Anti LAG-3 antibody(MacroGenics)

摘要：淋巴细胞活化基因3（LAG-3）是一种细胞表面抑制受体，对T细胞活化和效应功能方面具有多种生物活性。LAG-3在免疫中起着调节作用，并在不久前作为一种抑制性免疫检查点分子出现，与PD-1和CTLA-4相当，是增强抗癌免疫反应的潜在靶点。LAG-3是人类抗癌免疫治疗中第三代抑制性受体，它被认为是继PD-1和CTLA-4后，治疗癌症中潜在的下一代靶点。与PD-1和CTLA-4不同，LAG-3的确切作用机制及其与其他免疫检查点分子的关系仍不为人所知。是由于在其胞内结构域存在非传统的信号传导模式，这不同于其他传统的免疫调节信号传导模式，但具有相似的抑制活性。这里我们总结了目前LAG-3信号通路，以及它在LAG-3功能中的作用，从其作用机制到临床应用。1. LAG-3的分子特征1.1 LAG-3的基因结构   LAG-3编码一个分子量为70 kDa的蛋白，它位于人类的12号染色体短臂（12p13.32）的远端。LAG-3基因是编码一个498个氨基酸的I型跨膜蛋白。LAG-3的位点与CD4共受体相邻，具有相似的序列和内含子/外显子，强烈表明LAG-3和CD4是由一个预先存在的编码IgSF结构域的共同进化祖先基因复制进化而来的。LAG-3蛋白结构可分为胞外区、跨膜区、胞内区（图1）。LAG-3基因有8个外显子。外显子I编码疏水前导肽的19 aa；外显子II编码前导肽（9 aa）和41 aa的胞外区（41 aa）；其余胞外区域由外显子III（101 aa）、IV（90 aa）、VI（81 aa）编码；外显子VII编码跨膜区（44 aa）；外显子VIII（21 aa），存在于高电荷的细胞质区域。LAG-3蛋白相当于一个525个残基的成熟蛋白，其分子质量约为50kDa。CD4和LAG-3的细胞外区域都是由四个细胞外免疫球蛋白超家族（IgSF）结构域（D1-D4）组成。D1是一个Ig可变区（V-SET型），它包括一个额外的、独特的、富含脯氨酸的环（30个残基），位于该结构域的中间（在D1的C和C′β链之间结构域），通过一个不寻常的链内二硫键桥接。与CD4不同的是，这个环介导了 LAG-3-MHCII之间的相互作用。LAG-3的结构域D2、D3和D4都属于C2-SET，而CD4 的D3结构域属于V-SET型。LAG-3的D1和D3，以及D2和D4。具有很强的内部结构同源性。然而，CD4和LAG-3只有不到20%的氨基酸序列相同。D1、D2之间和D3、D4之间通过β链延伸。图1：CD4和lag3蛋白的分子组织此外，与CD4相比，LAG-3蛋白在膜近端D4结构域和跨膜区域之间有一个更长的连接肽。LAG-3在这个连接肽可以被裂解，释放出一种可溶形式的LAG-3。这种切割反应是两种跨膜金属蛋白酶ADAM10和ADAM17介导的，通过两种不同的机制调控。虽然ADAM10 介导构成性LAG-3裂解，而ADAM17介导LAG-3裂解，由PKCθ诱导的 TCR信号以PKCθ依赖的方式进行裂解。有趣的是，有证据表明 LAG-3从细胞表面脱落会增强T细胞的增殖和效应功能。LAG-3的细胞质尾部介导了细胞内的负信号转导，因为它的缺失完全废除了其抑制功能。LAG-3 的细胞质区含有 3 个保守基序，第一区域含有丝氨酸磷酸化位点，第二区域含有独特“KIEELE”基序内的单个赖氨酸残基，第三区含有谷氨酸 - 脯氨酸（EP）重复序列。在这三个区域中，“KIEELE” 基序被证明对信号转导和 LAG-3 的抑制功能至关重要。然而，关于这些基序如何影响LAG-3的分子功能和下游信号传导，有相互矛盾的证据。潜在的丝氨酸磷酸化基序（S484）已被描述在FxxL基序内，尽管除了与IL-2的产生有关外，没有具体的功能被赋予它。这个丝氨酸可能类似于蛋白 CD4分子中的蛋白激酶C结合点。KIEELE基序是一个高度保守的短序列，在其他蛋白中没有发现，它与LAG-3功能的相关性一直存在争议。KIEELE的缺失完全消除了CD4 T细胞上LAG-3的功能，突出了其在LAG-3抑制信号传导中的重要性。此外，对KIEELE残基的丙氨酸扫描突变显示，赖氨酸残基（K468）是LAG-3下游信号传导的绝对必需的，而E470和E471对CD4功能的贡献较小。然而，根据研究，LAG-3通过两种独立于KIEELE的不同机制介导细胞内在的负抑制信号，这两种机制依赖于膜近端区域的FxxL基序和羧基端EP重复序列。EP重复基序存在于不同物种和细胞位置的一些蛋白质中，这可能是一种潜在的共同生物学功能的一个指标。例如，PDGF-R、LckBP1和SPY75包含类似的EP区域，这有助于它们的信号传导机制。有研究提出，EP基序通过与LAP蛋白（LAG-3相关蛋白）的关联来抵消CD3/TCR激活通路的关键，允许LAG-3在脂筏内与CD3、CD4和CD8共定位。EP基序的缺失或S484A突变在CD4+和CD4−T细胞中保持了LAG-3的活性和功能，这表明这两个特征可能不是必要的。然而，如果同时去除KIEELE和EP基序，则只有在CD4−T细胞中，LAG-3的抑制活性才能被完全消除。EP基序可能在阻止LAG-3作为CD4等刺激共受体中发挥作用，而不是与KIEELE协同抑制信号转导。由于LAG-3在抗原刺激后定位于脂质筏中，其细胞质结构域可能介导其在细胞膜中的位置[8]。LAG-3与含有CD3、CD4或CD8的鞘糖脂富集微结构域复合物共同定位。在与TCR结合后，LAG-3与CD3和神经节苷脂GM1在免疫突触中共同定位。然而，迄今为止，还没有关于这些基序及其功能的系统的后续研究报道。除了表面表达外，LAG-3还可以存储在溶酶体中，并通过蛋白激酶C信号通路通过其胞质结构域易位到活化的T细胞的细胞膜上。1.2 LAG-3的配体MHC-II分子被认为是LAG-3的典型配体，它通过D1结构域稳定地相互作用，其亲和力明显高于与CD4。这种关联负调控T细胞的活化、细胞毒性和细胞因子的产生。事实上，LAG-3-Ig融合蛋白在CD4/MHCII类依赖的细胞粘附试验中竞争结合。一旦LAG-3与MHC-II结合，它就通过其胞质结构域传递抑制信号，并抑制CD4 T细胞的活化。然而，与其他免疫检查点分子相比，信号转导的分子机制仍未知。LAG-3与MHCII类结合有助于肿瘤逃避凋亡，并促进肿瘤特异性CD4 T细胞的募集，但会减少CD8 T细胞的应答。最初，高亲和力的LAG-3：MHCII类相互作用被认为是LAG-3通过与CD4：MHC II结合竞争抑制活性的主要机制。然而，鉴于最近发现的其他配体，与MHC-II的相互作用是否单独介导LAG-3的免疫抑制功能仍存在争议。第二个LAG-3的配体是半乳糖蛋白-3（Gal-3），一种31kDa的半乳糖结合凝集素，可调节T细胞的激活。Gal-3已被证明在各种肿瘤细胞和活性T淋巴细胞中高度表达。Gal-3与LAG-3结合，似乎是最佳抑制CD8 T细胞的细胞毒性功能所必需的。在肿瘤微环境中，Gal-3通过LAG-3的表达抑制活化的抗原特异性CD8 T细胞，并抑制浆细胞样树突状细胞的扩增，从而形成抗肿瘤特异性免疫反应。肝分泌纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）最近被鉴定为一种新的LAG-3功能配体。FGL1是纤维蛋白原家族的一名成员，通过与LAG- 3结合抑制抗原特异性T细胞，具有免疫抑制活性。FGL1结合LAG-3的D1和D2结构域。其表达是由IL-6诱导的，并在一些人类癌症中高度上调，如美国肺癌、前列腺癌、黑色素瘤和结肠直肠癌。事实上，研究表明血浆FGL1水平升高与不良的癌症预后和抗pd-1治疗耐药性相关。因此，这种结合被描述为一种新的免疫逃避机制，其阻断增强了临床前模型中的抗肿瘤T细胞免疫。FGL1/lag3的阻断可能与抗pd-1/抗pd-L1的治疗有协同作用。LAG-3的D1C’链结构域的单点突变（Y73F）破坏了LAG-3/MHC-II的结合，但没有破坏FGL1-Ig的结合[1]。然而，该突变体LAG-3仍然可以抑制T细胞，表明FGL1/LAG- 3相互作用对应于一种肿瘤免疫逃避机制。综上所述，这些数据表明，LAG3与几种配体的相互作用对其抑制功能很重要，与之前认为的不同，LAG3主要不是通过破坏CD4：MHC-II相互作用来发挥作用。1.2 LAG-3的功能LAG-3（CD223）是一种抑制性受体，首次在体外激活的T细胞中被发现。LAG-3对T细胞功能和CD4 T细胞活化具有多种生物学作用，通常具有抑制作用。在没有CD4激活的情况下，LAG-3似乎并不抑制T细胞的功能，但可能会干扰CD4共受体的功能。LAG-3负调控CD8和CD4 T细胞的增殖、激活、效应功能和稳态，这在LAG-3敲除的小鼠和在人细胞中通过抗体阻断LAG-3表现出来。因此，有证据表明，LAG-3干扰了CD4和CD8激活的共同途径，并调节T记忆细胞的激活和扩张。与PD-1和CTLA-4相比，LAG-3在免疫系统中发挥调节作用，通常包括抑制细胞增殖、免疫功能、细胞因子分泌和稳态。LAG-3在各种抗原刺激条件下均可上调。LAG-3的表达由TCR刺激或细胞因子刺激诱导，并且LAG-3在激活的、表达细胞因子的T细胞中上调。LAG-3与T细胞膜上的TCR：CD3复合物相关，负调控TCR信号转导，进而终止细胞增殖和细胞因子分泌，以响应CD3信号通路。LAG-3和CD3共同参与免疫突触是下调TCR信号转导的必要条件。在其他后果中，LAG-3/TCR与它们的配体同时接合会抑制TCR：CD3依赖的细胞内钙通量。与PD-1类似，构成性LAG-3的表达也经常与衰竭的T细胞有关，它通常被认为是CD4和CD8 T细胞在癌症和慢性病毒感染中对重复性抗原刺激的一种衰竭标志物。事实上，已经发现在TCR参与后，LAG-3与CD8和CD4 T细胞中的TCR在物理上相关，下调TCR依赖的信号级联，从而抑制T细胞反应（图2）。图2：在抗原呈递和T细胞激活过程中，T细胞和抗原提呈细胞（APC）之间在免疫突触内发生的分子相互作用示意图。2. 疾病中的LAG-32.1 癌症LAG-3在T细胞的表达通常被认为是有利于癌症发展，在广泛的人类肿瘤瘤如黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、结直肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、胃癌、滤泡性淋巴瘤、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、恶性胸膜间皮瘤、乳腺癌、肛门鳞状细胞癌、胰腺癌、口咽鳞状细胞癌和尿路上皮癌等。它的表达也被认为导致几种癌症中T细胞衰竭的因素，如胰腺导管腺癌。表达LAG-3的肿瘤通常与较低的生存期相关，尽管在一些实体肿瘤中，LAG-3的高表达与良好的总生存期和无病生存期相关，特别是在早期阶段，如乳腺癌、ENKTL鼻型、NSCLC和TNBC。在过去的5年里，人们对检查点抑制的抵抗机制有了更好的了解，如上调或激活替代免疫检查点，包括PD-1、CTLA-4和LAG-3。在一些恶性肿瘤中，LAG-3和PD-1共表达与疾病预后不良相关。它在肿瘤抗原特异性T细胞中的上调意味着细胞介导的免疫力受损，并标志着T细胞的增殖功能失调。免疫检查点表达在原发性和转移性癌症微环境中的预后意义现已成为现实。T淋巴细胞中LAG-3高表达的癌症患者在T细胞中表现出活化的促凋亡表型，这与PD-1表达增加和PD-1阻断后存活率低有关。PD-1/LAG-3表达是衰竭T淋巴细胞浸润肿瘤的标志物，这是一种高风险特征，是预测总生存率的临床因素。在TCR刺激后同时表达PD-1和LAG-3的NSCLC患者呈现出高度功能失调的全身性T淋巴细胞。这些功能失调的T淋巴细胞对抗PD-L1/PD-1单药治疗具有耐药性，可能是由于LAG- 3的表达。在不同的实验模型中已经表明，LAG-3和PD-1在进展性肿瘤的TILs中共同表达，它们的共同阻断对免疫逃逸、增加抗肿瘤反应、增强T细胞增殖和细胞因子的产生具有协同作用。事实上，在T细胞启动过程中，PD-1/LAG-3通路的阻断增加了T细胞的增殖、细胞因子的产生和抗肿瘤功能。总的来说，这些研究表明，免疫逃避主要由LAG-3介导的肿瘤对PD-1阻断较不敏感。因此，这为最终使用LAG-3作为免疫治疗中的生物标志物提供了可能性。目前正在进行几项临床试验，研究包括LAG-3在内的免疫检查点的联合阻断。2.2 帕金森病新出现的临床前和临床证据表明，LAG-3与帕金森病（PD）的风险增加相关。LAG-3在神经元中表达，并作为病理原纤维α-突触核蛋白的结合受体，介导其聚集、细胞内传递和扩散。这一过程涉及到预先形成的α-突触核蛋白原纤维，然后通过LAG-3参与神经元的外源性内吞作用。LAG-3的单核苷酸多态性变异与PD风险增加相关，特别是在女性人群中。血清和脑脊液（脑脊液）中的可溶性LAG-3已被证明与PD的临床发展和阴性进展相关。因此，中枢神经系统中LAG-3机能失调引起的免疫稳态的破坏可以造成神经元到神经元的α-突触核蛋白聚集和PD的进展。综上所述，LAG-3可能是减缓α-突触核蛋白病进展的治疗靶点。2.3 心血管疾病LAG-3的表达已被证明与冠心病（CHD）和心肌梗死（MI）增加相关。LAG-3在经历完全血管化、异位、同种异体心脏移植排斥反应的心脏同种移植物中积累。在临床研究中，LAG-3缺乏也与Tr1功能障碍导致的冠状动脉疾病（CAD）风险增加有关。2.4 高密度脂蛋白高胆固醇血症通过转录组学研究，LAG-3蛋白表达水平与高HDL胆固醇（HDL-C）和HALP（HDL-C≥60 mg/dL）显著相关。事实上，LAG-3的缺乏改变了脂筏的形成和细胞磷酸化信号传导，该过程导致了促炎状态的增强，并增加了炎症细胞因子如TNFα的产生。2.5 炎性肠病据报道，LAG-3是在肠道炎症反应中调节T细胞的调节因子。此外，在淋巴样细胞导致的结肠炎过程中，需要LAG-3+调节性T细胞来抑制CX3CR1+巨噬细胞的炎症活性，以维持组织稳态。此外，已经显示LAG-3+细胞在炎症粘膜中增加，并且与溃疡性结肠炎的内窥镜严重性和疾病表型相关。2.6 多发性硬化  LAG-3的等位基因变异导致多发性硬化(MS)的易感性。特别是，至少有三个单核苷酸多态性（SNPs）（p<0.05）与MS风险增加显著相关，可能是由于免疫稳态紊乱。在本研究中，发现三个SNPs分布对MS易感性有显著：rs19922452、rs951818和rs870849。Rs870849代表LAG-3，用非极性异亮氨酸取代不带电荷的极性苏氨酸(Thr455Ile ),这可能改变蛋白质的功能和构象。SNPs rs19922452和rs951818位于非编码区，因此它们在风险增加中的意义尚不清楚。然而，这仍有待于通过对LAG-3蛋白的功能研究来确定，以验证这些结果的重要性，并识别保护性SNP单倍型。2.7 糖尿病LAG-3的表达可以有效地预防一些自身免疫性疾病，因为它被描述为在糖尿病发作的起始阶段和驱动阶段限制CD4和CD8 T细胞的致病潜力。事实上，LAG-3的缺失加速了自身免疫性糖尿病。LAG-3的缺失导致雄性和雌性非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(人类1型糖尿病(T1D)的模型)中的自身免疫性糖尿病更快的发展。LAG-3的缺失导致了NOD胰岛内T细胞浸润的快速积累。即使是LAG-3表达的部分减少也会导致糖尿病疾病的快速发展。LAG-3在抑制Th1细胞活化、降低t细胞自身反应性和T1D方面也很重要。在这种情况下，LAG-3功能的治疗增强可以作为T1D的治疗。2.8 感染中的LAG-3LAG-3的表达也与某些感染的病理增加有关。LAG-3+CD138hi天然调节性浆细胞的高积累与对沙门氏菌感染的免疫控制受损有关，导致更高的细菌负荷和存活率降低。感染疟原虫（17XL、17XNL、查巴迪、伯氏疟原虫）可导致激活CD4细胞PD-1和LAG-3表达增加。事实上，CD11ahi CD49dhi CD4 T细胞在感染疟原虫过程中表达PD-1和LAG-3。有趣的是，体外阻断PD-1/LAG-3相互作用增强了感染时细胞因子的产生。在活动性的结核分枝杆菌感染过程中，LAG-3也在CD4 T细胞和NK细胞中表达，增强了高细菌负担，并改变了Th1反应。因此，lag3的表达在肺中增加，特别是在肉芽肿性病变中。LAG-3也可能与人类免疫缺陷病毒（HIV）感染有关，因为它的上调与T细胞耗尽亚群内的高病毒载量相关，并与更快的疾病进展相关。非致病性猴免疫缺陷病毒(SIV)原发感染诱导LAG-3编码基因的DNA甲基化。类似的机制可能发生在hiv感染患者中，这可能导致持续的代谢和炎症紊乱。LAG-3表达在乙型肝炎病毒(HBV)特异性CD8 T细胞中显著上调，LAG-3表达在乙型肝炎病毒(HBV)特异性CD8 T细胞中显著上调，作为HBV特异性细胞介导免疫的抑制因子，甚至抑制肝细胞癌的发病机制。LAG-3的表达也与人乳头瘤病毒（HPV）状态相关。因此，LAG-3抑制剂可能帮助免疫系统，克服免疫衰竭来对抗病毒感染。在慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染期间，LAG-3也在CD8 T细胞上表达，抑制细胞增殖、细胞毒性功能和细胞因子的产生。LAG-3+CD4T细胞数量与HCV-中和性抗体反应呈负相关。耗尽的LAG-3+CD8T细胞也与其他慢性病毒感染相关。与此一致的是，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）和单纯疱疹病毒1（HSV-1）感染后也显示了LAG-3的表达增加。3.LAG-3靶向治疗的临床前景   癌症免疫疗法，包括免疫检查点抑制剂的阻断，刺激免疫系统识别和消除肿瘤细胞，增强对传染因子的反应也很重要。这些治疗方法主要作用于T淋巴细胞的再活化。然而，并不是所有的患者都对这些治疗方法有反应，这代表了一个重大的临床、经济和伦理问题。在抗原呈递过程中调节T细胞激活的抑制性共受体是非常重要的免疫检查点。这些分子通常与TCR一起存在于免疫突触中，并调节其信号转导能力。列如PD-1、CD244、CD160、TIM-3、CTLA-4和LAG-3。特别是，ICIs阻断PD-1/PD-L1相互作用已经彻底改变了肿瘤学，在癌症治疗方面取得了非常有希望的结果。由于这些ICIs的疗效，一组第二代ICIs，如抗LAG-3抗体和组合正在临床前和临床水平上进行评估。LAG-3在2006年的临床试验中首次作为LAG-3-ig融合蛋白，利用其作为可溶性蛋白的免疫刺激活性（阿尔法，IMP321）。目前，有几种LAG-3拮抗免疫治疗模型处于临床阶段（表1）。此外，阻断LAG-3和其他免疫检查点（PD-1、PD-L1、TIM-3、CTLA4）的组合也正在研究中。新一代双特异性PD-1/LAG-3阻断剂已显示出强大的能力，可特异性靶向PD-1+ LAG-3+高度功能失调的T细胞，并增强其增殖和效应活性。表1.进入临床的LAG-3产品4.总结   淋巴细胞激活基因-3 (LAG-3)作为下一代免疫检查点，是免疫稳态的关键调节因子。几种LAG-3阻断免疫治疗模型正在临床和临床前发展的不同阶段进行研究。然而，导致LAG-3抑制功能的机制目前尚不清楚。这是一个主要的临床问题，也是免疫肿瘤学药物开发的最重大挑战之一。了解PD-1/LAG-3共信号通路驱动T细胞功能障碍的机制，有助于我们理解免疫治疗耐药性的基础，并揭示抵消耐药性和从免疫治疗中获益的机制。事实上，lag3与PD-1的联合阻断显示了令人鼓舞的结果，正如最近在RELATIVITY-047 III期临床试验中宣布的转移性黑色素瘤的治疗那样。relatlimab和nivolumab的组合满足无进展生存期的主目的。最后，深入了解LAG-3细胞内信号转导的基本机制，将为进一步发展癌症、感染、自身免疫性疾病和神经系统疾病的新策略提供见解。参考文献1.Chocarro L, Blanco E, Zuazo M, et al. Understanding LAG-3 signaling[J]. International journal of molecular sciences, 2021, 22(10): 5282.2.https://mp.weixin.qq.com/s/1wI0SaZnVxo1Ijla90dmjA识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。