Tricaprylin

摘 ｜ 要按照 2025 年版《中国药典》编制大纲确定的工作目标和任务，现已完成 2025 年版《中国药典》中药用辅料标准的制修订工作。其中药用辅料新增品种标准 52 个，与 2020 年版相比增长 15.5%, 总数已达 387 个。本文着重介绍了 2025 年版《中国药典》中药用辅料新增品种标准的总体情况和主要特点，以期对《中国药典》的使用者正确理解、执行或运用药典标准有所帮助。《中国药典》是国家药品标准的重要组成部分，循的技术要求，其中不仅包括中药、化学药和生物制是药品研制、生产 (进口)、经营、使用和监管所应遵品等药品标准，药用辅料和药包材标准也是不可或缺的重要组成部分。《中国药典》2020 年版在药用辅料标准数量、标准体系和标准形成机制上均有明显提升和完善, 共计收载了 335 个药用辅料品种 (规格), 虽比上一版增加了 24%, 但还远不能覆盖已上市制剂中的药用辅料品规。按照 2025 年版《中国药典》编制大纲确定的工作目标和任务，在国家药品监管部门的指导下，国家药典委员会组织数十家标准提高课题承担单位深入研究，并经第十二届国家药典委员会药用辅料专业委员会全体委员和特邀专家的认真审核，现已完成 2025 年版《中国药典》中药用辅料标准的制修订工作。其中药用辅料标准新增 52 个，与 2020 年版相比增长 15.5%, 总数已达 387 个。本文着重介绍 2025 年版《中国药典》中药用辅料新增品种标准的总体情况和主要特点，以期对《中国药典》的使用者正确理解、执行或运用药典标准有所帮助。《中国药典》2020 年版第一增补本收载的 11 个新增药用辅料的有关情况已另文介绍，本文不再赘述，重点介绍《中国药典》第一次收载的 41 个药用辅料标准的有关情况。01总体情况2025 年版《中国药典》药用辅料新增品种标准体现了几组关键词。一是 "量变与提质", 本版药典新增药用辅料标准不仅从数量上又有了大幅提升，进一步缩小与美国药典 (收载 500 余个药用辅料各论) 的差距；而且新增品种中包含中药、化药、生物制品的多种剂型所用的常用及特殊药用辅料，标准更加凸显药用辅料的关键质量属性，从名称到每个项目更加规范严谨。 二是 "协调与率先", 一方面加强了与国际、国内相关标准的协调 ", 药辅同源品种标准的协调，同品种多规格和同系列品种标准的规范与协调；另一方面，也敢为人先，在各国药典中率先收载了微晶纤维素丸芯、预胶化磷酸羟丙基二淀粉酯、苯度氯铵和培化磷脂酰乙醇胺等多个标准，以及研究制定了一批更加简便、精准、绿色环保的检验方法。三是 "配角与主角", 国家药典委员会一直践行 "政府主导、企业主体、社会参与" 的工作模式，鼓励药用辅料生产、使用、检验、科研等各类机构积极参与药用辅料标准制定。本版药典新增药用辅料标准的起草单位既有药品检验机构，也有科研院校，更有生产企业，充分发挥了各自的专业优势。为保障工作质量，提高工作效率，还特设了 "指导单位" 模式，以便为生产企业和首次参加药典标准制定的单位提供精准的帮扶，使更多有技术实力的单位更容易成 为药典标准制定的主角。2025 年版《中国药典》中新增的药用辅料标准见表 1。02新增药用辅料标准主要特点2.1油脂类药用辅料油脂类药用辅料是药用辅料中非常常见的一大类结构多样、分析难度大的复杂辅料，包括各种高级脂肪酸甘油酯的混合物、类似物或衍生物。这类辅料可作为溶剂、润滑剂、乳化剂、软膏或栓剂基质、增溶剂、稳定剂等，常用于多种传统制剂，也可在脂质体、脂肪乳等新型制剂中发挥递送或载药的重要功能，应用范围广、发展潜力大、质控要求高。2.1.1 芝麻油药用辅料芝麻油系胡麻科植物芝麻的成熟种子经榨取并精制得到的脂肪油，其组成是以各种脂肪酸甘油酯的形式存在。在制剂中通常作为溶剂或油相使用，给药途径包括口服、注射和外用，如阿法骨化醇软胶囊、黄体酮注射液等。美国药典 (以下简称 USP, 含 NF 的内容)、日本药典 (以下 简称 JP) 以及《中国药典》一部均有芝麻油品种标准 收载，欧洲药典 (以下简称 EP) 收载的名称为精制芝麻油。本次药用辅料标准起草过程中，重点对芝麻油的甘油三酯组成检测方法进行了研究，对 USP 的归一化法和 EP 基于蒸发光散射检测器的线性外标法的计算结果进行了全面比较，探究了普通型色 谱柱的检测能力，扩大了检测方法的普适性，最终建立的检测方法可区分芝麻油的 21 种甘油酯组分。2.1.2 蓖麻油药用辅料麻油为大载科植物麻的成熟种子经榨取并精制得到的脂肪油，以各种脂肪酸甘油酯的形式存在。蓖麻油中含有 85%~92% 的蓖麻油酸，蓖麻油酸含有羟基，因此蓖麻油的溶解性和黏度与其他天然油脂有明显差异。 在制剂中多用于局部用的乳膏和油膏，浓度为 5%~12.5%; 由于黏度大，注射和眼用时表现明显的缓释特性；还可以用于口服片剂、胶囊剂等，在包衣处方中，麻油的加入可以延缓氯吡格雷的释放。 在 USP、EP 和 JP 以及《中国药典》一部中均有蓖麻油品种标准收载。本次药用辅料标准起草过程中，重点研究并建立了加校正因子的蓖麻油酸归一化法，对蓖麻油中油酸异构体异油酸进行了定性和限度研究，并首次制定了本品甲氧基苯胺值 (供注射用) 的限度。此外，对 USP 收载的 ELSD 归一化法检测三酰甘油组成的方法进行了深入研究，证明其方法和限度存在不合理之处，故未收入《中国药典》。2.1.3 葵花籽油药用辅料葵花籽油为菊科植物向日葵的成熟种子提炼精制而成的脂肪油，以各种脂肪酸甘油酯的形式存在，其中亚油酸 (亚麻油酸) 所占比例最高。在制剂中主要用作溶剂，如黄体酮软胶囊。USP 和 EP 对葵花籽油均有收载。本次标准起草过程中，重点关注了碘值的测定方法，由于葵花籽油中高不饱和脂肪酸占比高，故在《中国药典》 通则 0713 脂肪与脂肪油测定法的基础上延长了反应时间，确保了检测结果的准确性；针对脂肪酸组成项目，根据葵花籽油主要脂肪酸的含量差异，配置不同浓度的对照品溶液，有利于色谱的分离效果。2.1.4 棕榈油棕榈油在制剂中主要用作包衣剂和乳化剂，目前 USP 有收载，企业标准各不相同。 本次标准研究中发现，USP 中薄层鉴别项有方法 1 和方法 2 两种，但方法 2 系统适用性比方法 1 差，故最终采用了更加准确可行的方法 1。在脂肪酸组成项目的研究中发现，亚麻酸包含 α - 亚麻酸和 γ 亚麻酸，这两种形态在自然界中均有可能存在，故本次起草标准中明确了亚麻酸的类型，使得标准更加完善严谨。2.1.5 氢化棕榈油氢化棕榈油属于氢化植物油类，由棕榈油进行精炼和氢化而获得，其中主要含有棕榈酸和硬脂酸的甘油三酯，在药物制剂中通常用于栓剂、胶囊剂、片剂、膏剂等。目前只有美国药典 (USP) 收载，企业标准各不相同。本次标准研究中，结合本品的生产工艺建立了适宜的标准，可促进对该药用辅料应用的深入研究。2.1.6 氢化植物油氢化植物油是以植物来源的油经过精制、漂白、氢化脱色及除臭、喷雾干燥而制得，主要含甘油三酯。常用的植物油来源为棕榈油、大豆油、棉籽油等。氢化植物油可作为亲油性控释制剂的基质形成材料，也可在制备油基液体和半固体配方中用作黏度调节剂。USP 和 JP 收载了氢化植物油品种标准，同时多国药典也单独收载了氢化大豆油、氢化棉籽油和氢化棕榈油的品种标准。本次标准起草过程中，兼顾了各国药典的各氢化植物油品种标准，首次制定了氢化植物油的酸值、碘值和皂化值等油脂类物质的常规质量控制项目；同时也对油脂氢化工艺常用的催化剂镍的残留进行了研究，建立了方法和限度；此外，考虑到氢化植物油特殊的熔点，在不皂化物、酸值和干燥失重检测时可能出现凝固结团等异常现象，在标准中对操作细节进行了规范。2.1.7 十四醇十四醇又名肉豆蔻醇，是从含十四醇酯的植物油脂如椰子油、棕桐仁油等中提取并在催化条件下加氢还原制得，主要用作柔软剂和稳定剂等。本次标准研究中，结合本品的结构特点制订了油脂类辅料通用的质控项目，包括酸值、经值、碘值、皂化值、水分等，并重点研究了有关物质和含量测定项目。本品收载于 USP, 但在研究中发现 USP 方法中使用的色谱柱效果不佳，在高于 180℃ 时有严重的柱流失现象，导致色谱图中基线不平，影响有关物质检测，因此通过筛选不同填料的色谱柱并优化色谱条件，建立了聚乙二醇的气相色谱法用于测定本品的有关物质和含量。2.1.8 油酸油酸来源于植物油脂，经纯化、精制而得，含不同含量的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，主要成分为顺 - 9 - 十八烯酸。其在脂肪乳注射液 (如中 / 长链脂肪乳注射液、丙泊酚中 / 长链脂肪乳注射 液) 中可作为乳化剂，使其形成稳定的油 / 水体系；也常在局部用制剂或口服制剂中作为乳化剂、透皮促进剂或软胶囊基质，以提高难溶性药物的生物利用度等。本品在 CDE 原辅包登记信息平台登记为 "油酸" 或 "油酸 (供注射用)",USP 和 EP 均有收载，国内标准有 1953 年版《中国药典》、注册标准和企业标准，各标准差异大、协调难度高。本次药用辅料标准起草过程中，综合国内外标准及药用辅料油酸生产和使用现状，考察了其残留溶剂、元素杂质、脂肪酸组成、细菌内毒素等二十余个质量控制项目，为使标准项目设置全面但不冗余，最终确定收载酸值、碘值、过氧化值、脂肪酸组成、含量测定等十余 项，并设定了合理的限度。考虑到作为药用辅料的 油酸应用范围广，含量限度跨度大，标准中设置了适 宜的含量限度表述方式，即 "含油酸不得少于 65.0% 且不得少于标示百分含量", 并在标示项要求企业明确本品的油酸百分含量，此种方式既体现了对油酸含量的最低要求，也有助于企业区分和选用适宜纯度的规格。2.1.9 三辛酸甘油酯三辛酸甘油酯由辛酸与甘油经酯化而得，常作为润滑剂、乳化剂及药用载体，同时适合应用于多囊脂质体的制备，起到填充缝隙、 防止膜融合、维持蜂窝状多囊结构稳定的作用，在脂质体相关上市产品及研发阶段越来越多地被运用。 本品收载于 USP, 本次标准不仅制订了酸值、经值、 过氧化值、皂化值、水分等油脂类辅料通用的质控项目，还研究并分别建立了测定甘油酯含量和脂肪酸组成的 2 种气相色谱法。此外，鉴于 USP 测定该品种游离甘油采用的氧化还原反应显色滴定法专属性 较差，首次建立了更加准确可行的分子排阻色谱法。2.1.10 抗坏血酸棕榈酸酯抗坏血酸棕榈酸酯系由棕榈酸与 L 抗坏血酸酯化而得，常用于口服和外用制剂中，作为对氧不稳定的药物的抗氧化剂，抗坏血酸棕榈酸酯与 α - 生育酚的组合显示出显著的协同作用。本次药用辅料标准起草过程中发现，样 品在储存过程中极易被空气氧化而导致颜色偏深，因此需注意贮存条件；关于含量测定，EP 采用滴定法，USP 采用高效液相色谱法，经比对分析，标准中收载了灵敏度和专属性更好的高效液相色谱法作为含量测定方法。2.1.11 聚氧乙烯 (15) 羟基硬脂酸酯聚氧乙烯 (15) 羟基硬脂酸酯为环氧乙烷和 12 - 羟基硬脂酸以 15:1 的比例缩聚而成的混合物，主要成分为聚乙二醇与 12 - 羟基硬脂酸的单酯、聚乙二醇与 12 羟基硬脂酸的双酯和 12 - 羟基硬脂酸聚乙二醇醚，以及游离聚乙二醇。目前 CDE 原辅包登记信息平台登记的名称为 "15 - 羟基硬脂酸聚乙二醇酯", 考虑到该名称可能存在歧义，故参考中国药用辅料通用名称命名原则命名为聚氧乙烯 (15) 羟基硬脂酸酯。该品种作为一种新型非离子型增溶剂和乳化剂，在口服胶囊、注射剂、注射用乳剂、眼用制剂和滴鼻液等制剂的应用中表现出良好的安全性，并且可以促进药物吸收和提高生物利用度。在参考《中国药典》通则 0713 脂肪与脂肪油测定法进行实验时发现，空白实验中用硫代硫酸钠将溶液滴定至淡黄色后加入淀粉指示剂变蓝，然而含有样品时加入淀粉指示剂不变蓝色，推测是由于样品对生成的碘有包合作用，故本次制定的标准中改为根据溶液颜色变化来判断滴定终点。根据工艺特点还专门建立了该品种环氧乙烷和二氧六环限度控制的检测方法 。该品种在合成过程中加入镍或氢氧化钠作为催化剂，研究中发现有样品镍含量超过控制阈值 (限度的 30%), 为满足制剂安全性和有效性要求，在标准 "注" 中提示了元素杂质镍的风险，并提供了检测方法。2.2淀粉类药用辅料淀粉不仅是人类重要的食物来源，作为药用辅料的历史距今也有 100 多年，是传统的大宗药用辅料。淀粉类药用辅料包括原淀粉和改性淀粉，在片剂、胶囊剂、颗粒剂等传统剂型中作为常用的赋形剂、填充剂、黏合剂和崩解剂等。原淀粉在制剂中的应用很大程度受淀粉原有性质的影响，为改善其应用性能或拓展在制剂中的新应用，在原淀粉固有特性的基础上，通过物理、化学、酶或发酵中的一种或多种方法加工处理而制得一系列改性淀粉，使其更适用于制剂的应用功能需求。淀粉类辅料具有良好的生物相容性和可降解性，随着淀粉加工技术的不断发展和制剂应用需求的提高，改性淀粉被广泛用于新型的药物递送系统中，在热特性和 pH 依赖性药物递送模型、纳米颗粒、凝胶等方面均表现出良好的预期，使得淀粉类药用辅料具有巨大的发展潜力。2.2.1 羟丙基淀粉羟丙基淀粉是淀粉部分或全部游离羟基被羟丙基基团醚化的产物，有良好的稳 定性和成膜性，主要用于黏合剂和填充剂，因淀粉来源不同，有不同的质量要求。USP 和 EP 均有收载，但收载方式不同，USP 将不同淀粉来源制备的产品 按不同的品种分别收载；EP 将不同淀粉来源的产品以同一个品种进行收载，但在检测项目下对不同淀 粉来源的产品进行区别要求。《中国药典》采用了 EP 的方式。本次着重对工艺过程中可能产生的基因毒性杂质 1 - 氯 2 - 丙醇及 2 - 氯 -- 丙醇的检测方法进行了研究，首次建立了灵敏度和专属性良好的气 质联用方法以减少样品的干扰。2.2.2 预胶化磷酸羟丙基二淀粉酯预胶化磷酸羟丙基二淀粉酯系淀粉在碱性条件下，通过醚化反应和交联反应后，经洗涤、过滤、干燥、糊化、粉碎等处理制得。通过羟丙基和交联改性的磷酸羟丙基二 淀粉酯，抗剪切、耐酸性方面得到显著改善，提高了透明度和冻融稳定性。该品种可作为增稠剂、黏合剂等，各国药典虽均未收载，但在药品中有多年的应用历史。本次标准研究中参考了《中国药典》中淀粉类品种、US"改性淀粉" 和 "预胶化改性淀粉"、 GB29931-2013 食品添加剂羟丙基二淀粉磷酸酯等标准，结合生产工艺和应用情况，对其无机杂质、有 机杂质等进行了深人研究。根据该品种的属性，重点对基因毒性杂质 1 - 氯 2 - 丙醇和 2 - 氯 - 1 - 丙醇的检测方法进行了优化，提高了专属性和检测灵敏度。2.2.3 磺丁基倍他环糊精钠磺丁基倍他环糊精钠主要作为增溶剂和稳定剂使用，目前已在多种上市的癫痫药、抗真菌药、抗病毒药等中使用，如被批准用于治疗重症新冠肺炎的瑞德西韦。USP 和 EP 均有收载，但在关键质量控制指标的检测方法上存在较大差异，如平均取代度、4 - 羟基丁烷 - 1 - 磺酸钠、双 (4 - 磺丁基) 醚二钠等。本次标准研究中，重点对比了相关方法的灵敏度、准确度和适用性，兼顾实际 使用需要，科学制定标准。2.2.4 L - 乳酸乳酸通常以淀粉质原料 (如玉米、 大米、薯干等) 为基础，经处理转化为糖类后发酵制得，为 2 - 羟基丙酸及其缩合物的混合物，有旋光性，D - 乳酸人体代谢困难，医药领域使用的原辅料均为 L - 乳酸。本品作为药用辅料时，常用作 pH 调节剂、 助溶剂等，可用于注射剂、口服制剂和外用制剂。 EP 收载了乳酸 (外消旋) 和 (S)- 乳酸的标准；JP 分别收载了乳酸和 L - 乳酸的标准；USP 收载的乳酸标准在定义中明确乳酸有外消旋和左旋两种，通过糖发酵得到的乳酸为左旋，合成得到的乳酸为外消旋；《中国药典》2020 年版二部收载的乳酸原料药标准尚无此方面的规定或分类。本次药用辅料标准研究中，根据实际使用的产品特点，对本品旋光性和制法进行了描述，并增加了比旋度测定以控制本品为左旋，增加红外鉴别以提高鉴别专属性，并结合本品生产工艺增加了乳酸单体、有关物质和乙醚不溶物检查等。2.3胶类药用辅料2.3.1 卡拉胶卡拉胶是一种天然的硫酸酯化多糖高分子聚合物，从角叉菜、鹿角菜、麒麟菜等红藻中提取而得，它是红藻植物组织纤维素纤维之间的间隙基质。卡拉胶具有良好的凝胶性、增稠性、乳化性和成膜性等特性，作为药用辅料应用于各种非注射给药剂型，包括混悬剂、局部用凝胶、滴眼剂、栓剂、片剂、胶囊剂和微球载体材料等。不同的原料来源可提取出不同型号的卡拉胶产品，常用的卡拉胶型号有 κ . 和 λ 型，三种型号的卡拉胶因硫酸酯取代的位置和数量不同，使其形成胶体的性质不尽相同。本次标准起草中重点关注卡拉胶的分型以及功能性项目的建立，通过红外鉴别和化学鉴别相结合，可有效鉴别卡拉胶的型号；研究制订了黏度、凝胶强度和硫酸酯等功能性指标的评价方法，并列入了标示项下。2.3.2 明胶明胶是一种从动物结缔组织中的胶原蛋白经过适度水解和热变性得到的蛋白质。它具有优异的理化特性和生物相容性，因此在药用辅料领域有着广泛的应用。USP、EP、JP 收载了明胶标准，《中国药典》二部收载了用于止血海绵的明胶标准，《中国药典》2020 年版四部仅收载了胶囊用明胶的标准。本次明胶药用辅料标准研究中，解决了现有鉴别方法专属性不强的问题，新建立的方法能够针对胶原的特征氨基酸一羟脯氨酸进行检测，从而有效区分明胶与其他蛋白质 "; 标准涵盖了非凝冻型明胶，拓宽了药典标准的适用范围；结合本品的生产工艺，建立了铁和锌的检测方法及限度标准。2.4聚合类药用辅料2.4.1 聚维酮系列聚维酮是由 N - 乙烯基咯烷酮聚合反应得到的合成聚合物，属于非离子型水溶 性高分子化合物，具有优良的生理惰性和生物相容性，应用广泛，和纤维素类衍生物、丙烯酸类化合物并称为三大主要合成药用辅料，常用作黏合剂、助溶 剂、固体分散体载体和缓控释制剂的致孔剂等。 《中国药典》2020 年版四部仅收载了聚维酮 K30, USP、EP 和 JP 均以聚维酮 1 个品种进行收载，其中只有 EP 对聚维酮 K 值进行了细分，分为 K12、K17、 K25、K30 和 K90。本次《中国药典》新增了 K25 和 K90 两个规格。因为反应机理不同，聚维酮 K25、 K30 和 K90 的 2 - 吡咯烷酮实测值不同，本次首次根据不同规格聚维酮的生产特点制定了 2 - 吡咯烷酮不同的限度值。本次研究中注重标准的国际协调，按 ICHQ3D 的理念对元素杂质进行了评估。同时，针对国外药典聚维酮 K90 甲酸检测方法容易出现分离不佳的情况，对该方法进行了优化，提高了方法 的可操作性。2.4.2 丙烯酸酯类共聚物丙烯酸酯类共聚物是由丙烯酸、甲基丙烯酸及其酯类，按不同的比例共聚而成的一类高分子聚合物，具有安全、稳定、惰性及无刺激等优点。聚合反应包括本体聚合、溶液聚合、 反相乳液聚合和反相悬浮聚合，选择不同的单体可聚合成性能各异的聚合物，常作为薄膜包衣、药物控释材料使用。该系列品种均被 USP 和 EP 收载，但 收载形式存在细微差异：如甲基丙烯酸 - 甲基丙烯酸甲酯共聚物，USP 以 1 个品种进行收载，EP 则根据单体含量的不同分为 2 个品种。另外，甲基丙烯酸甲基丙烯酸甲酯共聚物 (1:1) 和 (1:2), 以及甲基丙 烯酸胺烷酯共聚物分别与《中国药典》现行版收载的聚丙烯酸树脂 IIIV 非常相似，但在聚合工艺方面存在不同，前者为乳液聚合工艺，后者为溶媒聚合工艺。由于聚合工艺的不同，导致产品的黏度、分子量分布等存在一定差异，若用前者直接替换已在市场中使用的后者，可能会导致相关制剂出现问题。为给制剂的研发提供更多的辅料选择，本次新增了甲基丙烯酸 - 甲基丙烯酸甲酯共聚物 (1:1) 和 (1: 2)、甲基丙烯酸胺烷酯共聚物，同时还增加了甲基丙烯酸 - 丙烯酸乙酯共聚物及其水分散体、部分中和系列品种标准。本次标准研究中结合丙烯酸酯类共聚物的特点，重点研究了红外鉴别、黏度、残留单体、元素杂质、单体含量等项目。在标准中附有各品种的红外光吸收对照图谱，方便鉴别比对；对残留单体进行控制，确保产品的使用安全；合理设置炽灼残渣项的限度，更好满足实际使用中的需求；由于部分丙烯酸酯类共聚物会添加表面活性剂，可能对制剂产生一定影响，故在标示项要求明确标明表面活性剂的名称与用量。2.5丸芯类药用辅料一微晶纤维素丸芯微晶纤维素丸芯是由微晶纤维素加水制粒而得，主要用作胃肠溶微丸制剂和缓释控释制剂的芯料载体材料。相比常用的蔗糖丸芯，微晶纤维素丸芯具有更高的强度和硬度，还具有无糖的临床应用优势，本品在上市制剂中广泛使用。目前，国内外各国药典均未收载该标准。微晶纤维素丸芯进口产品执行其进口注册标准，国产产品多执行局颁标准或各企业内控标准。本品标准中的安全性指标与其原料微晶纤维素的标准基本一致。粒度是本品的重要功能性指标，由于本品粒度常根据客户的需求定制，产品的粒度规格较多，不同规格产品的粒度应由其标示粒径进行区分，故在标准标示项提出要求注明丸芯的粒径范围。起草过程中还对本品的粒度粒型和颗粒表面凹凸度等影响应用的功能指标进行了相关研究，因产品和方法应用的成熟度等原因暂未体现在标准中。2.6气体类药用辅料一氮氮的化学性质很稳定，常温下很难与其他物质发生反应，因其化学惰性，常用作保护气体，以防止某些物体暴露于空气时被氧化；在医药行业作为空气置换剂用于保证药品的稳定性而广泛使用。氮在 EP、USP 和 JP 中均有收载。标准研究中，通过网络问卷、现场座谈、发函和电话沟通等多种方式，广泛 收集生产企业和制剂应用企业的建议，对本品的生产工艺、应用场景以及重点关注的质量属性进行深人调研，首次将常用的两种制备工艺来源 (深冷法和分子筛分法) 的产品列入标准，制订了适宜的水分和氧的限度。国外药典均采用气相色谱测定氮含量 (氮含量=100-氧含量), 且色谱条件基本一致，但在该色谱条件下，除氧外，其他杂质如水分、一氧化碳、二氧化碳等均无法检出。本次标准起草中，研究建立了采用微量氧分析仪测定供试品中的氧，专属性准确性好、灵敏度高，并采用质量平衡法计算氮含量，涵盖氧、水分、一氧化碳、二氧化碳等杂质，含量测定结果更准确且方法简便易行。2.7氨基酸类药用辅料2.7.1 盐酸精氨酸盐酸精氨酸是一种具有显著生理活性的氨基酸，可作为保护剂、稳定剂、pH 调节剂应用于制剂中。USP、EP、BP 和《中国药典》二部 均有收载，但收载的项目、方法或限度不尽相同。对于微量不溶性杂质和呈色物质的控制，《中国药典》二部中采用透光率检查，EP 和 JP 采用澄清度与颜色检查。本次药用辅料标准起草过程中，比较了这两种方法并选择更直观的透光率检查法，避免人为因素对测定结果的干扰。分别采用薄层色谱法和氨基酸分析仪法对样品中的其他氨基酸进行了考察，显示两种方法结果无显著性差异，相比而言，氨基酸分析仪法精密度、重复性和灵敏度高，但考虑到氨基酸分析仪较为昂贵，标准中仍采用薄层色谱法。另外，对加入醋酸汞作为掩蔽剂的非水滴定含量测定法进行了改进, 不仅避免了有毒试剂醋酸汞的使用，也使方法的精密度、稳定性和准确度更高。2.7.2 盐酸组氨酸盐酸组氨酸由微生物发酵或蛋白质水解生成，并经处理精制而得。它是各种含氨基酸营养制剂的主要原料，随着生物药物的快速发展，组氨酸及其盐酸盐因其独特的结构和性质，以 药用辅料形式被广泛应用于重组蛋白、抗体、疫苗、小分子核酸等生物制品的生产过程和制剂制备，主要作为缓冲剂、抗氧剂和稳定剂。盐酸组氨酸已被 EP、JP 和《中国药典》二部收载。本次药用辅料标准起草过程中，重点优化了其他氨基酸检查项的色谱条件，解决了氯离子干扰组氨酸主斑点问题；收紧了比旋度范围；对弱吸收杂质、生物胺类杂质、异构体、残留蛋白、残留核酸、元素杂质等进行了系统研究，根据样品的实际质量状况，对收载入标准的检验项目进行了优化。2.8抑菌剂类药用辅料2.8.1 苯度氯铵苯度氯铵为n-C12H25取代的二甲基苄基氯化铵单一组分，主要由十二烷基二甲基叔胺和氯化苄缩合制得。本品为具有杀菌作用的季 铵盐类阳离子表面活性剂，为眼用制剂中常用的抑菌剂。目前各国药典只收录了同系混合物苯扎氯铵，未单独收录苯度氯铵。本次标准研究时，参考苯扎氯铵、苯扎溴的标准进行了横向协调，设置了区分度更强的 "烷基同系物及其他杂质项"。根据本品合成工艺的特点，在标准中设置了有机杂质苯甲醇、苯甲醛和氯化苄的检查项。2.8.2 羟苯乙酯钠羟苯乙酯钠别名为尼泊金乙酯钠，系在氢氧化钠水溶液中加入对羟基苯甲酸乙 酯 (羟苯乙酯) 反应后精制而成。本品拥有尼泊金酯的抑菌性能和安全性能，同时克服了尼泊金酯水溶性低的缺陷，常作为抑菌剂用于口服、外用、局部等制剂中，也广泛用于医药、食品、纺织工业的抑菌以及其他领域，如化妆品、饲料、日用工业品的抑菌。 本次通过对比 USP 和 CB 标准，结合本品生产工艺，优化了检测方法，对其无机杂质、有机工艺杂质等设立了适宜的控制项目。2.8.3 苯酚苯酚作为常用的药用辅料在制剂中也起着抑菌防腐的作用，常用于胰岛素、催产素等注射剂中，也用于中草药制剂及外用制剂。本次药用辅料标准起草中，通过对比 USP、EP、JP 和中国药典二部等标准，结合本品生产工艺，对酸度、澄清度与颜色、水分、不挥发物、含量等项目进行控制。起草过程中对苯酚中的异丙基苯、丙酮、甲醇、甲氧基苯、甲基异丁基酮和苯等挥发性杂质均进行了考察并根据《中国药典》药用辅料与 ICHQ3C 协调的相关原则 '" 不在标准中设置相应项目。2.9动物来源2.9.1 角鲨烯角鲨烯具有免疫激活作用，MF59 和 AS03 等水包油乳液佐剂均使用角鲨烯，其中，MF59 已用于 Fluad 三价流感疫苗和 Fluad Quadriva lent 四价流感疫苗，证实其可增强免疫应答；AS03 已被用于 HIN1 和 H5N1 疫苗。该品种在 EP 中有收载。本次药用辅料标准起草过程中，考虑到本品为多烯产品，对碘值检测的操作细节进行了详细研究，最终采用反应活性更高的氯化碘参与反应；并对该品种的细菌内毒素和微生物检测方法进行了开发和研究，使其能满足生物制品的需要。2.9.2 硫酸鱼精蛋白硫酸鱼精蛋白作为药用辅料，主要用作络合剂，是由科鱼类新鲜成熟精子中提取的一组碱性多肽的硫酸盐。本品种作为药品收载于 EP、USP 和《中国药典》二部，后者目前质量控制较为简单，现有鉴别方法不能对不同来源的鱼种进行区分，且未收载有效的理化方法对含量及有关物质进行控制。本次药用辅料标准研究中参考 USP 建立了高效液相色谱法进行鱼种鉴别，并同时测定硫酸鱼精蛋白含量和有关物质，用更稳定的仪器分析方法替代了采用动物全血或血浆测定的方法，解决了动物法实验误差大的问题。此外，还采用液质联用技术对四个主要肽段的氨基酸序列进行鉴定，在标准后附标准图谱和四个肽段的氨基酸序列以供使用时参考。同时，考虑到生产工艺中使用到有机溶剂，建立了残留溶剂测定方法，并以推荐方法的形式给出，方便需要时使用。2.10其  他2.10.1 碳酸钙碳酸钙为药辅同源品种，作为药用辅料，主要用作固体制剂的稀释剂，在分散片中起缓冲和分散的助剂作用，还可用作糖衣片包衣过程的包衣材料、薄膜衣片的遮光剂。根据加工方法的不同，碳酸钙可以分为轻质碳酸钙和重质碳酸钙，轻质碳酸钙是通过化学反应获得，重质碳酸钙是通过对天然矿物物理研磨获得。本次药用辅料标准起草中，全面考察了元素杂质、功能性项目，增加了氟化 物、铅的检查项，优化了盐的检查方法，同时对碳酸钙的工艺和分类进行了提示，并要求标明产品的类型 (重质或轻质)、粒度和粒度分布、堆密度和振实密度的标示值，以供制剂企业选型。2.10.2 甘露醇本品为药辅同源，作为药用辅料，因其毒副作用小、生物相容性好、无吸湿性以及良好的口感，被用作填充剂、冻干保护剂和矫味剂等。USP、EP、BP 收载的甘露醇标准适用于所有晶型甘露醇 (a、p、8 和混晶),《中国药典》2020 年版二部甘露醇标准仅适用于晶型，而非 B 晶型甘露醇因其独特的理化性质在药物制剂中有巨大应用潜力。本次药用辅料标准建立了转晶方法，使标准涵盖了所有晶型甘露醇；结合使用途径，有针对性地进行微生物限度、细菌内毒素控制；增加了关键功能性指标粒度的标示，方便制剂厂家筛选适宜的辅料；对甘露醇的工艺杂质进一步确证；优化了含量测定方法，提高其专属性；该品种在合成过程中加入镍或氢氧化钠作为催化剂，为满足制剂安全性和有效性要求，在标准 "注" 中提示了元素杂质镍的风险，并提供了检测方法。2.10.3 氯化锌氯化锌常用作胰岛素注射液中的稳定剂，还可以起到缓慢释放胰岛素的作用，还可以用作眼用制剂中的稳定剂和抗过敏剂。本品在 USP、EP 和 JP 中均有收载，为无机矿物来源的小分子化合物，主要应用于注射剂中，故重点关注其元素杂质风险。通过全面评估发现，本品的铅元素存在风险，因此标准中设置了铅的检查项，采用原子吸收分光光度法；对于铝、钙、铁、镁等元素设置了检查项，采用了操作更为便捷的化学反应法；镉元素风险相对较小，在 "注" 项下进行提示。2.10.4 甘羟铝甘羟铝包括二羟基氨基乙酸铝的无水物和含水物，可用作贴膏剂 (如氟比洛芬凝胶贴膏) 等凝胶基质的胶黏剂。由于本品为有机络合物，水溶解性差，不易去除不溶于水的物质，合成工艺的原料或副反应产物 (如氢氧化铝等无机物) 可能残留在产品中，有效控制本品的有关物质是重点。目前国内外该产品采用的合成方法为异丙醇铝合成法，异丙醇铝是以异丙醇和铝为原料在氯化汞催化条件下合成的，因此在标准中对本品的异丙醇、氯化物和汞进行了控制。此外，鉴于含量测定项是通过滴定法对铝进行检测，但氢氧化铝等杂质的存在会对结果造成影响，含量测定结果不能反映产品纯度，因此设置了氮含量检查项进一步控制了含氮物的量，对本品的纯度和含量进行了双重控制。2.10.5 磷酸三丁酯磷酸三丁酯由正丁醇和三氯氧磷酯化而成，可作为溶剂或增塑剂应用于注射剂中。本次标准起草过程中，对中外药典的酸值测定法进行了比较研究，确定了操作性更强的实验条件；对元素杂质进行了系统评估，铅元素超过了注射剂中元素杂质的控制阈值，但未超过限度，故在标准中 "注" 项下增加控制要求。2.10.6 苯甲酸苄酯苯甲酸苄酯为药辅同源产品，作为药用辅料主要用作助溶剂。其在 USP、EP 和 JP 中均有收载，均采用酸度和醛等理化检查项目控制有关物质，方法专属性有限；含量测定均为酸碱滴定法。本次药用辅料标准起草中，研究建立了专属性更强、灵敏度更高的高效液相色谱法，可对苯甲酸苄酯可能引入的苯甲醇、氯化苄、苯甲酸、苯甲醛等工艺和降解杂质同时进行检测，亦可用于含量 测定。2.10.7 注射用水注射用水原收载于《中国药典》二部，鉴于其为药品生产过程中使用或作为药 用辅料，故 2025 年版《中国药典》改为二部不收载，在四部收载，并对其制法和检验项目进行了修订。2025 年版《中国药典》不仅大幅增加了新增品种，还对《中国药典》2020 年版药用辅料标准进行了系统的修订，具体情况另文详述。《中国药典》还将继续结合中药、化药、生物制品及其各种剂型的特点，收载更多的药用辅料标准，使其凸显药用辅料的关键质量属性，更好的成为药用辅料选用和质量控制的重要参考和依据，助力我国医药产业高质量发展。致 ｜ 谢第十二届国家药典委员会药用辅料专业委员会全体委员和特邀专家：国家药典委员会药用辅料标准提高课题承担单位；积极参与相关课题研究的企业及协会；国家药典委员会秘书长舒融。 喜欢我们文章的朋友点个“在看”和“赞”吧，不然微信推送规则改变，有可能每天都会错过我们哦~免责声明“汇聚南药”公众号所转载文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请在留言栏及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。信息来源：健康号角往期推荐本平台不对转载文章的观点负责，文章所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示暗示的保证。

摘要：mRNA疫苗因其高效力、安全性和有效性、快速临床开发能力以及快速、低成本制造潜力，已被证明是传统疫苗的强大替代品。这些疫苗已从单纯的好奇之物发展成为COVID-19大流行疫苗的领跑者。在纳米技术领域为mRNA疫苗开发传递工具的进步具有极高的重要性。在这篇综述中，我们总结了mRNA疫苗的方方面面。文章描述了mRNA结构、其诱导免疫的药理功能、脂质纳米颗粒（LNPs）、以及mRNA疫苗制造的上游、下游和配方过程。此外，还描述了正在进行临床试验的mRNA疫苗。对未来mRNA疫苗的深入探讨，如其冻干、传递系统、以及LNPs靶向抗原呈递细胞和树突细胞，也进行了总结。 1.引言 疫苗接种是预防传染病传播的最有效手段。疫苗对医疗保健系统经济可行性的影响极大，因为它降低了传染病的治疗成本。此外，疫苗还有助于减少疫情的影响和风险。在COVID-19大流行期间，疫苗在公共卫生和安全以及对经济的延伸效应得到了重申和体现。成功的疫苗接种运动已经根除了天花和脊髓灰质炎等致命传染病，并试图应对COVID-19。世界卫生组织估计，疫苗每年可预防因百日咳、破伤风、流感和麻疹引起的2-3百万人死亡。疫苗已经从利用灭活和减毒病原体发展到包含病原体组分的亚单位，以触发免疫反应。疫苗研究的重要里程碑包括重组病毒载体疫苗、类病毒颗粒疫苗、结合多糖或基于蛋白质的疫苗和类毒素疫苗的开发。然而，最重要的一个里程碑是mRNA疫苗的开发，因为它在COVID-19大流行中的快速开发和批准，以及其mRNA技术在细胞内产生所需的疫苗抗原。 我们目前正处于mRNA疫苗接种时代，因为基础研究早在三十年前就已经奠定。尽管1990年代早期在动物模型中产生有效的体外转录（IVT）mRNA疫苗的表位呈递是有效的，但mRNA疫苗和治疗药物并未得到发展，因为直到19世纪末才得到验证。在过去的十年中，通过（i）引入加帽、尾随、点突变和有效的纯化技术提高其稳定性，（ii）引入脂质纳米颗粒改善mRNA传递，以及（iii）引入修饰核苷酸减少其免疫原性，从而提高整体mRNA质量的关键技术创新和广泛研究，使其作为疫苗得到广泛使用。与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有几个重要优势，包括活体和减毒病原体、基于亚单位和基于DNA的疫苗。这些包括（i）安全性，因为mRNA不与宿主DNA整合且不具有传染性；（ii）有效性，因为mRNA结构的修改可以使疫苗更稳定、有效，并减少免疫原性；以及（iii）制造和扩大规模的效率，因为mRNA疫苗在无细胞环境中生产，因此允许快速、可扩展和成本效益高的生产。例如，一个5升的生物反应器可以在单次反应中生产一百万剂mRNA疫苗。此外，mRNA疫苗还可以编码多个抗原，从而加强对一些顽固病原体的免疫反应。 当辉瑞-BioNTech为COVID-19大流行开发并批准mRNA疫苗时，这种疫苗技术的有效性得到了实现。这些疫苗在世界被SARS-CoV-2病毒感染、导致住院和死亡后不到一年的时间里开发出来，创下了记录。Spikevax®（Moderna）和Comirnaty®（辉瑞-BioNTech）的前所未有的开发和对数百万人的广泛接种帮助控制了COVID-19疫情。 这些疫苗的制造商展示的开发、批准和制造能力验证了mRNA平台作为一种安全有效的疫苗接种工具。此外，这也激发了科学界对mRNA作为预防性疫苗工具的极大兴趣。在这篇综述中，我们总结了mRNA疫苗的基础知识，包括其mRNA结构及其药理效应，mRNA结构的修改，并解释了mRNA疫苗如何在宿主中引发所需的免疫反应。综述还解释了脂质系统的重要性，如脂质纳米颗粒对mRNA疫苗传递的重要性。文章深入探讨了脂质纳米颗粒的结构组成部分和功能。第二代mRNA疫苗的最新发展和当前的临床试验也在本文中详细描述。 2.mRNA疫苗的药理学 2.1.mRNA结构 mRNA分子通过细胞质中的核糖体将DNA遗传序列有效地翻译成所需的蛋白质。非复制型mRNA和自扩增RNA是作为潜在疫苗候选抗原正在研究的两种主要类型的mRNA。传统的非复制型mRNA疫苗编码所需的抗原，用于免疫反应，包含50和30非翻译区（UTRs）和开放阅读框（ORF），也称为编码区和聚（A）尾。自扩增mRNA包含所有这些组分，在其ORF中还包含一个额外的编码区，编码病毒复制机制，这使得细胞内RNA持续扩增，随后抗原表达增强。体外转录（IVT）是一种反应，其中包含感兴趣基因的线性化DNA质粒被转录成mRNA序列。 2.2.5'端帽 mRNA的5'端含有一个7-甲基鸟嘌呤（m7G）基团，紧随其后的是第一个核苷酸的三磷酸基团（m7GpppN）。m7GpppN被称为5'端帽，它是一种保护性结构，可以保护RNA不被外切酶切割，调节前mRNA剪接，并启动mRNA的翻译以及从细胞核到细胞质的mRNA输出。5'端帽对于先天免疫系统识别非自身mRNA或外源性mRNA与自身mRNA或内源性mRNA也至关重要。通过引入许多转录后修饰，可以修改mRNA以提高其效力和稳定性。这些包括在第一个核苷酸（Cap 1, m7GpppN1m）和第二个核苷酸e（Cap 2, m7GpppN1mN2m）的20位的2'-O-甲基化。这些5'端帽结构的修饰不仅增加了mRNA的翻译效率，还阻止了内质网和细胞质受体的激活，包括RIG-I和MDA5，它们是防御病毒mRNA的防御机制。因此，5'端帽结构的2'-O-甲基化是提高和增强转录后mRNA蛋白产量的非常理想的属性，并阻止宿主免疫系统对外源性IVT mRNA的任何不良免疫反应。这个5'端帽可以通过向IVT mRNA反应中添加S-腺苷甲硫氨酸和Cap 0结构来实现，这会产生带有Cap 1结构和S-腺苷-L-同型半胱氨酸的IVT mRNA。Cap 1指的是m7GpppNm，其中Nm代表任何带有2'O甲基化的核苷酸。三核苷酸帽类似物也可以用来在共转录反应中制作Cap 1类似物。Ishikawa等人使用m7GpppAG类似物来加帽IVT mRNA。这些类似物在IVT反应中允许mRNA在5'端带有m7G基团，而没有反向加帽的5'端mRNA产品。使用A、Am、m6A或m6Am等核苷酸进行的进一步修饰，可以进一步改进IVT mRNA的特异性。特别是，m7Gpppm6AmG帽在体外转染实验中实现了最大的荧光素酶表达。Sikorski等人比较了改变第一个转录核苷酸如A、m6A、G、C和U以及是否带有2'-O-甲基化在mRNA IVT反应中的效果。他们观察到，携带A、Am或m6Am作为第一个核苷酸的脂质体介导的mRNA导致了更高的荧光素酶表达，而携带G或Gm的IVT mRNA导致了更低的荧光素酶表达。重要的是，在树突状细胞（DC）线JAWSII中，m6A和m6Am 5'端帽的mRNA翻译导致了8倍的差异。这些发现证明了5'端帽结构对于有效靶向DCs和产生期望的免疫反应的重要性。 2.3.5'和3'非翻译区（UTRs） 尽管UTRs不会被翻译成所需的抗原或蛋白质，但它们参与调节mRNA表达。这些区域位于ORF和5'和3'端之间，在mRNA的上游和下游。这些UTRs包含与mRNA稳定性相关的调控序列，以及mRNA的有效和正确翻译。它们还帮助核糖体识别mRNA，并帮助mRNA的转录后修饰。通过在UTRs中包含顺式调控序列，可以改善mRNA的翻译及其半衰期。此外，包括自然发生的序列，如来自α-和β-球蛋白的序列，已被广泛用于设计mRNA疫苗构建。Zeng等人基于鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量及其（GC）长度设计了新的5'UTR序列，用于mRNA疫苗的开发。 2.4.聚（A）尾 体外转录（IVT）mRNA在其3'端有一个聚腺苷酸部分，被称为聚（A）尾。这个聚腺苷酸尾对于确定mRNA的寿命至关重要。哺乳动物细胞中自然发生的mRNA分子的聚（A）尾长度大约为250个核苷酸（nt），随着mRNA在细胞质中的寿命逐渐缩短。由于尾大小影响mRNA的降解，因此在生产具有更长半衰期的mRNA疫苗和治疗剂中加入聚（A）尾是可取的。向聚（A）尾添加大约100个nt可以产生具有期望延长降解的mRNA。2.5.修饰核苷酸 天然 mRNA 及其他 RNA 分子包含 ATP、CTP、GTP 和 UTP 作为四种基本核苷酸。在 mRNA 分子的转录后修饰过程中，部分核苷酸会发生修饰，如伪尿苷和 5-甲基胞嘧啶。这些修饰核苷酸可以用于 mRNA 的体外转录 (IVT) [21]。尽管未修饰 mRNA 有其自身的优势 ，修饰核苷酸在避免 IVT mRNA 被先天免疫系统识别、从而避免任何不良免疫反应、提高 mRNA 翻译效率至所需抗原方面是有益的 。Andries 等人证明，含有 N(1)-甲基-伪尿苷 (m1) 修饰的 mRNA 在转染到细胞系或小鼠中时，与伪尿苷 (Y) 修饰的 mRNA 平台相比，分别提供了大约 44 倍和 13 倍更高的报告基因表达。作者还证明，(m5C/) m1-修饰的 mRNA 在体外转染时减少了细胞内先天免疫原性。这种修饰导致控制性激活 toll 样受体 3 (TLR3) 并启动下游先天免疫信号传导，这是 mRNA 疫苗的一个理想特性 。图 1 描述了 mRNA 分子的结构组成部分。 图1. mRNA分子结构组成。 2.6.mRNA疫苗对先天和适应性免疫的刺激 包含病原体特异性免疫原（编码病毒蛋白）和佐剂的疫苗可以帮助刺激适应性免疫反应。佐剂旨在刺激先天免疫反应并提供T细胞激活的信号，一个理想的佐剂应在不引起任何系统性炎症的情况下刺激先天免疫反应，因为系统性炎症可能会引起严重的副作用。对于mRNA疫苗而言，mRNA分子本身既作为免疫原也作为佐剂，这是由于mRNA固有的免疫刺激性特性。一旦肌肉内注射mRNA疫苗，就会通过以下途径潜在地激活适应性免疫系统：(i) 肌肉细胞和表皮细胞的转染，(ii) 注射部位的组织驻留免疫细胞如树突状细胞（DC）、巨噬细胞和朗格汉斯细胞的转染，从而启动T细胞和B细胞的启动，以及(iii) 次级淋巴组织如淋巴结（LNs）和脾脏的运输。图2描述了肌肉内注射的mRNA-LNP疫苗的作用模式。宿主细胞通过各种内质网和细胞质固有受体识别单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA），这些受体构成了人类对外源性病毒的先天免疫反应的关键部分。Toll样受体（TLR3和TLR7）在内质网中与外源性ssRNA结合，炎症信号受体包括RIG-I、MDA5、NOD2和PKR在细胞质中与ssRNA和dsRNA结合。这导致细胞激活，并产生I型干扰素和其他多种炎症介质。I型干扰素对细胞翻译有抑制作用，这可能会抑制mRNA疫苗产生的抗原量。目前可用的mRNA疫苗包含纯化的IVT mRNA，其性质为单链，并含有修饰核苷酸。这有助于减少与TLR3和TLR7以及免疫传感器的结合，因此限制了I型干扰素的过度产生及其对mRNA细胞翻译的抑制作用。mRNA疫苗转染组织驻留免疫细胞，包括APCs，如DCs和巨噬细胞。 图2. mRNA脂质纳米颗粒（mRNA-LNPs）的肌肉内注射部位及其作用模式。mRNA-LNP疫苗可以转染肌肉细胞以及转染注射部位附近的组织驻留抗原呈递细胞（APCs）。此外，mRNA-LNP疫苗可以流入淋巴结（LNs）并转染驻留于淋巴结的细胞，从而激活T细胞和B细胞。 mRNA疫苗通过转染非免疫细胞产生所需的抗原。然后该抗原在细胞质中的蛋白酶体中被降解，暴露出抗原表位，这些表位与主要组织相容性复合体（MHC）I类形成复合体，呈现给表达CD8+的细胞毒性T细胞。这有助于建立对mRNA表达的抗原的细胞免疫。mRNA疫苗转染肌细胞可以激活骨髓源性DCs，这有助于CD8+ T细胞的启动。mRNA疫苗还通过转染包括DCs和巨噬细胞在内的组织驻留免疫细胞发挥作用。这在注射部位触发局部免疫反应。免疫细胞的mRNA转染可以通过MHC I类途径呈现抗原，导致CD8+ T细胞的成熟。此外，APCs的激活也可以导致MHC II类途径的呈现，导致表达CD4的T辅助细胞的激活。转染局部免疫和非免疫细胞后，一部分注射的mRNA疫苗通过淋巴系统排入淋巴结。淋巴结包含单核细胞和原始T细胞和B细胞。淋巴结APCs的转染可以启动T细胞和B细胞的启动和激活。图3描述了mRNA-LNP疫苗诱导的适应性免疫反应的药理机制。 图3. mRNA-LNP疫苗诱导的适应性免疫反应的药理机制。(1)体外转录的mRNA被包裹进脂质纳米颗粒（LNP）中。(2)利用LNP表面的特殊脂质，将mRNA-LNP疫苗分子转染进宿主细胞。(3)mRNA-LNP的内吞作用。(4)内吞介导的内化后，mRNA从内涵体逃逸到细胞质中。(5)宿主细胞的核糖体将mRNA翻译成所需的抗原蛋白，这一过程发生在细胞内。(6)抗原蛋白在细胞外释放，或者被蛋白酶体降解，暴露出抗原位点。(7)主要组织相容性复合体I（MHC I）将MHC I表位呈现到细胞膜上进行抗原呈递（APC）。MHC I将表位呈递给CD8+ T细胞。(9)先前释放的外源蛋白可以被降解并通过MHC II表位呈递。细胞外抗原可以被B细胞识别，导致B细胞成熟。 3.mRNA疫苗的药物递送技术 本节可以按小标题划分。它应提供简洁、精确的实验结果描述、它们的解释以及可以得出的实验结论。mRNA疫苗分子体积大（104-106 Da），带负电荷。它们无法通过细胞膜的脂质双层。裸露的mRNA会被血液中的核酸酶破坏和降解。此外，裸露的mRNA也会被组织和血清中的免疫细胞附着和吞噬。将mRNA分子送入细胞的方法包括基因枪、电穿孔和体外转染技术。体内递送mRNA的方法涉及使用脂质或转染剂转染免疫或非免疫细胞。 3.1.脂质纳米颗粒（LNPs） 尽管裸露的mRNA、脂质体和多聚体在人类中显示出临床效果，但LNPs是唯一证明临床效果并获准用于人类的mRNA疫苗药物递送系统。由Moderna和Pfizer/BioNTech开发的针对SARS-CoV-2的COVID-19 mRNA疫苗使用LNPs将mRNA有效载荷送入体内。LNPs目前是非病毒递送载体中用于基因治疗的最前沿。LNPs的临床效果首次得到证明是在LNP-siRNA治疗药物Onpattro®（patisiran）获得美国FDA批准用于遗传性转甲状腺素介导的淀粉样变性。LNP配方是最成功、有效和安全的mRNA疫苗递送方法，用于人类免疫接种。LNPs为mRNA递送到作用部位提供了许多优势，包括配方和规模化生产的便利性、高效的转染能力、低毒性概况、模块化、与不同类型和大小的核酸的兼容性、保护mRNA免受内部降解以及增加mRNA疫苗的半衰期。LNPs通常由四个组分构成：可电离阳离子脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。这些脂质包裹mRNA疫苗的有效载荷，并保护核酸核心免受降解。 3.2.阳离子和可电离脂质 阳离子脂质是第一代开发并用于mRNA疫苗递送的脂质。这些脂质含有一个季铵氮原子，赋予它们永久的正电荷。这些脂质的正电荷使它们能够与带负电的mRNA疫苗形成离子相互作用，形成一个名为脂质复合物的脂质复合体。DOTMA及其合成类似物DOTAP是1989年首次用于递送mRNA疫苗的阳离子脂质。包括DOTMA、DOPE和DOGS在内的阳离子脂质自那时以来已被广泛用于mRNA递送，包括商业上可用且成功的Lipofectin。Lipofectin是DOPE和DOTMA的混合物，是最早的LNP配方之一，在体内mRNA转化中证明是成功的。早期的阳离子脂质在体外基因递送方面显示出了希望，但它们在体内效果不佳。早期阳离子脂质的氮头基团的正电荷和不可生物降解性是它们在体外递送和效果不佳的原因。可电离脂质，也称为pH依赖性离子脂质，是第二代阳离子脂质，含有一个伯胺，赋予它们在生理pH或低于生理pH时的正电荷。这些脂质在生理pH的血液中具有中性电荷的特性有助于提高它们的安全性，与第一代阳离子脂质相比。它们还延长了LNPs的循环时间，与由阳离子脂质衍生的LNPs相比。这些是为了克服第一代阳离子脂质的不足和安全性问题，如免疫激活和与血清蛋白的相互作用而开发的。DLin-MC3-DMA是第一个美国FDA批准的离子脂质，用于第一个siRNA药物Onpattro®。DLin-MC3-DMA离子脂质是在对第一个离子脂质DODMA进行一系列修改后合成的。DLinDMA是通过替换DODMA的油酸尾部形成的。与DODMA相比，DLinDMA在体内对呼吸道合胞病毒（RSV）的保护免疫方面表现出优越的能力。DLinDMA进一步优化为DLinKC2-DMA，再进一步为DLin-MC3-DMA，这取决于一系列基于结构-活性关系的研究。DLin-MC3-DMA被认为是第一代可电离脂质。 DLin-MC3-DMA或MC3具有长达72小时的血浆半衰期，增加了siRNA的作用持续时间。后来发现MC3可电离脂质在递送mRNA和siRNA方面都有效。MC3唯一的缺点是其长半衰期（72小时）。这限制了使用MC3的疫苗的长期给药。因此，下一代可电离脂质采用了可生物降解的官能团，这有助于快速清除。引入酯基团有助于增加MC3的生物降解性并增加其系统清除率。酯基团易于安装在脂质中，可生物降解且化学稳定，可被细胞内酯酶轻易裂解。MC3作为开发可生物降解酯基可电离脂质的重要前体和起点。这些包括Moderna的专有脂质、Acuitas的专有脂质等，包括YSK12-C4、CL4H6和L319脂质，被认为是第二代可电离脂质。基于酯的可生物降解可电离脂质在基因递送方面显示出比MC3可电离脂质更高的效力。Moderna的脂质5被发现效力是MC3脂质的三倍，而Acuitas的脂质ACL-0315（用于辉瑞/BioNTech COVID-19疫苗的脂质）在向动物递送荧光素酶mRNA方面的效力是MC3脂质的六倍US10166298B2。 第三代可电离脂质以优化的方式合成，化学合成步骤有限，这增加了可电离脂质的高通量生产。98N12-5是第三代可电离脂质的第一个例子。对98N12-5脂质的修改和改进导致了包括C12-200和C14-113在内的优越类似物的发明。C14-113脂质特别针对心肌，因此可以开辟新的视野，以优化和针对基因疗法以增强心脏功能。Li等人报道TT3是一种有效的脂质，用于递送编码CRISPR/Cas9、因子IX和SARS-CoV-2的各种mRNA分子。除了寻找增强效力外，提高基因递送到特定目标细胞或器官的特异性的兴趣也在进行中。针对疫苗和免疫疗法的免疫细胞以及初级和次级淋巴器官的靶向递送正在迅速进行。一些靶向剂的例子包括含有多环尾部的脂质，包括11-A-M，以及含有环状咪唑头基团的脂质，如93-O17S，专门设计用于靶向T细胞。此外，脂质A18-Iso5-2DC18中的环状胺头基团已被证明可以结合到干扰素基因刺激因子（STING）蛋白。这导致树突状细胞成熟，并通过免疫刺激具有抗肿瘤效果。这对于使用基因疗法的癌症免疫疗法可能是一个有用且理想的特征。利用第三代可电离脂质的基因疗法也显示出对多药耐药细菌感染的希望。环状维生素C衍生的可电离脂质递送抗菌肽和组织蛋白酶B mRNA到巨噬细胞，证明该疗法可以消除多药耐药细菌并保护小鼠免受细菌诱导的败血症。LNPs是最先进的且临床上批准的mRNA递送载体。 3.3.PEG-脂质 在成分中，聚乙二醇（PEG）是一种亲水材料，以其在化妆品、食品和制药行业的广泛应用而闻名。LNPs中的聚乙二醇化脂质组分通常与锚定脂质相连。发现PEG是LNPs配方中的基本化学物质，可以减轻过滤器官对纳米颗粒的摄取，同时改善LNPs在生物流体中的胶体稳定性。因此，LNPs的循环半衰期和体内分布得到增强。通常，PEG脂质在LNPs的脂质成分中占最小摩尔百分比（大约1.5%）。然而，它们在影响关键参数方面发挥着非常关键的作用，如粒径、多分散性指数、聚集减少、颗粒稳定性改善和封装效率。PEG的分子量和锚定脂质的碳链长度可以用来微调循环时间和免疫细胞的摄取，改变效率。此外，LNPs上的PEG-脂质涂层作为立体亲水屏障，防止存储过程中的自组装和聚集。因此，PEG的存在有助于稳定LNP并限制脂质融合来调节大小。PEG的数量与LNP的大小成反比；PEG含量越高，LNP的尺寸越小。通常，PEG的分子量范围在350到3000 Da之间，锚定脂质的碳链在13到18碳之间。许多文献报告指出，PEG的分子量越高和脂质链越长，纳米颗粒的循环时间就越长，免疫细胞的摄取也越少。随着PEG-脂质从LNP表面解离，它减少了LNP的循环时间，并提供了更多的机会将mRNA货物送入目标细胞，这被称为“PEG-困境”。在某些情况下，当PEG-脂质的摩尔百分比保持在1.5%时，体内转染水平被发现与脂质的碳链长度无关。PEG脂质的额外优势在于它们能够将特定配体结合到LNP上，从而有助于靶向药物递送。 3.4.辅助脂质 辅助脂质在LNPs配方中的主要功能在于支持其在储存和体内循环过程中的稳定性。从化学角度来看，这些是甘油酯，并且是非阳离子性的。在各种辅助脂质中，甾醇和磷脂是最广泛使用的。胆固醇是细胞膜中存在的天然成分。它是一个可交换的基团，可以很容易地在LNP中积累。从一系列不同的研究表明，胆固醇可能存在于表面、脂质双层内部，甚至与核心中的离子化脂质共轭。它通常被纳入LNP配方中，通过填补脂质之间的空隙来维持稳定性。需要胆固醇来调节LNP内部脂质双层基质的密度、摄取和流动性。因此，它控制了膜的刚性和完整性，从而通过“凝聚效应”防止任何泄漏。胆固醇的疏水尾部、甾体环的灵活性以及羟基的极性被报道影响LNP递送的效力。胆固醇还有助于通过减少表面结合蛋白来提高LNPs的循环半衰期。此外，它还有助于在LNPs被细胞摄取时与内质网膜融合。它在降低从层状相转变为六角相所需的温度中发挥着至关重要的作用；因此，来自LNP的mRNA货物将被递送到细胞质中。磷脂在LNP配方中的包含可以帮助提高封装效率（与胆固醇一起）并增加细胞递送。通常，LNP中的磷脂数量大大减少，同时增加胆固醇含量以延长循环时间。此外，磷脂的包含促进了LNP的包封效率和转染效力。有报道称，增加磷脂的摩尔百分比有助于加快LNPs递送效力。这些以Zwitter离子形式存在的磷脂被报道在LNP的组装中发挥关键作用，通过稳定阳离子脂质、mRNA货物和周围水分子之间的静电相互作用。然而，磷脂在通过LNP递送mRNA中的实际作用仍然不明确。因此，进一步探索磷脂在增强颗粒稳定性和体内递送中的实际作用仍然引人入胜。图4描述了LNPs的组成部分，包括可离子化脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。 图4. 脂质纳米粒的组成部分包括可离子化脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质。 3.5.影响mRNA-LNPs的物理化学性质 LNPs具有许多独特的特性，其中大多数是有益的；讽刺的是，一些特性赋予了一些不希望的毒性。因此，非常关键的是要了解影响载mRNA的LNP的物理化学性质。大小和表面积：大小和表面积决定了LNP与生物系统的相互作用过程，以及分布、消除、内化、降解和反应。减小尺寸对应于表面积的增加，从而使其对周围生物环境更具反应性。包括内吞作用和细胞摄取在内的基本生物活动主要依赖于颗粒大小。任何大小依赖的毒性都基于LNPs进入生物系统并修改大分子的能力，从而改变基本的生物功能。在疫苗的情况下，报告了高效率的递送，同时保持约50纳米的颗粒大小，无论其化学组成如何。 电荷：电荷在决定LNPs的生物分布和效力命运中起着主要作用。载体的电荷对于将mRNA疫苗穿过生物膜运输至关重要。因此，带负电的mRNA可以与带正电的阳离子脂质发展出静电相互作用，从而实现高效封装。最终，阳离子脂质体与带负电的细胞表面和内质网膜相互作用以释放mRNA货物。阳离子脂质的pKa（获得正电荷的能力）对递送mRNA货物有显著影响；显然，理解其作用非常重要。尽管如此，围绕基因递送所需的实际pKa仍存在一些不确定性。一些报告指出，通过静脉注射（IV）途径递送LNPs的理想pKa范围在6.2到6.6之间。电荷调节已被有效地研究用于减轻毒性表现，同时改善LNPs中mRNA的递送。 形状和结构：形状和内部结构是直接影响细胞摄取和与生物环境相互作用的关键参数。一些报告提到，与其他形状相比，球形纳米粒的内吞作用相对更容易。或者，非球形纳米粒更倾向于通过毛细血管流动。迄今为止，关于形状和结构的作用机制及其在体内的作用仍然不清楚。由于涉及许多技术挑战，源自形状和结构的实际作用机制仍然广泛未被探索。因此，研究需要加快对它们在变形膜和治疗效果中的活动的理解。 表面组成：LNPs的高效递送和生物分布可能受到递送载体表面组成的影响。众所周知的例子包括通过PEG化将PEG-脂质并入LNPs表面。这种PEG化过程已知可以改变纳米载体的运输轨迹并延长循环半衰期。尽管如此，除了改善生物分布和循环外，PEG化还可能导致LNPs的摄取因空间位阻减少，限制与血浆膜的相互作用。因此，PEG-脂质会从血清中脱离，减少空间位阻，有利于内质网的摄取。 4.mRNA疫苗制造 与传统疫苗相比，mRNA疫苗显示出几个优势，包括它们开发的便捷性、易于扩大规模和快速制造。与其他疫苗类似，mRNA疫苗药物产品在制造过程中经历三个典型步骤：上游生产、下游纯化和最终mRNA药物物质的配方。本节将讨论这些步骤以及每个过程中的较新发展，以简化mRNA疫苗生产。 4.1.上游生产 mRNA疫苗的上游生产包括从含有感兴趣基因的质粒生成mRNA转录本。这个反应称为体外转录反应（IVT）。IVT酶促反应依赖于T7、SP6或T3等RNA聚合酶。RNA聚合酶催化目标mRNA从含有感兴趣基因的线性DNA模板合成。线性DNA模板是通过限制性内切酶酶切含有感兴趣基因的质粒产生的，或者通过PCR扩增感兴趣基因也可以产生mRNA分子。IVT反应的基本酶包括：(i) RNA聚合酶—将DNA转换为RNA，(ii)无机焦磷酸酶（IPP）—增加IVT反应产量，(iii)鸟苷酸转移酶—向mRNA的5'端添加GMP核苷，(iv)Cap 20-O-甲基转移酶（SAM）—这种酶在mRNA的5'帽的20位添加甲基，(v) DNase I—用于从RNA样本中去除污染的基因组DNA和降解IVT反应中的DNA模板的内切酶，以及(vi)聚(A)尾聚合酶和(vii)修饰和未修饰的核苷三磷酸（NTPs）。这些酶促进了含有感兴趣基因的质粒的mRNA转录本的上游开发。加帽酶包括SAM和鸟苷酸转移酶，它们在mRNA的5'端酶促形成5'帽，而聚(A)尾聚合酶尾酶形成聚(A)尾。另一种5'加帽方法是共转录法，其中5'帽事先准备好，然后以非酶促方式添加到mRNA上。这种共转录反应可以使用CleanCap®试剂AG进行。 4.2.下游纯化 mRNA通过上游生产阶段的IVT反应产生；然后通过下游加工的多个纯化步骤进行分离和纯化。IVT反应混合物包含几种杂质，包括残留的NTPs、酶、错误形成的mRNA和DNA质粒模板。基于DNA去除的IVT mRNA实验室规模纯化方法包括DNase酶消化后用氯化锂（LiCl）沉淀。基于实验室的方法不允许完全去除异常mRNA物种，包括dsRNA和截断的RNA片段。去除这些杂质至关重要，以获得纯mRNA产品，该产品展示了其预期的效力和安全概况。低效的纯化技术可能导致mRNA疫苗产品的翻译效率降低和不必要的免疫刺激性概况。例如，当修饰的mRNA在传递给树突状细胞之前通过反相HPLC纯化时，观察到mRNA转染和相关蛋白产量增加了10-1000倍。 色谱法是生物制药工业中广泛接受的常用纯化过程，用于疫苗和生物药物产品的纯化。2004年首次发表的用于大规模核酸纯化的RNA寡核苷酸的程序使用了尺寸排除色谱法（SEC）。SEC有几个优点，包括选择性、可扩展性、多功能性、成本效益和实现高纯度和产量的核酸产品。然而，SEC不能去除具有相同大小的杂质，如dsDNA。与SEC相比，离子对反相色谱法（IEC）已被证明是mRNA疫苗的极好纯化技术。IEC可以轻松分离目标mRNA和IVT反应杂质。这种分离方法依赖于目标mRNA和杂质之间的电荷差异。IEC有几个优点，包括从目标mRNA中分离出更长的RNA转录本，更高的结合能力，成本效益和可扩展性。由于IEC是在变性条件下进行的，该过程变得复杂且温度敏感。 基于亲和的色谱分离是另一种mRNA纯化方法。脱氧胸腺嘧啶（dT）-寡dT是一个捕获mRNA聚（A）尾的序列。含有Oligo dT的色谱珠可以用于下游纯化mRNA疫苗。切向流过滤（TFF）或核心珠过滤可用于去除小尺寸杂质。作为mRNA疫苗的最终抛光步骤，与连接性相互作用介质单体（CIM）柱连接的疏水相互作用色谱（HIC），含有OH或SO3配体，可以极为有益。 4.3.配方mRNA分子带有负电荷，应配制在基于脂质的药物递送系统中，以避免mRNA降解并提高其转染效率和半衰期。LNPs是美国FDA批准的用于递送mRNA疫苗药物物质的最可靠、最可靠的基于脂质的非病毒载体系统。通过在有机相中沉淀溶解的脂质并与水相中的mRNA混合形成mRNA LNPs。有机相中最常用的脂质是可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和PEG脂质。同时，mRNA溶解在柠檬酸盐或醋酸盐缓冲液中，pH值为4。混合水相和非水相质子化可电离脂质，导致可电离质子化的脂质与阴离子mRNA之间发生静电吸引。这种相互作用同时与其他脂质的疏水相互作用耦合，驱动mRNA-LNPs自发自组装，将mRNA包裹在纳米颗粒的核心内。这个过程也称为微沉淀。LNP形成后，它们被透析以去除非水溶剂，通常是乙醇，并提高溶液pH至生理pH。微流体混合器可以形成小尺寸LNPs，具有低多分散指数和高mRNA包裹效率。微流体混合是实验室规模和GMP水平mRNA LNP配方中最常用的方法。Precision NanoSystems的NanoAssemblr®平台已广泛用于LNP配方开发和在受控环境下的GMP生产。该系统使用错开的鲱鱼骨微混合器（SHM）墨盒结构。SHMs的结构使得两种水相和非水溶剂在微秒内混合。这个时间尺度比脂质聚集所需的时间要小得多；因此，SHMs产生均匀尺寸的小纳米颗粒。NanoAssemblr®设置可以简单调整，以改变水相和非水相的流速和体积，获得所需尺寸和尺寸分布的LNPs。通常使用12-14 mL/min的总流速和3:1的流速体积比，非水相：水相，以产生小的单分散LNPs。尽管SHMs在高效生产LNPs方面具有几个优点，但由于溶剂不兼容性，它们在GMP制造中的实用性受到限制。SHM及其内部部件长期暴露于含有聚二甲基硅氧烷的乙醇可能导致其变形。在连续的GMP生产运行中更换墨盒变得困难。因此，T-混合器用于LNP的放大和制造。它们可以生产与SHM相似的LNPs，可以处理更高的流速和体积（60-80 mL/min），并且与乙醇等有机溶剂兼容。图5解释了mRNA疫苗制造的过程。 图5. mRNA疫苗制造过程的步骤和阶段。mRNA疫苗生产可以分为三个阶段：上游mRNA制造、下游mRNA纯化和mRNA脂质纳米颗粒的配方。mRNA生产可以在一步共转录反应中进行，其中使用加帽试剂，或者在两步反应中进行，其中进行酶促加帽。小规模实验室规模的mRNA纯化过程包括DNase I消化酶，然后是mRNA的LiCl沉淀。大规模的mRNA纯化涉及利用成熟的色谱方法结合切向流过滤（TFF）。最后，mRNA疫苗的配方包括将mRNA水溶液与非水相中的脂质溶液混合。这导致脂质纳米颗粒（LNPs）的自组装，并在LNPs的核心内包裹带负电的mRNA。mRNA与脂质分子在错开的鲱鱼骨微混合器（SHM）中的混合发生在多个周期，这导致最终mRNA-LNP疫苗的形成。 5.mRNA疫苗在临床试验中 任何疫苗候选物在成功的临床前研究之后以及在市场推出之前的关键步骤是临床开发。任何mRNA疫苗的临床开发包括一系列临床试验，以评估其在人类中的安全性、免疫原性和效力。根据患者人群和试验目标，它们被分类为1期、2期、3期和4期。1期研究在一小群人类中进行（理想情况下是一个中心），主要用于确定疫苗的安全性和药代动力学。2期研究是概念验证研究，主要旨在确认1期研究中获得的结果，并在稍多的人类中评估效力。3期研究是确认性研究，多个中心和广泛的人类人群中进行，以确认疫苗候选物的效力和安全性。这些研究通常与活性对照或安慰剂一起进行。4期研究在疫苗候选物获得市场批准后进行，主要旨在确认疫苗的安全性。每个疫苗候选物在商业推出之前应经过所有临床研究的关键临床评估。疫苗的开发需要几年时间才能完成。然而，由于COVID-19大流行，Comirnaty（辉瑞）和Spikevax（Moderna）在不到一年内获得了紧急使用授权（EUA）。目前，有多种mRNA疫苗正在进行临床试验，旨在针对传染病（COVID-19、流感、寨卡病毒、尼帕病毒、呼吸道合胞病毒等）、遗传性疾病和癌症，因为mRNA疫苗能够平衡适应性和先天免疫反应。这些疫苗大多数是基于脂质体的，并且处于1期和2期临床试验中。此外，约60-70%的正在进行的临床研究是使用基于mRNA的COVID-19疫苗进行的。因此，我们在下面的表1中总结了所有正在进行的基于mRNA的疫苗的临床试验（不包括COVID-19疫苗）。如前所述，大多数mRNA疫苗处于临床试验的早期阶段（1期或2期），只有少数基于mRNA的疫苗处于3期开发阶段。下面的部分提供了有关当前处于3期阶段的疫苗的详细信息。 5.1.mRNA-1345 mRNA-1345是Moderna公司针对呼吸道合胞病毒（RSV）感染开发的疫苗候选物，它编码一种称为预融合F糖蛋白的RSV蛋白，从而引发有效的中和抗体反应。这种蛋白负责病毒的进入和细胞间传播，对RSV感染的传播至关重要。这种疫苗是一种基于脂质纳米颗粒的疫苗，包含优化的蛋白质和密码子序列。美国FDA最近为60岁以上的成人授予了mRNA-1345的快速通道审查指定。在mRNA-1345之前为RSV感染开发的几种疫苗在临床试验中失败，原因是免疫反应低。最近，Moderna报告了正在进行的1期研究的中期结果，评估儿童、年轻人、老年人和育龄妇女中mRNA-1345的耐受性、反应原性和免疫原性。结果显示，截至数据截止日期，疫苗在试验的所有剂量水平上都得到了良好的耐受。该研究预计将在2023年完成。正在进行的mRNA-1345疫苗2/3期研究（NCT05127434）在60岁及以上的成人中进行，以评估mRNA-1345疫苗的安全性和耐受性，并证明与安慰剂相比，单剂量mRNA-1345疫苗在预防首次RSV相关下呼吸道感染（RSV-LRTD）方面的效力，从注射后14天至12个月。该研究计划在两个安慰剂对照阶段进行，即2期在400至2000名参与者中进行，3期在超过30000名参与者中进行。研究的主要目标是评估疫苗的安全性和效力。安全终点包括监测参与者不良反应、不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件的发生率。主要效力终点包括mRNA-1345疫苗效力（VE）预防首次RSV-LRTD发作在注射后14天至12个月期间。这项研究于2021年11月开始，预计将于2024年11月完成NCT05127434。 5.2.mRNA-1010 mRNA-1010是Moderna公司开发的四价流感疫苗候选物，它编码世界卫生组织推荐的四种季节性流感病毒的表面蛋白、血凝素（HA）蛋白，包括季节性流感A/H1N1、A/H3N2和流感B/Yamagata-、B/Victoria系。HA被认为是疫苗开发的重要目标，因为它能产生广泛的抗流感保护，并且是当前可用的流感疫苗的主要目标。mRNA-1010的效力已在1期和2期研究中得到评估。2021年12月，Moderna发布了正在进行的1期研究的中期结果，该研究在年轻人和老年人中评估了3种剂量（50微克、100微克和200微克）的mRNA-1010。结果显示，在所有参与者中，所有剂量在接种后29天成功提高了针对所有毒株的血凝抑制试验几何平均滴度，没有显著的安全发现。该公司还确认，正在进行的mRNA-1010的2期研究已达到全额招募，计划在2022年进行中期分析。正在进行的3期活性对照研究（NCT05415462）旨在评估成人≥18岁的mRNA-1010季节性流感疫苗的免疫原性和安全性。活性对照是任何许可的四价灭活季节性流感疫苗。该研究的主要目标是评估mRNA-1010相对于活性对照针对疫苗匹配的流感A和B毒株在第29天的体液免疫原性，并评估mRNA-1010的安全性和反应原性。安全终点包括监测参与者不良反应、不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件的发生率。主要效力终点包括第29天抗血凝素（HA）抗体的几何平均滴度（GMT）和达到血清转换的参与者百分比。这项研究于2022年6月开始，预计将于2023年8月完成NCT05415462。 5.3.mRNA-1647 mRNA-1647是由Moderna公司针对育龄妇女的巨细胞病毒（CMV）感染开发的疫苗候选物。它由六种mRNA组成，这些mRNA编码了CMV表面的两种抗原。其中五种mRNA编码形成膜结合五聚体复合物的亚单位，而第六种编码全长膜结合糖蛋白B（gB）。mRNA-1647疫苗指导人类细胞制造抗原，产生模拟CMV在自然感染期间向免疫系统呈现的功能抗原。迄今为止，mRNA-1647疫苗已在第一阶段和第二阶段研究中进行了评估。这两项研究的中期分析结果积极，导致启动了第三阶段研究以确认mRNA-1647的效力和安全性。这项第三阶段研究（NCT05085366）是一项随机、观察者盲、安慰剂对照的研究，旨在评估16至40岁健康参与者中mRNA-1647疫苗的效力、安全性和免疫原性。研究的主要目标是评估CMV血清阴性女性参与者中mRNA 1647疫苗的效力，以及评估所有参与者中mRNA-1647疫苗的安全性和反应原性。安全性终点包括监测参与者不良反应、不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件的发生率。主要效力终点包括血清免疫球蛋白G（IgG）对mRNA-1647未编码抗原从阴性转为阳性的结果（时间框架：第三剂注射后第197天（28天）至第887天（第三剂注射后24个月）。该研究于2021年10月开始，预计将于2025年7月完成NCT05085366。 5.4.mRNA疫苗的临床安全性 任何疫苗候选物在临床开发计划的早期阶段的主要目的是评估其在人类群体中的安全性。疫苗的安全性在整个临床开发过程中通过主要监测不良事件、死亡、实验室发现等进行评估。只有在安全性概况可接受的情况下，任何疫苗才能获得市场授权/批准。如果在研究期间和临床开发计划中发生任何不良事件，监管机构/机构伦理委员会（IEC）可以停止临床试验。预计与疫苗候选物相关的不良事件应该能够迅速解决/恢复。即使在疫苗获得市场批准后，赞助商也有责任监测其安全性概况。由于核苷的存在，毒性是需要考虑的mRNA疫苗的重要因素之一。文献报道，一些基于核苷的抗癌药物和抗病毒药物的毒性是由于非天然核苷。特别是在针对Crigler–Najjar综合征的疫苗的临床前研究中，观察到的最常见毒性是肝毒性。这可以归因于用于传递的脂质纳米颗粒配方中的任何有毒辅料的存在。在另一项针对狂犬病的mRNA疫苗的研究中，由于mRNA的炎症性质，在临床试验中报告了系统性不良事件。与mRNA疫苗相关的大多数毒性主要是由于用于配方的辅料或其他在配方开发过程中使用的溶剂。通过在安全限制内使用辅料以及遵循减少疫苗中残留有毒成分的过程，可以避免这些毒性。未来，mRNA疫苗预期的毒性包括局部和全身炎症、表达免疫原的生物分布和持续性、自身反应性抗体的刺激，以及任何非天然核苷酸和传递系统组分的潜在毒性效应。此外，这些疫苗还可能引起强烈的I型干扰素反应、水肿（由于细胞外裸露的RNA）、血液凝固和病理性血栓形成。另一方面，全球卫生当局已经批准了几种mRNA疫苗用于人类。所有批准的疫苗在临床试验评估期间都显示出可接受的安全性概况。例如，辉瑞-BioNTech（Comirnaty）和Moderna（Spikevax）的两种COVID-19 mRNA疫苗已经展示了出色的安全性和效力概况。总体而言，目前正在临床开发的几种mRNA疫苗的安全性概况是可以接受的（耐受性良好），迄今为止很少有或没有从临床试验中撤回的。在临床研究期间报告的大多数不良事件包括注射部位反应。所有赞助商都预计在疫苗开发过程中将安全性作为一个重要因素，通过在非临床开发期间进行彻底的毒性测试来考虑。非临床研究的观察结果应在临床试验中予以考虑，并应仔细监测。 6.第二代mRNA疫苗 第二代疫苗是在改进了第一代mRNA疫苗的一些效率低下问题并增强了安全性、效力、储存和处理之后开发的疫苗。这些变化包括使疫苗在室温下稳定，并减少对冷链储存和运输的需求，同时保持相同的效力和安全性。其他变化包括寻找更强大和靶向配体的纳米载体，这些载体可以有更好的安全性和mRNA传递效力概况。此外，正在进行大量研究，探索各种RNA基分子作为疫苗的使用，包括自我放大RNA。本节重点介绍预计将在不久的将来开发的第二代mRNA疫苗。 6.1.冻干mRNA脂质纳米颗粒 通常，mRNA脂质纳米颗粒（LPN）疫苗必须储存在零下温度以保持稳定性和效力。用于储存疫苗的冷链运输限制了低收入和新兴经济国家疫苗的获取。长期稳定性是LNPs开发的一个主要问题，因为在水悬浮液中储存时观察到物理和化学不稳定性。化学降解涉及mRNA分子中键的改变。物理降解包括变性/聚集（失去二级和三级结构）、融合和封装mRNA的泄漏。mRNA的化学降解主要通过水解和氧化发生。LPNs中脂质的降解也导致水解和氧化。水解主要通过磷酸二酯键发生，这是mRNA分子的骨架。另一方面，氧化影响mRNA的核苷和糖基团。氧化导致mRNA链断裂、碱基断裂和二级结构的改变，这可以阻止体内抗原的翻译。此外，LNPs储存期间的脂质结晶和脂质多态转变导致泄漏或药物排斥。储存条件是一个强烈影响mRNA-LNP疫苗稳定性的关键参数。mRNA-LNPs的长期储存尚未完全探索。在长时间储存期间，mRNA-LNPs可能会经历结构变化。因此，了解其在储存期间所施加的变化至关重要，以获得稳定的mRNA-LNP。由于mRNA-LNPs中的降解反应是由水的存在引发的，冻干是一种广泛用于包括mRNA-LNPs在内的纳米颗粒长期储存的干燥技术。在冻干蛋糕或粉末形式下，mRNA-LNP疫苗可以方便地全球运输，而不需要冷冻储存。冻干过程分为三个阶段：冷冻、一次干燥和二次干燥。在冷冻过程中，水被冻结成冰晶，而溶质材料被排除在冷冻浓缩相之外。一次和二次干燥过程都是在真空下进行的。一次干燥步骤在低温下进行，在此阶段通过升华过程去除冻结的水。在二次干燥步骤中，温度升高以通过解吸机制去除任何未冻结的水。冻干过程的细节在其他研究中讨论。由于mRNA-LPN疫苗是由特定类型的脂质在一定浓度下制备的，因此在冻干和随后的储存过程中保持物理化学参数如粒径、多分散性和封装效率非常重要。因此，仔细选择冻干过程参数、缓冲液以及冷冻和冻干保护剂至关重要，以确保稳定效果。在一项研究中，Shirane等人在形成LNPs后冻干了含有乙醇的siRNA-LNP分散液。结果表明，新制备的（传统的）和重新配制的冻干配方之间在体内基因敲低效率方面没有差异，证明了mRNA-LNPs的冻干可行性。在冻干过程的冷冻和干燥步骤中，封装在LNP中的mRNA可能暴露于不同的压力下，这最终影响mRNA-LNP的稳定性。因此，使用冷冻保护剂在配方中非常重要，而LNPs稳定的最优冷冻保护剂取决于材料和配方类型。Zhao等人确定了脂质类纳米颗粒（LLNs）的mRNA的最佳储存条件。LLNs是使用离子化脂质、N1、N3、N5-三（3-（二十二烷氨基）丙基）苯-1,3,5-三羧酰胺衍生物、TT3制备的。筛选和评估了冷冻保护剂（海藻糖、葡萄糖和甘露醇）类型和物理状态条件，如水相、冷冻或冻干，以评估纳米颗粒大小和体外及体内mRNA表达等属性。在水相条件下，LLN mRNA没有保持长期储存稳定性。在最佳浓度下添加冷冻保护剂有助于保持冻干LLNs中mRNA的体外表达效率。然而，在冻干和重悬过程中，LLN-mRNA的纳米结构发生了变化，影响了mRNA-LLNs与血清蛋白的体内相互作用，导致不同的体内效率。在液氮中冷冻mRNA的LLNs，加入5%的蔗糖或海藻糖，被认为是长期储存的最佳选择。 Hong等人开发了一种使用阳离子脂质基传递系统的可冻干SARS-CoV-2疫苗。重新配制的疫苗在小鼠体内诱导针对SARS-CoV-2的体液和细胞免疫反应，证明了冻干后SARS-CoV-2的免疫原性和中和抗体活性。在冷冻过程中的各种压力可能会影响LPNs的稳定性，包括晶体形成、界面效应、冷冻浓缩、缓冲液pH值变化和相分离。冷冻过程中的晶体形成施加了冰-液界面，这可能导致包括mRNA在内的蛋白质分子胶体结构的吸附和损伤。冷冻增加了剩余液相中溶质材料的浓度，促进了粒子-粒子相互作用，并导致粒子聚集。冷冻浓缩增加了对脂质双层的渗透压，对膜施加物理压力，导致膜破裂。此外，渗透稳定性取决于脂质膜组成，因为溶质选择性渗透。其他研究讨论了冷冻和干燥引起的压力的详细信息。在一项研究中，Jones等人检查了冷冻干燥对mRNA完整性的影响。在水或10%海藻糖中冷冻干燥的纯化RNA（25 µg/mL），储存在−70◦C、−20◦C、4◦C、37◦C或室温下，在氮气下储存长达10个月，并分析RNA完整性。在水和10%海藻糖中冷冻干燥的RNA的恢复率分别为66%到零。此外，在10%海藻糖中储存的RNA在所有时间点上显示出高一致性的恢复，允许RNA在4◦C下储存长达10个月。这允许即使在发展中国家也能开发RNA疫苗。Muramatsu等人证明，核苷修饰的mRNA-LNPs可以冻干，并且mRNA LNPs的物理化学属性（粒径、封装效率）在室温下12周和至少4◦C下24周储存后没有显著变化。然而，在4◦C和25◦C储存时，冻干的核苷修饰mRNA-LNPs的RNA完整性分别观察到10-15%和30%的下降。此外，在小鼠中进行的体内生物发光成像研究表明，冻干的萤火虫荧光素编码mRNA-LNPs保持了高表达，没有失去高翻译性。在比较小鼠免疫研究中，作者证明了冻干的核苷修饰mRNA LNP流感病毒疫苗在室温储存12周后或至少4◦C储存24周后保留了其效力。水替代假说和玻璃化是冷冻和冻干保护剂（糖）在冻干过程中稳定生物系统的两种机制。作为冻干保护剂的海藻糖被报道在冷冻干燥过程和随后在−80、5、25和40◦C储存期间稳定mRNA-精蛋白复合物配方。在储存期间分析的质量属性，包括外观、RNA完整性、RNA含量、pH值和渗透压，符合质量（稳定和安全）RNA药物所需的稳定性规格（WO2016165831A1）。蔗糖也似乎是稳定SS-可切割的质子激活脂质类材料（ssPalm），LNPs的一个组成部分的合适冷冻保护剂。通常，在冷冻期间，相互混溶性较低的分子导致相分离，颗粒将通过相互碰撞发生聚集/聚并。蔗糖与含有接枝聚乙二醇（PEG）聚合物的LNP表面具有高混溶性。蔗糖与LNP表面PEG层之间的优先相互作用通过表现出冷冻保护属性稳定颗粒。糖与磷脂头基团之间的相互作用降低了干燥状态下脂质膜的熔化温度。糖减少了磷脂的酰基链之间的范德华相互作用，并保持了头基团间距。因此，糖减少了水与磷脂之间的相互作用，然后取代了水。在无水条件下，糖是水的良好替代品。糖与脂质双层表面的脂质之间形成了多个氢键，而没有改变脂质双层结构。糖可以同时与不同的脂质相互作用，与磷脂极性基团（P=O和/或C=O）和脂质胆碱基团的甲基基团相互作用。在玻璃化过程中，糖溶液在冷冻过程中变得冷冻浓缩，在去除水分后形成稳定的玻璃基质，结果在糖的玻璃基质中捕获了冻干蛋糕。具有低流动性和高粘度的玻璃基质保护脂质双层免受冰晶引起的损伤。此外，糖玻璃基质抑制了脂质相变介导的构象变化。渗透和体积效应是玻璃化期间的两个关键属性，通过防止脂质膜在近距离聚集时相邻双层的密切接触，减少机械应力。冻干技术的进展，包括使用SMART冷冻干燥进行压力测量和用于监测关键过程参数的过程分析技术，有助于满足mRNA-LNP疫苗更好的储存要求。 6.2.聚合物纳米载体 通常，与基于脂质的载体类似，mRNA传递的聚合物载体利用静电吸引力（聚合物的正电荷和mRNA的负电荷之间）进行mRNA多聚体的自组装。与基于脂质的系统相比，mRNA多聚体在雾化后恢复结构，因此在探索粘膜疫苗接种方面具有吸引力。mRNA多聚体形成更坚硬的超分子结构，具有高分子量和较慢的聚合物链流动性，这提供了更好的稳定性。Palamà等人通过乳液-扩散-蒸发方法开发了聚（ε-己内酯）纳米颗粒，用于GFP（绿色荧光蛋白）-mRNA的细胞内传递。在颗粒组装之前形成精蛋白-mRNA复合物，以获得更好的稳定性、控制释放和更高的mRNA装载量。具有核壳结构的纳米颗粒有一个被聚（ε-己内酯）层覆盖的mRNA内核，提供了更大的稳定性和隐身属性。作者指出，聚（ε-己内酯）纳米颗粒有可能解决mRNA不稳定问题。mRNA传递的聚合物载体一直在与细胞毒性作斗争，部分原因是聚合物阳离子电荷。用聚乙二醇链修饰阳离子电荷聚合物可以改善体外和体内的货物传递，并减轻细胞毒性。此外，聚合物载体的固有异质性和它们相对较低的基因转移效率限制了聚合物mRNA疫苗的临床转化和大规模生产。由于患者依从性和较少侵入性疫苗接种，基于支架的mRNA疫苗传递已被利用。Yan等人报告了一种用于mRNA疫苗传递的可注射壳聚糖海藻酸盐凝胶支架。通过单链mRNA与脂质体载体纳米颗粒的复合形成脂质复合体复合物。然后，mRNA脂质复合体被装载到冻干的壳聚糖-海藻酸盐支架上，随后进行再水化步骤。此外，确定了凝胶中mRNA释放动力学和凝胶-mRNA的免疫效率。结果表明，基于支架的mRNA疫苗传递可能是传统免疫方法的潜在替代品。聚乙烯亚胺已被广泛用于mRNA疫苗传递。聚乙烯亚胺结构的优化提供了高基因转染效率。聚乙烯亚胺的属性，如在广泛的pH范围内的缓冲能力和在低pH下氨基酸基团的高质子化比率，有助于核酸复合物的形成。尽管效果出色，但聚乙烯亚胺的应用受到其毒性和与带负电荷的血清蛋白的相互作用行为的限制，这会导致蛋白质聚集。将PEG纳入配方中，使用低分子量聚合物形式（约2kDa的聚乙烯亚胺），与环糊精的共轭，以及二硫键连接是一些可以减轻聚乙烯亚胺毒性的策略。 低分子量聚乙烯亚胺（2k）已被用于传递HIV-gag mRNA至树突状细胞和BALB/c小鼠。在体内皮下注射后，形成的mRNA-低分子量聚乙烯亚胺复合物具有诱导抗原特异性免疫反应的潜力。基于2 kDa聚乙烯亚胺的mRNA疫苗通过鼻内给药成功传递了编码HIV gp120抗原的mRNA，并诱导了系统性免疫反应。为了确定聚乙烯亚胺的化学结构对mRNA传递至目标部位（淋巴结）及随后的免疫反应的影响，研究了聚乙烯亚胺化学结构的修饰，包括与几种环糊精复合。Tan等人合成了β-环糊精（β-CD）和支链聚乙烯亚胺（2 kDa）的共轭物，用于mRNA疫苗的传递。形成的复合物有效包裹mRNA，并通过穿过质膜和从内质网逃逸，提供高转染效率。 除了聚乙烯亚胺之外，还研究了其他聚合物载体，如聚（氨基酯）、壳聚糖、聚酰胺胺和聚（2-丙基丙烯酸）。由于其外围的高胺密度，聚（氨基酯）是一种可生物降解的聚合物，通过形成超支化树状球形树状体，有效地形成mRNA复合物。以前已经研究过用于传递核酸（mRNA）的基于壳聚糖（CS）的纳米颗粒。然而，它们有限的从内质网逃逸能力阻碍了mRNA的传递。壳聚糖是一种从甲壳质衍生的生物相容性阳离子生物聚合物，与核酸发生静电相互作用，并且可以进行化学修饰。电荷密度或脱乙酰度、分子量和胺基与磷酸盐比率（N:P）是影响SiRNA-CS基系统转染效率的壳聚糖参数。通过硫酸化透明质酸包覆和添加海藻糖，CS-mRNA纳米颗粒的生物活性提高了4-10倍。尽管壳聚糖纳米颗粒的体外和体内传递效率很高，但与用于传递mRNA的脂质纳米颗粒相比，它们的胶体稳定性和内质网逃逸潜力较低。聚酰胺胺（PAMAM）树状体是高度支化的（甲基丙烯酸和乙二胺，以胺基和羧基末端基团结束）阳离子聚合物，并且是生物相容的，允许与核酸一起包埋。Chahal等人开发了体外转录的传统未修饰mRNA和修饰的PAMAM树状体纳米颗粒（MDNP）用于RNA疫苗传递。修饰的树状体纳米颗粒可以通过在小鼠中提供多种抗原来提供针对包括H1N1流感病毒和埃博拉病毒在内的广泛致命病原体的保护性免疫反应。结果表明，修饰的树状体纳米颗粒通过在小鼠中提供多种抗原，诱导了保护性免疫反应。 聚（ε-己内酯）是一种吸引人的mRNA应用聚合物，已获得食品药品监督管理局（FDA）的批准。由聚（ε-己内酯）组成的纳米颗粒具有低体外和体内毒性、在生物液体中高胶体稳定性、控制封装货物的释放行为，以及通过内吞作用实现的卓越细胞摄取。可生物降解的聚合物，如聚葡糖（一种葡萄糖聚合物）和精胺（一种在所有生物中发生的多胺），已被采用于mRNA疫苗的传递。聚葡糖：精胺共轭物以5:1的电荷比自组装与编码SARS-CoV-2 RBD抗原的mRNA，保护了被包裹的mRNA免受核酸酶的降解，允许在4°C下以冻干形式储存而不失核酸活性，这对于疫苗的储存和运输是一个重要考虑因素。 E. Jeandupeux等人研究了将聚（2-丙基丙烯酸）PPAA，一种在酸性pH下具有膜溶解特性的阴离子聚合物，纳入壳聚糖mRNA纳米颗粒中，以提高生物活性并促进内质网逃逸。三元（CS/mRNA/PPAA）纳米颗粒被评估了粒径、多分散指数、z-电位和体外转染效率。与脂质对照（LipofectamineTM MessengerMaxTM（LP-MM）mRNA脂质纳米颗粒）相比，三元纳米颗粒在pH 6.5时的表达水平为86%，没有显示出任何代谢毒性，而脂质对照的生物活性仅为75%。假设PPAA通过增加内质网释放或减少CS/mRNA复合物稳定性来增强生物活性。 虽然越来越多的研究表明使用各种聚合物载体进行mRNA传递，但值得注意的是，目前还没有全面的比较研究可以指导使用聚合物载体有效传递mRNA疫苗的理想配方。 6.3.佐剂纳入脂质纳米颗粒 为了增强免疫反应，佐剂被纳入疫苗中，通过激活细胞特异性受体，进而促进抗原呈递。不溶性铝盐传统上被用作佐剂。然而，它们与许多限制相关，例如对某些抗原无效和无法启动需要替代品的强大细胞免疫反应。在抗原呈递细胞上表达的 toll样受体（TLRs）由于其在激活后增强细胞因子产生的能力，成为佐剂开发的主要目标。这反过来又触发了免疫系统，从而增强了疫苗的效力。 肽也被纳入脂质纳米颗粒作为佐剂。Xiang等人合成了靶向淋巴结的melittin-脂质纳米颗粒，能够刺激位于淋巴结区域的丰富抗原呈递细胞，从而改善癌症免疫治疗结果。与游离melittin相比，α-melittin-脂质纳米颗粒在刺激CD8+ T辅助细胞方面表现出3.6倍的增加，这些细胞可以有效地对抗肿瘤细胞。α-melittin的良好稳定性和缺乏副作用使其成为一种理想的靶向淋巴结的纳米疫苗，具有转化潜力，可以诱导系统性抗肿瘤反应。在一些研究中，从细菌衍生的单磷酸脂质被纳入作为佐剂。Ravindran等人通过纳入可溶性利什曼抗原（SLA）和佐剂单磷酸脂质-海藻糖二角诺霉素，配制了一种脂质体制剂，能够增强针对内脏利什曼病的免疫反应。与脂质体佐剂配方在BALB/c小鼠的肝脏和脾脏中对Leishmania donovani的保护水平明显更高。即使在接种后四个月，也明显观察到包括IFN-γ和Ig2a抗体诱导在内的细胞免疫反应，这为所开发配方提供长期免疫能力的潜力提供了证据。Chikh等人探索了合成的甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤基序包含的寡核苷酸作为疫苗佐剂的潜在用途，并得出结论，将佐剂封装在稳定的脂质纳米颗粒中并增强了其免疫刺激性活性。这些佐剂属于被命名为病原体相关分子模式（PAMPs）的分子组，可以被抗原呈递细胞上表达的病原体识别受体特别识别。佐剂通过toll样受体9（TLR-9）信号通路起作用，从初步数据中明显看出，这导致了TLR-9表达的上调、一氧化氮诱导和内质网成熟。在Lee等人进行的一项研究中，将称为Pam-3的佐剂纳入脂质纳米颗粒，以促进mRNA介导的癌症免疫治疗。阳离子脂质已成为mRNA传递的有前途的载体。这些脂质在生理条件下具有中性电荷，在酸性条件下具有正电荷，这使得在低pH下容易纳入mRNA，以产生具有特征性高封装效率的脂质纳米颗粒。所制定的纳米颗粒成功表达了肿瘤抗原，最终导致刺激免疫反应。因此，Pam-3纳入的脂质纳米颗粒为mRNA疫苗预防肿瘤提供了协同效应。在某些情况下，根据所纳入的脂质的性质，脂质纳米颗粒本身作为佐剂，导致免疫系统的激活。Mohamed等人证明了在脂质纳米颗粒中封装mRNA和蛋白亚单位疫苗后，其效果得到增强，这归因于T滤泡辅助细胞的诱导和体液反应的激活。发现纳入阳离子脂质组分对于引发免疫反应至关重要。从比较研究中获得的结果表明，所制定的脂质纳米颗粒优于目前批准的佐剂，如MF59。 生物材料的电荷对其与免疫系统的相互作用有显著影响。Kedmi等人证明了阳离子脂质如1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷能够刺激促炎反应。阳离子纳米颗粒诱导的Th1细胞因子，包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，比对照组高出10至75倍。脂质的正电荷通过静电相互作用实现核酸的结合和凝聚，从而促进有效载荷跨越细胞膜进入细胞质。因此，阳离子脂质是最广泛研究的非病毒载体之一，用于传递核酸、mRNA和小干扰RNA。Zhang等人开发了一种具有自我佐剂特性的C1脂质纳米颗粒疫苗，用于传递具有抗肿瘤效果的mRNA疫苗。抗原和免疫增强佐剂的共传递促进了抗原呈递细胞的摄取，进而激活了TLR4信号传导。此外，体内生物分布研究表明，纳米疫苗在淋巴结和肺部有强烈的定位。体内效果的评估显示淋巴结中CD8+ T细胞的浓度最高，从而证实了纳米疫苗给药后免疫反应的增强。核苷修饰的mRNA在脂质纳米颗粒中的配方已被证明是对抗传染病的有效免疫方式。已确定，在对抗艾滋病的免疫中，mRNA-脂质纳米颗粒引发的免疫反应与重组蛋白疫苗相比，要么相同，要么增强，即血清中HIV-1结合抗体的高滴度。发现对HIV的抗体诱导至少持续41周。因此，含有佐剂的脂质纳米颗粒在生产针对各种感染的单组分或多组分疫苗方面具有很大的潜力。 6.4.靶向抗原呈递细胞 脂质纳米颗粒作为一种载体系统，因其生物相容性、高装载效率和可定制的表面特性等多功能特性，正在成为传递疫苗的极其有效的系统。Moderna（mRNA-1273）和辉瑞-BioNTech开发的两种针对COVID-19的疫苗的成功，证明了脂质纳米颗粒的巨大转化价值。经过多年的深入研究，现代脂质纳米颗粒技术已成为临床上先进的基因传递系统，克服了传统基因疗法的主要困难，包括核酸降解和细胞摄取最小化。为了通过激活细胞特异性受体来增强免疫反应，进而促进抗原呈递，疫苗中加入了佐剂。不溶性铝盐传统上被用作佐剂。然而，它与许多限制相关，例如对某些抗原无效和无法启动强大的细胞免疫反应，这就需要替代品。在抗原呈递细胞上表达的toll样受体（TLRs）由于其在激活后增强细胞因子产生的能力，成为佐剂开发的主要目标。这反过来又触发了免疫系统，从而增强了疫苗的效力。 肽也被纳入脂质纳米颗粒作为佐剂。Xiang等人合成了靶向淋巴结的melittin-脂质纳米颗粒，能够刺激位于淋巴结区域的丰富抗原呈递细胞，从而改善癌症免疫治疗结果。与游离melittin相比，α-melittin-脂质纳米颗粒在刺激CD8+ T辅助细胞方面表现出3.6倍的增加，这些细胞可以有效地对抗肿瘤细胞。α-melittin的良好稳定性和缺乏副作用使其成为一种理想的靶向淋巴结的纳米疫苗，具有转化潜力，可以诱导系统性抗肿瘤反应。在一些研究中，从细菌衍生的单磷酸脂质被纳入作为佐剂。Ravindran等人通过纳入可溶性利什曼抗原（SLA）和佐剂单磷酸脂质-海藻糖二角诺霉素，配制了一种脂质体制剂，能够增强针对内脏利什曼病的免疫反应。与脂质体佐剂配方在BALB/c小鼠的肝脏和脾脏中对Leishmania donovani的保护水平明显更高。即使在接种后四个月，也明显观察到包括IFN-γ和Ig2a抗体诱导在内的细胞免疫反应，这为所开发配方提供长期免疫能力的潜力提供了证据。Chikh等人探索了合成的甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤基序包含的寡核苷酸作为疫苗佐剂的潜在用途，并得出结论，将佐剂封装在稳定的脂质纳米颗粒中增强了其免疫刺激性活性。这些佐剂属于被命名为病原体相关分子模式（PAMPs）的分子组，可以被抗原呈递细胞上表达的病原体识别受体特别识别。佐剂通过toll样受体9（TLR-9）信号通路起作用，从初步数据中明显看出，这导致了TLR-9表达的上调、一氧化氮诱导和内质网成熟。在Lee等人进行的一项研究中，将称为Pam-3的佐剂纳入脂质纳米颗粒，以促进mRNA介导的癌症免疫治疗。阳离子脂质已成为mRNA传递的有前途的载体。这些脂质在生理条件下具有中性电荷，在酸性条件下具有正电荷，这使得在低pH下容易纳入mRNA，以产生具有特征性高封装效率的脂质纳米颗粒。所制定的纳米颗粒成功表达了肿瘤抗原，最终导致刺激免疫反应。因此，Pam-3纳入的脂质纳米颗粒为mRNA疫苗预防肿瘤提供了协同效应。在某些情况下，根据所纳入的脂质的性质，脂质纳米颗粒本身作为佐剂，导致免疫系统的激活。Mohamed等人证明了在脂质纳米颗粒中封装mRNA和蛋白亚单位疫苗后，其效果得到增强，这归因于T滤泡辅助细胞的诱导和体液反应的激活。发现纳入阳离子脂质组分对于引发免疫反应至关重要。从比较研究中获得的结果表明，所制定的脂质纳米颗粒优于目前批准的佐剂，如MF59。 6.5.自扩增mRNA疫苗 脂质纳米颗粒因其生物相容性、高装载效率和可调节的表面特性等多样化特性，正成为疫苗递送领域极其有效的载体系统。Moderna（mRNA-1273）和辉瑞-BioNTech成功开发了两种针对COVID-19的疫苗，证明了脂质纳米颗粒的巨大转化价值。经过多年的深入研究，现代脂质纳米颗粒技术已成为临床上先进的基因递送系统，克服了传统基因疗法的主要困难，包括核酸降解和细胞摄取不足。为了增强免疫反应，疫苗中加入了佐剂，通过激活细胞特异性受体促进抗原呈递。传统上使用的是不溶性铝盐作为佐剂，但它存在许多限制，例如对某些抗原无效和无法引发强烈的细胞免疫反应，因此需要替代品。表达在抗原呈递细胞上的Toll样受体（TLRs）因其在激活后增强细胞因子产生的能力，成为佐剂开发的主要目标。这反过来触发免疫系统，增强疫苗的效力。生物材料的电荷对其与免疫系统的相互作用有显著影响。Kedmi等人证明了阳离子脂质如1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷能够刺激促炎反应。阳离子纳米颗粒诱导的Th1细胞因子包括IL-2、IFN-γ和TNF-α，比对照组高出10至75倍。脂质的正电荷通过静电相互作用实现核酸的结合和凝聚，从而促进有效载荷穿过细胞膜进入细胞质。因此，阳离子脂质是最广泛研究的非病毒载体之一，旨在递送核酸、mRNA和小干扰RNA。张等人开发了一种具有自佐剂特性的C1脂质纳米疫苗，用于递送具有抗肿瘤效力的mRNA疫苗。抗原和免疫增强佐剂的共递送促进了抗原呈递细胞的摄取，进而激活了TLR4信号传导。此外，体内生物分布研究表明纳米疫苗在淋巴结和肺部有强烈的定位。体内效力评估显示淋巴结中CD8+ T细胞浓度最高，从而证实了纳米疫苗给药后免疫反应的增强。将核苷修饰的mRNA配方在脂质纳米颗粒中已被证明是对抗传染病的有效免疫方式。已确定，在对抗艾滋病的免疫中，mRNA-脂质纳米颗粒引发的免疫反应与重组蛋白疫苗相同或更强，即血清HIV-1结合抗体滴度更高。发现对HIV的抗体诱导至少持续41周。因此，含有佐剂的脂质纳米颗粒在生产单一或多组分疫苗对抗各种感染方面具有很大的潜力。 7.mRNA疫苗的不足 7.1.抗体反应的持续时间 mRNA疫苗产生的抗原被APCs摄取并运输到淋巴结。在这里，B细胞、APC和滤泡辅助T细胞（TFH细胞）之间的相互作用促进了生发中心的形成。然后B细胞在生发中心增殖并分化和突变，产生针对病原体的高亲和力中和抗体。这一级联的生化免疫反应对于持久的抗体至关重要，对应于对抗传染病的长期作用。几种有前景的mRNA疫苗正在开发中，它们积极针对APCs。针对APC细胞特异性配体、单克隆抗体（mAbs）和肽的LNPs是正在探索的一些策略，以增加mRNA疫苗产生的免疫反应。此外，通过延长抗原mRNA的翻译来改变mRNA疫苗的药代动力学特性，现已成为增强抗体反应的有希望的工具。mRNA疫苗在针对HIV-1、SARS-CoV-2、寨卡病毒和流感病毒的临床前研究中引发了强大的生发中心免疫原性反应和TFH细胞诱导。尽管这些结果是有希望的，但抗体反应的持续时间是一个复杂的现象，会因抗原而有很大差异。此外，评估mRNA疫苗的免疫反应持续时间需要更长期的数据才能全面了解。 7.2.安全性 总体而言，目前的mRNA疫苗在临床试验和批准后的实际人群中显示出有希望的安全性。这些疫苗在临床试验中只有轻微或中度的不良事件。然而，也有一些零星的安全事件需要进一步优化mRNA疫苗及其所有成分。例如，CureVac基于精蛋白的狂犬病疫苗CV7201，在78%的参与者中引起不良反应。这导致CureVac采用LNPs作为他们下一个狂犬病候选疫苗CV7202的主要和首选递送工具。与大多数药物一样，对mRNA疫苗的不良反应通常随着剂量的增加而增加和升级。例如，在Moderna的流感H10N8疫苗的I期试验中，从400 µg开始观察到不良事件。因此，他们继续使用高达100 µg的较低剂量。在CV7202的I期试验中，5 µg剂量具有高反应原性；因此，1 µg是给予受试者的最高剂量。在每百万COVID-19疫苗接种中，轻度过敏性反应为4.7例，其中Moderna疫苗为每百万2.5例，辉瑞-BioNTech疫苗为每百万2.2例。这比传统疫苗通常看到的要高得多。科学家提出，这种过敏反应可以归因于患者对LNPs中使用的聚乙二醇化脂质的预先存在的抗体。这些抗体可以在体内形成，以响应许多消费品中的聚乙二醇，如牙膏和洗发水。尽管聚乙二醇是安全的，但据传它以T细胞独立的方式在一部分人口中激活体液免疫。它通过直接交联B细胞受体并引入IgM产生来实现这一点。据报道，40%的人群中存在抗聚乙二醇抗体，这可能会加速和增加过敏反应的风险，并阻碍疫苗效力。CDC建议不要给有对辉瑞-BioNTech或Moderna疫苗过敏反应史的人接种mRNA疫苗。由于mRNA疫苗配方的一些成分可能会引起一部分人口中的过敏反应，因此应该重新设计配方成分，以增强安全性。 7.3.孕产妇/新生儿疫苗接种 怀孕期间和婴儿新生儿阶段的免疫系统是高度动态和不断发展的，这可能会增加一个人对传染病的易感性。寨卡病毒可以感染发育中的胎儿的皮层神经元和胶质细胞，导致细胞死亡、神经炎症和胎儿严重的先天性畸形。巨细胞病毒感染可能导致大约1%的妊娠并发症，导致先天性残疾，以及婴儿的神经损伤。也有报道称SARS-CoV-2病毒在子宫内的传播极为罕见。其对孕产妇和新生儿健康的影响正在调查中。为了解决这些不足，孕产妇疫苗接种已成为提高孕产妇健康和减少新生儿发病率负担的工具。孕产妇IgG抗体可以通过与新生儿结晶可片段（Fc）受体结合并进入胎儿循环来轻易穿过胎盘屏障。这保护胎儿免受病原体和其他传染病的侵害。几项临床前研究表明，孕产妇接种mRNA-LNPs预防了寨卡病毒传播给怀孕小鼠的胎儿，A组和B组链球菌，并保护了小鼠新生儿免受疱疹病毒的侵害。 7.4.老年人疫苗接种 预计到2050年，全球60岁以上人口比例将从12%翻倍至22%。这一人群非常需要疫苗，因为许多传染病对老年人的影响格外严重。例如，70-90%的流感相关死亡发生在65岁以上的人群中，COVID-19在65岁以上患者中的致命性比年轻患者高65倍。老年人群体通过疫苗接种获得免疫更加困难，因为年龄对先天和适应性免疫系统产生不利影响。感染后产生的适应性免疫反应通常不足，除了细胞因子信号传导受损外，还有生理和细胞变化受损。这些变化包括较少的初始B细胞和T细胞、T细胞凋亡的易感性增加、T细胞受体多样性减少，以及在细胞毒性CD8+ T细胞上关键受体如CD28的表达减少。mRNA疫苗可能是增强老年人免疫力的解决方案。这些疫苗可能对所有年龄组，特别是老年人提供强大的效力，如辉瑞-BioNTech疫苗候选物BNT162b2的III期临床试验所见。该疫苗在所有按年龄明确定义的治疗组中激发了超过93%的效力。同样，Moderna疫苗mRNA-1273也非常有效，在65岁以上的志愿者中显示了86.4%的效力，相比之下，18-65岁年龄组的效力为95.6%。设计高效的药物递送系统对于提高老年人的疫苗效力至关重要。mRNA递送工具充当佐剂，通过增强APCs对注射部位的招募来放大疫苗反应。例如，诺华的油包水乳液MF59，已被用作mRNA递送工具，并可用作佐剂。MF59放大了流感疫苗的免疫反应，并且已获准用于老年人。在老年人群体中，用MF59佐剂的流感疫苗增强了血清转换和血清保护率，与非佐剂疫苗相比。 7.5.疫苗接受度 只有当疫苗被接种，并且人们对疫苗有满意的接受度和对疫苗效力的信念时，疫苗才有效。然而，由错误信息引发的公众怀疑威胁到群体免疫的实现和维持，并将最脆弱的人群，如老年人和儿童，置于风险之中。疫苗覆盖率和接种率的下降可能导致本已根除的危及生命的疾病的重新出现。例如，麻疹在2000年已在美国完全根除，但由于疫苗接受度差，2019年感染了超过1200人。对于COVID-19，由于信息量大和意识广泛，全球疫苗接受率在55%到90%之间。美国目前的接受率在56-75%之间，可能不足以维持对SARS-CoV-2的群体免疫阈值。此外，在美国，mRNA疫苗试验的高效力率提高了公众对mRNA疫苗的信心。 7.6.疫苗获取 负担得起且容易获取疫苗是在实现对传染病普遍保护方面的最大挑战，特别是在低收入国家。由于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的冷储要求，这种获取进一步受到限制。在2014-2016年致命的西非埃博拉病毒爆发期间，需要-80°C储存的疫苗通过便携式和可重复使用的Arktek冷冻箱在刚果民主共和国供应，允许向40万人接种疫苗。这种冷储技术能够在流行病期间迅速部署数百万剂疫苗。然而，在像COVID-19这样不断演变的大流行中为数十亿人接种疫苗需要热稳定的疫苗。两种SARS-CoV-2疫苗候选物在室温下的临床前研究中报告为热稳定。如果这些热稳定的mRNA疫苗候选物在临床试验中显示出有希望的结果，它们可以极大地简化全球对mRNA疫苗的获取。设计负担得起、稳定且有效的热稳定mRNA疫苗是当务之急。 8.结论 几十年来在mRNA设计及其递送技术的发展和研究，使mRNA疫苗成为对抗大流行和现有传染病的惊人工具。首批两种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗以意想不到的速度开发出来。这些疫苗超出了预期，为mRNA疫苗的未来奠定了坚实的基础和基本工作。从众多mRNA疫苗的临床试验中可以看出，这些疫苗可以与常规疫苗平台并驾齐驱甚至取代它。mRNA技术有潜力开发出针对持久和具有挑战性的病原体的更有效疫苗，并在不久的将来治疗各种癌症。然而，需要在mRNA递送技术上取得进展，以实现更有效、更安全、无需冷链的mRNA疫苗，有能力为全球数十亿人口接种疫苗。需要进一步研究mRNA疫苗如何影响先天免疫反应。批准的mRNA疫苗的大量积极安全性和效力数据，加上经过验证的监管批准路径，为科学界带来了希望，即mRNA治疗确实有巨大的潜力改变现代生物治疗方法，用于疫苗接种、蛋白质替代疗法和癌症免疫疗法。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。