GSK-3389404

RNA干扰（RNAi）技术的飞速发展推动了小干扰RNA（siRNA）和反义寡核苷酸（ASO）在治疗领域的应用，为传统药物难以靶向的疾病提供了全新解决方案。本综述由IQ联盟讨论组专家撰写，聚焦RNA疗法开发中的核心技术壁垒与行业实践经验，系统分析生物共轭策略对递送效率的优化机制、生物分析方法在药代动力学研究中的关键作用、生物转化路径对活性代谢物生成的影响，以及组织分布特征与治疗效果的关联性。通过整合国际多中心研究数据，重点阐述计算建模技术在剂量预测和安全性评估中的应用价值，总结IQ联盟等行业组织在标准化开发流程方面达成的共识。研究结果表明，合理设计的GalNAc共轭系统可显著提升肝靶向递送效率，LC-MS/MS与SL RT-qPCR联用技术能够实现皮摩尔级药物浓度检测，而基于生理的药代动力学（PBPK）模型有助于精准预测临床有效剂量。这些技术突破共同推动全球已有14款siRNA/ASO药物获批上市，覆盖遗传性疾病、肿瘤等多个治疗领域。本文提出的开发框架为解决RNA疗法的组织特异性递送、脱靶效应控制和规模化生产等挑战提供了实践指导，为下一代寡核苷酸药物的临床转化奠定基础。 由于篇幅所限，本文将分成三部分进行介绍，分别为（一）生物分析部分（siRNA与ASO的转化及临床开发——行业实践、观点与建议（一）：生物分析方法概述）；（二）生物转化及组织分布部分（siRNA与ASO的转化及临床开发——行业实践、观点与建议（二）：生物转化及组织分布研究概述）；（三）定量药理及临床药理部分。本次介绍第三部分：定量药理及临床药理部分。 计算建模与模拟 RNA疗法的药代动力学/药效动力学关系呈现独特的组织驱动特征，决定治疗效果的核心因素是药物在靶组织的分布水平，而非血浆暴露水平。这种特殊关系要求建模框架需整合组织特异性摄取、亚细胞分布及靶点相互作用等多尺度过程。间接响应模型通过引入"信号转导"中间变量，成功刻画了siRNA介导的基因沉默延迟效应，在givosiran的临床研究中，该模型准确捕捉到给药后7-14天出现的药效峰值，较传统直接响应模型预测误差降 低62%。 寡核苷酸（ASOs和siRNAs）可高效对基因表达进行调控，其药效动力学（PD）主要由组织的药代动力学（PK）决定，而非血浆PK，从而为患者提供了更长给药间隔且更便捷的给药方案。这是由于寡核苷酸药物较短的血浆PK半衰期（以小时计）、较长的组织PK半衰期（以天至周计）及较长的PD或靶点结合持续时间（以天至周计）之间存在不一致性。其中GalNAc偶联的siRNAs的是这一现象的典型代表。这些独特的PK/PD关系需要通过建模与模拟（M&S）来整合特定分子类型的组织分布和靶点结合机制以连接血浆PK、组织PK和PD建立模型并进行模拟。由于人体组织的PK数据通常难以获取，因此借用非临床的组织分布数据建立模型进行预测可用于指导临床剂量选择和优化。传统方法如异速生长放大法和间接效应PK/PD建模已成功应用于寡核苷酸药物开发，而更具机制性的策略如PBPK 建模正被越来越多地采用。 下文中总结了来自10家IQ公司专家关于寡核苷酸的计算建模与预测（M&S）方法的最佳实践与建议（表1），并概述了已获批寡核苷酸疗法所采用的药代动力学/药效学（PK/PD）建模策略（表2）。基于上述总结和分析，与会者也讨论了开发和应用M&S工具支持寡核苷酸药物发现与开发过程中存在的局限性与知识空白，以期为该类产品的后续开发提供参考。 表1 ASO和siRNA建模模拟策略及应用的目前实践及IQ建议  总体而言，寡核苷酸的初始计算模型可基于非临床数据建立（如表2所示），用于指导首次人体试验（FIH）的剂量预测。当获得SAD和MAD研究的部分或全部临床数据后，该模型可进一步优化以指导2期和3期临床试验的剂量选择，以及确定器官功能受损等特殊人群（参见“临床药理学”章节）的剂量，并最终支持药品标签中治疗给药方案的确定。 表2 已上市GalNAC siRNA转化及临床研究中的PK/PD研究策略  1． PK/PD建模及模拟外周给药的ASOs、siRNAs及GalNAc偶联ASOs/siRNAs的模型具有相似的结构。以组织浓度作为输入变量的房室模型可有效描述这类药物的PK/PD行为。间接效应模型能够捕捉由于下游翻译和靶点周转率导致的PD延迟效应。可能需要额外的房室来解释ASOs/siRNAs在组织中的延迟转录和降解。 （1）siRNA（小干扰RNA） 自1998年Fire等人发现了siRNA以来，关于其作用机制和ADME特性的理解已比较深入。然而，siRNA疗法的临床转化研究仍存在挑战。有鉴于此，Ayyar等人开发了一个用于描述siRNA的分布和基因沉默的、小型的 PBPK /PD模型。该模型包括 ASGPR 介导的肝脏摄取，并通过使用异速放大法将参数缩放到其他物种，在将小鼠体外有效浓度范围数据转化为体内活性剂量方面取得了一定的成功。 K-PD模型通过PD或生物标志物数据估算剂量-反应关系，无需依赖药物浓度。这种方法对siRNA治疗药物尤为重要，因其血浆半衰期通常较短，血浆药物浓度难以反映持续的药效作用。此外，直接测量人体靶组织中的药物浓度存在较大困难，使得K-PD建模成为理想替代方案。然而，Boianelli等人分析了11种GalNAc偶联siRNA在小鼠、猴子和人类中的生物标志物数据，指出异速放大法对多个参数的估计可信度有限。虽然观察到人类生物相半衰期延长及潜在ED50降低的趋势，但多数参数缺乏跨物种一致性。 这些研究结果表明，由于靶点和生物系统的差异，K-PD模型参数可能无法像小分子药物那样在不同物种间可靠地进行异速放大。一个有前景的替代方案是开发基于寡核苷酸分子平台的PK/PD模型，该模型需同时考虑siRNA靶点生物学特性及化合物特异性清除或生物分布特征。若siRNA序列的改变不会影响不同寡核苷酸分子的药代动力学特性，采用固定PK参数的K-PD平台模型可帮助预测不同结构的同类型分子间的靶点结合能力。表2总结了在siRNA药物开发中应用K-PD及平台PK/PD方法时的策略与考量因素。 （2）ASO（反义寡核苷酸） 研究表明，外周给药的ASO的人体药代动力学特征可可靠地从非人灵长类动物（NHPs）特征推导出来，而鞘内给药的ASO的可转化性仍需进一步临床验证。药代动力学的可转化性可能取决于靶点。若靶点生物学特性保守，从非临床物种中推导的预测性更高。2．基于生理的药代动力学（PBPK）模型 （1）siRNA（小干扰RNA）目前，绝大部分获批的siRNA疗法是经皮下给药后靶向肝脏的GalNAc-siRNA，旨在治疗罕见疾病并且越来越多地用于常见的适应症。在fitusiran和givosiran开发过程中，研究者开发了应用于GalNAc-siRNA的简化的PBPK /PD模型。目前，该模型被改造成适用于GalNAc-siRNA的平台模型，并用于测试作用于其他靶点的GalNAc-siRNA，如inclisiran和vutrisiran。简化PBPK/PD模型成功用于临床转化的关键影响参数包括：寡核苷酸药物在肝内体的降解速率、内体逃逸分数、RNA诱导沉默复合体（RISC）装载及降解动力学和寡核苷酸药物的体内活性。这种基于模型的研发模型可以帮助确定那些试验是在测试新的GalNAc-siRNA分子时需要优先考虑开展的最有必要的试验测试，从而优化项目的转化研究策略。目前，研究者也已建立反映器官功能不全的病理生理学模型，用以评估器官功能不全对GalNAc-siRNA在人体的药代动力学（PK）、药效动力学（PD）及安全性的影响。尽管针对器官损伤与GalNAc-siRNA的专门的研究较为有限，但通过整合inclisiran和vutrisiran在相关患者群体中的临床数据，验证了该模型及其假设的可靠性。这些预测工具可为寡核苷酸临床药理学研究策略的制定提供支持，帮助项目团队确定寡核苷酸药物在器官功能不全人群中的给药方案，并为是否需要开展单独的器官功能不全受试者的临床试验提供决策依据。此类基于生理学机制的建模方法还能识别寡核苷酸药物转化研究中的特定知识缺口，为这个快速发展的领域启示未来研究方向。（2）ASO（反义寡核苷酸）鞘内给药的ASO是治疗神经系统疾病的有前景的治疗方法（如用于脊髓性肌萎缩症的nusinersen和用于肌萎缩侧索硬化症的tofersen）。PBPK模型可有效表征ASO在不同器官和组织中的分布，指导FIH研究设计。鞘内注射ASO后，可在脑脊液、脊髓、肝脏、肾脏、血浆以及特定脑区（如皮层和海马体）中测量ASO浓度以建立PK模型。该PK模型可与PD模型相关联，PD模型包括IC50和靶点周转率等参数。通过预测药物-靶点结合情况，该模型的研究结果有助于确定首次人体研究中适当的剂量和采样计划。如果根据毒理学终点推算的FIH剂量过高，PBPK 模型能提供更合理的方法来选择一个更安全的、有活性的剂量，以充分探索暴露-效应关系。尽管PBPK 建模可以利用现有的人体药代动力学/药效学数据进行验证，但脑组织等靶部位的药物浓度数据往往不足，限制了模型的预测效能。建议对靶组织中的ASO水平进行敏感性分析，以评估靶点结合的潜在影响。为提高寡核苷酸的开发效率，将PBPK 建模扩展至包括靶点药理学和病理学（例如PBPK -PD或系统药理学方法）可进一步提高模型的可预测性，就像在GalNAc-siRNA研发中的应用一样。（3）知识缺口、数据局限与建模挑战在行业层面的讨论中，已识别出一些知识缺口与数据局限。这些知识缺口和数据局限性使得针对这类寡核苷酸药物的计算建模模拟方法的开发、验证与应用面临挑战，包括（但不限于）：• 肝内体逃逸机制与RISC动力学：针对GalNAc-siRNA，需开展更多基础研究以深入理解肝脏内体逃逸的机制和动力学特性，以模拟可用于RISC装载的游离药物。同理，也需进一步确定siRNA装载至RISC复合物的动力学特征、RISC装载siRNA的后续降解动力学及其跨物种转化可行性。• 研究案例有限：尽管肝脏清除率转化研究前景广阔，但其数据基础仍较为有限。需要开展更多关于GalNAc-siRNAs的研究，以增强对当前转化研究方法的信心。• 基于建模方法的局限性：例如，K-PD模型无需经验性组织PK数据，但依赖于生物标志物和/或PD终点。这虽然减轻了组织采样的负担（在人体研究中通常不可行），但在从临床前物种向人类外推时，应谨慎考虑这些生物标志物和靶点结合终点在人于动物间的可转化性。• 生物标志物的挑战：循环生物标志物可用于评估寡核苷酸药物与靶点结合及作用情况。但这些数据与肝脏中mRNA敲除靶点的位置相距较远，且常受肝脏靶点敲除与生物标志物进入体循环这一过程中多个生理步骤的影响，这可能使得生物标志物的变化滞后于靶点的结合及作用。在应用基于临床前数据建立的模型预测FIH剂量时，必须仔细考虑这些因素。• 数据缺口：由于数据有限且缺乏可获取的人脑数据进行验证，针对大脑的ASO开展定量药理研究具有非常大的挑战。非人灵长类动物目前是用于预测人脑和脑脊液PK的可靠转化物种。然而，ASO在大脑中的半衰期较长，且非人灵长类动物研究成本高昂，因而很难获取全面的基于大脑的数据集。在临床开发中，由于难以获取脑样本，通常使用脑脊液中的PK和PD数据建立模型。当大脑与脑脊液的PK/PD之间的关系尚未明确时，基于脑脊液数据建立的PK/PD模型可能无法正确反映药物在脑内的PK/PD特征。虽然我们通常对siRNA和ASO采用相似的 PKPD 与 PBPK 研究策略，但实际上需针对每个具体案例量身定制建模模拟研究策略。如上所述，药物针对的靶组织类型（例GalNAc偶联型寡核苷酸、其他偶联型寡核苷酸或裸寡核苷酸）、给药途径（全身给药，鞘内给药）以及现有知识的多少或数据缺口的程度等因素，都会影响最优建模策略的选择。因此，尽管建模模拟方法在提升药物开发效率方面具有显著潜力（尤其针对寡核苷酸类药物），但其技术仍在研究中逐步发展。随着获批寡核苷酸类药物数量的增加，当前研究重点正聚焦于利用这些案例研究，持续提升模型接受标准，使这些应用于寡核苷酸药物研发的模型达到与其他成熟治疗分子（小分子药物及特定生物药）模型相当的水平，从补充证据发展为支持监管审批与临床豁免的依据。临床药理学1．QTc延长风险评估 监管机构建议根据ICH E14和S7B指南，评估寡核苷酸疗法的心脏安全性。然而，寡核苷酸具有较大的分子量（6–20 kDa），这限制了其与hERG离子通道的相互作用；并因其亲水性、带负电荷的特性及低膜通透性导致其分布容积较低，从而使得寡核苷酸类药物子啊心肌细胞的暴露量极低。因此，寡核苷酸引起QTc间期延长的风险被认为非常低。 对于鞘内注射局部给药的寡核苷酸（如nusinersen和tofersen），其血浆浓度显著低于脑脊液中的浓度，从而进一步降低其诱发心脏安全性风险。研究表明，已上市的寡核苷酸未在hERG测试中表现出抑制作用，且在非人灵长类动物研究中未观察到QTc间期延长。 迄今为止，尚未有已获批上市的寡核苷酸药物在临床上导致显著QT间期延长的报道。大多数寡核苷酸类药物的1期临床试验均包含心电图（ECG）监测以分析浓度-QTc间期延长反应关系，且针对米泊美生（mipomersen）、依立西兰（inclisiran）和伏拉奈索（volanesorsen）的专门QTc研究均未发现显著延长（表3）。表3  已上市寡核苷酸药物心脏安全性评估及肝、肾功能不全试验总结  针对寡核苷酸类药物的心脏安全性评估，IQ工作组的建议如下： （1）毒理学研究：在相关物种中进行重复给药毒理学研究，并结合心血管安全性遥测数据评估寡核苷酸药物诱发QTc间期延长的潜在风险。 （2）c-QTc分析：在早期临床研究阶段采集高质量心电图（ECG）及时间上与其匹配的PK血样采集，以满足E14指南要求，并可能豁免后期临床开发阶段对额外QTc监测的要求。 （3）体外hERG检测：可在FIH给药前进行hERG检测，以评估药物延迟复极化风险的大小。 （4）建议在临床2期结束前与美国食品药品监督管理局（FDA）心脏安全性研究跨学科评审团队进行沟通。此时可能已获得最大治疗剂量预测值及高临床暴露量信息，因而评估c-QTc研究的设计的合理性。 鉴于现有数据表明寡核苷酸药物的致心律失常风险较低，未来可考虑采用简化方法来评估寡核苷酸的QTc间期延长风险。2．药物相互作用（DDI）评估 寡核苷酸受CYP抑制剂或诱导剂影响的可能性较低。与小分子药物不同，寡核苷酸并非细胞色素P450（CYP450）酶或UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UGT）的底物。它们通过核酸内切酶和核酸外切酶水解，这意味着CYP和UGT的抑制剂或诱导剂预计不会与寡核苷酸发生药物-药物相互作用。FDA在其指南中承认了寡核苷酸药物不会发生 DDI的特点。寡核苷酸通常也不是主要外排转运蛋白（Pgp和 BCRP）或肝、肾摄取转运蛋白的底物。因此，这些转运蛋白的抑制剂或诱导剂预计不会显著影响寡核苷酸的PK。针对2-MOE-ASOs和GalNAc偶联siRNAs的全面评估显示，在临床相关浓度下上述两个分子均未发现显著药物相互作用。在FDA批准上市的寡核苷酸中，仅吉沃西兰因其独特的PD效应显示出了一定的药物相互作用，具体表现为对CYP1A2和CYP2D6的中度抑制，对CYP3A4和CYP2C19的影响较小。这是因为吉沃西兰的药效学作用是降低肝脏ALAS1酶（该酶是血红素生物合成途径中的首个限速酶）活性，降低了血红素的合成，进而能影响肝脏中依赖血红素的酶的活性，例如CYP酶活性。  IQ工作组对于寡核苷酸类药物的药物-药物相互作用的建议如下： FDA建议申办方参考FDA相关药物相互作用（DDI）指南，在体外评估寡核苷酸是否为CYP酶或转运蛋白的潜在抑制剂或诱导剂。现行最佳实践允许通过体外DDI研究为临床 DDI 研究豁免提供依据。除吉沃西兰观察到的基于药理作用机制的 DDI 外，监管申报文件中尚未发现其他寡核苷酸诱发DDI的案例。IQ工作组认为，无需对寡核苷酸与CYP酶或转运蛋白的相互作用开展标准的临床前评估。申办方可与卫生主管部门进行研究策略的沟通于对齐，特别是在pre-IND会议中。若预计寡核苷酸给药后可能诱发基于作用机制或疾病-药物相互作用，则可能需要开展临床 DDI 研究。3．器官功能不全对寡核苷酸类药物的影响 全身给药的寡核苷酸主要在肝脏蓄积并通过肾脏排泄，因此在临床开发中必须考虑肝功能不全（HI）和肾功能不全（RI）对寡核苷酸类药物的药代动力学的影响（表3）。图1展示了用于指导寡核苷酸类药物器官功能不全研究的决策树。临床前研究应阐明肝脏和肾脏在寡核苷酸清除中的作用，而机制性的 PBPK 模型可评估器官功能不全对寡核苷酸类药物PK的影响。 （1）肾功能不全试验（RI） 部分寡核苷酸类药物（如吉沃西兰）可导致血清肌酐升高及肾小球滤过率（eGFR）降低，需在给药过程中监测肾脏安全性生物标志物。若寡核苷酸的肾脏排泄率极低（<30%），在后期试验中纳入不同水平肾功能不全的受试者是可行的，前提是药有安全性数据支持。若寡核苷酸的肾脏排泄率显著（>30%）或安全性数据不足，则可在与监管部门协商后，与3期试验同步开展专门的肾功能不全研究。肾功能不全对寡核苷酸全身暴露量的影响亦可通过定量建模进行评估。 针对寡核苷酸的单独的肾功能不全研究，其总体设计原则与常规研究相同。在开展单独的肾功能不全研究时，可考虑采用简化研究设计。 总体而言，寡核苷酸在肾功能不全患者中不太可能产生具有临床意义的药代动力学（PK）、药效学（PD）或安全性的改变（表3）。即使观察到全身暴露量变化，也可能无需调整寡核苷酸的给药剂量。例如，golodirsen和casimersen在肾功能不全患者中的暴露量变化并未导致杜氏肌营养不良症（DMD）患者需要调整剂量。 类似地，inclisiran在肾功能不全研究中显示出暴露量变化，但由于其在肾功能不全人群和正常肾功能人群的药效学和安全性结果一致，未建议对肾功能不全患者调整剂量。 图1 寡核苷酸药物器官功能不全试验决策树 （2）肝功能不全试验（HI） 根据FDA）指南，建议将肝功能不全患者纳入非肝脏靶向寡核苷酸的临床试验。可通过定量建模评估肝功能不全对P）和PD的影响（表3）。对于肝脏靶向寡核苷酸，采用适应性或序贯设计可评估不同肝功能不全水平患者中的PK、安全性和有效性。若条件允许，可能需要开展专门的肝功能不全研究。虽然肝功能不全可能导致肝脏靶向寡核苷酸的血浆浓度升高，但这通常并不必然意味着需要调整剂量。例如，inclisiran在中度肝功能不全患者中显示出较不显著的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）降低，但无需调整剂量。GalNAc-siRNAs通常被设计为饱和ASGPR受体，从而限制了增加给药剂量的获益。 （3）种族药理学评估 目前关于种族/民族对寡核苷酸PK影响的研究数据有限，但PK可能因靶受体表达差异而存在不同。建议在2/3期临床研究中纳入多样化人群，通过群体PK研究评估种族相关协变量对药代的影响。对bepirovirsen、danvatirsen和inotersen等ASO，GalNAc-ASO类药物GSK3389404及 LNP -siRNA类药物patisiran的群体PK分析显示，种族对药物PK无显著影响。针对GalNAc-siRNA JNJ -73763989在中国和日本健康受试者中开展的1期桥接PK研究也表明，PK参数在不同种族间无显著差异。结论 RNA疗法领域在过去十年取得了里程碑式进展，siRNA和ASO药物凭借序列特异性靶向能力，成功突破传统小分子药物的“不可成药”靶点限制，已有14款药物获批用于治疗遗传性疾病、心血管疾病及癌症，未来可期。 siRNA和ASO疗法的研发需要综合考量多个维度。这些维度包括生物偶联类型（将药物与引导其靶向特定细胞的分子结合）、生物分析（检测组织或血液中的药物浓度）、生物转化（药物在体内的代谢过程）、组织分布、计算建模以及临床药理学。尽管部分监管机构已发布了监管指南草案，但许多方面仍缺乏详细且统一的指导原则。 IQ联盟核酸工作组文章汇集了从事这些疗法研究的行业专家的见解。它着重讨论了现行指南中的关键空白，并提供了实用建议，特别是在生物偶联物的评估、生物分析方法、生物转化评估和组织分布研究领域。 工作组还强调了计算模拟与预测（M&S）在寡核苷酸药物研发中日益增长的重要性。这些工具能够预测寡核苷酸类药物在体内的行为，支持FIH及有效剂量选择，并增进对组织特异性药物浓度（而非血浆浓度）如何驱动PD及治疗反应的理解。这对于在特定组织细胞内起作用的siRNA和ASO尤为重要。 寡核苷酸类药物作为一个分子量、极性均较大的分子，临床上发生QTc间期延长的风险非常低；该类药物不会直接对CYP450酶或转运体产生影响，其药代也不会受CYP450酶或转运体抑制剂或诱导剂的影响，但应评估是否可能发生PD效应引发的DDI；肝肾功能不全可能会影响寡核苷酸的循环暴露水平，但鉴于该类药物的PK、PD特征，一般不会根据循环暴露水平的改变调整给药剂量。