Tetravalent influenza vaccine (Shanghai Institute of Biological Products)

12月10日，中国生物长春生物制品研究所生产的四价流感病毒裂解疫苗正式发运澳门特别行政区，这是该疫苗2024年2月获得澳门特别行政区政府药物监督管理局注册批准后的首次供应，也是中国生物第一个进入澳门特别行政区使用的流感疫苗。 长春生物是中国最早的流感疫苗研究生产基地，在流感疫苗研发和生产方面具有悠久的历史，具有多技术平台的优势。长春生物制品研究所生产的四价流感病毒裂解疫苗已连续上市22年，累计上市销售超9000万剂，批签发合格率100%。2023年，长春生物生产的流感病毒裂解疫苗通过世界卫生组织（WHO）预认证。  长春生物制品研究所积极践行中国生物国际化发展方针，四价流感疫苗先后在多国开展海外注册，狂犬病疫苗与甲肝疫苗也在积极推进海外注册，不仅为国内疾病防控作出卓越贡献，也为构建全球健康屏障贡献中国力量。 内容来源：长春生物制品研究所 搜索“中国生物” 关注中国生物全媒体矩阵

中文摘要 重组病毒载体疫苗是以病毒为载体递送目的抗原的一种疫苗。病毒载体技术路线早期多用于动物疫苗和难以用传统技术路线开发的病原体疫苗。我国针对新型冠状病毒感染疫苗研发布局的5条技术路线中，因重组病毒载体疫苗具备可同时产生较强的体液和细胞免疫、可通过黏膜途径接种以及1剂完成免疫程序等优势而获批上市，并在疫情防控中起到了重要作用。但重组病毒载体疫苗因预存免疫问题，即存在可能降低疫苗保护效力、为增强免疫原性可能导致安全性风险提升等因素，故上市的重组病毒载体疫苗产品较少。随着基因工程技术、分子生物学技术的发展，病毒载体种类日渐增多，并在多种疫苗中得到应用。此文就重组病毒载体疫苗的研发现状进行综述。 正文 重组病毒载体疫苗是将编码有效抗原的特定基因插入病毒载体并表达而获得的疫苗，可诱导体液及细胞免疫，病毒基因组稳定，无需佐剂即可诱导高免疫原性和持久免疫应答等，但存在预存免疫问题，当前研究主要通过人类稀有或灵长类动物腺病毒（adenovirus，Ad）来替代高流行性病毒载体、增加接种剂量等，来一定程度上克服预存免疫、加强免疫原性。病毒载体根据复制能力可分为2种，复制型病毒载体和复制缺陷型病毒载体。病毒载体疫苗平台是快速有效应对新突发传染病的途径之一，目前主要使用的病毒载体有Ad、痘苗病毒（vaccinia virus，VV）、疱疹病毒、水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）、流感病毒等。本文就各种用于预防或治疗不同疾病的病毒载体疫苗研究新进展进行综述。 1 病毒载体 1.1 双链DNA病毒 1.1.1　Ad载体　Ad直径70～90 nm，基因组约36 kb，在自然界广泛分布，人类Ad已有52种。Ad基因组包含早期表达的与病毒复制相关的E1—E4基因，第1代Ad载体剔除了E1和E3基因，缺失复制能力；第2代在第1代基础上删除E4基因，突变E2基因，降低了在293细胞中培养时产生复制型Ad的能力，虽提高了安全性，但降低了免疫原性；第3代为去除了所有编码蛋白质序列的空壳病毒，极大增加了载体容量，增加了安全性，也进一步降低了免疫原性，未规避预存免疫，病毒包装过程还需依靠辅助病毒和互补细胞系。重组Ad载体是非常有前景的载体之一，目前研究较多的有人5型Ad（Ad5）、26型Ad（Ad26）以及黑猩猩Ad（chimpanzee Ad，ChAd） 3型（ChAd3）等，用于已上市COVID-19疫苗、埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）疫苗等，以及临床研究阶段的呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）疫苗等。 1.1.2　VV载体　VV是一类体积大、结构复杂的病毒。病毒颗粒约为360 nm×270 nm×250 nm，基因组140～220 kb。VV宿主范围较广，作为载体可容纳大片段外源基因而不影响其生长特性。在开发靶向蛋白较大的疫苗时具有优势。如天花疫苗使用改良型VV安卡拉毒株（modified VV ankara，MVA），与天花病毒存在交叉抗原，能够表达有效抗原并诱导机体产生体液和细胞免疫，且安全性较好。VV载体被用于研究多种传染病预防，如EBOV疫苗、猴痘疫苗、流感疫苗等。 1.1.3　疱疹病毒载体　疱疹病毒的种类很多，共发现有100余种，人疱疹病毒直径120~150 nm，基因组120~150 kb，被开发为病毒载体的有单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）、火鸡疱疹病毒、猪伪狂犬疱疹病毒等。疱疹病毒作为载体，可携带多个或较大基因，容纳外源基因能力强。其中，HSV能够感染多种细胞并快速增殖，利用这一特性改造的HSV基因工程载体可以用于基因和神经系统疾病治疗。2015年，FDA批准了第1个基于HSV-1的溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）药物，该药物通过基因工程技术删除HSV-1基因组中的感染细胞蛋白（infected cells protein，ICP）34.5和ICP47基因，并将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ，GM-CSF）插入ICP34.5位点，用于治疗黑色素瘤。HSV作为OV载体的研究热点，可发挥原位肿瘤疫苗功能，激活抗肿瘤免疫，多应用于肿瘤治疗。HSV-1和HSV-2作为载体均已被开发成OV候选药物，并且已进入临床试验阶段。 1.2 单链RNA病毒 1.2.1　仙台病毒（Sendai virus，SeV）载体 　SeV又称乙型副流感病毒Ⅰ型，直径150~200 nm，基因组长约15 kb，是典型的人畜共患病毒。基于SeV载体的OV药物因潜在的癌症治疗作用而受到关注。SeV载体具有宿主范围广、表达量高、胞质表达、安全性好等优点，作为利用反向遗传学构建的新兴RNA病毒载体，SeV载体目前广泛用于基因治疗药物和新型疫苗研究。日本DNAVEC公司开发的用于治疗下肢缺血的SeV-hFGF2/dF，是国际上首个获批临床研究的SeV载体基因治疗药物。此外，应用SeV载体开发的HIV、HSV疫苗等处于临床前研究阶段。 1.2.2　麻疹病毒（measles virus，MV）载体　MV直径100～250 nm，基因组长约15 kb，可导致儿童急性呼吸道疾病。目前我国麻疹发病有低龄化趋势，且易伴有并发症。作为病毒载体，MV具有可容纳6 kb的外源序列并稳定表达、同时诱导产生显著的细胞和体液免疫应答、仅在胞浆中复制不会整合到宿主基因组等优点。通过将与目标病毒感染、复制或逃逸有关的蛋白基因插入MV反基因组载体中开发的HIV、寨卡病毒和基孔肯雅病毒的候选疫苗均已步入临床试验阶段。 1.2.3　VSV载体　VSV长度150～180 nm，直径50～70 nm，基因组约11 kb，通过昆虫叮咬和家畜传染，人感染后仅出现流感症状，但家畜感染后表现为口、蹄等水疱样病灶，肉、奶产量下降，造成畜牧业经济损失。VSV基因组能容纳多个外源基因；病毒复制多代次后性状保持稳定；不会整合到宿主细胞基因组；增殖滴度高，免疫原性好，不受宿主抗病毒载体免疫影响，可诱导较强的细胞免疫和体液免疫。基于VSV载体开发的EBOV疫苗已获FDA批准上市，保护率达到97.5%。 1.2.4　流感病毒载体　流感病毒通常呈球形颗粒，直径约100 nm，但新分离的毒株大多为丝状颗粒，长度能达到20 μm。人流感病毒分为甲、乙、丙型。通过反向遗传学技术，在流感病毒中插入外源基因构建流感病毒载体疫苗。流感病毒载体在人体内可引起体液、细胞及黏膜免疫，复制周期无DNA，不会整合到宿主细胞，还可通过更换亚型解决预存免疫问题。目前以流感病毒为载体开发的疫苗包括已进入Ⅲ期临床试验的COVID-19疫苗，以及早期研究阶段的HIV疫苗、RSV疫苗等。 1.2.5　新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）载体　NDV颗粒呈多形性，直径120~300 nm，长约15 kb。不同NDV株的毒力不同，多数NDV载体疫苗选择La Sota缓发型弱毒株。构建NDV载体疫苗首先利用反向操作技术获得感染性病毒克隆，随后进行分子遗传操作。重组NDV活病毒载体遗传性状比较稳定，毒株间不易发生重组；病毒复制在胞浆内完成，不产生DNA，不会整合到宿主细胞基因组。NDV弱毒株疫苗可同时诱导全身体液免疫、细胞免疫和局部黏膜免疫，有较好的保护作用，已在临床试验中验证了其安全性，NDV已被应用于COVID-19疫苗的临床前开发等。 2 重组病毒载体疫苗 2.1 COVID-19疫苗 COVID-19可引起急性呼吸道传染病，目前已经上市的重组病毒载体COVID-19疫苗主要采用人或黑猩猩Ad载体，流感病毒载体等开发的COVID-19疫苗已进入临床试验阶段。 国内上市的COVID-19载体疫苗，采用人Ad5去除了E1和E3基因并导入新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）刺突蛋白基因，在感染细胞后可表达SARS-CoV-2 刺突蛋白，诱导体液和细胞免疫。但人Ad5在人群中流行率较高，可通过提高病毒滴度或者加大接种剂量来解决预存免疫。临床研究发现接种1剂COVID-19载体疫苗14 d后，重症保护率和总体保护率分别为96.0%、63.7%，安全性良好。英国牛津大学与阿斯利康公司合作开发了以ChAd为载体的疫苗AZD1222，在载体中导入COVID-19全长刺突蛋白，采用加大接种剂量的方式解决预存免疫问题。受试者接种2剂AZD1222，第2剂加强接种后至少14 d，疫苗总体保护率为70.4%。俄罗斯Gamaleya公司开发的Sputnik V COVID-19疫苗是一种基于重组Ad26和Ad5的组合载体疫苗，2个载体均可表达SARS-CoV-2刺突蛋白，分别使用2种重组载体进行初次、加强免疫，第1剂接种后21 d保护率达91.6%。由于人呼吸道中的抗体水平远低于外周血中，SARS-CoV-2在鼻腔感染和复制时就容易出现免疫逃逸，因此Chen等将改造双重减毒甲型流感病毒载体插入SARS-CoV-2受体结合域基因，开发了可经鼻腔喷雾接种的活病毒载体疫苗dNS1-RBD，该疫苗株可在上呼吸道有限复制，NS1基因缺失增强了流感病毒载体的安全性，且可诱导强效的抗病毒应答，在Ⅲ期临床试验中呈现出广谱保护率和安全性。 2.2 EBOV疫苗 EBOV是一种能够引起烈性传染病的病毒，有较强的传染性和最高达90%的病死率。基于重组病毒载体技术路线开发的EBOV疫苗众多，主要采用Ad、VV和VSV载体。 中国人民解放军军事科学研究院与天津康希诺生物股份公司开发的表达EBOV Zaire型（ZEBOV）囊膜糖蛋白（glycoprotein，GP）的Ad5-EBOV疫苗，可产生有效的细胞和体液免疫应答，于2017年在国内获批上市，增加Ad5-EBOV疫苗免疫剂量可在一定程度上克服载体预存免疫影响。Ewer等以灵长类动物ChAd3为载体来降低预存免疫，将Ad的GP基因替换成ZEBOV或EBOV Sudan型的GP基因，开发的复制缺陷型ChAd3- ZEBOV疫苗可诱导细胞免疫。在重组痘病毒载体的EBOV疫苗研发中，为提高有效抗原的表达量，减少预存免疫影响，免疫策略均为序贯免疫，即不同技术路线的疫苗按照一定时间间隔、剂次开展的接种，也称为异源疫苗接种。西安杨森制药有限公司采用2种EBOV疫苗Zabdeno（Ad26.ZEBOV）和Mvabea（MVA-BN-Filo）异源接种，临床研究表明，双剂量方案具有良好安全性，该方案于2020年获欧盟委员会批准上市。提高异源接种间隔时间，抗体有效浓度最高可保持1年。同源疫苗接种是指相同技术路线的疫苗按照一定时间间隔、剂次开展的接种，异源和同源Ad26、MVA载体EBOV疫苗方案都具有良好的耐受性，异源第2剂加强接种免疫后效果更好。美国默沙东公司Ervebo疫苗是在减毒VSV中插入EBOV表面抗原GP，保留了一定的复制能力，通过该病毒的轻度感染即可产生特异性抗体，该品于2019年获FDA批准上市。Grais等发现，Ervebo维持预防效果可达2年之久。以VSV为载体开发的重组VSV-ZEBOV疫苗在Ⅲ期临床试验中显示良好安全性，提高接种剂量可降低预存免疫、增加免疫原性。 2.3 HSV疫苗 HSV可引起人类多种疾病，如口唇部疱疹、腰腹部疱疹以及生殖系统疱疹等。在新生儿、严重营养不良和免疫功能低下者等人群中可引发危及生命的感染。从20世纪30年代开始，虽然尝试了灭活疫苗、蛋白质亚单位疫苗、减毒活疫苗和DNA疫苗等各种技术路线，但目前还没有获批上市的疫苗。 目前虽已发现HSV基因组的ICP34.5等基因表达的蛋白质会导致HSV的免疫逃逸并减弱细胞对HSV的清除，造成HSV基因组在感染细胞内持续存在，形成“潜伏”状态，但HSV影响潜伏的蛋白及其机制尚未被阐明。尽管已有将HSV改造成载体荷载免疫调节基因如GM-CSF的OV用于肿瘤的治疗，但用于健康人群的疾病预防仍具有潜在风险。因此，HSV疫苗的开发主要采用其保护性抗原，构建病毒载体、重组蛋白或者mRNA核酸疫苗等技术路线。 HSV蛋白GP〔如糖蛋白D（glycoprotein D，gD）〕、衣壳结构蛋白和披膜蛋白（如VP16）、非结构蛋白ICP27等能够诱导细胞免疫，可作为疫苗靶标的蛋白。由于HSV疫苗开发可能需要多蛋白协同发挥免疫效应，因此，多个外源基因的病毒载体SeV、Ad等成为目前开发HSV疫苗的选项。 以HSV阴性人群预防和阳性人群治疗为目标，Ren等采用复制缺陷型SeV，通过反向遗传学方法构建了2个重组病毒载体，1个编码HSV-2 gD（HSV-2-gD)，另1个编码HSV-2 ICP27，在动物实验中显示出良好的体液和细胞免疫应答。通过2种携带HSV-2抗原的复制缺陷型病毒载体疫苗加强免疫，可较好地克服预存免疫，产生较强的特异性免疫原性并能够有效地预防HSV-2引起的生殖器复发感染。通过Ad构建编码HSV-2-gD的重组载体疫苗，在动物实验中显示出良好的体液免疫应答，也可一定程度上抑制HSV-2感染复发时的症状。 2.4 RSV疫苗 RSV是导致呼吸系统疾病的主要病原体，可引发各年龄段人群的下呼吸道感染，更是导致婴幼儿病毒性呼吸道感染住院的首要因素。免疫力低下或患有慢性基础病的老年人感染RSV的风险高并极易导致原有基础病加重。目前开发RSV疫苗使用的病毒载体有Ad、流感病毒等。 Salisch等使用人群中低流行性的Ad26和Ad35载体开发的RSV疫苗，动物实验显示能够诱导有效的免疫应答。婴儿免疫系统未发育完全，老年人免疫系统弱，均需要免疫原性更强的疫苗。武汉博沃生物科技有限公司开发的RSV疫苗采用Ad5载体，以融合蛋白作为RSV疫苗的主要靶标，可避免其他技术路线RSV疫苗缺点，如减毒活疫苗的毒力返祖、灭活疫苗可能诱导的抗体依赖的疾病增强效应，该产品已进入中试样品制备阶段。Lee等将RSV 的融合蛋白262—276蛋白表位插入到流感病毒载体构建的疫苗，动物实验显示可诱导产生保护性中和抗体。 2.5 HPV疫苗 HPV感染症状表现为寻常疣、尖锐湿疣等，分低危、高危型。临床已证实高危型HPV感染是引起宫颈癌和癌前病变最重要因素。用于研发HPV重组载体疫苗的病毒载体有Ad、MV等。 以Berna商业疫苗株MV载体开发的预防性HPV疫苗，动物实验显示可诱导特异性抗体。Gupta等基于MV开发的HPV疫苗已进入Ⅱ期临床试验。浙江普康生物技术股份有限公司开发的HPV16重组Ad载体治疗性疫苗已进展至Ⅰ期临床试验。法国Transgene公司开发的TG4001是基于非复制型、高度减毒的重组牛痘病毒MVATG8042载体、含有HPV16抗原（E6、E7基因）的重组病毒载体疫苗，目前已进入Ⅱ期临床试验，其联合程序性死亡配体1抑制剂Avelumab治疗晚期HPV阳性肿瘤患者，试验结果表明二者联合使用安全，且在HPV 16阳性肿瘤患者中产生抗肿瘤活性。中国生物技术股份有限公司研发的疫苗以HSV-1 OV为载体，在构建载体具有溶瘤活性的同时，表达HPV E6、E7等多个蛋白的多个抗原表位，可诱导产生持久的细胞免疫应答。 2.6 流感疫苗 流感病毒是引起呼吸道疾病的主要病原体，临床一般表现为轻症，即急性起病、发热、头痛等，重症病例可出现病毒性肺炎、继发细菌性肺炎甚至休克。目前开发的重组病毒载体流感疫苗主要采用Ad和VV载体。流感病毒根据血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性分为不同的亚型，通过调整HA和NA的组合可解决预存免疫问题。 HA是流感病毒表面重要的糖蛋白，唐昕莹选择人群血清阳性率较低的灵长类动物来源的Ad载体，以HA为靶基因，插入多个流感病毒抗原表位制备的流感疫苗，通过加强免疫降低预存免疫，该品在动物实验中展现出有效的保护效果。口服疫苗可作用于黏膜免疫系统，美国Vaxart公司的口服Ad5载体H1N1疫苗VXA-A1.1在Ⅱ期临床试验中显示出有效保护率和安全性。美国Altimmune公司的Ad5载体鼻腔接种流感疫苗NasoVAX，在免疫原性最强的剂量下，可诱导体液、细胞和黏膜的广泛免疫应答，具有良好的免疫原性及安全性。韩頔等以Ad5为载体，构建了表达SARS-CoV-2 刺突蛋白和H3N2 HA的重组双价非复制型Ad5载体疫苗HAdV5-S1-2A-HA，该品在小鼠体内诱导对SARS-CoV-2和H3N2流感病毒感染的特异性体液与细胞免疫，为预防COVID-19和流感的双价疫苗研发提供了基础。将流感病毒A/Wisconsin/67/2005株的核蛋白和基质蛋白构建到MVA上获得的重组病毒载体疫苗MVA-NP+M1已进入Ⅱ期临床试验，该品可诱导良好的T细胞免疫应答。 3 展望 重组病毒载体疫苗是新型基因工程疫苗研究的热点，虽具有可诱导多种免疫、表达稳定等优点，但已上市产品仍较少，主要是预存免疫问题，包括单一病毒载体疫苗应用于多次免疫接种程序或人群中高流行性病毒（如Ad）产生的预存免疫；为降低预存免疫，采用多样化病毒载体疫苗序贯接种时，诱发非特异性免疫；载体中插入大容量外源基因时，可能存在构建效率低、脱靶、耗时长等问题。未来开发病毒载体疫苗要突破的关键技术包括：联合基因编辑和同源重组等新技术，构建多样化、可容纳大容量外源基因的DNA病毒载体；利用反向遗传学技术等，拯救重组病毒构建多样化RNA病毒载体；形成较为全面的安全、高效表达的病毒载体库；采用免疫组学等新型免疫评价技术，发现并鉴定更有效的免疫原及作用靶点，进一步降低预存免疫问题。建立病毒载体疫苗研发平台，可快速响应新突发传染病，开发应对多领域各类疾病的治疗性疫苗，对保障人民健康、促进生命科学技术发展具有十分重要的意义。 作者 邢思熙1,2  许方婧伟1,2  张云涛1,2 1中国生物技术股份有限公司科研管理部，北京  100024；2新突发传染病新型疫苗研发全国重点实验室，北京  100024 通信作者：张云涛， Email：zhangyuntao@sinopharm.com 引用本文：邢思熙, 许方婧伟, 张云涛. 重组病毒载体疫苗的研究新进展[J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(5): 318-324.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20231205-00021 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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