influenza A subtype H3N2 infection

2021年8月3日，赛诺菲宣布与临床阶段mRNA治疗药物公司Translate Bio（纳斯达克股票代码：TBIO）达成了一项最终协议（definitive agreement），赛诺菲将以每股38美元收购Translate Bio的所有已发行股票，总计约32亿美元。这个价格较Translate Bio过去60天的每股成交量加权平均价格溢价56%。 值得一提的是，尽管在早期管道中布局了治疗囊性纤维化和其他罕见肺部疾病的潜在药物，但Translate Bio在被收购时尚未在市场上推出任何药物。彼时，Translate Bio使用其mRNA平台的临床阶段肺产品正在I/II期临床试验中作为囊性纤维化的吸入治疗进行试验，并正在研究肝脏疾病和肿瘤学等领域。   创始团队“退出”经验丰富， 更名两年后顺利IPO Translate Bio成立于2011年，坐落于美国马萨诸塞州剑桥，创立初期仅对外透露公司正在开发一个技术平台，以实现目标基因的选择性激活。2016年11月，团队以RaNA Therapeutics的名义正式注册成立，并于2017年6月更名为Translate Bio，其利用专有的MRTT™平台为2016年收购Shire所得，用于开发mRNA疗法的候选产品。 与大多数初创公司的发展路线相同，Translate Bio在2012年收获了第一桶金。随即在更名后一跃完成超5000万美元的C轮融资。 Translate Bio的创始人Ankit Mahadevia博士身兼数职，是一位企业家、演讲者和作家，Translate Bio可能只是其众多创业项目中的一员。当前， Mahadevia担任Spero Therapeutics兼董事长，此前他也担任该公司首席执行官一段时间，且是其联合创始人之一。在加入Spero 之前，他是Atlas Venture的风险投资合伙人。他与合作伙伴共同创立了九家治疗公司，包括 Nimbus Therapeutics、Arteaus Therapeutics（被礼来收购）和Translate Bio。此外，Mahadevia也曾担任其中多家公司的首席执行官，包括Rodin Therapeutics（被Alkermes 收购）。在加入 Atlas 之前，他曾在Arcion Therapeutics、基因泰克、Vanda Pharmaceuticals、麦肯锡和Monitor Group工作。他的职业生涯始于医疗保健政策，曾在美国参议院卫生、教育、劳工和养老金委员会以及政府问责局任职。 Translate Bio的重要投资人之一Jean-François Formela有着和Mahadevia相似的经历。他于1993年加入Atlas Venture，并成为其合伙人，打造美国生命科学特许经营权。同时，Formela是IFM Therapeutics、Intellia Therapeutics（纳斯达克股票代码：NTLA）和Triplet Therapeutics的董事兼联合创始人。此外，他还担任Ikena Oncology（纳斯达克股票代码：IKNA）和Scorpion Therapeutics的董事会成员。Formela之前领导投资过Arteaus Therapeutics（被礼来收购）、CoStim Pharmaceuticals（被诺华收购）和Exelixis（纳斯达克股票代码：EXEL）。Formela曾获得巴黎大学医学院医学博士学位和哥伦比亚大学工商管理硕士学位。 两位拥有丰富退出经验的管理层将目光投向mRNA技术，并将囊性纤维化药物以及治疗罕见肝病的MRT5201作为早期发力的重点。 2018年成为Translate Bio发展的关键一年。4月12日，FDA批准该公司启动MRT5005药物治疗囊性纤维化患者的首个人类临床试验。MRT5005是一种治疗囊性纤维化根本病因的mRNA候选产品，旨在通过雾化向肺上皮细胞输送编码全功能囊性纤维化跨膜传导调节因子蛋白质的mRNA。 随后，Translate Bio向美国证监会提交了规模达1.15亿美元的IPO申请，并以TBIO股份代码在纳斯达克上市。 就在同一年，Translate Bio与赛诺菲宣布达成了一项多年研发合作以及最多针对5类传染病开发mRNA疫苗的独家授权协议，根据协议，双方将在最初的三年研究期内共同开展研发活动，研发项目包含5种疫苗。赛诺菲将向Translate Bio支付4500万美元的预付款，Translate Bio可获得最高8.05亿美元的各种疫苗里程碑付款，还可获得分级特许权利金。赛诺菲的合作目的也非常明确：确保公司能在下一代疫苗的研发中继续保持领先地位。 至此，Translate Bio和赛诺菲的长期合作正式拉开帷幕。   市场热度起步之前， 抢滩mRNA疫苗市场 2018年的生物医药领域认为mRNA疫苗是一种创新方式，它提供的核苷酸序列可对与预防或治疗一种病原体相关的任何蛋白质进行编码。由于具备高效、快速开发的能力和降低生产和安全管理成本的潜力，mRNA疫苗可能成为传统疫苗的创新替代品。 ● MRT™技术平台，向肺部高效递送mRNA Translate Bio旗下的MRT™平台最初由Shire Human Genetic Therapies开发，后者已在2016年被Translate Bio收购，并顺势接手了MRT™，而且负责MRTTM技术研发的创始人Michael Heartlein也随着此次的收购加入了Translate Bio，并继续负责MRT™平台的优化及候选产品的研发。 ● MRT™平台生产mRNA产品的过程包括： （1）使用未修饰的碱基及进一步的序列优化合成表达目的蛋白的mRNA，如在mRNA的5’端和3’端加入非翻译区（UTR），以改善mRNA在细胞内的稳定性和翻译效率； （2）将mRNA包装入递送载体中，如将mRNA包装入脂质纳米粒（lipid nanoparticle，LNP）中。 MRT™平台的机制，图片源自Translate bio官网 其中，脂质载体可以保护mRNA免受酶促降解，且封装效率高，一些脂质在生理环境中带正电，并且可以静电涂覆带负电的mRNA，从而使递送系统能够与目标细胞膜很好地结合。脂质载体在药物递送方面至今已有60多年的发展历史，用于mRNA递送的脂质载体可分为多种类型，包括脂质体（LPs）、类脂质纳米粒子（LLPs）、固体脂质纳米粒子（SLNs）、纳米结构脂质载体（NLCs）、脂质聚合物杂化纳米粒子（LPNs）、纳米乳液、外泌体和脂蛋白颗粒（LPT）。 因此，利用MRT™平台生产的候选产品具有稳定性好、免疫原性低等优点。 首款吸入式mRNA疗法进入快速通道，多款适应症管线在研 2020年2月26日，Translate Bio基于MRT™平台的首款吸入式mRNA疗法MRT5005，获得FDA授予治疗囊性纤维化（CF）的快速通道指定。 MRT5005是Translate Bio首个临床阶段mRNA候选产品，也是第一种可递送至肺部的mRNA治疗药物，旨在通过雾化作用将编码全功能CFTR的mRNA传递到肺上皮细胞，从而解决CF的潜在病因，患者可通过手持式雾化器吸入。此外，2015年，FDA授予MRT5005用于治疗CF的孤儿药称号。 囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）是全球最常见的遗传疾病之一，影响着约7万人，病因是囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的突变，造成粘稠的黏液形成并在双肺、消化道和人体其他部位积聚，进而引起严重的呼吸道和消化道疾病以及炎症和糖尿病等其他并发症。 彼时MRT5005正在进行一项随机、双盲、安慰剂对照的I/II期临床试验。试验的主要终点将是通过雾化单次或多次递增剂量，评估MRT5005的安全性和耐受性。MRT5005在低剂量和中剂量水平下通常耐受良好; 在所有剂量水平均未报告严重不良事件（SAE）。第29天最常见的不良事件是咳嗽和头痛，所有治疗引起的不良事件（TEAE）被认为是轻度至中度。 Translate Bio由此认为MRT™平台可通过多种给药途径应用于不同适应症和目标组织，以治疗罕见和非罕见疾病，并开始推动其他管线进入临床前研究。 其中，MRT5201针对鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症（ornithine transcarboxylase deficiency，OTCD），后者是一种代谢性肝病，其发病机制在于OTC酶缺陷引起尿素循环障碍，血氨浓度升高，导致严重且不可逆的神经损伤。目前OTC的标准治疗是膳食控制，根治手段为肝移植，但存在着肝脏供体有限及手术风险较高的限制。 而MRT5201是一种编码全功能OTC酶的mRNA，通过静脉输注的方式被递送至肝脏中，进而在肝细胞产生正常的OTC酶，以治疗OTCD。 此外，公司还开发了针对其他肺部疾病，例如原发性睫状运动障碍（PCD），肺动脉高压（PAH）和特发性肺纤维化（IPF）的发现阶段程序，以及针对肝，眼和中枢神经系统疾病的候选产品。 截至2020年Translate Bio在研管线，图片源自Translate Bio官网 从合作伙伴到被收购，biotech助推MNC进入mRNA疫苗下半场 2020年3月28日，受新冠流行影响，赛诺菲公司旗下的疫苗部赛诺菲巴斯德（Sanofi Pasteur）和Translate Bio联合宣布合作开发针对COVID-19的创新mRNA疫苗。与此同时，比尔及梅琳达·盖茨基金会和诺华宣布，它们与十多家生命科学公司联合建立了新的研发组织，加速COVID-19疫苗、诊断和疗法的开发、生产、和递送。这些公司包括BD、百时美施贵宝、礼来、吉利德、葛兰素史克、默沙东、默克、辉瑞等。 在新冠流行之前就专注mRNA的Translate Bio无疑备受瞩目。就在合作协议提出3个月后，赛诺菲巴斯德与Translate Bio扩大2018年签订的合作关系，以更好地开发用于传染病的mRNA疫苗，包括COVID-19疫苗。根据新的交易条款，赛诺菲将以每股25.59美元的价格向Translate Bio支付4.25亿美元的现金，包括3亿美元的现金和1.25亿美元的私募普通股投资。此外，Translate Bio未来还有资格获得可能的里程碑和其他付款，最高可达19亿美元。除了获得疫苗的使用权外，此次扩大合作，赛诺菲还将获得Translate Bio约7.2％的股份。 这场19亿美元的豪赌让Translate Bio和赛诺菲的合作进一步加深。2021年3月，赛诺菲与Translate Bio启动针对SARS-CoV-2的mRNA候选疫苗MRT5500的1/2期临床试验。3个月后，一项受众更广的试验——mRNA疫苗预防季节性流感I期临床试验启动。值得一提的是，合作的加深让Translate Bio开发了两种使用不同脂质纳米颗粒成分的疫苗配方，分别为MRT5400和MRT5401，这两款疫苗编码了甲型H3N2（A/H3N2）流感病毒株的血凝素蛋白。 两个月后，也就是在2023年8月，赛诺菲正式收购Translate Bio。 自2020年起，辉瑞、礼来、赛诺菲、GSK、阿斯利康等知名药企都通过与Moderna、CureVac或BioNTech等mRNA药物公司合作研发的手段，涉足mRNA药物领域。从合作情况看，大多数制药企业着重布局mRNA治疗型产品，预防性疫苗以新冠疫苗、流感疫苗居多。 COVID-19关注度的消退并未给mRNA技术降温，反倒引来MNC超百亿元重注，并让流感在内的上成人RSV相关下呼吸道疾病（RSV-LRTD）和急性呼吸疾病（ARD）成为热门适应症。国内方面，阿法纳生物、嘉晨西海、圣诺医药、深信生物、石药集团、星锐医药等也纷纷布局了RSV mRNA疫苗。 而随着GSK以及高达10.5亿欧元的里程碑和版税（合人民币113.9亿）与CureVac重新拟定mRNA疫苗合作许可协议，流感mRNA疫苗的研发正步入一个全新的阶段。当前，随着包括流感在内的公共卫生话题回归大众视野，MNC以及中国生物上海生物制品研究所、嘉晨西海等本土企业纷纷入局mRNA领域，不断完善脂质体技术，致力于开发针对流感病毒新型疫苗，并有望也为全球的流感防控带来全新解法。 如果您想对接文章中提到的项目，或您的项目想被动脉网报道，或者发布融资新闻，请与我们联系；也可加入动脉网行业社群，结交更多志同道合的好友。 近 期 推 荐 声明：动脉网所刊载内容之知识产权为动脉网及相关权利人专属所有或持有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制及建立镜像等任何使用。 动脉网，未来医疗服务平台

摘要：全球范围内，季节性流感病毒的感染每年导致300万至500万例严重疾病和29万至65万例呼吸道死亡。自20世纪30年代发现流感病毒可以在受精卵中培养以来，已经开发了各种流感疫苗，包括灭活裂解型和亚单位型、重组和减毒活疫苗。然而，这些疫苗提供的保护率相当低，特别是在非常年幼的儿童和老年人中。在这篇综述中，我们描述了流感疫苗开发的历史、疫苗诱导的免疫反应以及应用的佐剂。此外，我们提出了提高所有年龄组流感疫苗有效性的未来发展方向。这包括开发一种基于对免疫系统的理解，诱导平衡的辅助性T细胞1型和2型免疫反应的流感疫苗，以及开发一种广谱流感疫苗，即使在流感病毒特有的抗原漂移和变化的情况下也能提高效果。如果能够实现安全有效的佐剂的开发，可以预见一个更光明的未来。 1.引言 流感病毒属于正黏液病毒科，其基因组由负义RNA片段组成。它们被分为A、B、C和D型，后者于2011年4月从表现出流感样症状的猪中分离出来。在人类中，主要是A型和B型引起疾病，A型比B型引起的疾病更为严重。流感A病毒根据其表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性进一步分类，共有18种HA和11种NA血清型。自20世纪70年代以来，流感B病毒仅分化为两个抗原上可区分的谱系，即山形和维多利亚谱系。目前流行的人类流感病毒主要是A/H1N1和A/H3N2以及B/山形和B/维多利亚谱系。每年，季节性流感在全球造成300万至500万例严重疾病和29万至65万例呼吸道死亡。死亡率和严重病例在65岁以上的老年人和5岁以下的儿童以及免疫抑制人群中更高。用于治疗流感的抗病毒药物包括奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦和巴洛沙韦。然而，疫苗接种被认为是控制流感最有效的方法。通过持续的抗原漂移，即表面抗原的点突变积累，流感病毒可以逃避免疫，这就是为什么每年都需要接种疫苗的原因。自20世纪40年代以来，季节性流感疫苗一直在稳步发展，目前市场上的预防性疫苗在类型（全病毒、裂解、重组和亚单位灭活，以及减毒活疫苗）和生产所用的基质（受精卵或细胞）上有所不同。 美国疾病控制和预防中心的一项疫苗有效性研究表明，尽管与流行株抗原匹配，但它们的保护率仍然很低（40%-60%）。令人关注的是，疫苗在非常年幼的儿童（6-35个月）和老年人（>65岁）中不有效地引发免疫反应，这两个年龄组更容易感染流感病毒，并且死亡率更高。因此，迫切需要为所有年龄段提供有效的流感疫苗。 2.流感疫苗的开发历史和疫苗诱导的免疫反应 2.1.流感疫苗开发的历史 流感病毒的培养方法在20世纪30年代得到发展。1933年，通过将从患者喉洗液中获得的标本通过鼻内滴入的方式，将人类流感病毒传播给雪貂。1935年，威尔逊·史密斯提出了一种在受精卵的卵黄囊膜中培养流感病毒的方法。这种方法产生的病毒浓度比以前基于从感染动物的肺部提取病毒的方法要高得多。受精卵至今仍用于生产流感疫苗。此外，自20世纪30年代中期以来，已经开发了使用细胞和培养基的培养方法。随着能够分离和培养流感病毒，流感疫苗的研究开始了。从20世纪30年代中期到40年代初，通过监测抗体产生，研究了从受精卵的羊水或感染动物器官提取物中获得的活化和甲醛灭活的流感病毒在动物和人类中的疫苗效果。发现疫苗与流行株之间的抗原匹配对于保证疫苗效力很重要，而且无论是灭活还是未灭活的病毒，浓缩疫苗比未浓缩疫苗更有效。1942年，在临床研究中评估了由受精卵生产的由PR8型流感A型和Lee型流感B型组成的灭活全病毒双价流感疫苗诱导的免疫反应。1943年，美国武装部队流感委员会进行的更大规模的临床研究表明，包括A型亚型PR8和Weiss株以及B型Lee株的灭活全病毒三价疫苗对流感有保护作用。通过临床试验确定了疫苗剂量，1945年，第一种灭活流感疫苗（IIV）在美国获得许可。 自20世纪40年代在受精鸡卵中开发第一种灭活全病毒疫苗以来，IIV的生产方法不断改进，20世纪50年代，使用受精卵的当前IIV生产过程得以发展。IIV包括全病毒疫苗、通过洗涤剂裂解的病毒和进一步纯化的亚单位疫苗，由表面抗原HA和NA组成。全病毒疫苗，第一种开发的IIV，即使在未预先免疫的个体中也能诱导良好的免疫反应。然而，人们对热原性和不良反应感到担忧。为了克服这些问题，20世纪60年代，通过用乙醚或洗涤剂处理病毒，开发了裂解病毒疫苗，使它们对儿童安全。20世纪70年代，主要基于HA和NA的纯化亚单位流感疫苗得到了发展，进一步提高了安全性并减少了反应原性。 自20世纪30年代以来，通过在雪貂和小鼠或受精卵中连续传代制备的减毒活流感疫苗（LAIV）也得到了研究。这些宿主范围变异疫苗可以保护人类免受流感侵害，而不会引起流感症状。然而，它们有一些缺点，包括低病毒滴度和在保持恒定的减毒和抗原性水平方面的困难。20世纪60年代，采用了一种新的方法，通过在受精卵中连续低温传代来减毒流感病毒，产生了冷适应的、温度敏感的变异株。由于冷适应的温度敏感流感病毒在较低温度下复制得最好，病毒复制在鼻腔而不是在呼吸道进行。这些病毒比以前的减毒方法更安全，并能诱导免疫反应。因此，它们作为LAIV的供体病毒得到了进一步发展。 作为RNA病毒，流感病毒缺乏校对活性，因此遗传上不稳定；因此，抗原突变发生的频率很高。为了提高流感疫苗的保护率，准确预测将流行的流感病毒并生产含有这些毒株的疫苗是很重要的。为此，世界卫生组织（WHO）的全球流感监测和应对系统自1952年以来一直在进行全球流感监测，基于监测结果，WHO每年都会宣布北半球（2月）和南半球（9月）的推荐流感病毒疫苗成分。 最初，世界卫生组织推荐了三种流感病毒株，包括A/H1N1、A/H3N2以及B/维多利亚或B/山形谱系中的任一种，用于三价疫苗；然而，由于两个B谱系的共同循环频率很高，现在建议在四价流感疫苗中同时包含B/维多利亚和B/山形谱系。然而，由于灭活疫苗和减毒活疫苗是使用推荐的候选病毒生产的，如果预测不准确，它们将因抗原不匹配而无效。因此，正在积极研究广谱或通用流感疫苗。这些疫苗类型针对流感病毒的保守区域，如HA的茎部、M2e、M1或核蛋白，而不是免疫显性的、可变的和特定于毒株的HA球形头部（图1）。这些疫苗是通过使用病毒载体、DNA载体、类病毒颗粒（VLP）、纳米颗粒或直接刺激T细胞的肽制备的。其中，纳米颗粒和VLP平台在完成2020年的III期临床试验（NCT04120194、NCT03301051和NCT03739112）时显示出最明显的效果。纳米颗粒（Novavax）和VLP流感疫苗（Medicago）均显示出诱导交叉反应抗体和T细胞反应的结果。 图1 广谱或通用流感疫苗的靶标。广谱或通用流感疫苗针对能够引发广泛交叉免疫反应的抗原。由HA茎部和M2离子通道（M2e）的外域诱导的抗体，这些是高度保守的区域，可以介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。针对HA茎部的抗体具有中和作用；而针对M2e的抗体则没有。M1和NP蛋白拥有保守区域，并且是内部蛋白。因此，它们主要诱导细胞毒性T细胞反应。 2.2.流感疫苗生产的基质 尽管使用受精卵的传统方法仍然在全球范围内主要使用，但它有显著的缺点。基于鸡蛋的疫苗可能会引起对白蛋白的过敏反应，当对受精卵的需求突然增加时，例如在大流行期间，供应可能不足，妨碍及时生产疫苗。最重要的是，特别是在H3N2的情况下，连续在受精卵中传代病毒可能导致抗原位点的鸡蛋适应性突变，从而导致抗原性改变，从而降低疫苗的有效性。为了克服这些缺点，开发了基于细胞培养的疫苗生产技术。使用的细胞系包括Solvay和Seqirus（前身为Novartis）的Madin-Darby犬肾（MDCK）、Sanofi Pasteur（前身为Crucell）的PER.C6、Baxter的Vero以及Protein Science（重组HA）和Novavax（VLP疫苗）的Sf9昆虫细胞与杆状病毒载体相结合。因此，流感疫苗的开发正逐渐从传统的基于鸡蛋的平台转向细胞培养（图2），尽管需要努力提高后者的产量并降低生产成本。 图2 流感疫苗基质从受精卵到细胞的演变。在20世纪30年代，开发了在受精卵中培养流感病毒的方法，直到20世纪50年代，使用受精卵制造流感疫苗的方法不断得到发展。自从20世纪50年代末建立了MDCK细胞系以来，揭示了流感病毒可以在各种细胞如MDCK和Vero细胞中培养的事实，并且逐渐地，制造流感疫苗的基质开始从受精卵转向细胞。MDCK，即Madin-Darby犬肾细胞系。 2.3.FDA批准的流感疫苗及其触发的免疫反应 疫苗触发的免疫反应根据接种物是灭活抗原还是活病毒而有所不同。在灭活病毒疫苗的情况下，通过吞噬作用被抗原呈递细胞（APCs），如树突细胞，吞噬的灭活细胞外抗原。然后在APCs的溶酶体中将抗原降解为肽段，肽段通过主要组织相容性复合体（MHC）II分子呈现在APCs表面。MHC II-抗原复合物被T辅助（Th）细胞识别，也称为CD4+ T细胞，这导致未激活的Th细胞激活。激活的Th细胞进一步分化为T辅助1（Th1）细胞、Th2细胞、Th17细胞、滤泡Th（Tfh）细胞、诱导性调节性T细胞（iTregs）等。 在各种CD4+效应T细胞亚群中，Th1、Th2和Th17细胞在防御病原体方面发挥主要作用。Th1细胞诱导细胞介导的免疫反应，分泌IFN-γ和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），激活巨噬细胞和中性粒细胞，通过增加吞噬作用和炎症来消除细胞内病原体。Th2细胞诱导体液免疫反应，主要分泌IL-4、IL-5和IL-13。最后，Th17细胞分泌IL-17和IL-22，这是促炎细胞因子，以及IL-21，从而刺激对细胞外病原体和真菌的免疫反应。 相比之下，活病毒或减毒活病毒疫苗感染细胞并在感染细胞的细胞质中产生病毒蛋白。病毒蛋白被蛋白酶体降解为肽段，肽段与MHC I分子复合物呈现在感染细胞表面。MHC I-抗原复合物被CD8+ T细胞识别，随后在其他信号和Th细胞帮助下分化为细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。树突细胞不易被病毒感染，但通过交叉呈递在激活CD8+ T细胞中发挥重要作用。在这一途径中，被病毒感染的细胞被树突细胞吞噬，导致病毒抗原在树突细胞的细胞质中释放。从蛋白酶体降解到呈递的后续过程与上述MHC I途径相同。当CTLs识别感染细胞上的MHC I-抗原复合物时，它们释放细胞毒素蛋白、穿孔素和颗粒酶，这些蛋白进入感染细胞并诱导凋亡。CTLs还可以通过CTLs上表达的Fas配体与目标细胞上表达的Fas的相互作用来杀死感染细胞。FDA批准了各种类型的流感疫苗（表1），它们引起不同的免疫反应。根据免疫反应诱导机制，流感疫苗大致分为IIVs和LAIVs，IIVs进一步分为全病毒、裂解和亚单位类型。 由于IIVs的活性物质是三个（三价IIVs）或四个（四价IIVs）灭活抗原，接种的抗原主要通过MHC II途径呈现在APCs表面，因此将主要刺激CD4+ T细胞；然而，IIV接种后的免疫反应尚未完全了解。如上所述，CD4+ T细胞可以分化为几种亚型，但IIV主要刺激Th2免疫反应，诱导体液免疫反应而不是细胞免疫反应。IIV诱导的血凝抑制滴度与流感特异性抗体相关，在成人中提供50%的流感感染保护率。然而，IIV不有效地诱导粘膜免疫和细胞免疫，这在呼吸道病毒感染中起着重要作用。与IIV不同，LAIVs通过鼻内途径给药。它们感染上呼吸道的细胞，并通过MHC I途径更有效地处理，从而诱导粘膜免疫和细胞免疫。此外，LAIVs在CD4+ T细胞的情况下很好地激活Th1免疫反应。尽管LAIV可以被认为是流感的理想疫苗类型，因为它诱导平衡的Th1/Th2免疫反应，但它存在安全问题，不能在非常年幼的儿童和免疫受损的个体中给药。此外，由于禽流感病毒在人类上呼吸道的嗜性大于下呼吸道，因此不易开发针对禽流感病毒的LAIVs。 3.流感疫苗佐剂开发的现状 3.1.流感疫苗佐剂的必要性 佐剂是增强疫苗免疫反应的制剂，通过每剂使用较低量的抗原，诱导更高的抗体产生和更持久的保护，从而减少疫苗生产的负担。 与季节性流感病毒不同，引起大流行的流感病毒是新的重配或变体病毒，人类对其没有预先存在的抗体，因此导致更高的死亡率。非佐剂化的H5N1和H7N9大流行流感疫苗诱导的免疫反应较弱，可能是因为大多数人对这些亚型没有预先存在的免疫力，并且大流行疫苗不是每年接种。因此，大流行流感疫苗通常使用佐剂，特别是因为它们可以改善因慢性病、肥胖、HIV感染或移植治疗而免疫功能低下的个体的免疫反应。此外，与未添加佐剂的IIV不同，添加佐剂的IIV可以提供平衡的Th1/Th2免疫反应和粘膜免疫，从而保护免受流感感染。 3.2.批准的流感疫苗佐剂的免疫机制 目前流感疫苗中使用的佐剂包括磷酸铝（AlPO4）凝胶、氢氧化铝（Al[OH]3）、AS03和MF59。最古老和最常用的佐剂是AlPO4和Al(OH)3，通常称为铝佐剂（尽管严格来说，铝佐剂指的是硫酸钾铝钾[KAl[SO4]2]）。含有MF59或AS03的流感疫苗是比铝佐剂更晚开发的油包水乳液佐剂，分别在1997年和2009年获得批准。这些佐剂比铝佐剂在IIVs中更有效。美国FDA批准的三种H5N1大流行流感疫苗中有三种含有AS03或MF59佐剂。第三种疫苗不含佐剂，但含有比含佐剂疫苗多12-24倍的HA（表2）。FDA批准的含MF59的佐剂化季节性流感亚单位疫苗（Seqirus，FluAd®）旨在用于老年人（>65岁），他们的免疫反应比年轻成人差（表2）。 尽管铝佐剂长期以来一直被广泛用作佐剂，但其机制仍然未知。最初，人们认为铝佐剂通过所谓的抗原储存效应，通过缓慢且持续地将抗原暴露给APCs来增强免疫反应。然而，最近的研究表明，铝佐剂还可以招募包括中性粒细胞和单核细胞在内的各种类型的先天免疫细胞到注射部位，从而激活先天免疫反应。有关细胞和分子机制的研究报告称，铝佐剂通过APCs吞噬铝佐剂导致的吞噬体不稳定化，触发NLRP3炎症体的激活，从而分泌促炎细胞因子IL-1β。此外，铝佐剂在注射部位引起坏死，导致损伤相关分子模式的释放，如尿酸和DNA，这些分子激活NLRP3炎症体。铝佐剂可以通过前列腺素E2的产生增强免疫反应，前列腺素E2参与诱导Th2免疫反应，通过ITAM-Syk-PI3Kδ信号传导。这些结果表明，铝佐剂诱导Th2反应而不是Th1反应。 MF59是一种由角鲨烯和两种表面活性剂聚山梨醇酯80（Tween 80）和山梨醇三油酸酯（Span 85）组成的油包水佐剂。自1997年首次在欧洲流感疫苗中应用以来，进行了大量的研究以阐明其免疫增强机制。MF59没有储存效应，这一发现表明，即使在抗原注射前24小时至注射后1小时内注射，它也显示出佐剂效应。相反，MF59在注射部位激活单核细胞、巨噬细胞和粒细胞，导致趋化因子的分泌，随后是免疫细胞的招募，增加抗原摄取，单核细胞分化为未成熟树突细胞，以及增强抗原运输到引流淋巴结。MF59诱导的单核细胞分化为未成熟树突细胞有助于它们迁移到引流淋巴结，在那里它们刺激T细胞和B细胞，从而增强适应性免疫反应，对接种的疫苗抗原产生平衡的Th1/Th2反应。此外，MF59佐剂化的抗原在免疫小鼠的淋巴结的各种细胞上呈现，包括B细胞、单核细胞和中性粒细胞，而铝佐剂化的抗原只在树突细胞上呈现，表明MF59在增强免疫反应方面比铝佐剂更有效。MF59导致注射部位的肌肉细胞释放ATP，并通过MyD88发挥其佐剂功能。在动物模型中，局部施用apyrase水解ATP导致对MF59佐剂化的三价IIV的T细胞反应和血凝抑制滴度降低。因此，ATP在MF59佐剂功能中起着重要作用；然而，确切的信号传导途径需要进一步研究。 AS03是一种由聚山梨醇酯80（Tween 80）和两种可生物降解的油，角鲨烯和α-生育酚组成的油包水佐剂，α-生育酚是维生素E的最可利用形式。饮食中的维生素E补充具有免疫刺激作用。因此，α-生育酚表现出类似佐剂的功能，而MF59组分本身并不具有佐剂效应。在小鼠中进行的研究表明，当抗原与缺乏α-生育酚的AS03一起施用时，免疫反应减弱。与MF59不同，AS03需要与抗原在空间和时间上共定位才能作为佐剂发挥作用。与MF59类似，AS03促进免疫细胞招募到注射部位，以及抗原摄取和运输到引流淋巴结。具体来说，AS03在局部和短暂地增加NF-κB，并增强细胞因子释放和免疫细胞招募。随后，激活的抗原负载的APCs在引流淋巴结中激活CD4+ T细胞，这些细胞直接刺激抗原特异性B细胞。因此，AS03通过诱导大量记忆B细胞和抗体分泌浆细胞来加强免疫反应。 3.3.流感疫苗佐剂的开发现状 佐剂在全球范围内被广泛研究。下面，我们讨论了除铝佐剂、MF59和AS03之外，已经进入临床试验的流感疫苗佐剂的机制和免疫反应，包括TLR配体、细胞因子以及微乳液和纳米乳液。此外，还有一些免疫刺激剂，其作用机制尚不完全清楚。在这些研究中，TLR激动剂和配方是最被研究的（表3）。 TLR通过识别病原体相关分子模式来刺激先天免疫反应。根据其定位，它们被分类为细胞表面TLR和细胞内TLR。细胞表面TLR，包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，主要识别来自微生物膜的成分。细胞内的TLR，定位在内体中，包括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，识别自身和非自身核酸。鉴于各种TLR可以识别独特的配体，几种TLR激动剂作为佐剂正在进行临床试验。TLR4激动剂AS01和AS04已获得许可，而其他TLR4激动剂，包括葡萄糖基脂质佐剂、单磷酸脂质（MPLA）和LPS，正在积极研究中。此外，dsRNA、flagellin、imiquimod和CpG分别作为TLR3、TRL5、TLR7和TLR9激动剂正在开发中。 MF59和AS03等乳液颗粒有时与其他物质如皂苷、DNA和MPLA结合。具有不同成分和比例的各种乳液型佐剂正在进行临床试验。其他颗粒类型，如病毒体或VLP，也可能具有佐剂功能。一些作用机制尚不清楚的免疫刺激剂也在研究中。细胞因子在小鼠中刺激Th1免疫反应和B淋巴细胞分化，但在I期临床试验中未显示出佐剂效应。因此，开发一个能够准确预测佐剂效应的非临床系统非常重要。在最近的一项研究中，一种与单链RNA佐剂配制的IIV诱导了对异源流感病毒感染和粘膜免疫反应的交叉保护。其详细机制和安全性方面还有待研究。 4.流感疫苗开发的发展方向 4.1.流感疫苗的现状和相关不良事件 目前市场上的流感疫苗可以用于非常年幼的儿童（≥6个月大），尽管每种产品的推荐接种年龄不同，而且它们大多数是灭活疫苗。它们主要诱导Th2免疫反应，并导致对接种的流感病毒株产生特异性抗体，从而提供免疫保护。然而，过去十年调查的流感疫苗的有效性并不高，平均保护率为42%（范围，19%-60%），并且在幼儿和老年人中通常更低。 为了克服幼儿和老年人的低抗体产生率，疫苗制造商已经将儿童（≥6个月大；Flulaval Trivalent/Quadrivalent, Fluarix Quadrivalent, Fluzone Quadrivalent）的季节性流感疫苗的标准HA抗原含量提高了两倍，老年人（≥65岁；Fluzone High-Dose）提高了四倍，或者使用了佐剂（仅适用于老年人；FLUAD）。这些产品已获得FDA许可，并且已经证明了改进的效力或有效性。然而，增加抗原生产的需要可能会给制造商带来负担，特别是在大流行等紧急情况下。 或者，如前所述，可以通过接种LAIV而不是IIV来增强对流感疫苗的免疫反应，或者采用新策略，例如使用皮内途径而不是注射（Sanofi Pasteur的Fluzone® Intradermal流感疫苗），因为皮肤富含APCs。尽管是相同的IIV，皮内途径与肌肉注射途径相比，使用更少的HA抗原（每株9微克）诱导了非劣的保护性免疫反应。然而，使用这些方法的FDA许可产品也尚未适用于幼儿或老年人。LAIV FluMist适用于2-49岁的人群，而Fluzone intradermal是皮内注射的，适用于18-64岁的人群。 与流感疫苗相关的不良事件从轻微症状，如注射部位的红斑、头痛、发烧、恶心和肌肉痛，到不寻常的事件，如严重过敏反应、格林-巴利综合征和眼呼吸道综合征。大多数与流感疫苗相关的不良事件都是轻微的，容易恢复。然而，针对2009年H1N1流感大流行的Pandemrix疫苗被认为与嗜睡症有关，这种由Pandemrix引起的嗜睡症与自身免疫疾病有关，但机制仍然未知。 4.2.流感疫苗开发的发展方向 对于流感疫苗，血清保护、血清转换和几何平均滴度比是考虑作为商业产品获得批准的标准。在评估疫苗的有效性时，重点是Th2免疫反应，而不是Th1免疫反应。然而，Th1和粘膜免疫反应在防御呼吸道病毒（如流感病毒）方面也起着重要作用。因此，一种在所有年龄组，包括婴儿和老年人中诱导平衡的Th1/Th2免疫反应的流感疫苗，包括细胞介导和抗体反应以及涉及分泌型IgA的粘膜免疫反应，可以显著降低流感的死亡率和发病率。 如前所述，已经尝试使用各种平台（包括病毒载体、DNA载体、VLP或肽疫苗）来提高流感疫苗的效力，这些平台预计将克服当前流感疫苗的局限性，例如通过诱导更强的Th1反应和记忆反应。此外，考虑到流感疫苗株的抗原性几乎每年都会变化，并且由于抗原转移和漂移，各种流感亚型都可能引起爆发，因此正在积极研究通用流感疫苗。一种候选疫苗，包含来自流感A和B的九个保守表位的重组蛋白M-001，目前正在进行III期临床试验，预计将在2020年12月完成。基于mRNA的疫苗在SARS-CoV-2大流行期间证明了它们的潜力；因此，它们也值得考虑用于流感大流行。基于mRNA的流感病毒疫苗在小鼠中显示出保护效果，在人类临床试验中显示出免疫原性反应和安全性，并通过诱导流感病毒HA茎部特异性抗体产生交叉保护效果。AS03和MF59等佐剂已经应用于流感疫苗。然而，由于流感疫苗每年接种，因此应该大力开发新的佐剂，这些佐剂具有良好的安全性，适用于重复接种和效力，如基于RNA的佐剂。这些佐剂容易降解，如TLR3或TLR7/8配体，并且与其他在体内长时间停留的佐剂相比相对安全。 5.结论 流感疫苗相当复杂。它们根据疫苗类型（如IIV与LAIV）、接种年龄以及诱导免疫反应的机制不同而诱导不同的免疫反应，这些机制尚未完全阐明。大多数许可的疫苗主要诱导Th2型免疫反应，在幼儿和老年人中诱导的免疫反应比成人弱。因此，需要努力开发能够诱导更强大和更平衡的Th1/Th2免疫反应的流感疫苗，这基于我们对随年龄变化的免疫系统的理解。 目前对流感疫苗的批准标准，侧重于Th2反应，将需要相应修改，以包括确认T细胞介导的保护。通过使用佐剂也可以实现更好的免疫反应，因此，应该开发更安全、更有效的佐剂。最后，用于预测疫苗和佐剂免疫反应的有效和可靠的工具将极大地有助于提高对流感病毒感染的保护率，不仅在成人中，而且在幼儿和老年人中也是如此。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：流感仍然是主要的公共卫生问题之一，因为它每年都会流行，并有可能引发全球大流行。包括疫苗和抗病毒治疗在内的多种对策正在用于对抗季节性流感感染；然而，由于抗病毒药物的持续抗药性以及与其他疫苗相比流感疫苗相对较低且不可预测的效率，它们的有效性一直受到讨论。对疫苗作为预防和控制流感的有前途方法的兴趣日益增加，可能会提供具有潜在提高效率的替代疫苗开发选项。除了市场上现有的灭活、减毒活和重组流感疫苗外，目前正在探索诸如病毒样颗粒（VLPs）和纳米颗粒等新型平台，以及新的疫苗配方。这些平台提供了设计具有改进属性的流感疫苗的机会，以最大化质量和安全性。流感疫苗的生产过程也在向前发展，涉及基于鸡蛋和细胞的生产、纯化过程，以及对物理化学属性和疫苗降解途径的研究。这些将有助于设计更稳定、优化的疫苗配方，指导当代分析测试方法和通过实施该领域最新进展的实现。 1.流感病毒及其亚型 流感病毒是正黏液病毒科的一种包膜病毒。感染脊椎动物的流感病毒有四个属：A型、B型、C型和D型，它们根据基质蛋白和核蛋白的抗原差异进行区分。A型是迄今为止最有毒的病毒，可导致严重的呼吸道疾病或死亡。它甚至可能导致新的流感流行病和全球大流行。B型流感病毒也会导致人类的季节性流感流行。有两种流行的B型流感病毒谱系，即B/Yamagata和B/Victoria，它们包含在季节性流感疫苗中。与此同时，C型流感病毒通常引起轻微症状，并不已知引起流行病，而D型流感病毒已被确认感染猪、牛和羊，并未被识别为在人类中引起疾病。病毒携带一个负义、单链RNA(ssRNA)基因组，分为八个（A型、B型）或七个（C型、D型）独立的片段。在透射电子显微镜(TEM)下，A型和B型流感病毒在形态上无法区分（图1）。 图1.(A) 流感病毒的透射电子显微镜图像，主要呈球形，粒径约为100-150纳米；(B) 流感A型病毒的示意图，表示病毒组分，包括表面糖蛋白HA和NA，M1和M2蛋白，非结构蛋白和核蛋白。 它们具有直径约100纳米的球形或丝状形态，球形结构的直径通常超过300纳米，丝状形态的长度通常超过300纳米。A型流感病毒颗粒表面覆盖有病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。每个平均大小为120纳米的病毒颗粒在其脂质膜上有大约300-400个HA和40-50个NA，尽管不同亚型之间的每种蛋白的数量各不相同。这两种糖蛋白成为进一步细分A型流感病毒的基础。迄今为止，已鉴定出18种HA亚型和11种NA亚型。H1-3和N1,2株（例如A/H1N1和A/H3N2）主要感染人类，目前作为季节性流感株在人类中流行。也有记录显示，其他亚型如高致病性H5N1也会导致家禽爆发和人类感染。 病毒膜上存在少量的基质离子通道蛋白(M2)，其比例大约是每10-100个HA分子一个M2。脂质包膜及其三种蛋白(HA、NA和M2)包裹着称为M1的基质蛋白，它环绕着病毒核心。病毒内部含有非结构蛋白2(NS2)和核糖核蛋白(RNP)复合体，该复合体由RNA片段和核蛋白(NP)层叠构成，RNA依赖的RNA聚合酶由两个聚合酶基础亚基(PB1和PB2)和一个聚合酶酸性蛋白(PA)亚基组成。 流感B型病毒的结构配置几乎与四种膜蛋白相同：HA、NA，以及代替M2的NB和BM2在B型病毒中发现。流感C型和D型病毒在结构上与A型和B型病毒明显不同，它们只有一种主要的表面糖蛋白，即HA酯酶融合糖蛋白，其功能类似于A型和B型病毒的HA和NA。流感C型和D型病毒颗粒有多种形态：它们呈椭圆形或球形，直径为80-120纳米，或呈丝状，直径相似，但长度在微米范围内。2.流感病毒生命周期 流感病毒的复制周期经历了几个阶段，如图2所示，如下：(1)病毒附着在唾液酸受体上，(2)病毒进入宿主细胞，(3)病毒颗粒的融合和解壳，(4)vRNPs进入细胞核，随后病毒RNA基因组的转录和复制，然后vRNPs从细胞核中导出，(5)病毒组分的组装和在宿主细胞膜上的出芽，最后(6)新病毒颗粒从宿主细胞中释放。 图2.流感A型病毒的生命周期：(1) 病毒通过HA附着在唾液酸受体上；(2) 病毒通过内吞作用进入宿主细胞；(3) 病毒颗粒的融合和解壳；(4) vRNPs进入细胞核，随后病毒RNA基因组的转录和复制，然后vRNPs从细胞核中导出；(5) 病毒组分的组装和在宿主细胞膜上的出芽；(6) 新病毒颗粒从宿主细胞中释放。 (1) 病毒附着在唾液酸受体上：病毒感染的第一阶段是HA附着在宿主细胞膜表面的唾液酸上。唾液酸通过糖苷键与HA的碳水化合物相连。有两种连接对于HA的特异性至关重要；(i) a(2, 3)连接在禽类的消化道或人类、猴、马的支气管组织中丰富，以及猪的上呼吸道肺上皮，(ii) a(2, 6)连接在人类上呼吸道细胞表面以及蝙蝠和猪的气管中发现。 (2) 病毒进入宿主细胞：病毒结合后发生受体介导的内吞作用，病毒以内体形式进入宿主细胞。 (3) 病毒颗粒的融合和解壳：内体的酸性pH值（pH 5-6）导致病毒和内体膜融合，并打开M2离子通道蛋白，使核酸酸化，从而允许vRNP从M1中释放出来，进入宿主细胞的细胞质，然后进入细胞核。 (4) vRNPs进入细胞核后的转录和复制：构成vRNP（NP、PA、PB1和PB2）的病毒蛋白检测到可以附着在细胞核输入机制上的核定位信号，因此进入细胞核进行转录和复制过程。负义RNA首先被转化为正义RNA，并作为生成病毒RNA的模板，随后由病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）启动内部RNA合成。通过其C末端结构域，RdRp与RNA聚合酶II（Pol II）的大亚基相关联，继续转录以产生成熟的mRNA。然后vRNPs通过核孔从病毒核心中导出。 (5) 病毒组分的组装和出芽：病毒的蛋白组分，即HA、NA和M2，被运输到膜的顶部区域，病毒颗粒从极性上皮细胞中出芽。 (6) 新病毒颗粒从宿主细胞中释放：在形成病毒颗粒后，由NA切割糖蛋白和糖脂上的唾液酸残基，使新合成的病毒颗粒能够从宿主膜上释放并传播到附近的细胞。3.流感病毒的HA和NA HA和NA是主要的跨膜糖蛋白，HA大约占病毒表面的80%。这两种糖蛋白识别宿主细胞的同一分子，即唾液酸(SA)。除了病毒的感染力和传播力外，这两种蛋白还与病毒的毒力特性、宿主特异性和对抗病毒治疗的抗性有关。HA和NA结构的带状图示于图3中展示。 图3.1918年人类HA（蛋白质数据银行(PDB) ID: 1RUZ）和2009年H1N1 NA与奥司他韦(PDB ID: 3TI6)复合物的带状图，其受体结合位点以蓝色圆圈显示。(A) HA单体；(B) NA单体；(C) 三聚体HA和(D) 四聚体NA从顶部显示。 HA由三个不可区分的亚基（同源三聚体）组成，附着在病毒脂膜上，每个单体都拥有一个包含受体结合域的球形头部，以及一个杆状区域（图3A）。这种蛋白负责病毒与其目标细胞的初次接触，这些细胞含有末端唾液酸残基。此外，HA通过内吞作用促进病毒进入宿主细胞，从而将核蛋白送入细胞质。HA作为流感病毒上的主要抗原，成为抗体中和的主要靶标。 NA（图3B）是一种四聚体蛋白，由四个相同的多肽组成，包括一个球形头部、一个细胞质尾部、一个跨膜域和一个杆状区域。它是一种酶，通过催化从一系列糖缀合物（如糖蛋白和糖脂）中切割末端α-(2,3或2,6)-酮苷键唾液酸，破坏HA所识别的受体，因此在病毒复制周期中发挥着至关重要的作用。NA作为一种生物学剪刀，切割HA和细胞表面糖苷的唾液酸残基，促进病毒进入期间病毒的运动，以及从新合成的病毒颗粒的表面糖蛋白上切割，从而允许病毒从宿主细胞中释放并继续感染其他细胞。 流感病毒完全依赖于HA和NA的平衡作用来建立有效的感染。在初次感染期间，受体结合亲和力的增加似乎也需要增加病毒NA的受体破坏活性。另一方面，在感染的后期，增强的受体结合是一个严重的不利因素，因为它会阻止新病毒颗粒从宿主细胞中释放。 4.HA和NA的糖基化 在流感病毒的复制周期中，由于复制过程的错误，病毒基因可能发生小的变化，这可能导致抗原漂移（病毒基因的小变化或突变，可能导致HA或NA的变化）。除了氨基酸序列的改变，抗原漂移通常还涉及病毒糖蛋白的糖基化模式的变化。HA和NA都具有N-糖基化潜在区域，通过N-糖苷键将寡糖链添加到存在于Asn-AA-Ser/Thr序列中的Asn残基上，其中AA可以代表除脯氨酸以外的所有氨基酸。这种附加是在内质网（ER）中存在的糖基转移酶和寡糖转移酶酶的帮助下发生的，随后在通过ER和高尔基体转移过程中，通过甘露糖苷酶和糖苷酶对寡糖进行结构改变。这种翻译后修饰对流感病毒生命周期至关重要，它影响生物合成、结构稳定性和糖蛋白功能。 HA的糖基化位点位于杆状区域，有助于HA的分子稳定性、其受体结合和宿主的免疫反应。先前的研究还表明，HA球形头部的糖基化可能暴露或保护抗原位点，使病毒能够逃避中和抗体。自1977年以来，四种季节性人类流感病毒株，两个A型亚型（A/H1N1和A/H3N2）和两个B型谱系（B/Victoria和B/Yamagata）已在全球范围内传播。图4展示了A/H1N1和A/H3N2株从1918年到2018年的糖基化模式的演变，即它们首次引入人类和当前流行的模式。1918年大流行A/H1N1和1968年A/H3N2流感病毒的HA杆状区域的糖基化已知是高度保守的。1918年A/H1N1在残基27、28、40、304、498和557处拥有六个保守的N-糖基化（NLG）位点（图4A），而1968年A/H3N2在残基24、38、54、301和499处有五个糖基化位点（图4B）。另一方面，HA的球形头部多年来经历了随后的糖苷增加和丢失。A/H3N2 HA球形头部的NLG位点数量从1968年最初的两个（位于残基97和181）增加到2018年季节性株的八个（位于残基79、138、142、149、160、174、181和262），在1975年左右97位点消失后。同样，1918年A/H1N1在其消失于1957年之前获得了越来越多的糖苷，并在1977年重新出现直到2009年A/H1N1株取代它之前具有相同的糖基化剖面。目前流行的A/H1N1株是猪系病毒的重组结果，糖基化与非常早期的人类A/H1N1相似。与此同时，自1983年Victoria和Yamagata谱系分裂以来，流感B病毒的NLG位点一直保持在大约10-12个位点相对稳定。 图4. 1918年HA（A）和1968年HA（B）的一些NLG位点。这些NLG位点是最初确定的，而红色、绿色和黄色的NLG位点是后来获得的。粉红色圆圈代表NLG位点的演变。1918年A/H1N1最初拥有六个NLG位点，并在1977年获得了两个NLG位点，但失去了两个，而2009年A/H1N1获得了三个。当前流行的2018年A/H1N1株又失去了五个NLG位点。与此同时，1968年A/H3N2 HA球形头部的NLG位点从1968年最初的两个增加到当前2018年株的八个（随着时间的推移，NLG位点的数量和位置发生了变化）。 HA中的糖基化位点和糖苷剖面的变化影响病毒与宿主免疫系统的相互作用。逃避中和抗体的识别使病毒能够继续在人类群体中传播。因此，需要更多的研究来研究病毒糖蛋白的糖基化模式，以设计更好的针对流感病毒的疫苗。虽然已知HA的NLG有助于免疫逃逸和流感病毒的毒力，但NA的NLG如何影响其功能仍然不清楚。先前发表的研究表明，N8 NA蛋白的糖基化对正确的四聚体化是必要的。此外，NA蛋白头部结构域的糖基化对正确的成熟是必需的。在最近的一项研究中，Bao等人探讨了A/1933/WSN/H1N1（WSN）病毒NA蛋白中NLG修饰的功能。结果表明，NA蛋白的NLG修饰对其出芽至关重要。在转染细胞中，非糖基化NA蛋白失去了出芽能力。此外，NLG修饰的缺失显著降低了突变病毒的出芽和复制。在小鼠模型中，NLG在219位点的缺失显著减弱了WSN病毒。有建议称，在细胞中过表达非糖基化NA蛋白诱导了未折叠蛋白反应（UPR），这可能会影响NA蛋白的出芽能力，从而减弱突变病毒的毒力。 5.流感流行病与大流行  流感病毒可以通过感染呼吸道引起严重的传染病，可能导致住院甚至死亡。据预测，每年的季节性流感大约有300万至500万例严重疾病和29万至65万例相关呼吸道死亡。东南亚和撒哈拉以南非洲的死亡率最高，75岁及以上的老年人、五岁以下儿童以及患有长期疾病使他们更容易感染流感或其并发症的个体，是严重后果和死亡的高风险群体。 新的A型流感病毒株每2至5年不定期出现，持续3至6个月，具体取决于地区。流感流行病通常被称为流感季节，可能与天气和气候有关。病毒表面糖蛋白HA和NA内的特定突变使得病毒能够逃避宿主免疫系统，导致自然感染或接种疫苗后都无法对病毒产生持久免疫力。流感病毒抗原性的微小变化被称为抗原漂移，这是流感流行病频繁发生的基础，使得每年都有必要根据世界卫生组织的建议更新流感疫苗以匹配当前流行的毒株。 另一方面，流感大流行是由病毒抗原性的显著变化引起的，大约每10至40年发生一次；然而，它可能在任何时候发生。历史上记载，20世纪至少发生了三次大流行：1918-1919年的西班牙流感、1957-1958年的亚洲流感和1968-1969年的香港流感，各自的死亡率从毁灭性到温和不等。这些大流行病毒通过不同流感病毒株的RNA片段重组获得了新的亚型。这种遗传变化，被称为抗原转变（由两种病毒株的基因组重组引起的病毒抗原性的突然变化），允许病毒株从一个动物物种跳到另一个物种，从动物跳到人类。 1918年的大流行，也称为西班牙流感，是有史以来第一次也是最严重的流感大流行。据估计，该病毒通过感染全球约25-30%的人口，杀死了大约5000万个体，约占世界人口的2.7%。2018年Spreeuwenberg等人的更近期分析表明，早期估计过高。他们自己的估计将死亡人数定为1740万，占世界人口的0.95%。1918年大流行是由A/H1N1亚型流感病毒引起的，被认为是几乎所有人类A型流感病例的共同祖先。这不仅包括1918年H1N1病毒的抗原“漂移”后代，还包括1957年（H2N2）、1968年（H3N2）和2009年（H1N1）出现的遗传重组大流行病毒。1957年2月在中国湖南省出现的H2N2亚型流感A病毒，被认为在临床上比导致1918年大流行的H1N1病毒更温和，全球死亡率为110万。该病毒在全球传播，直到1968年H3N2出现，引起了另一次大流行。它首先在中国出现，然后迅速传播到香港。1968年大流行，也称为香港流感，相比之下是一次较温和的大流行，死亡人数约为100万。21世纪的流感大流行始于2009年初，当时一种新的猪源性流感病毒出现并取代了以前的季节性流感H1N1。最初在墨西哥发现的病毒迅速在全球传播，并在74个国家报告感染后，世卫组织于2009年6月宣布为大流行。该病毒，也称为“2009 H1N1”，是两种已存在的猪流感病毒—北美H1N2和欧亚H1N1—之间的重组产物。 过去二十年，直接从鸟类到人类的禽流感病毒传播的报告有所增加，导致禽流感A/H5N1在家禽中的持续爆发和相关的人类感染。1997年，首次在香港检测到人类感染H5N1的致命病例。六年后的2003年，该病毒作为一种高致病性禽流感病毒重新出现，在当地家禽中引起了毁灭性的爆发，引发了对潜在流感大流行的担忧。这些爆发在几个国家已成为地方病，埃及、印度尼西亚和越南的病例数量最多。2007年，有证据表明中国有限的人传人H5N1。此外，世卫组织报告称，2006年和2007年在印度尼西亚和巴基斯坦分别观察到有限的、非持续的人传人H5N1病例。2014年1月8日，加拿大报告了美洲首例H5N1感染病例，是一名从中国返回的旅行者。尽管人类感染这种病毒并不常见，但大约60%的病例导致死亡。2019年11月，世卫组织宣布自2003年以来共有861例经核实的人类禽流感A(H5N1)病例，导致455例死亡，最后一例于2019年4月30日在尼泊尔报告。 6.针对流感流行病和大流行的疫苗  有几种疫苗用于对抗流感流行病和大流行。流感疫苗每年根据当前流行株的全球监测进行重新配制。因此，每年接种疫苗仍然是预防季节性流行性感冒的最有效方法。 目前，全球使用三种类型的疫苗：灭活流感疫苗(IIV)、减毒活流感疫苗(LAIV)和重组HA疫苗（表1）。每种疫苗都有其优点和缺点。疫苗可以诱导免疫效应分子，包括体液效应分子（B淋巴细胞产生的抗体），能够特异性结合病毒抗原，以及细胞效应分子（细胞毒性CD8+ T淋巴细胞），通过杀死感染细胞来限制病毒在体内的传播。所有流感疫苗都需要每年更新，因为免疫持续时间很短，并且要匹配流行病毒的抗原性。因此，世卫组织和其他利益相关者每年两次会面，根据全球流通病毒的抗原和遗传特性以及不同国家的流行病学信息，选择最合适的流感病毒。其中一次流感疫苗组成会议针对北半球，另一次针对南半球。 多年来，含有两种流感A（H1N1和H3N2）和一种流感B病毒系的三价疫苗被配制出来，以提供对三种不同流感病毒的保护，尽管存在两种不同的B病毒系。因此，为了更广泛地保护当前流行的病毒，将第二种B病毒系添加到配方中，制成四价流感疫苗。目前批准的流感疫苗在HA数量或抗原性方面进行了定量标准化，但并非在中和抗体（NA）方面。因此，疫苗的NA含量和NA免疫原性可能差异很大。 6.1.灭活流感疫苗(IIV) 灭活病毒疫苗是全球最常用的方法，因为它的高安全性和相对较低的生产成本。因此，它在全球流感疫苗市场中占有最高的百分比。IIV适用于六个月以上的儿童，如Afluria Quadrivalent、Fluarix Quadrivalent、FluLaval Quadrivalent和Fluzone Quadrivalent；然而，一些IIV仅适用于65岁及以上的个体，如Fluad和Fluzone High-dose Quadrivalent（表1）。这种类型的疫苗通常在鸡胚或哺乳动物细胞培养中培养病毒（图5）。已经证明IIV可以诱导局部和全身免疫，尽管可能需要加强疫苗接种以维持抗体滴度。IIV有三种类型：全病毒灭活疫苗、裂解病毒灭活疫苗和亚单位灭活疫苗。 图5.流感疫苗制造过程。基于鸡蛋和基于细胞的疫苗制造都是从在鸡蛋或细胞中培养的候选疫苗病毒（CVV）开始的（步骤1）。在收获、分离、过滤和纯化之后（步骤2），病毒通常使用甲醛进行化学灭活，以制造灭活流感疫苗，或者通过化学表面活性剂破坏，以准备分裂病毒疫苗或亚单位疫苗（步骤3）。最后一步涉及填充-完成过程和包装，在冷链条件下交付和储存产品（步骤4）。重组流感疫苗不需要整个病毒的生长；只需获得HA抗原的遗传信息，并与杆状病毒结合，以便于将遗传信息（DNA）传递到宿主细胞中表达HA抗原。然后生产、收获、过滤、纯化抗原，接着制备疫苗。 6.1.1.全病毒灭活疫苗(WIV) 全病毒疫苗是最早使用的流感疫苗。然而，在接种后报告了若干系统性和局部副作用。这些不良反应可能源于疫苗中的杂质，如鸡蛋蛋白。不过，疫苗生产技术的改进已经使得疫苗更安全，杂质更少，副作用更少。在WIV中，在鸡胚中孵化和生长后，病毒颗粒主要用甲醛或β-丙内酯化学灭活，然后进行纯化（图5）。尽管这种方法是流感病毒灭活最常用的方法，但也可以采用其他方法进行病毒灭活，包括加热和辐射。 由于市场上已经出现了其他类型的疫苗，如裂解病毒灭活疫苗，具有较少的反应原性效应，因此这种类型的流感疫苗的使用目前受到限制。疫苗3Fluart是由Fluart Innovative Vaccines Kft.生产的WIV，仅在欧洲使用。 6.1.2 裂解病毒灭活疫苗 目前使用的大多数流感疫苗是裂解病毒或亚单位疫苗，因为它们具有适当的免疫原性和生产便利性。然而，由于缺乏整个病毒结构，它们失去了一些固有的免疫原性，这与WIV不同。裂解病毒疫苗可以通过使用Triton-100或辛基葡萄糖苷等表面活性剂化学破坏病毒膜来制备。然后，通过切向流过滤去除表面活性剂。表1总结了美国（代表北半球）和澳大利亚（代表南半球）的季节性流感裂解病毒疫苗，包括其制造商和适用年龄组信息。 在澳大利亚，大多数季节性流感疫苗是裂解病毒灭活疫苗，市场上有五种疫苗：FluQuadri（由Sanofi, 美国宾夕法尼亚州生产）、Vaxigrip Tetra（由Sanofi-aventis, 新西兰奥克兰生产）、Fluarix Tetra（由GlaxoSmithKline Biologicals, 德国德累斯顿生产）、Afluria Quadrivalent（由Seqirus, 澳大利亚墨尔本生产）和Influvac Tetra（由Abbott, 荷兰霍夫多尔普生产）。在美国，裂解病毒灭活疫苗也占季节性流感疫苗的主要部分，有五种疫苗：Afluria Quadrivalent（由Seqirus, 澳大利亚墨尔本生产）、Fluarix Quadrivalent（由GlaxoSmithKline Biologicals, 德国德累斯顿生产）、FluLaval Quadrivalent（由ID Bio-medical, 加拿大魁北克省拉瓦尔生产）、Fluzone High-dose Quadrivalent（由Sanofi, 美国宾夕法尼亚州生产）和Fluzone Quadrivalent（由Sanofi, 法国巴黎生产）。 6.1.3.亚单位灭活疫苗 通常，亚单位疫苗只包含病毒的抗原部分：HA和NA。这些蛋白质是通过使用表面活性剂裂解病毒后从流感病毒中纯化的（见图5）。这种类型的流感疫苗通常需要佐剂来诱导足够的免疫原性，特别是在老年人中。Seqirus生产的Fluad和Fluad Quadrivalent是可用于65岁及以上人群的亚单位流感疫苗。另一个疫苗，由Mylan Health生产的Influvac Tetra，适用于三岁以上人群（见表1）。由于它们的免疫原性相当且反应原性低，所需的疫苗剂量大和高生产成本，所有这些都需要进一步改进。自20世纪70年代以来，裂解病毒比亚单位病毒疫苗更常用。 6.2.减毒活流感疫苗（LAIV） LAIV的开发是为了模仿自然感染和免疫，而不引起严重疾病，从而诱导体液和细胞免疫。LAIV最早在20世纪60年代提出，方法是在鸡蛋中在非最佳条件下培养流感病毒。这些减毒病毒对温度敏感，只在25°C（冷适应）下生长。冷适应供体病毒经过几次传代，温度逐渐降低，在孵化的鸡蛋中进行。因此，当LAIV通过鼻内给药时，它可以在与鼻咽粘膜表面相同的温度范围内生长。LAIV比IIV有一些优势，因为它主要诱导局部粘膜免疫和局部免疫球蛋白A（IgA）的产生以及IgG，而IIV只有系统性IgA和IgG抗体。然而，由于使用活病毒进行免疫的风险，LAIV不推荐用于免疫功能低下的个体（免疫受损）或与他们密切接触的人。 由MedImmune生产的FluMist Quadrivalent（见表1）是一种经美国批准的鼻内LAIV季节性流感疫苗，可安全用于2至49岁的儿童和成人，包含四种流感毒株（两种流感A和两种流感B）。由AstraZeneca生产的Fluenz Tetra在欧洲获批，是另一种用于2至17岁儿童的LAIV。截至2021年，澳大利亚尚未批准任何LAIV。 6.3.重组HA疫苗 重组HA疫苗可以通过昆虫细胞和杆状病毒的重组蛋白表达技术生产，因为它们产量高且成本效益好（见图5）。昆虫细胞是用于重组蛋白表达的典型细胞系，Gibco Sf9细胞系是最常用于人类或兽医医学中重组蛋白表达的细胞系。 重组HA疫苗比基于鸡蛋的流感疫苗有优势：没有来自鸡蛋适应的不需要的突变（见表1）。此外，重组HA疫苗是鸡蛋过敏者的合适选择。尽管重组HA疫苗和IIV的作用机制相似，但重组HA疫苗的免疫原性较低，因此需要比IIV多三倍的HA才能诱导出与IIV相同的抗体滴度。重组HA疫苗的另一个优势是它适合流感大流行，因为它可能需要更短的制造时间，并且由于缺乏高致病性病毒，它比其他流感疫苗更安全。然而，由于在儿童中缺乏效力，重组HA疫苗仅限于成人。由赛诺菲巴斯德生产的Flublok Quadrivalent是第一种重组HA疫苗（见表1）。 7.流感疫苗制造过程 目前，流感疫苗可以通过三种不同的方法生产：传统的基于鸡蛋的疫苗（传统方法）、基于细胞的疫苗和重组HA疫苗。这些方法在图5中总结。基于鸡蛋和基于细胞的疫苗制造都是从在鸡蛋或细胞中培养的候选疫苗病毒（CVV）开始的（步骤1）。在收获、分离、过滤和纯化之后（步骤2），病毒通常使用甲醛进行化学灭活，以制造灭活流感疫苗，或者通过化学表面活性剂破坏，以准备分裂病毒疫苗或亚单位疫苗（步骤3）。重组流感疫苗不需要整个病毒的生长；只需获得HA抗原的遗传信息，并与杆状病毒结合，以便于将遗传信息（DNA）传递到宿主细胞中表达HA抗原。最后一步涉及填充-完成过程和包装，在冷链条件下交付和储存产品（步骤4）。 7.1.基于鸡蛋的疫苗 自20世纪40年代以来，基于鸡蛋的疫苗一直是每年生产数百万流感疫苗的最常见方法。无论疫苗株如何，都需要大量的鸡蛋供应来在鸡蛋中培养目标病毒。这种方法从选择预测的循环病毒株开始，然后是HA和NA的遗传片段在鸡蛋中可以大量生长且具有良好安全特性的鸡蛋适应病毒中的重组，如A/Puerto Rico/8/1934。在这些重组病毒产生后，它们被注入孵化的鸡蛋中生长，然后进行测序确认以收集候选病毒。经批准的病毒随后由世界卫生组织全球流感监测和响应系统（GISRS）的附属中心交付给私营制造商。制造商在孵化的鸡蛋中大量生产病毒，然后纯化重组病毒。然后，使用甲醛或β-丙内酯化学灭活纯化的病毒，并标准化HA含量，去除非病毒蛋白的污染物。HA蛋白是诱导针对流感病毒的抗体的关键因素，因此是流感疫苗开发的重点。 尽管基于鸡蛋的制造方法有许多好处，例如通常获得高滴度的流感病毒和大规模生产的重要经验，但有几个缺点可能影响其效率。首先，重组病毒在鸡蛋中的适应性和筛选分离病毒的抗原性延迟了为下一个流感季节生产流感疫苗所需的时间，因此，必须在即将到来的流感季节之前很久就开始生产流感疫苗。然而，一些流感株（如H3N2病毒）在鸡蛋中生长不佳。因此，使用这些株的流感疫苗生产需要很长时间，并因影响标准生产时间框架而延迟疫苗的交付。在基于鸡蛋的制造过程中，病毒没有被监测并且会发生突变。这种鸡蛋适应性可能导致生产与循环株不匹配的病毒，从而导致疫苗效力下降。此外，由于潜在的禽流感病毒在鸡舍中的暴露风险，还存在生物安全问题。 7.2.基于细胞的疫苗 美国食品药品监督管理局（FDA）在2012年批准了Flucelvax，这是美国首个获批的基于细胞的流感疫苗。使用Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞来培养病毒。基于细胞的方法可以类似于基于鸡蛋的方法，使用选定毒株的HA和NA进行病毒的重组。与基于鸡蛋的方法相比，基于细胞的方法具有一些优势。首先，使用细胞可以克服鸡蛋短缺的限制，并由于依赖生物反应器的容量，提供了更灵活的疫苗生产方法。因此，与基于鸡蛋的疫苗相比，基于细胞的疫苗可以在更短的时间内生产。此外，在鸡蛋中培养病毒时可以观察到HA蛋白更异质的糖基化谱。一些研究调查了使用哺乳动物细胞作为基质可以增强疫苗免疫原性相对于禽类细胞的理论。 此外，基于细胞的疫苗是曾经经历过鸡蛋过敏的人的合适选择，因为它们的产品不含鸡蛋蛋白。有趣的是，基于细胞方法最重要的优势之一是缺乏由于鸡蛋适应而引起的HA突变。因此，在2016年，FDA批准了使用基于细胞的病毒，以防止由鸡蛋适应引起的进一步突变。 尽管基于细胞的方法存在优势，但仍然存在一些缺点。与基于鸡蛋的疫苗相比，大规模生产基于细胞的疫苗的经验仍然较少。此外，根据美国疾病控制中心（CDC），Flucelvax的成本比基于鸡蛋的疫苗高出40%。尽管程度较小，但在细胞培养中由于连续传代，HA和NA蛋白仍然可能发生突变。 8.流感疫苗配方和成分  疫苗必须含有确认对人类安全的成分。此外，每种疫苗成分都具有特定的目的，即增加抗原的免疫原性并保持疫苗配方稳定。 8.1.活性成分 病毒抗原，活性药物成分（API）作为免疫原性成分，是疫苗最关键的部分。每个流感季节，世界卫生组织（WHO）都推荐在四价疫苗中包含四种流感病毒，在三价疫苗中包含三种毒株。因此，四价流感疫苗包含四种流感毒株（两种流感A型毒株和两种流感B型毒株），三价流感疫苗包含三种流感毒株（两种流感A型毒株和一种流感B型毒株）。 8.2.佐剂 佐剂是改善疫苗免疫反应的化合物。其中包括如氢氧化铝（Panflu）、磷酸铝和硫酸铝钾等铝盐。佐剂被认为通过使抗原靠近注射部位，使免疫系统细胞容易接触到它们，从而增加免疫反应。疫苗中使用铝佐剂通常意味着每剂疫苗的抗原较少，在某些情况下，需要较少的疫苗剂量。疫苗中佐剂的使用通常与接种后注射部位的局部反应有关。其他佐剂也可以用于流感疫苗，如病毒体或油包水乳液（MF59、AS03、AF03）。Fluad Quad是澳大利亚唯一的含佐剂（MF59）流感疫苗。 8.3.稳定剂 稳定剂用于保持疫苗效力，通过在储存期间保持抗原和其他疫苗成分完整。稳定剂还防止疫苗成分粘附在疫苗瓶的侧面。稳定剂的例子包括糖（乳糖和蔗糖）和氨基酸（甘氨酸和谷氨酸钠）。 8.4.防腐剂 防腐剂用于某些疫苗配方中，以消除疫苗中的真菌和/或细菌感染。防腐剂最初是为了避免多剂量瓶中的细菌污染（不用于单剂量瓶疫苗）。硫柳汞、苯氧乙醇和苯酚是所使用的防腐剂之一。尽管全球范围内与使用防腐剂相关的重大有害效应相对较少，如过敏，但防腐剂已在众多疫苗接种中使用。 8.5.痕量成分 疫苗中的痕量成分是在生产初期使用的微量化学物质或物质，或从容器中浸出的，例如。根据生产程序，细胞培养液、鸡蛋蛋白、抗生素或灭活剂的痕量可能存在。在某些情况下，最终疫苗成分中只发现这些化合物的少量。 抗生素有时会在加工阶段使用，以确保不发生细菌污染。一些流感疫苗含有如新霉素、多黏菌素B和/或庆大霉素等抗生素。此外，预充疫苗注射器可能含有用作预充疫苗注射器润滑剂的硅油的痕迹。在WIV和分裂病毒灭活疫苗的开发过程中，使用灭活剂，最终疫苗含有相对较少的这些灭活化学物质或分裂剂，如甲醛、戊二醛或表面活性剂。 9.新型流感疫苗平台  9.1.类病毒颗粒（VLP）疫苗  VLP由表面病毒糖蛋白组成，它们自组装形成看起来像病毒的非复制颗粒。这些颗粒模仿原生病毒结构，但缺乏遗传物质，不能引起感染。VLP已成功开发为疫苗，并已用于对抗包括乙型肝炎病毒（Heptavax-B（由默克公司，新泽西州怀特豪斯）、Engerix-B（由葛兰素史克生物制品，比利时里克斯萨尔特）、H-B-VaxII（由默克公司，怀特豪斯，美国）和Hepavax-Gene（由杨森疫苗公司，韩国仁川））、人乳头瘤病毒（Gardasil（由默克公司，怀特豪斯，美国）、Cervarix（由葛兰素史克生物制品，比利时里克斯萨尔特）、Cecolin（由中国北京万泰生物制药）、Gardasil-9（由默克公司，怀特豪斯，美国））和戊型肝炎病毒HEV（Hecolin，由中国北京万泰生物制药）。因此，VLP平台已被证明是生产疫苗的良好策略，包括流感疫苗。 VLP已与乙型肝炎病毒核心（HBc）结合，并含有三个串联副本的M2蛋白（3M2e）以及核蛋白（NP）表位，以克服流感快速演变的挑战。VLP可以直接激活先天免疫，或通过刺激抗原呈递巨噬细胞或树突细胞，从而有效诱导病毒特异性T细胞和B细胞反应。此外，流感VLP疫苗可以包含几种不同的病毒蛋白（HA、NA、M1或M2e）在单个VLP上单独或组合，为更广泛的保护提供一定的灵活性。将纯病毒神经氨酸酶添加到传统流感疫苗中，可产生平衡且广泛的免疫反应。此外，由于蛋白质的保守性，M2e是通用疫苗开发的潜在靶标。由M1和NA组成的VLP复合物诱导了对同源和异源A亚型的反应性抗体反应和显著的保护水平。一些VLP流感疫苗候选物已进入临床试验（见表2）。Novavax公司的一种重组A（H1N1）2009流感VLP疫苗（HA）在2012年进行了2期临床试验，以评估其安全性和免疫原性。这种VLP流感疫苗在单次接种后显示出强大的免疫反应，仅有轻微的不良事件。此外，Medicago公司的一种基于植物的QVLP（HA）在2019年完成了2期临床试验。基于植物的VLP流感疫苗能够诱导强大的抗体反应和抗原特异性CD4+ T细胞。这些VLP疫苗候选物能够产生体液和/或细胞反应。它还通过诱导对四种不同流感毒株（两种流感A型和两种流感B型）的抗体，显示出交叉保护。 9.2.抗原呈递细胞（APC）诱导型疫苗 CD11c+ 树突状细胞（DCs）在病毒感染期间通过积累和转化病毒抗原为肽段，并通过主要组织相容性复合体（MHC）在二级淋巴器官向T细胞呈递，从而显著促进适应性抗病毒免疫反应。一些临床前工作已经进行，以通过诱导抗原呈递细胞来加强针对流感病毒的T细胞反应。例如，Fonteneau及其同事研究了流感病毒感染对纯化的血液DCs的影响及其向CD8+和CD4+ T细胞呈递病毒抗原的能力。他们证明，暴露于流感病毒可以诱导抗流感病毒的TH1型CD4+ T细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的扩增。这些发现表明DCs在产生抗病毒T细胞反应中具有新功能，暗示这些DCs在适应性免疫反应中扮演重要角色。另一种方法表明，将alpha-Gal表位嫁接到HA上可以增强APCs对流感疫苗病毒的摄取。因此，通过有效地针对APCs进行疫苗接种，可以增强流感病毒疫苗的免疫原性。此外，可以使用融合DNA疫苗将流感HA靶向到APCs，这些疫苗编码的蛋白能够双价地结合到流感HA上，将其靶向到APCs的不同表面分子上。这种靶向能够诱导对CD8+/Th1 T细胞反应或抗体/Th2反应的免疫反应。 9.3.基于纳米粒子的流感疫苗 传统的流感疫苗可以提供针对病毒的系统性保护；然而，对于流感病毒，也期望在粘膜呼吸道中提供局部保护。纳米粒子具有如溶解度和稳定性等特性，使它们适合粘膜免疫，因为它们能够诱导针对呼吸道病毒的免疫。这些纳米粒子可以来自天然或合成来源，并作为抗原载体。因此，与其他病毒相比，使用纳米粒子对抗流感病毒的研究更多。番木瓜花叶病毒纳米粒子被用作三价灭活流感疫苗的佐剂，并已在小鼠免疫中进行了测试。这种纳米粒子疫苗在诱导基于IgG2、IgA和支气管肺泡灌洗样本及血清中的IgG滴度的抗流感免疫方面，发现优于IIV，特别是在鼻内免疫后。此外，聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒子与流感A（H1N1）保守肽结合，并作为疫苗鼻内给药。这种疫苗能够诱导抗原特异性的CD4+和CD8+ T细胞，从而在猪的肺部诱导保护。因此，诱导能够针对感染过程中涉及的多个途径的交叉保护性抗体，对于更好地保护流感病毒将大有裨益。两种不同的保守流感抗原（螺旋C和基质蛋白2（M2e）的外域）被链接在一个自组装的纳米粒子中，以实现这一目标。它们能够在小鼠模型中诱导中和抗体。 9.4.通用流感疫苗 尽管疫苗接种是预防流感感染的最有效方式，但流感病毒的抗原转变和抗原漂移使它们能够逃避抗体中和。流感病毒的这些变化是不可预测的，因此流感疫情管理非常具有挑战性。为了克服当前流感疫苗的局限性，一种提供长期和广泛保护的通用流感疫苗将非常理想。理想的通用流感疫苗应该对所有流感病毒（A型和B型）的HA和NA亚型或抗原突变都有效。为了达到这个目标，疫苗应该诱导交叉保护性抗体，这可能通过针对HA、NA或M2或内部蛋白如M1和NP中发现的保守表位来实现。HA的茎或柄区域在不同毒株的流感病毒中高度保守，被认为是开发通用流感疫苗非常有希望的目标。此外，一些从人类中分离出的针对病毒柄区域的抗体能够中和所有流感A型病毒亚型，可以用于开发通用流感疫苗。例如，开发了一种顺序嵌合HA疫苗技术，将免疫反应从头部重定向到柄域（表3）。嵌合HA由来自第1组或第2组流感病毒的柄域和来自禽流感病毒亚型的头部域组成。在2020年完成I期临床试验后，这种通用流感疫苗候选物被发现是安全的，并能唤起针对血凝素保守、免疫亚显性柄的广泛、强烈、持久和有效的免疫反应。此外，开发了一种计算优化的广泛反应性抗原（COBRA）针对H1作为通用流感疫苗（表3）。为了评估B细胞的广度，由COBRA血凝素（HA）（称为P1）诱导的抗体分泌细胞与由历史H1N1疫苗株诱导的抗体分泌细胞进行了比较。P1 HA诱导的单克隆抗体（mAbs）展示了广泛的HA识别范围，从狭窄到广泛的反应性mAbs。还开发了一种新的疫苗Multimeric-001，通过包含流感A型和B型毒株的HA、NP和M1蛋白的保守线性表位，来防御季节性和大流行性流感病毒类型，与突变无关（表3）。这种疫苗在2020年的III期临床试验中进行了评估，以评估其保护和耐受性，以及体液和细胞免疫反应。该疫苗耐受性良好，没有记录到严重不良效应。体液和细胞反应表明，该疫苗具有针对突变无关的流感病毒株的交叉免疫。在接受季节性疫苗接种前给予Multimeric-001剂量的参与者中，与单独季节性疫苗接种相比，H1N1和H3N2株的抗体反应更大。此外，在接种Multimeric-001的人群中，与基线相比，H1N1、H3N2和流感B的CD4+和CD8+ T细胞反应有所增加。 10.疫苗产品的表征  大部分疫苗生产时间（70%）都用于质量测试，以确保纯度、效力和疫苗安全性。在流感疫苗开发过程中，需要进行广泛的表征，以确保生产步骤遵循现行良好生产规范（cGMP）。尽管疫苗生产不同，质量控制测试必须考虑某些物理化学参数的方面，如纯度、含量、均质性和稳定性。 10.1.纯度  疫苗的纯度是确定最终疫苗产品中“活性”疫苗抗原比例的关键物理化学标准。最终，通过疫苗抗原测量的纯度程度将取决于测试的特异性、额外的定量方法以及产品样本的准备，以及非产品杂质。因此，至关重要的是使用选择性测定法来测量潜在的非产品/工艺相关杂质（例如，宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA和/或RNA、脂质、细胞培养诱导剂等）和产品相关杂质（例如，分子重量变体，如聚集体和降解产物），以界定低于定义量的污染物和杂质的存在。此外，需要通过过滤、离心或蒸发方法去除灭活剂来纯化IIV。需要在最终产品中去除分裂病毒疫苗中的分裂材料，如Triton-100，这可以通过过滤或其他分离方法如疏水作用色谱来完成。表4总结了几种可能使用的方法，通常结合使用，以确定疫苗纯度。例如，使用正交过程如质谱法，可以准确测量分子质量，并且还可以详细说明共价变化（即糖基化）的身份和位置。此外，由于杂质在质谱分析中可能表现出与疫苗抗原相同的质量/电荷（m/z）比率，因此使用另一种正交方法如光散射（尺寸排除色谱、多角度激光光散射）来测量基于半径的回转半径的质量，有助于在质谱分析中将疫苗抗原与未解决的杂质分离。 10.2.含量 HA是流感病毒中的主要抗原蛋白，疫苗中的HA含量必须足以激发免疫系统。因此，任何类型的流感疫苗中HA的含量必须达到15 µg/mL。使用传统的蛋白质估算方法如UV吸收280 nm、双缩脲酸测定、Bradford测定、Lowry测定、基于洗涤剂的荧光检测、带荧光染色的定量凝胶电泳、胺标记“衍生化”（使用荧光探针）和酶联免疫吸附测定（ELISA）来进行定量。尽管每种方法都有潜在的优点和缺点，但了解测量方法与样本体积、pH环境、灵敏度、通量、稳健性和测定精度之间的关系至关重要。最后，评估“活性”疫苗抗原在产品相关杂质存在下的数量对于制定正确的剂量指南至关重要。 10.3.均质性 可以使用多种技术确定疫苗抗原中蛋白质的大小或分子量：分离和散射方法是主要的两种方法。在分离方法中，可以对样本施加力（例如，机械、离心、电力），根据大小、电荷、疏水性等不同特征分离分子，然后根据其运动确定生物分子的大小、形状或电荷。分离方法包括色谱测定，如高效液相色谱、凝胶电泳和沉降平衡。除了光散射方法，质谱和荧光光谱等其他光谱方法在样品表征时也常被使用。此外，透射电子显微镜（TEM）和流动成像显微镜等显微镜方法在蛋白质表征方面也有重要应用（表4）。场流分离是一种根据分子在狭窄通道中层流的取向分离蛋白质/糖蛋白/颗粒的技术，较小的分子流动更快，较大的分子（无法快速分散）流动缓慢。使用质谱法评估蛋白质的分子量或规模有助于蛋白质识别，并在定量和定性阶段量化蛋白质纯度、共价修饰和降解产物。光散射和电子显微镜（EM）是用于表征和确定基于蛋白质/糖蛋白的疫苗抗原的大小或WIVs中病毒大小分布的两种常用技术。此外，疫苗产品中蛋白质聚集的存在可能影响疫苗的稳定性和效力。这些聚集体可能是由于在分裂病毒流感疫苗的生产中去除分裂剂（表面活性剂）引起的。除了EM和光散射，UV-Vis吸收光谱和荧光发射光谱是识别蛋白质聚集的可靠技术。EM是确定大型蛋白质或蛋白质复合物大小和形状的直接成像工具。然而，由于仪器的高成本和进行此类实验所需的专业知识，通常选择其他技术（如光散射）作为大小分析的主要方法。通过动态光散射可以测量分子量、分布、扩散系数和流体动力学半径。 10.4.稳定性 了解蛋白质/糖蛋白疫苗抗原的功能和稳定性对于疫苗在激发所需的保护性免疫反应方面的总体效力至关重要。疫苗的不稳定性可能由不同因素引起，如热量、光线、辐射、环境变化或与容器或其他疫苗成分的相互作用。过度加热或冷冻可能会加速疫苗效力的丧失。因此，必须谨慎处理疫苗，密切关注它们的处理，以确保它们质量高，并提供最大效力。这可以通过使用冷链将疫苗保持在限制性温度环境中（这是保持效力所需的）从生产者到最终消费者来实现。此外，在分裂病毒疫苗中，表面活性剂类型、孵化时间、病毒浓度、表面活性剂浓度和病毒分裂比例是可能影响疫苗稳定性的其他因素。例如，在稀释或去除表面活性剂后可能会出现聚集，因此应通过优化过滤步骤的数量来监测剩余表面活性剂浓度，以维持疫苗的稳定性和效力。可以使用多种分析方法来研究疫苗稳定性，如荧光发射光谱、UV-Vis吸收光谱和血凝抑制试验（HI）测定（表4）。由于聚集和/或降解是影响蛋白质/糖蛋白稳定性的典型特征，利用这些分析方法有助于识别聚集体的大小或分子量，以了解疫苗的短期和长期稳定性。 11.流感疫苗的有效性 流感疫苗的有效性一直是流感疫苗的主要问题，因此每年都会评估季节性流感疫苗的有效性。疫苗的有效性测量可能会受到一些因素的影响，如被调查的人群、研究设计、评估的结果以及分析的流感疫苗季节。通常情况下，在流感季节，当大多数流通的流感病毒与流感疫苗中使用的病毒非常匹配时，流感疫苗接种会降低一般人群感染流感疾病的风险，降低幅度在40%到60%之间。然而，如果流感疫苗与流行病毒匹配度不高，则对由常见流通病毒引起的疾病几乎没有或没有保护作用。因此，流感疫苗的有效性每年都有所不同，从2004-2005年的10%到2010-2011年的60%不等（见图6）。 图6.根据美国疾病控制中心的数据，2004年至2020年间季节性流感疫苗在美国的有效性波动。 许多参数导致疫苗反应的不一致性，包括内在的病毒特性以及宿主因素。越来越多的数据表明，宿主变量如年龄、性别、怀孕和免疫历史在改变流感疫苗的有效性方面发挥重要作用。因此，更好地了解影响流感疫苗诱导的免疫的宿主变量，可能有助于通过优化甚至定制疫苗类型、剂量和佐剂使用，提高现有季节性和未来通用流感疫苗的有效性。自2004年以来，通常使用测试阴性设计（TND）来测量流感疫苗的有效性，当时卫生官员开始追踪流感疫苗的有效性。TND是一种修改后的病例对照方法，它对比了因流感样症状来到医疗保健场所的个体的疫苗接种状况。尽管它最大限度地减少了与寻求医疗活动相关的选择偏差，但它的局限性在于它只包括寻求呼吸疾病治疗的人。然而，随机对照试验更适合测量疫苗的有效性，因为它们较少受到选择和混杂偏差的影响。 为了提高流感疫苗的有效性，可以使用不同的策略。例如，增加疫苗的HA抗原剂量，以实现更高的血凝抑制滴度和免疫原性。最近的元分析显示，高剂量IIV比标准剂量IIV更有益于避免因流感住院，以及减少65岁以上个体与流感相关的死亡率。使用皮内疫苗接种是提高疫苗有效性的另一种选择，显示出等于或优于通过肌肉注射获得的血凝抑制水平。这归因于真皮内抗原呈递细胞数量的增加，这是增强皮内疫苗接种免疫原性的机制之一。向疫苗中添加佐剂是另一种提高疫苗效力的方法。与无佐剂的三价灭活疫苗相比，引入新型佐剂三价灭活疫苗已被证明可以增强老年人的免疫反应，并减少因流感和肺炎住院的风险。另一个选择是使用非基于鸡蛋的系统，以避免突变和其他变化，如在病毒鸡蛋适应过程中病毒蛋白的翻译后修饰，包括糖基化。 12.结论  由于广泛的病毒变异和漂移，流感可以逃避宿主的免疫防御，因此，它仍然是一个重要的、周期性的全球公共卫生挑战。因此，需要每年更新流感疫苗。目前市场上有三种流感疫苗：灭活流感疫苗（IIV）、减毒活流感疫苗（LAIV）和重组血凝素（HA）疫苗。像大多数其他疫苗一样，流感疫苗的配方复杂，需要几个关键成分，如病毒抗原、佐剂、防腐剂和稳定剂，以保持稳定和有效的疫苗配方。此外，疫苗在加工步骤和最终产品中经过许多质量测试，以确保疫苗符合标准并且安全使用。尽管如此，仍需要更多的研究来克服当前流感疫苗的局限性，如效力低、生产时间长以及缺乏交叉保护。为此，新的流感疫苗候选物正在进行中，以提高疫苗效力或提供针对许多不同毒株的交叉保护（即通用流感疫苗），以克服每年更新疫苗的需求。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。