P-53

p53的故事具有启发意义。目前有大概12万篇论文涉及对p53这一强大的肿瘤抑制因子的研究。而就在几年前，编码p53的TP53基因被选为最‘‘热门’’的人类基因之一。现在，在Cell杂志创刊50周年之际，科学家反思了目前我们究竟对p53了解多少？本篇综述阐述了一个悖论：根据p53在癌症中的突变状态，p53既可以是肿瘤抑制因子，又可以是明显的癌基因。本篇综述还讨论了将海量p53知识转化为临床实践面临的主要挑战。接下来，就从回顾p53如何成为如此耀眼的“明星分子”开始……01早期实验表明：TP53是一个癌基因1979年，几个美国和欧洲的团队描述了一个新的细胞蛋白质。最初，每个团队都给它取了不同的名字，但随后这一小撮科学家最终一致同意将其称为‘‘p53’’。这个名字没有指定任何特定的功能，据说是根据它在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度推断出的分子量而来的（回顾起来，根据p53的实际分子量，它应该被称为‘‘p44’’，在克隆p53后确定）。尽管如此，对于p53来说，情况似乎非常简单：在正常细胞中几乎不存在，但在癌细胞（图1）和被SV40 DNA病毒转化的细胞中通常更丰富。许多RNA肿瘤病毒已被证明可以劫持细胞基因并驱使其过度表达，从而将它们从原癌基因转化为癌基因。因此，合理地假设p53是一种类似的癌蛋白质，其由肿瘤病毒或其他机制的上调可能会促进癌症的发生。但是，要严格推断出任何功能，首先需要克隆p53基因。这是在人类基因组测序之前很久，甚至是PCR发明的几年之前。因此，研究人员不得不采用一种繁琐的程序，通过仔细鉴定RNA（通过与数百个不同的重组DNA克隆物杂交）来进行，这些RNA可以转译成与p53特异性抗体反应的蛋白质。因此，现在由一名有能力的本科生可以在几周内完成的工作，曾经需要数年的密集团队合作才能完成。最终，成功地从几种癌细胞系中克隆出了p53基因（主要是cDNA）。在实验中测试时，它们产生了效果，包括使原代细胞永生化、在培养中产生多层生长，并在体内增加肿瘤发生的效果（图1），这确实与p53的原癌效应一致。因此，所有的迹象都指向p53是另一个癌基因。因此，癌症研究会议通常在其‘‘癌基因’’分会场次中讨论p53。然而，p53是一种癌蛋白的概念并没有持续很长时间。图1. p53研究的高度概要时间线0220世纪80年代晚期：野生型p53被证实为真正的肿瘤抑制因子在20世纪70年代初期，Knudsen提出了儿童癌症视网膜母细胞瘤需要两个单独‘‘打击’’的假设。这一开创性的假设暗示了肿瘤抑制基因的存在，并最终导致了在20世纪80年代中期克隆了RB1基因，使肿瘤抑制基因成为了分子现实。随后，1989年发现了人类结肠直肠癌肿瘤中存在一个TP53等位基因被删除，而另一个等位基因发生突变，这符合肿瘤抑制基因而不是癌基因的预期。很快，在许多其他癌症类型中也很快发现了类似的突变。值得注意的是，p53基因的缺失已经在一些小鼠癌症模型和人类癌细胞系中早先观察到，但这些观察被认为是不违背‘‘p53癌基因’’规则的例外。然而，当真正的野生型（WT）p53最终被测试时，它不仅未能引起培养细胞的癌变——事实上，它还强烈抑制了由典型癌蛋白驱动的转化，包括MYC和RAS。因此，真正的野生型p53表现为肿瘤抑制因子，而不是癌基因（图1）。20世纪80年代末标志着对p53作为中心肿瘤抑制因子的现代研究时代的开始。如当时指出的（直到现在仍然如此），通过对大量患者数据集的分析，TP53是人类癌症中突变最频繁的基因。TP53突变谱在某种程度上对于一个肿瘤抑制基因来说是有些不寻常的。TP53突变主要是错义变异，即点突变，导致完整长度、通常高表达的蛋白质。在这些突变中，有几个‘‘热点’’突变远远超过其他突变的频率。值得注意的是，DNA测序揭示了之前研究的所有癌基因p53 cDNA克隆体，这些克隆体是从癌细胞中分离出来的，也都携带了类似的点突变；正如下文所讨论的，这种突变体可以阻止WT p53的功能，并且甚至可能获得癌基因活性。此外，在许多保留了WT TP53的肿瘤中，它们的p53蛋白的功能性被其他改变所破坏，例如p53的负调控因子MDM2和MDM4（又称MDMX）的过度表达，这些因子可以单独功能性地抑制p53，并且也可以一起作用以将p53靶向蛋白酶体降解。未来所面临的挑战是解释WT p53的功能是什么？它如何作为肿瘤抑制因子发挥作用？以及p53突变如何促进癌症的发生？0320世纪90年代：p53的黄金时代p53成为热门话题后，90年代就产生了一系列关键发现，极大地推动了我们对p53的理解。科学界对p53的兴奋达到了顶点，1993年被选为《科学》杂志的年度分子。p53还被《新闻周刊》（1996年）封面报道，并成为众多报纸文章的主题，证明其名声甚至传播到了普通大众中。新的关键发现似乎完全澄清了p53的作用机制。首先是发现Li-Fraumeni综合征（Li-Fraumeni syndrome, LFS）易患癌症的家族携带有生殖系TP53突变（他们出生时一个等位基因为野生型，另一个为突变型），而绝大多数LFS患者的肿瘤已经失去了野生型等位基因。这证实了p53在人类中是一个肿瘤抑制因子。但是对于老鼠呢？它们对于确定p53在生理环境中的作用方式至关重要，并且是研究p53生物化学的必不可少的配套工具。基于对p53作为肿瘤抑制因子的兴奋，1991年6月在普林斯顿举办了国际p53研讨会。在几天的讲座中介绍了p53的功能和作用机制后，得知将有一个‘‘最新消息’’的报告，来自一组已经制备了p53敲除小鼠的团队；值得一提的是，就像前一个十年的基因克隆一样，工程敲除小鼠并不像现在那样简单。当消息最终被大众所了解时，已成功生成不表达任何p53的小鼠。但让所有人失望的是，现在三个月大的老鼠看起来完全正常。哦不！如果老鼠无论是否有p53都无所谓，那么为什么还要研究p53呢？幸运的是，对于研究人员来说（但对于老鼠来说是不幸的），那些外表正常的老鼠在普林斯顿研讨会后几个月就患上了侵袭性淋巴瘤（图1）。p53毕竟还是很重要的，并最终满足了所有符合资格成为一个全面的肿瘤抑制因子的标准。研究人员急切地希望利用这些小鼠的细胞来测试他们对p53可能如何起作用的想法，而最早的一个重要观察结果是来自p53缺失小鼠的细胞比它们的野生型对照的基因组更加不稳定。从p53缺失小鼠得出的关键发现并不止于此。事实上，随着逐渐增加复杂性的鼠模型的生成，许多关于p53的基本发现都有了牢固的基础。90年代还发现了p53的两个同源基因，p63和p73（便于称呼）。尽管每个基因都是非常有趣的研究对象，但可以肯定地说，它们都尚未完全被认识，即它们是否、何时以及如何发挥作用来抑制（或促进）癌症。与小鼠遗传实验并行的是关于p53作为蛋白质以及其在人类细胞中作用的研究。p53是一种DNA序列依赖性转录因子，其蛋白序列包括N端转录活化结构域和中央DNA结合结构域（DBD），后面是一个寡聚化结构域，以及在其极端C末端的复杂调节结构域。值得注意的是，大多数p53错义突变形式，包括频繁出现的热点突变体，都集中在DBD中。当DBD的晶体结构报告出来时，显示了p53如何结合到特定DNA序列上，它也指出了为什么热点突变体失败的原因。研究还表明p53在响应广泛的来自上游损伤传感器（如ATM）的压力信号时会经历广泛的翻译后修饰。这些修饰最重要的是通过破坏p53与MDM2/MDM4之间的相互作用来促进p53的活化，这些相互作用通常限制p53的基线水平和活性。巩固这些相互作用的重要性的发现是，鼠Mdm2或Mdm4的缺失会导致早期胚胎致死，而p53的共缺失完全挽救了这一情况，这一发现最终扩展到了活体老鼠的许多组织中。事实上，如果没有MDM2/MDM4，细胞中的p53可能会杀死我们！增加p53活性的细胞结果，包括细胞周期停滞、细胞衰老和凋亡细胞死亡，与p53作为肿瘤抑制因子的功能非常一致。与此同时，意识到p53是一个压力依赖的转录调节因子，引发了对其转录靶点的搜索。最早的发现表明，激活的p53诱导细胞周期停滞蛋白依赖性激酶抑制剂p21（又称Cip1、WAF1或CDKN1A）和促凋亡蛋白BAX的表达，进一步支持了一个简单的图景，即只需诱导几个关键基因，即可引起细胞增殖停滞或（更好的是）细胞死亡，这就是p53在癌症预防中如此重要的原因。然而，随着p53研究进入21世纪，故事变得更加复杂……042000年及以后：p53是复杂的！野生型p53对肿瘤抑制的错综复杂性随着研究人员继续热情地探索这种蛋白质的奥秘，p53展现了其惊人的复杂性。许多问题涌现出来，至今仍然没有答案。最初简单的观点认为，野生型p53有几个转录靶点，这些转录靶点可以解释其阻止细胞增殖或杀死细胞，并从而保护各种组织类型免受不同形式的癌症，但这种观点很快就被打破了。事实上，p53被证明是一种极具多功能性的蛋白质，它可以调节成百上千个基因，这些基因产物的种类多种多样，并且匹配了许多远远超出细胞周期停滞、凋亡和衰老的细胞结果。此外，不断增长的证据表明，p53对靶基因的调控在不同的细胞类型和组织之间存在很大差异，因此展示了p53作为转录调节因子的显著的上下游依赖性。现在我们知道p53可以组织大量的生物过程和细胞状态，包括多种关键的代谢途径、不同的DNA修复过程、干细胞调节、衰老、发育、生育等等。同样，p53在细胞死亡中的作用不仅仅局限于凋亡。例如，p53被证明是调节铁死亡的关键因子，铁死亡是细胞死亡类型中相对令人兴奋的新成员。此外，不同的压力信号引发不同的p53依赖性转录响应，进而产生多样化的细胞结果。因此，p53表现出了很高程度的‘‘分子智能’’。此外，显而易见的是，p53还具有非细胞自主活动。最值得注意的是p53与免疫系统的相互作用，其中野生型p53支持表达一些分泌因子，指导抗肿瘤的免疫微环境的形成。然而，这还不够令人望而却步，当有报道称缺乏诱导细胞增殖停滞、衰老或凋亡能力的p53突变体仍然能够抑制老鼠体内的癌症时，故事变得更加复杂了。因此，看似解决了的p53如何抑制肿瘤形成的问题再次变得开放。显然，并不能将单一的细胞结果归因于p53的工作方式。正如癌症可以被视为许多不同的疾病，随着起源组织和特定微环境的不同而变化，所以p53可能已经进化成了保护不同关键过程的机制，这些过程是特定组织背景下可能发生肿瘤的唯一性质。05突变型p53的谜团：权衡得失让我们回到使用突变p53（mutp53）的早期实验。为什么它们会增强转化和肿瘤生长？为什么癌细胞经常显示出过量的mutp53，以至于在组织学切片中强烈的p53染色被认为是肿瘤中存在TP53突变的一种指标？为了解决这个问题，有人提出一些mutp53变体可能已经获得了新的增强功能（gain of function, GOF）致癌活性（图1），重新提出了‘‘p53癌基因’’的概念，尽管形式有所变化。这也是基于这样的证据，即经过基因工程改造的mutp53敲入小鼠相对于p53敲除小鼠发展出了不同且更具转移性的癌症形式。进一步的对mutp53 GOF的支持逐渐出现，通过研究表明常见的与癌症相关的mutp53变异体在它们施加一系列分子和生化效应方面与WT p53的能力呈相反的镜像，包括细胞自主和非细胞自主的效应（图2），改变转录谱；破坏代谢；抑制DNA修复；诱导非整倍体；增强细胞增殖、存活、迁移和侵袭；削弱抗肿瘤免疫力；促进转移，所有这些可能都有助于癌症的发生。值得注意的是，WT和肿瘤来源的p53突变形式似乎在直接相反地调节着Hanahan和Weinberg提出的几乎所有经典的‘‘癌症标志’’。mutp53 GOF主要通过与其他细胞蛋白质的相互作用来发挥作用，包括特异性转录因子。特别有趣的靶点是p63和p73，它们是扩展p53家族的转录因子和成员。就像围绕着野生型p53的肿瘤抑制作用的混乱一样，最近实验上也对mutp53的GOF存在提出了挑战。如何解决这种明显的争议呢？几乎不可避免的结论是，mutp53的GOF是依赖于上下文的：同一个p53突变体在特定的环境下可能具有GOF，而在不同的环境下完全缺乏。这一点最典型的例子是观察到，p53热点突变体的影响可以从肿瘤抑制转变到促进癌症，这取决于肠道微生物分泌的代谢产物。图2. 不同的方法揭示了野生型和突变型p53的相反结果顶部：p53已经通过细胞和分子生物学方法、高分辨率结构分析以及包括蠕虫、果蝇和小鼠在内的众多动物模型系统进行了研究（在某种程度上，甚至包括大象），并结合对人类癌症患者数据集的广泛挖掘。底部：野生型（WT）p53有助于维持代谢稳态和基因组完整性，并抑制与癌症相关的过程，从而抑制肿瘤发生。与癌症相关的TP53突变消除了WT p53的肿瘤抑制活性，在missense突变的情况下，可能赋予产生的突变p53（mutp53）蛋白具有肿瘤促进的增益功能活性，进一步促进了癌症的进展。06药物在哪里？自从人们意识到p53的重要性以来，制药业和学术界都进行了大量的工作，以开发基于p53的治疗方法，主要目的是在失去p53功能的癌细胞中重建p53功能，从而希望引发它们的灭亡。早在20世纪90年代，至少有两种基于p53的策略已经进入了三期临床试验，这p53很快成为肿瘤学家的重要武器燃起了极大的希望。这两种策略都使用了改良的腺病毒，一种将野生型p53基因传递到肿瘤中，因此代表了真正的基因治疗；另一种则选择性地杀死缺乏功能性p53的癌细胞（溶瘤病毒）。然而，不幸的是，世纪之交时期病毒介导的基因治疗临床研究中出现的致命并发症触发了进一步基因治疗工作的几乎完全停止。尽管如此，基于p53的基因治疗在随后又在中国得到了重新审视，2005年批准用于癌症治疗的Gendicine的上市，这是一种表达p53的重组腺病毒。关于Gendicine的疗效，仍在等待最终结论。由于基因治疗不受青睐，随后对基于p53的治疗的工作主要采取了两个主要方向，取决于所治疗的癌症的TP53状态。大约一半的人类肿瘤没有TP53突变，但它们的野生型p53显然未能发挥其肿瘤抑制作用。由于p53主要受到MDM2/MDM4的直接结合限制，干扰这种结合的化合物是促进p53增强的首选候选物。另一方面，在表达mutp53的肿瘤中，设计能够“纠正”缺陷mutp53的化合物似乎是合理的，例如，通过促进其正确的重折叠，从而将过量的mutp53转变为过量的野生型p53。这也将消除假定的mutp53 GOF，在一个药物中达到双重“打击”。同样，以降解mutp53为靶点的化合物也应该消除其GOF。值得注意的是，靶向mutp53蛋白特别具有吸引力，因为这些蛋白是癌细胞特有的。事实上，多年来已经开发出许多MDM2/MDM4结合抑制剂和mutp53靶向化合物，并且在体外和动物模型中展示出令人印象深刻的抗癌活性。那么为什么临床上还没有批准的基于p53的药物呢？对于这个问题有多种答案。值得注意的是，MDM2抑制剂不仅会增强癌细胞中的p53，还会增强正常细胞中的p53，而这些正常细胞的p53被MDM2抑制。一些正常细胞，尤其是骨髓中的细胞，会受到影响，这使得MDM2抑制剂止步于临床试验。另一方面，虽然检测的mutp53重新激活分子表现出更可耐受性，但到目前为止它们在临床试验中尚未表现出足够的疗效。努力开发基于p53的癌症治疗仍在积极进行。一个有希望的途径可能是针对个别p53突变体的选择性化合物。例如PC14586就专门针对Y220C突变体。此外，受癌症免疫治疗取得的显著成功启发，越来越多的工作正在将p53知识用于肿瘤免疫根除，例如通过调节p53活性来改变肿瘤免疫微环境，或者通过引导免疫系统攻击展现mutp53衍生新抗原的癌细胞。太明显了，p53不容忽视。我们相信，尽管存在许多障碍，成功的基于p53的癌症治疗最终将成为现实。写在最后p53的故事生动地展示了最初看似清晰简单的东西实际上并非如此。许多曾经被认为已经完全回答的问题仍然需要更好的答案。此外，通过小鼠模型和人类疾病，现在已经认识到p53不仅是一个肿瘤抑制基因，还在发挥其他生理作用。这些研究能否为除癌症以外的其他疾病提供新的治疗方法？未来的研究肯定会扩大我们对这一令人惊奇的蛋白质的理解，并且甚至可能提供人们一直如此热切追求的长期期待的治疗突破。参考资料：[1] p53: A tale of complexity and context[2] The first 30 years of p53: growing ever more complex[3] Insights into wild-type and mutant p53 functions provided by genetically engineered mice[4] A dominant-negative effect drives selection of TP53 missense mutations in myeloid malignancies[5]The gut microbiome switches mutant p53 from tumour-suppressive to oncogenic[6]Glimmers of Hope for Targeting p53声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓