miniCMYA5技术成为首个通过基因操纵促进hiPSC-CM结构和功能成熟的手段。
复旦大学生物医学研究院、复旦大学附属中山医院心内科上海心研所路福建研究员和哈佛医学院波士顿儿童医院William Pu教授团队在 Nature Biomedical Engineering 期刊发表了题为：Virally delivered CMYA5 enhances the assembly of cardiac dyads 的研究论文。
该研究揭示了心力衰竭的重要致病机制——CMYA5表达水平降低，并开发了一种可通过腺相关病毒（AAV）载体递送的微型化CMYA5蛋白（miniCMYA5）。心脏特异性表达miniCMYA5稳固了dyad的结构，显著改善心脏功能，并在hiPSC-CM中启动了dyad的组装，为心力衰竭的治疗和hiPSC-CM的体外成熟提供了新方法。
在之前的研究中，研究团队使用生物素介导的邻近蛋白质组学标记技术（BioID），在活体、原位成功捕获了位于dyad空间的蛋白质组，发现了新型dyad蛋白CMYA5是调控jSR定位于Z线（dyad组装的早期和关键步骤）的重要分子。CMYA5缺失破坏了dyad结构、dyad在Z线上的定位以及jSR 的Ca2+释放，导致心力衰竭和对压力超载应激的不耐受。通过检测主动脉缩窄术（transverse aortic constriction，TAC）后小鼠和扩张型心肌病患者的心脏样本发现， CMYA5转录水平和定位正常，但与RYR2互作的CMYA5蛋白水平显著下调，成为心力衰竭中dyad结构破坏的重要因素。因此，增强CMYA5蛋白表达可能有助于保护dyad结构，抵抗和治疗心力衰竭。
AAV是主要的活体心脏基因递送载体， 但其容量有限（~4.7 kb），无法用于表达全长的CMYA5（长达11.2 kb）。为此，研究团队设计了一种可以通过AAV递送的CMYA5衍生物，分析不同物种中CMYA5氨基酸的保守性发现，N端（78-319，NT）和C端（2731-3739，MD9）高度保守。免疫荧光和免疫共沉淀实验表明，NT负责CMYA5的Z线定位，而MD9负责与RYR2的互作。在CMYA5 缺失的心肌细胞中，NT和MD9单独均无法恢复RYR2的定位。相反地，研究团队将NT融合到 MD9后，产生了足够小、AAV可装载的微型化蛋白——miniCMYA5，能够定位于Z线并与RYR2互作，在缺失CMYA5的细胞中恢复了RYR2的定位。进一步功能评估表明，miniCMYA5能有效替代全长 CMYA5，修复由于CMYA5缺失引起的dyad组装、Z线定位和心脏功能方面的紊乱。
在随后的实验中，研究团队采用两套方案测试AAV-miniCMYA5的治疗潜力：一是在新生小鼠注射全剂量AAV，成年后进行TAC手术，测试其抵抗心力衰竭的能力；二是对成年鼠进行TAC手术建立心力衰竭模型后进行AAV注射，验证治疗效果。通过超声心动图监测心脏功能、组织原位成像、免疫组化分析以及对单个心肌细胞进行收缩力和钙成像等操作，全面评估基因治疗效果。结果显示，通过 AAV-miniCMYA5增强CMYA5活性能稳定dyad结构，纠正异常的Ca2+释放，缓解心肌肥厚和功能障碍。与以往基于Junctophilin2 和Bin1的治疗策略相比，miniCMYA5展现出了更为优越的效果，是一种更具潜力的新型治疗心力衰竭的手段。
最后，对体外分化的iPSC-CM和健康供体的成熟心肌进行对比分析发现， CMYA5及其互作蛋白在转录和蛋白水平的缺失，可能是hiPSC-CM结构不成熟的重要因素。结合细胞微图案（micropattern）和工程化人源心肌组织（engineered heart tissue，EHT）技术，在hiPSC-CM中表达miniCMYA5促进了RYR2/jSR与Z线的对齐，增加了钙释放的同步性和钙瞬变的幅度，同时提高了EHT的收缩力。miniCMYA5技术成为首个通过基因操纵促进hiPSC-CM结构和功能成熟的手段。
复旦大学路福建研究员为该论文第一作者和共同通讯作者，波士顿儿童医院William Pu教授为论文共同通讯作者。此外，该研究还得到了中山大学吴泽璇博士，湖北大学张冬卉教授课题组，西安交通大学谢文俊教授，波士顿大学 Francisco Naya教授，宾夕法尼亚大学Kenneth Margulies教授课题组，哈佛大学Kit Parker教授课题组，加拿大卡尔加里大学Wayne Chen教授的帮助和支持。
