之业，在太平洋另一端迎来曙光。 2022年1月11日，石药集团宣布其附属公司石药集团中诺药业（石家庄）有限公司开发的盐酸米托蒽醌脂质体注射液（10 ml∶10 mg）已正式获得国家药监局颁发的药品注册批件，用于治疗复发或难治的外周T细胞淋巴瘤（PTCL）。据悉，该产品具有完全知识产权，发明专利已在中国、美国、欧洲、日本等十多个国家和地区获得授权。此外，盐酸米托蒽醌脂质体注射液的研发获得了“国家重点研究计划”“国家重大新药创制专项”等多项国家课题的资助。 需要指出的是，NeoPharm之后，北美尚有团队采用柠檬酸梯度法，但因药物无法释放，导致没有治疗效果；不少国内企业也有尝试，但是最终都无法实现技术突破、达成工业生产。 石药集团于2004年着手进军脂质体技术领域，通过不断进行研发投入，打造了具有自主知识产权的脂质体技术平台。石药集团对米托蒽醌进行优化，重新设计工艺。采用了独特的载药、释药技术，保证了给药后纳米粒子可以有效地在肿瘤富集，并合理地释放药物，进而提高药物在肿瘤的生物利用度，从而产生显著改善的疗效和安全性，也避免了容易出现的皮肤毒性和输液反应。 大浪淘沙后，最终是石药集团率先实现了米托蒽醌脂质体的上市。 如果您想对接文章中提到的项目，或您的项目想被动脉网报道，或者发布融资新闻，请与我们联系；也可加入动脉网行业社群，结交更多志同道合的好友。 近 期 推 荐 声明：动脉网所刊载内容之知识产权为动脉网及相关权利人专属所有或持有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制及建立镜像等任何使用。 动脉网，未来医疗服务平台

摘要：我们从工业角度讨论了抗体-药物偶联物（ADCs）的化学偶联策略，并比较了三种有前景的化学偶联技术，以生产位点特异性ADCs。涵盖领域：目前，有九种ADCs获得商业批准，全部是通过化学偶联技术生产的。然而，其中七种ADCs含有相对广泛的药物分布，可能限制了它们的治疗指数。2019年，第一只位点特异性ADC由Daiichi-Sankyo推向市场。这一成就以及过去十年的临床试验分析表明，ADC领域的当前工业兴趣正在转向位点特异性偶联技术。从工业角度出发，我们旨在提供已经应用于扩大阶段的既定偶联方法的指导。本文讨论了ADC生产的偶联方法，强调了高产、可扩展性和合成过程的鲁棒性。专家意见：本文综述中描述的三种化学偶联技术各有优缺点，因此药物开发者可以根据其生物学和/或蛋白质靶标利用这些技术。ADC领域的未来前景也进行了讨论。 1.抗体-药物偶联物概述 在过去的十年中，抗体-药物偶联物（ADCs）已成为癌症治疗的有前途的方法。目前，有九种ADCs可供商业使用（表1）：Mylotarg（gemtuzumab ozogamicin）、Adcetris（brentuximab vedotin）、Kadcyla（trastuzumab emtansine）、Besponsa（inotuzumab ozogamicin）、Polivy（polatuzumab vedotin）、Padcev（enfortumab vedotin）、Enhertu（trastuzumab deruxtecan）、Trodelvy（sacituzumab govitecan-hziy）和Blenrep（belantamab mafodotin-blmf）已获批准；两种ADCs（Trodelvy和Blenrep）于2020年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，目前有超过85种ADCs正在进行临床试验。ADC的结构可以分为四个部分（单克隆抗体、细胞毒性有效载荷、连接子和偶联位点，图1）。单克隆抗体具有对肿瘤相关抗原的特异性亲和力，因此ADCs可以被认为是最有前途的药物递送系统之一。许多商业上可用的治疗性抗体，包括用于ADCs的抗体，都来源于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的发酵。使用CHO细胞的抗体生产平均成本为每克59美元，采用微生物生产平台等方法试图降低这一成本。ADC有效载荷通常基于有机合成化学家熟悉的化合物。几个世纪以来，大量具有作为有效载荷潜力的天然产物已经通过新颖的化学反应和优雅的合成策略（如发散合成、原子经济策略、氧化还原经济策略或无保护剂合成）生产出来。到目前为止，只有少数天然产物类似物已成功用于ADCs。然而，许多有吸引力的合成有机化合物的全合成，如肽衍生物、萜类化合物、蒽环类化合物和auristatins，定期有报道，预计这些可能在不久的将来作为成功的ADC有效载荷使用。 除了抗体和有效载荷外，连接子和偶联化学也是生产稳定和有效ADCs的关键。抗体和有效载荷之间的共价键需要足够的稳定性以形成稳定的ADC并在治疗给药后具有体内药代动力学。连接子还需要在被目标细胞内化后释放其有毒有效载荷。 偶联方法的发展是肿瘤学领域的热门话题。已经发表了一些关于这一不断发展技术的综述手稿。迄今为止，所有FDA批准的ADCs都是通过偶联到溶剂暴露的赖氨酸的氨基或通过二硫键还原的链间二硫键的半胱氨酸的硫醇基团生产的。产生的ADC的药物-抗体比率（DAR）已知对其药物疗效和安全性概况有显著影响。通常，高DAR物种不仅可能导致ADC聚集，而且还可能在体内快速清除，可能导致安全性降低和药物疗效降低。低DAR物种可能出现与药物疗效相关的问题，因为裸抗体（或轻载物种）可能与有限的目标抗原竞争；根据有效载荷本身的药物疗效，ADC的最佳DAR将有所不同，需要控制最佳DAR以制造ADC。已知连接子的稳定性取决于抗体上偶联位点的位置，这表明偶联位置可以影响ADC的稳定性和药代动力学。为了生产具有增强临床相关TI的最佳ADC格式，生物偶联行业正在进行广泛的研究，探索受控的偶联方法。 有前景的偶联方法对于生成临床有效和安全的抗体-药物偶联物（ADCs）以及建立简化的ADC生产和制造过程都是有益的。迄今为止，对于药物开发者和合同开发与制造组织（CDMOs）来说，开发可扩展和鲁棒的ADC流程仍然是一个极具挑战性的任务。然而，目前有限的综述文章从直接的CMC（化学、制造和控制）角度进行报道。因此，我们旨在提供对已经应用于放大阶段的既定偶联方法的指导性展望，强调高效、可扩展和鲁棒的合成过程。 图1. (a) ADCs的每个部分的要求 (b) 偶联过程的要求 2.化学偶联的优势  通常，ADC生产的偶联方法可以分为三个主要类别。其中一种主要方法涉及通过安装半胱氨酸残基或纳入非天然氨基酸残基作为有效载荷偶联的反应标签，进行抗体工程和修饰。2008年，Junutula、Mallet及其同事首次在化学文献中报道了通过半胱氨酸工程生产位点特异性ADCs的例子。一些通过这种偶联方法生产的位点特异性ADCs目前正在进行人体临床试验，但其他一些则遇到了困难。尽管抗体工程方法在技术上具有吸引力，但确定适当的插入位点的详细优化不仅使最初的ADC考虑变得复杂，而且对于与裸抗体细胞培养条件优化相关的ADC制造过程的放大和可重复性也提出了一些挑战。尽管与生产和表达有关一些问题，但结合抗体工程和化学偶联技术的合成琥珀密码子技术已经开发出来，并似乎已准备好进行大规模ADC生产。 另一种生产ADCs的主要方法涉及使用酶触发偶联。已有几种酶被用来将天然或基因工程抗体与各种有效载荷偶联，或向抗体引入合适的生物正交功能团。这些酶以位点特异性的方式修饰抗体，通常允许生产具有良好控制的DAR的单占据ADC。糖基重塑是一种有前景的酶促ADC偶联生产方法。在抗体的Fc部分的Asn297处酶促修饰天然糖基，引入生物正交的叠氮功能团，可以生成DAR=2的位点特异性ADC。目前，使用这种技术生产的ADC正在进行几项临床前研究。然而，酶促方法在生物制药制造中使用酶有两个潜在问题。首先是过程开发，包括酶的生产和纯化。由于酶本身是一种蛋白质，其分子大小和物理性质与抗体衍生化合物相似。因此，简单切向流过滤（TFF）纯化，一种用于清除化学化合物的成熟方法，可能不足以完全去除残留的酶，可能需要制备性柱色谱。为解决这一问题，已有几种纯化策略，包括使用固定化蛋白A。此外，为了将酶作为药物原料使用，还需要CMC策略。最近，辉瑞的一个团队报告了一种从大肠杆菌生产转谷氨酰胺酶的方法，展示了酶平台技术在GMP生产中的实用性。转谷氨酰胺酶正在被深入研究用于许多除偶联外的应用，预计GMP制造将在未来不久成为可能。在追求用于ADC制造的酶促偶联方面，预计将有更多的报告。 化学偶联策略对肿瘤治疗社区非常感兴趣，因为这些方法受益于相对直接的ADC CMC。事实上，目前市场上所有的ADC都是通过化学偶联方法生产的。2000年，首个名为Mylotarg的ADC获得了FDA的批准。自这一显著成就以来，已有六种ADC（Adcetris、Kadcyla、Besponsa、Polivy、Padcev和Blenrep）通过随机化学偶联方法生产。2019年，首个位点特异性ADC（Enhertu）出现在市场。Enhertu和随后获得批准的Trodelvy是通过位点特异性化学偶联生产的，这表明市场对控制偶联技术的接受，并预示着向位点特异性ADC的转变趋势。 3.通过化学偶联生产随机ADC  传统的随机化学偶联方法基于非选择性修饰，使用天然存在的氨基酸残基，如天然赖氨酸和还原的链间天然半胱氨酸（图2）。 3.1.原生赖氨酸偶联 天然赖氨酸偶联是将药物-连接子与抗体连接的传统方法。活化酯基团（如NHS）可以与赖氨酸残基侧链上存在的溶剂可及氨基反应，形成新的稳定酰胺键。这项技术为三种FDA批准的ADC（Mylotarg、Kadcyla和Besponsa）奠定了基础。T-DM1（曲妥珠单抗emtansine；Kadcyla）是一种2013年批准用于乳腺癌的ADC，是通过天然赖氨酸偶联生产的，合成过程分为两个步骤：使用称为SMCC的NHS连接子的活化步骤，然后是硫醇-马来酰亚胺偶联（图2a）。 图2. a) T-DM1的合成过程，b) 曲妥珠单抗-MMAE的合成过程。 乍一看，赖氨酸型偶联似乎是一种高效的ADC生产方法，因为它具有良好的转化效率，副产品只是可以通过TFF纯化的低分子量化合物。然而，天然的IgG1抗体大约有80个赖氨酸残基，因此相应的合成ADC可能是许多不同但相关物种的混合物。事实上，Chari及其同事已经鉴定了大约10个可访问的赖氨酸残基，这些残基可以不同程度的标记和组合。Lazar及其同事也提到了T-DM1的广泛药物分布。这些DAR分布可能对治疗性ADC的药物疗效、安全性概况和稳定性产生影响。此外，观察到的异质性使得ADC的分析非常困难：T-DM1的DAR分析是通过UV-bis和TOFMS进行的，而通过HPLC分析几乎没有意义。尽管存在这种分析挑战，但三种基于赖氨酸的ADC已经克服了由于药物异质性导致的技术和监管困难，并且已经商业化，但这种基于赖氨酸的偶联需要相当大的努力来建立一个稳健的ADC生产过程，具有可重复的有效载荷分布和DAR。 3.2.原生半胱氨酸偶联 原生半胱氨酸偶联是利用还原的链间半胱氨酸生产“半随机”ADC的主要方法。这种基于半胱氨酸的偶联方法已经产生了四种商业上可用的ADC（Adcetris、Polivy、Padcev和Blenrep）。这种合成过程也分为两个步骤：通常使用三（2-羧乙基）膦（TCEP）的活化（还原）步骤，然后是硫醇-马来酰亚胺偶联（图2b）。 从CMC的角度来看，基于半胱氨酸的偶联优于基于赖氨酸的，因为它产生了具有相对控制的DAR和减少异质性的ADC混合物。这种偶联方法目前是ADC合成的首选选项，并且用于许多正在进行临床试验的ADC。如上所述，已经建立了制备半胱氨酸型ADC的通用程序，但进一步的改进和改进是可能的。TCEP还原通常在37摄氏度下进行，这种未优化的程序有时会产生混浊的反应溶液，暗示存在蛋白质聚集体。已有几项实验设计（DOE）研究报告了克服这种聚集问题的方法。通常，由于抗体的反应性取决于它们的等电点（PI），因此很难建立一个黄金标准平台程序，因为它们需要在个案基础上进行研究和优化。 从分析或监管的角度来看，由于较低的异质性，基于半胱氨酸的ADC可能比基于赖氨酸的ADC更受青睐。它们的简化组成允许分析化学家使用高效液相色谱（HPLC）技术，这些技术通常用于定量分析。基于半胱氨酸的ADC的HIC-HPLC显示了它们的DAR分布，RP-HPLC也可以提供DAR结果和位置异构体的存在。最近，已经报道了几组通过半胱氨酸型偶联生产的单批ADC的分析比较，但观察到分析方法之间的DAR值略有不同。正如DAR值的差异所示，基于半胱氨酸的ADC在获得准确的DAR值方面存在困难。 4.通过化学偶联生产位点特异性ADC  近年来，许多研究人员承担了开发生物相容方法以生产位点特异性ADC的挑战，目标是提高临床相关治疗指数的希望。然而，只有少数这些技术从研究阶段过渡到工艺开发和放大阶段。 4.1.高DAR负载的ADC 高DAR负载的ADC通常与DAR=2和DAR=4的ADC相比显示出不太理想的特性，因为它们的药代动力学特性和体内的系统暴露。然而，在2014年，Lyon及其同事报告说，通过含有PEG的亲水性连接子掩盖有效载荷的疏水性，可以改善负责体内早期清除的有效载荷的疏水性。众所周知，可以使用基于多聚乙二醇的聚合物合成含有大量有效载荷的ADC。这种聚合物载体方法被Mersana称为Fleximer，基于该技术的ADC现在正在进行人体临床试验。Amunix的研究人员开发的XTEN平台是另一种延长高负载ADC半衰期的方法。XTEN是一种由丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸组成的肽连接子。尽管这些基于聚合物的方法很有用，但使用这些方法生产相应的ADC时，抗体偶联位点仍然不受控制。因此，为了生产位点特异性偶联物，需要额外的技术，如抗体工程。最近，位点特异性偶联的高DAR ADC开始在ADC领域流行；2019年，首个获得FDA批准的位点特异性ADC，称为trastuzumab-deruxtecan，出现了。第一三共集团展示了他们原创的药物-连接子组合，作为克服传统DAR=8 ADC常面临的疏水性问题的优雅解决方案。他们解决方案的背后理念模仿了基于天然半胱氨酸的ADC，这两种类型的ADC都是通过还原链间二硫键生产的。然而，随机ADC含有使质量控制、可重复性和分析更加困难的位置异构体，而像trastuzumab-deruxtecan这样的DAR=8 ADC由于大多数半胱氨酸基团被偶联到有效载荷上，含有最少的位置异构体。第一三共的有效载荷来源于喜树碱类似物exatecan，并通过四肽连接子（甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸）与抗体共价连接。这种四肽连接子在血液循环中相当稳定，并在ADC定位到目标肿瘤组织后被溶酶体酶有效切割。也许令人惊讶的是，这种药物-连接子组合可以增强高DAR ADC的总稳定性，从而保持与裸抗体相比的清除率。基于deruxtecan连接子-有效载荷的PEG单元被认为可以减少高DAR ADC的聚集；直接将药物与抗体连接而不引入亲水性间隔物会导致不可接受的聚集水平。总之，引入短长度PEG单元巧妙地抑制了ADC生产中聚集的发生。 继这一商业成功之后，sacituzumab govitecan-hziy于2020年获得FDA批准（图3）。这种ADC也属于高DAR类型，每个针对Trop-2的抗体平均含有八个SN38有效载荷。Trop-2是一种在多种实体瘤中高度表达的蛋白质，包括大多数非小细胞肺癌，因此被认为是癌症进展和降低存活率的重要因素。sacituzumab govitecan-hziy的连接子部分由七个亲水性PEG单元组成，从而改善了ADC的物理性质。在细胞内化后，碳酸盐基团在适当的酸性条件下被切割，以释放SN-38有效载荷。 图3. sacituzumab govitecan-hziy的合成过程。 4.2.原生半胱氨酸重新桥接 半胱氨酸重新桥接是一个两步过程，利用一系列迈克尔/逆迈克尔反应（图4）将天然抗体转化为位点特异性ADC。2014年，PolyTherics（现为Abzena）的一个团队报告了这种称为“ThioBridge®”的优雅方法。这种独特的方法提供了低异质性DAR=4的ADC，拥有适合的亲水间隔物以改善物理和生物性质。使用这种方法，从完整抗体到ADC的转化已知可以以70-95%的高产量进行，包括纯化在内的总工艺产量超过70%。此外，所需的试剂是相对分子质量较小的还原剂和含有亲水间隔物的药物-连接子，这些可以通过TFF纯化轻松去除。偶联和纯化过程的这种简单性是半胱氨酸重新桥接方法的一个显著优势。此外，PolyTherics团队还在AKTA Pure系统上建立了适当的分离策略，通过制备性HIC HPLC获得几种DAR种类的半胱氨酸重新桥接ADC，通过色谱法额外控制DAR值。 图4. 基于半胱氨酸重新桥接的曲妥珠单抗-MMAE合成过程。 关于重新桥接位点特异性方法的额外报告已经在化学文献中发表，因为其相对简单和高效的偶联过程。特别是，双烷基化试剂，如溴甲基吡咯酮、二硫马来酰亚胺、二溴吡嗪二酮或芳基二丙烯腈，对许多有机合成化学家来说都很熟悉，并且在与抗体的位点特异性偶联反应中非常有效。此外，双(乙烯基磺酰)哌嗪实现了均匀的DAR=2 ADC合成。这些结果表明，ADC的DAR可以根据烷基化试剂进行控制。 4.3.Fc亲和肽偶联 具有高抗体亲和力的化合物已经被研究了相当长的时间；来自细菌的相对较小的蛋白质，如蛋白A、蛋白G和蛋白L，由于它们对抗体的特异性而得到了特别好的研究。这些化合物通常用作独立固定相亲和柱，用于抗体纯化。许多研究也已经进行，以用更短的肽替换这些抗体亲和蛋白；在1996年，Wells及其同事发现了一个33个残基的肽Z33，它是由蛋白A修饰而来的，并显示出潜力替代固定化的蛋白A柱。Z33肽被转化为环肽Z34C，以增加抗体亲和力。同样，Wells及其同事还报告了一个17个残基的肽Fc III，它特别附着在人IgG1的Fc位点上。此外，Z33、Z34C和Fc III已经与人类IgG1抗体的Fc部分共晶，揭示了结合位点。这种共晶结构激发并启发了化学家开发来自这些Fc亲和肽的新型标记试剂。 利用这些亲和化合物进行的化学偶联，称为亲和标记，是蛋白质位点特异性修饰的有前途方法之一。光亲和标记是该领域最常用的技术。几个小组报告了他们使用各种亲和化合物的独特方法，如蛋白A的Z结构域、模拟蛋白G的肽或Fc III衍生肽，但紫外线照射对蛋白质结构构成潜在风险。为了避免这种情况，已经报道了使用活性基团，如活化酯（例如4-氟苯基氨基甲酸赖氨酸（FPheK）或NHS酯）。在过去的十年中，这种偶联策略已经被几个实验室用于位点特异性ADC合成。然而，直到2019年，尽管这种相对简单的偶联程序具有潜在优势，但在同行评审的文献中还没有报道过使用亲和标记方法进行ADC生产的工业研发活动。2019年，味之素集团应用了一种源自Fc III的肽试剂，该试剂具有可切割的连接子，用于无痕标记技术，称为AJICAP®，并证明了所得到的位点特异性ADC的充分体内效力。然后，这一过程迅速应用于放大，建立了使用AJICAP技术生产GLP材料的GMP策略（图5）。 图5. 基于AJICAP®第一代的曲妥珠单抗-MMAE合成过程。 结合一个活化酯的亲和肽试剂以位点特异性的方式结合到曲妥珠单抗Fc区域的Lys 248，提供曲妥珠单抗-肽偶联物。抗体和肽部分之间的二硫键被切割，然后重新氧化以提供含硫醇的抗体。新安装的硫醇基团与市售的MC-VC-MMAE反应，得到AJICAP®-ADC。这个位点占据是通过亲和肽控制的，并由肽图谱分析确定。四个步骤的总产品产量为90%，获得了1.72克位点特异性ADC。这种ADC生产过程包括一个简单的程序，其中包含一个TFF（切向流过滤）纯化步骤，从而省去了制备色谱纯化的需求。5.专家意见5.1.三种化学偶联过程的比较 本文综述中描述的三种化学位点特异性偶联方法已经非常成熟，并且在相应的ADC生产和制造中似乎很难找到明显的缺陷。因此，在本节中，我们比较了三种化学偶联方法，重点关注所得ADC的不同特性（表2）。 表2. 三种化学位点特异性偶联方法的比较 高DAR饱和方法在工艺稳健性和使用记录方面具有显著优势，因为它被用于商业上可用的ADC中。因此，通过微调CMC和制造条件，它可以适用于其他ADC生产方法。然而，目标DAR和/或药物-连接子的兼容性似乎有限。例如，传统的药物-连接子MC-VC-MMAE不能在不重新设计药物-连接子的情况下轻易应用于高DAR方法。有报告称，由于其高度疏水性，它会引发相当数量的聚集。在其他含有DM1和MMAF的常见药物-连接子的情况下也观察到了这个问题（内部数据）。此外，高DAR ADC的重链和轻链仅由较弱的（非共价）键组成，这可能是一个缺点。铰链区缺乏二硫键可能会影响所得ADC的物理性质。实际上，已知sacituzumab govitecan-hziy的ADCC活性显著降低；随着市场上有两种ADC，我们可以预期这不是一个固有问题，但它可能限制了可以应用于高DAR ADC的抗体和药物-连接子的组合。 半胱氨酸重新桥接在偶联反应条件方面具有很高的灵活性，因为可以通过简单地改变双烷基化试剂来调整目标DAR。不应忽视的是，半胱氨酸重新桥接不需要硫醇-马来酰亚胺化学，这带有Retro-Michael反应的风险。Retro-Michael反应可能会在血液循环中脱落连接子-有效载荷，导致不希望的效果。虽然可以使用琥珀酰亚胺环开口来避免Retro-Michael反应，但这种处理需要碱性条件，可能会导致抗体脱酰胺。半胱氨酸重新桥接是形成稳定连接的快速有效方式，但可能的缺点是存在产生一些不希望的“错误桥接”ADC的风险。然而，这可能通过使用新型双烷基化试剂和偶联过程开发来解决。 Fc亲和肽偶联在应用于各种抗体和药物-连接子方面具有显著潜力。这种偶联方法可以在不需要亲水连接子或双烷基化试剂的情况下提供位点特异性DAR=2的ADC。Seattle Genetics小组报告了从通过色谱纯化准备的随机ADC混合物中分离出的纯化DAR=2、DAR=4和DAR=8 ADC的体内效力和药代动力学，说明降低每个抗体的药物负荷可以提高治疗指数。这一发表的结果暗示DAR=2的ADC可能是某些肿瘤学设置中理想的ADC格式。Fc亲和肽方法的一个缺点是相对长的合成序列的要求。然而，味之素的研究人员已经指出，最近进行了简化序列的优化，这个问题可能会得到解决。 总之，我们建议在追求生物药物计划中的抗体偶联方法时，将这三种偶联方法都视为潜在工具，具体取决于特定的目标，如目标DAR或偶联格式和生物学要求。 5.2.未来展望 最后，预测了ADC领域的未来方向。由于CMC优势和由此带来的扩大的治疗指数，对位点特异性ADC的需求将变得更大。显然，与高异质性ADC相比，位点特异性ADC能够简化ADC分析，因为它们的组成更简单，并且在监管方面是可取的。此外，可以预期，位点特异性和均匀DAR的ADC将有增加的需求，并且可能需要通过色谱纯化分离DAR种类。可扩展的HIC HPLC纯化方法的开发正在稳步进展，已经提出了适合药物-连接子疏水性的适当树脂。此外，HPLC纯化的关注点之一——回收率正在逐渐提高。 未来的偶联物将利用双特异性抗体和Fc融合蛋白等各种其他分子格式。由于结构复杂，一些由此产生的结构可能在生产条件下不稳定，制造这些可能需要开发专门的偶联条件。本文综述中报告的大多数偶联方法涉及通过TCEP进行二硫键切割过程，对于某些高度工程化的下一代抗体（如可能对氧化还原敏感的双特异性抗体）是否适合这种切割反应存在不确定性。将来，可能需要开发省略二硫键还原需求的位点特异性偶联方法。例如，学术界有许多引人入胜的报告，涉及开发非共价ADC、色氨酸选择性或酪氨酸选择性偶联方法，以及金属催化的抗体标记反应。我们强烈希望这些技术能够从研究阶段进入开发和放大阶段，成为工业相关的技术。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。