TB-RB

，中文摘要       人副流感病毒（human parainfluenza virus，HPIV）主要引起5岁以下儿童急性呼吸道感染，临床发病率仅次于呼吸道合胞病毒感染，其中超过一半病例由HPIV-3引起，给新生儿的生命健康带来极大威胁，而目前仍然没有批准上市的针对HPIV的有效治疗药物及疫苗。此文就HPIV-3的基本结构、流行病学、感染免疫，以及目前针对HPIV-3疫苗的研发进展做一综述。正文       人副流感病毒（human parainfluenza virus，HPIV）是一类有包膜、非节段的单股负链RNA病毒，属副黏病毒科。20世纪50年代末，研究者最初从日本仙台1例患者样本中分离出仙台病毒，1959年研究者首次将这类特性与流感病毒、流行性腮腺炎病毒相似，但抗原性与流感病毒不同且有独特生物学特性的病毒命名为副流感病毒（parainfluenza virus，PIV）[1]。根据其病毒遗传性和抗原性，PIV可分为1—4型，HPIV-4又分为A和B亚型[2]。2018年，国际病毒学分类委员会根据病毒感染差异及磷酸化蛋白（phosphoprotein，P）基因的重复阅读框编码蛋白不同（C/D/V蛋白），将HPIV-1和HPIV-3划为呼吸道病毒属，将HPIV-2和HPIV-4划为腮腺炎病毒属[3]。HPIV主要感染5岁以下儿童，可引起多种呼吸道疾病，如喉气管炎、支气管炎和肺炎。HPIV-1和HPIV-2更容易感染喉气管炎及气管近端，与急性喉气管炎或支气管炎相关；HPIV-3主要感染远端气道，与支气管炎和肺炎相关[2]。目前国内外尚无针对HPIV-3的疫苗和药物上市，但有研究发现姜黄素及某些抗蛋白酶降解肽可以抑制HPIV-3在人体内的复制，达到一定的治疗效果[4-5]。鉴于这种病毒在5岁以下儿童中更容易引起严重感染，开发针对性的疫苗显得尤为必要。1HPIV基本结构及复制过程1.1基本结构        HPIV通常呈球形，直径为125~250 nm，基因组全长约15 500 bp，编码6个结构蛋白，包括2个跨膜糖蛋白：血凝素-神经氨酸酶（haemagglutinin-neuraminidase，HN）和融合（fusion，F）蛋白，以及4个膜内蛋白：基质（matrix，M）蛋白、核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白、P 和大聚合酶（large polymerase，L），见图1。基因组编码结构域为恒定的N-P-M-F-HN-L[6] 。此外，P的编码基因中由于存在重叠的阅读框，会编码1或多个非结构蛋白，且不同型别间存在差异[2，7]。某些非结构蛋白可能有利于病毒的复制[8]，但目前尚未完全了解这些非结构蛋白。       HN是HPIV中含量最高的蛋白，高度保守，主要为二聚体结构，但也有四聚体存在[9]。其四级结构和流感病毒的神经氨酸酶高度相似，功能也有一定的相似性。HN的作用如下：（1）血凝素受体结合活性；（2）通过与细胞的糖链末端唾液酸结合并将其破坏，释放出唾液酸残基，促进病毒与宿主细胞的黏附；（3）和F蛋白相互作用，起到病毒融合的作用从而促进病毒的释放[9]。有研究发现，HN的糖基化位点和数量在不同病毒亚型间不一致，这可能是一种免疫逃逸的策略[10]。       F蛋白以无活性前体F0存在，进入宿主细胞后被反式高尔基体中的蛋白水解酶（弗林蛋白酶）水解为以二硫键连接的异二聚体F1+F2[11]，此外还发现Kex2蛋白酶也可作为F0的水解酶[12]。F0在水解后，新生成的F1的N端高度疏水，最先接触细胞脂质膜，与病毒的融合有关[11]。研究发现，F1具有3个结构域，其中结构域2和3之间6个氨基酸的连接蛋白在F蛋白介导的融合功能中起到至关重要的作用[13]。如果宿主细胞缺乏相应的水解酶，就会导致产生非感染型病毒，不能维持复制增殖周期，故宿主细胞内的水解酶活性一定程度上决定了病毒的毒力和宿主范围。HN和F蛋白一起构成HPIV的主要毒力相关蛋白。       包膜内层由M蛋白组成以维持结构完整性，负责连接病毒的脂质包膜和核糖核蛋白[14]。M蛋白在引导病毒装配和出芽中起关键作用。有研究发现，只表达M蛋白的载体就足以完成病毒装配出芽，并释放出病毒样颗粒[15]。研究还发现M蛋白可通过促进宿主细胞线粒体自噬，从而促进病毒的组装和运输，在病毒的装配中发挥着至关重要的作用[16]。N蛋白紧密包绕着基因组单股负链RNA。1个N蛋白与6个核苷酸绑定，形成一个模板，供L、P进行转录，并和L、P 一起组装为核糖核蛋白[2]。P和L在病毒的复制和转录过程中发挥多聚酶作用，研究发现L具有2个特定的类泛素蛋白化修饰位点，同样可以对病毒的复制活性进行调节[17]。目前对于HPIV的4个膜内蛋白的相关作用的认识仍有待进一步研究。1.2复制过程       HPIV感染复制过程如下：（1） HPIV进入宿主体内后，通过HN吸附到宿主细胞表面的唾液酸残基。（2）通过HN、F蛋白共同作用促进膜融合。（3）通过病毒-RNA-聚合酶系统，从基因组3'端识别并转录出一段很短的未加帽的leader RNA作为转录开始的起点。（4）从3'端开始进行转录，得到5'端有多聚腺苷加帽的mRNA，这些 mRNA编码病毒相应的蛋白；多聚酶系统在转录完一个编码区后遇到终止子停止转录，然后跳过编码区之间的非编码序列，从下一个编码区的启动子重新开始转录，但这种转录重新启动可能失败，故从病毒的3'端到5'端的编码区存在转录梯度，即由3'端向5'端转录水平逐渐下降。（5）经胞内核糖体翻译病毒mRNA，再由N蛋白紧密包绕，即形成核衣壳[18-19]。（6）当P和N蛋白数量达到一定水平时，多聚酶系统会无视编码区域间的起始或终止信号，产生1条完整的反义基因序列，合成的反义基因链作为指导合成病毒基因组的模板。（7）利用宿主细胞的膜系统进行包装，然后出芽释放子代病毒[20]。       目前有研究发现，HPIV感染细胞后还可以调控自噬小体介导线粒体片段化，进一步导致线粒体自噬，为病毒装配提供了更多的场所和膜系统，有利于病毒感染[16]。2HPIV流行病学特性与感染免疫       HPIV通过人与人的直接接触和飞沫经呼吸道传播，主要在5岁以下儿童中引起急性下呼吸道感染。有研究统计，美国5岁以下儿童由于急性呼吸道感染而住院的病例中约6.8%是HPIV感染引起的，其中HPIV-3占比超过一半，估计HPIV感染每年引起约23 000例5岁以下儿童住院病例[21]。多项流行病学研究显示，5岁以下儿童中，由HPIV引起的急性呼吸道疾病发病率仅次于呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）。赵显虹和王宇清[22]对苏州地区2 298例14岁以下住院儿童进行检测，其中98例（4.26%）为HPIV-3阳性；孙小宇等[23]发现北京西城区626例疑似呼吸道病毒感染样本中，27例（4.64%）为HPIV-3；周杉杉等[24]对河南漯河地区627例儿童急性呼吸道感染样本进行检测，其中27例（4.31%）为HPIV-3阳性。HPIV引起的呼吸道感染症状大多为轻症，以发热、支气管炎、鼻炎等常见症状为主。这些轻症患者往往在门诊就结束就诊，不会进行进一步的病因学检查，造成HPIV感染率被低估。        HPIV感染宿主后，可激活机体固有免疫应答系统，从而进一步诱导机体产生针对病毒的特异性体液免疫和细胞免疫应答。体液免疫包括产生针对病毒表面糖蛋白HN和F蛋白的中和抗体，抗体种类主要为IgG，同时伴随着IgM和黏膜局部分泌性IgA抗体。同时机体也会产生特异性CD4+、CD8+ T细胞免疫应答，分泌干扰素抑制HPIV的初步复制[25]。虽然细胞免疫在感染初期限制病毒复制可发挥关键作用，但保护机体的长期免疫作用主要来自针对HN和F蛋白的中和抗体[26]。3HPIV-3疫苗研究进展3.1 全病毒灭活疫苗       病毒灭活疫苗指通过物理或化学手段使病毒失活，经过纯化后使用的疫苗。Aguayo-Hiraldo等[25]分别用甲醛及紫外灭活的HPIV-3疫苗接种棉鼠，发现没有产生较强的免疫保护作用，反而引起疾病增强作用，且这种增强作用有注射剂量的依赖性。分析原因如下：灭活疫苗引起的免疫应答主要是体液免疫，不能产生有保护性的CD8+ T细胞应答，这种疾病增强现象可能与Th2细胞因子相关，而其保护作用主要与Th1细胞因子相关。因此，HPIV-3全病毒灭活疫苗并不能产生有效的保护作用。3.2减毒活疫苗        减毒活疫苗指对病毒进行一定的处理（包括诱导突变、传代突变、基因重组技术改造等），使得病毒的毒力大幅下降甚至消失、感染人体后不会引起疾病发生但能引起免疫应答的疫苗。目前进入临床试验的HPIV-3疫苗中，减毒活疫苗数量最多。3.2.1 基于牛3型副流感病毒（bovine PIV type 3，BPIV-3）的减毒活疫苗    BPIV-3的N及F蛋白的氨基酸序列与HPIV-3有约75%的相似性，最早用于疫苗研究的 BPIV-3 株（bPIV3/Kansas/15626/84）分离自1984年美国堪萨斯州一头患有肺炎的小牛，对仓鼠及非人灵长类动物具有免疫原性[27]。相比HPIV-3，BPIV-3在猕猴的上呼吸道和下呼吸道的病毒载量下降至1‰~1%[28]。Pennathur等[27]通过猕猴实验证明BPIV-3可以保护动物免受HPIV-3感染。1项Ⅱ期临床试验中BPIV-3被用于预防HPIV-3，试验结果推定在13〜16月龄儿童中，该疫苗可降低HPIV-3的发病率达67%〜88%[28]。但是该疫苗研究并没有继续，现在也没有进行中的临床试验，推测可能是因为其免疫原性或减毒程度不如之后发现的减毒株。3.2.2 嵌合 BPIV-3/HPIV-3 减毒活疫苗（rB/HPIV-3）   rB/HPIV-3是在BPIV-3 的基础上，以HPIV-3的HN和F基因序列替换BPIV-3的相应片段得到的减毒活疫苗，包含78%的BPIV-3基因组，故rB/HPIV-3仍能保留减毒性。Pennathur等[27]通过猕猴实验证明这种疫苗能保留减毒活性，但是毒力高于3.2.1所述的BPIV-3疫苗，证实HN和F蛋白是PIV主要的毒力因子，且rB/HPIV-3诱导的抗HPIV-3抗体水平高于BPIV-3。以BPIV-3为载体引入HPIV-3毒力基因使得这种嵌合疫苗接种更接近于HPIV-3感染。目前这种疫苗已经完成Ⅰ期临床试验[29]。3.2.3 冷适应型HPIV-3减毒活疫苗（rHPIV-3.cp45）   根据甲型流感病毒和RSV的冷传代得到稳定减毒株的经验，有研究选取野生HPIV-3（JS株）作为第0代，在22 ℃传代10次，随后在20 ℃传代35次，得到对温度敏感的减毒型稳定的冷传代rHPIV-3.cp45毒株，并通过实验进一步证明这种病毒已经丧失了在35 °C下连续传代的能力[30]。以这种病毒制备的疫苗在Ⅰ期临床试验中对30名1岁以下的儿童表现出较好的安全性、免疫原性及保护作用，并通过接种后个体排出的病毒体外接种培养证实了该病毒的基因稳定性，且通过测定抗体水平发现免疫原性比BPIV-3更好[31]。目前这种疫苗已经完成Ⅱ期临床试验，其结果显示20名受试者中仅有1例被感染。3.2.4 嵌合HPIV-3.cp45/HPIV-1减毒活疫苗（rHPIV3-1.cp45L）     rHPIV3-1.cp45L 是在HPIV3.cp45的基础上，以HPIV-1的HN和F基因序列替换HPIV-3.cp45的相应片段得到的减毒活疫苗。原预想其可以保持减毒性，并同时产生对HPIV-1和HPIV-3的保护，但通过仓鼠实验发现得到的抗原保护性主要针对HPIV-1，对HPIV-3的保护性较弱，且只能维持数个月[32]。研究还发现，若接种者在之前接种过RSV/HPIV-3的二价疫苗，可能会影响rHPIV3-1.cp45L的保护效力，因为之前的HPIV-3和rHPIV3-1.cp45L共享了HPIV-3 的部分抗原。不过动物实验中，即使存在接种干扰，仍然可以对仓鼠产生较低水平的HPIV-1免疫保护。综合抗原性的干扰以及对HPIV-3的保护较弱等因素，这种疫苗也未进入临床试验。3.2.5 嵌合 BPIV-3/HPIV-3/RSV-F 蛋白减毒活疫苗（rB/HPIV3-RSVF）   rB/HPIV3-RSVF是在rB/HPIV-3编码N蛋白和P的开放阅读框之间插入一段编码RSV F2蛋白的基因，得到的嵌合减毒疫苗[33]。原预期该疫苗株在保留减毒性的情况下，可同时产生对HPIV-3及RSV的抗原保护。Ⅰ期临床试验中对49名RSV及HPIV-3血清抗体同时阴性的6〜24月龄儿童进行3剂接种（0、2、4个月），结果显示所有受试者均产生了对HPIV-3的免疫保护，但有50%受试者额外产生了对RSV的免疫保护，安全性良好。原因可能是RSV的F蛋白序列产生突变，导致终止密码子提前[34]。目前这种疫苗已经完成Ⅱ期临床试验，只有1例疫苗受试者感染了HPIV-3。3.3亚单位疫苗        亚单位疫苗指通过物理或化学手段，筛选出病毒中具有抗原性、能诱导机体产生相应抗体的蛋白，经分离纯化后制成疫苗，亚单位疫苗不含完整的病毒，不能在人体内复制。有研究分别构建HPIV-3 HN和F蛋白表达质粒，然后对棉鼠进行免疫，发现单独的抗HN或抗F蛋白抗体均能产生一定水平的抗HPIV-3感染保护，HN质粒刺激棉鼠产生的HPIV-3中和抗体水平是F质粒的3倍；质粒免疫后进行HPIV-3攻击，结果发现HN质粒组的上呼吸道病毒载量为F质粒组的1‰[26]。但是这两种抗体单独作用均不能对下呼吸道产生完全的保护作用。随着感染造成的完全保护，两种特异性抗体水平均上升[35]。研究结果提示，有效且具有完全保护作用的HPIV-3亚单位疫苗应该同时包含HN和F抗原。目前尚无亚单位疫苗进入临床试验。3.4核酸疫苗       核酸疫苗是将外源性的编码蛋白的DNA或RNA直接作为疫苗对人体进行免疫，核酸利用宿主体内的环境进行转录翻译复制等过程，使机体对翻译产物产生免疫应答，从而获得免疫保护。核酸疫苗相比传统疫苗具有可产生长期免疫应答的优点。美国Moderna公司目前公布的mRNA疫苗mRNA-1653，含有2段mRNA序列分别编码HPIV-3和人巨肺病毒的F蛋白，由脂质纳米颗粒技术递送。目前该疫苗已经进入Ⅰ期临床试验，并已通过对成人接种后的安全性评估。Moderna公司的公开报道中认为该疫苗具有较好的免疫原性和安全性[36]。目前Ⅰ期临床试验的结果仍未公开。4展望       目前人们对于HPIV的认识尚不完全，尤其是对于其膜内蛋白在病毒的复制和功能调控上的认知仍有待进一步探索。但是随着越来越多的科研人员的努力，现在已经有越来越来多的HPIV-3疫苗进入临床试验（表1），其中2种已经进入Ⅱ期临床试验，并且也取得了一定的成果。在基因重组技术的发展下，使得以病毒作为载体的嵌合疫苗具有大好前景，目前进入临床试验的疫苗中有2种是嵌合疫苗。相信随着进一步的深入研究，终能研发出具有良好安全性、免疫原性及较长期保护性的HPIV-3疫苗。作者邱陈晨1   李秀玲21上海生物制品研究所有限责任公司第四研究室，上海  200051；2上海生物制品研究所有限责任公司，上海  200051通信作者：李秀玲，Email：18910222351@163.com引用本文：邱陈晨, 李秀玲. 人3型副流感病毒疫苗研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2022, 45(6):343-348.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220222-00015在抗体圈微信公众号回复“JPM23”可下载60 家药企PPT合集。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。