Eritoran Tetrasodium

摘要：近几十年来，疫苗一直是预防病原体传播和癌症的非凡资源。即使它们可以由单一抗原形成，但添加一个或多个佐剂是增强免疫信号对抗原反应的关键，从而加速并增加保护效果的持续时间和效力。它们的使用对于脆弱人群，如老年人或免疫功能低下的人尤其重要。尽管佐剂非常重要，但只是在过去的四十年里，对新型佐剂的寻找才有所增加，发现了新的免疫增强剂和免疫调节剂类别。由于涉及免疫信号激活的级联反应的复杂性，它们的作用机制仍然不甚了解，即使得益于重组技术和代谢组学，最近已经取得了显著的发现。本综述着重于研究中的佐剂类别、近期作用机制研究，以及纳米输送系统和可以化学操纵以创造新型小分子佐剂的新型佐剂类别。 1.引言 佐剂——根据该词的拉丁语词源（adjuvare，意为“帮助”）——被定义为添加到疫苗中以增强免疫系统对抗原的反应并延长其持续时间的物质。在疫苗开发中使用佐剂利用了这些物质可以提供的许多好处，例如减少每次接种剂量所需的抗原量和加强接种的频率，或通过延长其半衰期改善抗原成分的稳定性，从而增强其免疫原性。佐剂可以根据其作用机制、化学性质或来源（合成、天然、内源性）进行分类。佐剂超级家族包括许多不同的物质，特别是能够激活或增强免疫信号或传递系统的小分子或大分子。免疫增强剂是能够在成人或脆弱人群中激活免疫信号的化合物；其中包括模式识别受体（PRRs）的激动剂，如RIG-I样受体（RLR）、干扰素基因（STING）、Toll样受体（TLR）和NOD样受体（NLRs）。传递系统是能够改善和延长疫苗保护的佐剂，如乳液和纳米制剂，类似于脂质体、病毒样颗粒和病毒体。根据所需的免疫反应类型，抗原应与适当的佐剂或佐剂组合正确配制，以获得尽可能少的副作用的最佳反应。到目前为止，已经开发出适当的配方，特别是通过结合不同的佐剂家族，尤其是铝盐与脂质体或乳液。确定适当的佐剂组合可能极为重要，目前许多临床研究正在进行中，以研究它们在不同病理情况下的疗效，特别是在癌症方面。由于佐剂的应用范围从病原体到过敏、自身免疫性疾病和癌症，需要正确理解关键机制，以便只针对特定途径，避免潜在的毒性。即使疫苗试验遵循严格的指导方针，多年来也出现了许多关于其安全性的担忧，特别是在COVID-19疫苗接种活动期间。疫苗的潜在毒性有时归因于所含佐剂。最近还对最成熟和最安全的佐剂，如铝衍生物的潜在毒性表示担忧。即使铝含量在许可的佐剂中每剂从0.8到0.125毫克不等，但近年来出现了关于神经毒性和自闭症的担忧。相比之下，其他研究表明铝的神经毒性是在长期服用后发生的，监管机构将铝在食品中的可容忍周摄入量（TWI）限制在每公斤体重1毫克。有趣的是，有时佐剂由脂质构成，如纳米制剂的脂质体，或其他内源性无风险大分子。EMA和FDA已经批准了47种疫苗，但这些制剂中包含的大多数佐剂是最早的铝佐剂类成员，或脂质体制剂。这种选择可能是由于这些佐剂类的已知耐受性，以及寻找新化合物的相关成本。事实上，近年来发现了不同类别的小分子免疫增强剂；然而，与药物一样，这些化合物需要适当的、耗时的临床前和临床试验来评估它们的疗效和安全性。在最近和最有趣的类别中，报告了几种PRR激动剂，对成人群体具有有希望的结果。最近的研究表明，能够通过线粒体应激途径激活免疫反应的小分子具有通过PRR途径激活免疫反应的效力。本综述着重于作用机制，开发的佐剂类别，特别强调可以针对的新的途径，以创建新的佐剂。 2.佐剂作用机制 尽管佐剂通常用于数十亿剂疫苗的配方中，但其作用机制仍然不甚了解。因此，深入理解作用方式和参与免疫系统对病原体反应的免疫机制是开发新佐剂的关键步骤。最近，人们非常关注更深入地理解疫苗佐剂如何刺激免疫反应。由于最近在免疫学研究方面的进展，已经有可能阐明佐剂作用的一些机制，如储存效应和细胞因子和趋化因子的释放，免疫细胞在注射部位的动员，适应性免疫反应的诱导，增加抗原免疫原性，以及抗原呈递细胞（APCs）的激活。阐明佐剂发挥作用的所有机制将提供关于自适应免疫如何由先天免疫促进的关键信息，并有助于开发新的强效疫苗。可以使用广泛因素对佐剂进行分类，包括它们的物理化学特性、起源和作用模式；最受欢迎的分类方案将疫苗佐剂分为两组，传递系统和免疫刺激剂。另一类佐剂由粘膜佐剂组成，可以作为传递载体或免疫刺激化合物，如壳聚糖及其衍生物（N-三甲基和单-N-羧甲基壳聚糖）、霍乱毒素（CT）和热敏肠毒素（LTK3和LTR72）。表1中报告了新的传递系统佐剂。传统上，传递载体仅作为免疫刺激佐剂的储存库，以激活先天免疫系统的细胞。由于现在有证据表明一些传递机制可以激活先天免疫，这种分类不再准确。事实上，传递载体佐剂既作为抗原载体，又通过激活先天免疫系统引起局部促炎反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这些现象导致先天免疫细胞的激活，导致细胞因子和趋化因子的释放，这是免疫增强剂佐剂利用的相同作用模式。免疫佐剂（表1）是通过直接刺激先天免疫系统来增强抗体产生的免疫增强剂化合物。此外，作为免疫调节剂的佐剂可以刺激特定类型的细胞因子的产生，从而增强免疫系统的反应。例如，铝盐、弗氏佐剂和CpG寡脱氧核苷酸已被报道能够诱导产生和释放一些参与调节先天和适应性免疫的细胞因子，如干扰素（IFNs）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素（IL2和IL12）。已有几种细胞因子被报道作为免疫增强剂佐剂，刺激抗原特异性血清/粘膜抗体和细胞介导的免疫。在这类物质中，最知名的细胞因子佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN、趋化因子和一些白细胞介素（IL-1, IL-2, IL-12-IL-15, IL-18）[15]。此外，免疫刺激剂对于招募免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞（DCs））、激活APCs以及疫苗在注射部位的长期积累非常有用。最近的研究将Toll样受体（TLR）与自身免疫系统联系起来，发现了TLR激活先天免疫系统导致适应性免疫和炎症反应诱导的机制，确保了持久保护。 佐剂可以作为传递系统，捕获、吸附或聚集抗原，并随时间缓慢释放它们。这种被称为"贮存效应"（图1a）的机制发生在注射部位，佐剂通过防止由于肝脏清除导致的抗原移除，增强了疫苗的半衰期，并确保了免疫系统的持续刺激，从而产生高抗体滴度。多年来，许多通过贮存效应发挥作用的佐剂被描述出来，如脂质体、乳液（油包水和水包油）、病毒体，以及脂质或聚合物纳米颗粒（NPs）。其中一些已被开发来模拟病原体膜，以运输、保存和释放抗原，并同时增强其免疫原性功能。几种类型的脂质体，如传统的脂质体、多层囊泡（MLVs）或固体核心脂质体，也通过促进贮存效应发挥作用。油包水乳液，如完全弗氏佐剂（CFA），以及一些NPs也通过确保持久免疫反应的贮存效应发挥作用。 图1. (a) 贮存效应及细胞因子和趋化因子的募集。(b) 免疫细胞的募集和炎症体的激活。 颗粒佐剂可以通过利用几种机制诱导免疫反应，例如上调细胞因子和趋化因子的释放，诱导注射部位的炎症状态，激活炎症级联反应，并招募先天免疫细胞。例如，油包水（o/w）乳液MF59和AS03刺激免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞）的募集，这些细胞将抗原和佐剂运输到更接近的淋巴结。免疫细胞在注射部位的募集诱导半胱氨酸蛋白酶的激活，导致进一步释放趋化因子（IL-18、IL-33、IL-1β），吸引其他树突细胞并延长这一现象（图1b）。此外，MF59和AS03在注射部位增加了CCR2、白细胞募集趋化因子（例如CCL2、CCL3和CCL5）以及集落刺激因子3（CSF3）的表达。同样，明矾在注射后诱导局部促炎微环境，引发补体级联反应，导致从血液流中招募免疫细胞。炎症体是先天免疫系统的重要组成部分。它们是针对病原体的有效免疫反应所必需的。当炎症体被激活时，细胞分泌促炎细胞因子，如IL-18、IL-33和IL-1β，这些细胞因子增强适应性免疫反应（图1b）。炎症体是由工作成分组成的细胞质蛋白信号通路，如富含亮氨酸的重复（LRR）C末端或DNA结合域（HIN200）、caspase-1效应物和适配蛋白ASC，这些蛋白激活炎症caspases。粒细胞、T细胞和B细胞、单核细胞、肝细胞、神经元、小胶质细胞和朗格汉斯细胞都表达炎症体，负责识别病原体并启动先天免疫反应。当炎症体被激活时，它蛋白水解裂解前caspase 1，释放活性形式，将前IL-1β和前IL-18转化为活性物种。ILs从细胞释放后，启动炎症并诱导保护免受病原体侵害的免疫反应。此外，IL-18激活淋巴细胞并刺激T细胞和B细胞的增殖，自然杀伤细胞（NKs）的活性，以及IFN-γ、TNF、IL-1和IL-2的分泌。因此，作为炎症体激活剂的佐剂是增强和维持免疫反应强度的成功策略。这些佐剂通过类似的机制激活炎症体，包括溶酶体降解、cathepsin释放和活性氧（ROS）的形成。在炎症体激活剂中，可以找到如铝盐、壳聚糖、皂素、鞭毛蛋白和合成阳离子聚合物等佐剂。铝盐诱导溶酶体损伤，诱导参与炎症体形成的cathepsin B的产生，特别是NOD样受体蛋白3（NLRP3）；活性炎症体触发caspase-1并刺激细胞因子的释放。壳聚糖和由合成阳离子聚合物制成的纳米颗粒激活NLRP3炎症体，并增强多种白细胞介素（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A和TNF）、IFN和IgG滴度的分泌，增强细胞和体液免疫反应。 佐剂可以通过一系列机制增强疫苗的免疫反应，如贮存效应和刺激先天免疫。先天免疫代表了针对病原体的第一道防线。事实上，早期识别病原体是发展适应性免疫反应的关键步骤。佐剂可以通过激活细胞模式识别受体（PRRs），识别PAMPs和损伤相关分子模式（DAMPs），刺激抗原呈递细胞（APCs）。由于在先天免疫系统中的中心作用，PRRs代表了新佐剂的战略目标。在PRRs超家族中，区分为表面和内体受体的Toll样受体（TLRs）是很有前途的佐剂目标，因为它们可以诱导信号通路，从而诱导关键转录因子的产生，如核因子-B（NF-B）。佐剂也可以用于靶向内体PRRs，如寡聚化结构域样受体（NLRs）和视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）（图2a）。定位与它们的性质密切相关；事实上，血浆TLR识别病原体蛋白和脂质，而内体受体则由核酸激活。TLR通过MyD88途径诱导NF-kB，导致促炎细胞因子的释放。基于TLR的佐剂复制了感染期间产生的PAMPs，因此可以非常有效地对抗通常诱导PRRs的病原体或疾病。尽管PRR激动剂具有出色的免疫刺激性效果，但它们作为疫苗佐剂的使用受到高制造成本的限制，这代表了未来临床应用的限制。APCs，如树突细胞（DCs），表达各种PRRs，使它们能够识别多种病原体成分。当PRRs被PAMPs激活时，它们启动复杂的信号级联反应，导致细胞因子和趋化因子的产生，包括干扰素（IFNs），增强抗原呈递能力，以及DCs向淋巴组织的迁移，在那里它们与T细胞和B淋巴细胞相互作用，启动和塑造适应性免疫反应。成熟的DCs也可以刺激naive CD4+ T细胞分化为不同的T辅助（Th）亚群（例如，Th1和Th2细胞），帮助B细胞产生抗体。几种细胞因子调节Th细胞分化；例如，如IL-12、IL-15和IL-27等细胞因子调节naive CD4+ T淋巴细胞向Th1细胞的发展。总之，Th1细胞主要响应于细胞内病原体，如病毒和一些细菌，而Th2细胞主要响应于大型细胞外寄生虫。DCs还能够刺激naive细胞毒性CD8+ T细胞成为活化的CD8+ T细胞。这种现象称为“交叉呈递”，对于诱导针对外源性抗原的强大和持久的细胞免疫，以及有效预防病毒疾病和癌症是必要的。目前尚不清楚外源性抗原是如何在DCs中处理并呈现给MHCI上的CD8+ T淋巴细胞的；然而，已经提出了两种不同的机制。在细胞质途径中，抗原通过内体囊泡进入细胞质，并被蛋白酶体降解。在囊泡途径中，抗原在溶酶体隔室中被降解，独立于蛋白酶体活性。铝、皂素和TLR佐剂可以利用这种机制。 图2. (a) 表面和内体 TLR 激活。(b) 增强抗原呈递。由主要组织相容性复合物（MHC）在抗原呈递细胞（APCs）上呈递的抗原，是激活适应性免疫的关键步骤。许多佐剂，如明矾、乳液和纳米颗粒（NPs），被认为通过"靶向"抗原到APCs，增强MHC的抗原呈递功能。迄今为止，尚不清楚佐剂增加抗原呈递的机制是否有助于适应性免疫系统的发展。例如，明矾已被证明可以增强树突细胞对抗原的摄取，以及延长抗原呈递的持续时间。抗原大小似乎在调节抗原呈递效率方面很重要。在早期内体/吞噬体中发现了大的脂质囊泡，它们增加了抗原呈递，而在晚期溶酶体中发现了较小的囊泡，它们减少了抗原呈递。 3.佐剂类型  3.1.铝盐  基于铝的佐剂（ABA）最早发现于1926年，目前是全球疫苗中最常用的佐剂。最初使用的铝佐剂是硫酸铝钾，通常称为"明矾"，通过将抗原溶液和佐剂与碱直接沉淀制备而成（明矾沉淀疫苗）。今天，抗原被吸附到预先形成的铝盐凝胶上（直接吸附），在商业制剂的标准化和可重复性方面提供了更多的优势。目前，传统使用的明矾几乎完全被类氢氧化铝（Alhydrogel?，Croda，丹麦Frederikssund）和非晶磷酸铝（AdjuPhos?，Croda，丹麦Frederikssund）所取代。两种新型佐剂是硫酸铝羟磷酸盐（AAHS），目前用于某些人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗的配方和Imject? Alum（Pierce，Rockford，美国），由非晶碳酸铝和结晶氧化镁组成。在人类疫苗接种中，ABA主要用于针对破伤风、白喉、百日咳、脊髓灰质炎、甲型和乙型肝炎以及人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗。FDA批准的含有ABA的人类疫苗列表见表2。ABA也在兽医疫苗中广泛应用，用于预防细菌、病毒和寄生虫感染。 尽管使用历史悠久，但关于ABA（铝盐佐剂）免疫刺激特性背后的机制仍需进一步阐明。最初，ABA的佐剂特性首先归因于"贮存效应"。根据这一假设，抗原颗粒从不溶性盐颗粒中缓慢释放到体内，随着时间的推移，允许抗原对免疫系统的长期暴露和强化的免疫刺激，从而产生更高的抗体滴度。然而，最近的发现挑战了这一理论，证明抗原在接种部位的保留并不是免疫反应所必需的，而是接种部位炎症的程度才是佐剂效应的解释。因此，除了作为缓释系统外，ABA对免疫刺激还有其他主要影响，如先天免疫细胞的募集和激活、炎症介质的释放以及通过诱导Th2细胞激活适应性免疫。 给药后，先天炎症细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞（DC）和单核细胞，被招募到注射部位。尽管许多免疫佐剂的活性基于Toll样受体（TLR）信号，但铝盐显然不引起基于TLR的反应。与在细胞损伤后释放到细胞质中的不溶性单体尿酸钠（MSU）晶体的尿酸类似，已经显示ABA的颗粒性质促进了巨噬细胞的吞噬作用和APCs中抗原的摄取。此外，ABA的细胞毒性诱导了热休克蛋白（如hsp70）和其他DAMPs（如MSU形式的尿酸）的分泌。NLR家族含吡啉结构域3（NLRP3）是核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族（NLR）的成员，是一种细胞质模式识别受体（PRR），在调节先天免疫信号中起着至关重要的作用。NLRP3通过钾离子外流激活，作为膜完整性的感应器。当被ATP、石棉、硅石、铝佐剂或MSU等刺激触发时，NLRP3与适配蛋白凋亡相关斑点蛋白含有CARD（ASC）和非活性前caspase-1结合形成NLRP3炎症体多聚体复合物。前caspase-1的自蛋白解剪切为活性caspase-1，将促炎细胞因子前体pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-IL-33裂解为它们的活性和分泌形式。有假设认为，铝盐可能通过直接方式激活NLRP3炎症体，通过吞噬溶酶体损伤和随后的cathepsin B释放，或者通过MSU的间接释放。除了NLRP3介导的炎症外，哨兵细胞极化为活跃的巨噬细胞和APCs，增加了吞噬体活性氧物种（ROS）的产生，吞噬体酸化干扰和通过低氧诱导转录因子-1α（HIF-1α）的细胞代谢重编程，是最近揭示的对ABA免疫刺激特性有贡献的其他机制（图3）。 图 3. 基于铝的佐剂（ABA）的效果。 哨兵细胞激活为抗原呈递细胞（APCs）对适应性反应至关重要，从而将先天免疫与适应性免疫联系起来。ABA通过主要组织相容性复合体II类（MHCII）分子增加活化树突细胞上的抗原呈递。MHCII抗原呈递位点激活CD4+ T细胞，这些细胞分化并激活B细胞，进而主要产生IgG，推动体液免疫。铝盐优先增强抗体介导的免疫反应，通过TFH细胞和IL-4信号，结果产生IgG1并诱导Th2细胞分化，这些细胞通过IgE推动嗜酸性粒细胞炎症反应。与强烈的Th2反应相比，明矾对需要Th1细胞介导保护的感染效果较差。在小鼠研究中，已证明明矾间接抑制Th1反应，原因是IL-4激活。通过Th1反应产生的淋巴因子是补体固定IgG2a抗体的基本诱导因子，因此是巨噬细胞的刺激因子。此外，先天免疫系统的细胞可以发展适应性特性（“训练免疫”），并且铝佐剂可能涉及训练免疫的诱导。然而，NLRP3炎症体和caspase-1在抗体反应诱导中的作用仍然存在争议。经过近一个世纪的使用，铝盐仍然是疫苗佐剂的里程碑，因为它们具有确立的安全性和有效性记录。ABA非常耐受，并且仅报告了一些轻微的局部反应，如注射部位疼痛、肿胀、红斑，以及罕见的肉芽肿和过敏反应，这些反映了它们通过炎症体激活、促炎介质、吞噬细胞积累和抗体产生的作用模式。在一些免疫接种对象中还描述了接触性皮炎的罕见病例，注射后头痛、关节痛和肌痛以及持续性肿胀。有关铝佐剂长期毒性的辩论引起了广泛关注，包括如阿尔茨海默病（AD）、慢性自身免疫和多发性硬化症等影响。由佐剂引起的自身免疫综合征（ASIA）指的是一组不良效应，包括海湾战争综合征、巨噬细胞性肌筋膜炎、硅肺症和与佐剂暴露相关的接种后现象。此外，由于铝离子在AD的发病机制中被牵连，人们对ABA的生物持久性和潜在神经毒性提出了担忧，但这种相关性从未被证明。尽管需要进一步的知识来更新和确认ABA的安全概况，但作为佐剂的铝盐的风险-效益概况仍然极其积极，并确认它们作为疫苗佐剂的黄金标准。 3.2.STING激动剂佐剂 环状GMP-AMP合酶/干扰素基因刺激因子（cGAS/STING）途径是先天免疫系统胞质模式识别受体（PRRs）网络的一部分，监测细胞质以感知危险刺激。途径的刺激激活下游的核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子3（IRF3），增加I型干扰素（IFN-1）和其他促炎细胞因子的转录，从而增强抗原呈递和免疫反应。cGAS/STING在免疫调节中的关键作用使其成为免疫疗法的重要靶点，特别是与癌症相关的，并且是使用STING激动剂作为有前途的疫苗佐剂的理由。STING激动剂（图4）主要在肿瘤学和病毒学中应用，包括环状二核苷酸（CDNs）、非核苷小分子（NCDNs）、胞质双链DNA（dsDNA）、锰离子、可电离脂质和聚合物。如20,3-环状鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）、环状二聚鸟苷酸（c-di-GMP）或环状二聚腺苷酸（c-di-AMP）等环状二核苷酸是途径的天然激动剂，但它们由于高极性和由于外切核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPP1）酶降解导致的短半衰期，其药代动力学（PK）特性较差，大大限制了它们的使用。为了改善环状二核苷酸的PK特性，已经测试了如ADU-S100的磷酸衍生物，ENPP1抑制剂也是一个有前途的新策略。为了选择活性更好的候选物，寻找模仿CDNs和STING结合构象的刚性类似物的研究导致了一类新的激动剂，即大环桥接刺激剂（MBS），如E7766。为了克服环状二核苷酸的PK限制，研究还集中在NCDNs上，如黄酮类5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）和α-芒果苷，以及二聚酰胺苯并咪唑（diABZI）衍生物，这些在肿瘤免疫疗法和针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）方面取得了有希望的结果。 图 4. 小分子STING激动剂的二维结构 作为触发STING途径的一种方式，诱导细胞质双链DNA (dsDNA) 释放的策略也被采用，例如使用放疗、基于明矾的佐剂，以及化疗药物，如顺铂或多柔比星。无机锰被发现能激活cGAS，并通过增强第二信使cGAMP的产生，充当STING的间接激动剂。在其他激动剂类别中，我们列举了聚合物，如壳聚糖或PC7A，以及基于纳米粒子的可电离脂质。目前在临床试验中的STING激动剂总结在表3中。 cGAS/STING信号的触发因素是细胞质dsDNA，这是细胞损伤的重要标志。因此，cGAS作为直接的DNA受体，催化dsDNA转化为第二信使cGAMP，这诱导了STING的激活和寡聚化。STING寡聚体激活TANK结合激酶1 (TBK1)，它招募IRF3并通过NF-κB诱导I型干扰素刺激基因的转录。下游自噬的诱导和NLRP3炎症体的激活增加了病原体清除，并在自身免疫和炎症性疾病、衰老以及与肿瘤相关的炎症中具有重要意义。STING激动剂通常与环状二核苷酸有关，如cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们作为各种微生物的代谢产物被发现。 STING途径的激动剂能直接诱导树突细胞的成熟和MHCII分子的上调，增加抗原呈递、T细胞的启动，并通过炎症细胞因子间接促进前述效应。STING激动剂还增强适应性免疫反应，通过IgG1和IgG2的产生、脾脏生发中心的诱导以及记忆B细胞的刺激来增强体液免疫。此外，I型干扰素诱导CD4 T细胞分化为Th1和TFH细胞，显著帮助B细胞的启动，也促进CD8 T细胞的激活和增殖，这对抗击耐药肿瘤细胞很重要。通过STING刺激协调的多种免疫反应使得这一途径成为免疫疗法的一个有吸引力的靶点。尽管cGAS/STING的急性激活无疑对病原体和癌细胞有益处，但慢性激活可能导致由IFN驱动的系统性炎症，引发细胞因子风暴（细胞因子释放综合征），类似于败血症。除了可能诱发系统性炎症反应外，STING过度刺激引起的其他主要问题包括缺乏细胞和组织特异性以及淋巴细胞毒性。这些前提，加上具有挑战性的药代动力学特性，使得STING激动剂的全身给药情况复杂化，它们通常在肿瘤内给药。使用药物载体技术，如纳米粒子、基于脂质的载体和抗体至关重要，以实现更选择性的靶向，结合改善的传递和功效。尽管它们的药代动力学具有挑战性，且全身使用的疗效指数较窄，STING激动剂代表了一个非常有前途的佐剂类别，需要优化它们的制剂以进一步提高其佐剂性。 3.3.TLR配体 3.3.1.Toll样受体 市场上的大多数疫苗主要由单一佐剂组成，但通常保护性免疫反应并未达到有效使用疫苗的标准。因此，显著的Toll样受体（TLR）是先天免疫的关键组成部分，提供防御性炎症反应以抵御入侵的病原体。人类TLR包括10个成员（TLR1-10），可以跨越细胞表面（TLR1、2、4、5、6、10）或定位在内质网膜（TLR3、7、8、9）上，并参与不同PAMPs（表4）的识别。PAMPs的结合诱导TLR同二聚体（TLR3、4、5、7、8、9）或异二聚体（TLR1/2或TLR2/6）的形成，将两个toll/IL-1受体（TIR）结构域聚集在一起，允许适配蛋白MyD88（髓样分化初级反应-88）与复合物结合。TLR3是唯一结合不同适配蛋白的受体，即含有TIR结构域的适配蛋白-诱导干扰素-β（TRIF）蛋白。与其他TLR不同，TLR4信号可以通过涉及MyD88信号适配蛋白或TRIF的两条独立途径进行。一旦激活，TLR将增加免疫细胞的迁移并引发适应性免疫反应。 由于TLRs作为免疫增强剂，它们的激动剂可以用作疫苗佐剂。疫苗产生的免疫反应类型取决于由特定TLR及其适配蛋白激活的信号通路。虽然大多数TLR途径导致Th1免疫反应，TLR2诱导Th0、Th1或Th2反应，TLR3激活NF-κB途径。表1总结了疫苗配方中使用的几种TLR激动剂，TLR激动剂的结构报告在图5中，临床试验中的TLR激动剂在表5中。 3.3.2.TLR2激动剂 TLR2可以识别许多PAMPs，因为它们可以与TLR1和TLR6形成异二聚体。L-pampo是由PAM3CSK4（PAM3）、TLR1/2、聚(I:C)和TLR3构成的复杂系统，是一种有效的佐剂。它在乙型肝炎病毒（HBV）疫苗中使用，诱导细胞介导的免疫反应，增加CD4+ T细胞水平。目前，它正在作为使用RBD（受体结合域）、S1抗原和RBD-Fc作为病毒抗原的SARS-CoV-2疫苗的佐剂进行研究，已被证明能引发强烈的体液和细胞免疫反应。 TLR2识别细菌脂蛋白，因此，由细菌LPS衍生的合成脂肽作为疫苗佐剂被开发出来。MALP2（巨噬细胞激活脂肽2，图5）来源于支原体发酵，利用TLR2-MyD88信号通路激活免疫细胞。PAM2CSK4和PAM3CSK4是两种作为疫苗佐剂评估的TLR2激动剂，用于对抗利什曼病、疟疾和流感。由于它们的尺寸、化学复杂性和疏水性，TLR2激动剂通常不用于疫苗开发，即使在固相自动肽合成研究可以帮助发现新的更简单的衍生物。 图5.小分子Toll样受体激动剂的2D结构。TLR2激动剂（紫罗兰色上部） 面板）、TLR4 激动剂（青色，中间面板）、TLR 7/8 激动剂（绿色，下面板）。 3.3.3.TLR3激动剂 TLR3是内体受体，能够检测病毒dsRNA。聚(I:C)是一种结构类似于病毒RNA的佐剂。它能够诱导IFN-I和IFN-III的产生，并刺激Th1细胞因子反应。MVS途径（RIG-1和/或MDA5）的激活会导致人类毒性，因此开发了新的聚(I:C)衍生物，聚(ICLC)和聚(IC12U)。 聚(ICLC)是一种聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，能刺激干扰素的产生。它诱导炎症体和补体系统的表达，并在针对恶性疟原虫、HIV和癌症的疫苗候选中使用，显示出引发Th1反应的强能力。由于这种佐剂的高度免疫刺激性和对血清核酸酶的高抗性，设计了聚(IC12U)。这种新物质显示了尿嘧啶和鸟嘌呤残基的错配，导致毒性较低（不与MDA5结合），以及IFN-I的产生减少。 3.3.4. TLR4激动剂 TLR4通过MD-2（髓样分化因子-2）和CD14识别细菌脂多糖。LPS的免疫刺激性活性是由于脂质A区域，并且脂肪酸链的变化反映了不同的生物活性。Eritoran是一种TLR4-MD2激动剂。它是一种由脂质A衍生的合成物，其特点是含有四个脂质链，其中一个含有顺式双键。3-O-去酰基-40'-单磷酸脂质A（MPLA，图5）和葡萄糖基脂质A（GLA）表现出低致热性和强免疫增强特性。LeIF（利什曼原虫真核起始因子）和neoseptins（合成肽模拟化合物，图5）是两种非糖脂配体，它们不像LPS，但能够像天然配体一样激活TLR4。在THP-1细胞中筛选激活NF-κB途径的小分子化合物，发现了一种属于吡啶并吲哚类的特定TLR4激动剂（1Z105，图5）。1Z105被确定为安全的TLR4激动剂，其他研究目前正在进行中。TLR4可以激活一个强大的TRIF介导的细胞反应，其特征是多能CD8+/CD4+ T细胞的存在和对癌症和传染病的CTL活性增强。 3.3.5.TLR5激动剂 TLR5由多种免疫细胞表达，参与细菌鞭毛蛋白的识别。配体与TLR5的结合诱导炎症途径的激活，释放包括TNFα、IL-1β、IL-6和一氧化氮在内的炎症介质，引发Th1和Th2反应。当与抗原一起给予时，鞭毛蛋白诱导粘膜免疫反应，这对于保护免受呼吸和胃肠道感染至关重要。鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白已与PR8流感病毒（IPR8）、HA（H5N1）或禽流感病毒（AIV）H5N1抗原配方，证明它能引发强烈的免疫反应，包括IgA的产生。对鞭毛蛋白的修改导致了嵌合鞭毛蛋白或活细菌中的鞭毛蛋白抗原复合物，如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌、肠毒素大肠杆菌（ETEC）等，并在动物模型中使用。三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗正在进行临床试验阶段，其中两种针对流感病毒，一种针对鼠疫耶尔森菌。 3.3.6.TLR7/8激动剂 TLR7/8能够诱导Th1免疫反应，并产生高水平的I型干扰素、IL-12、TNF-α和IL-1β。TLR7/8和TLR9激动剂能够激活并促进cDCs（常规树突细胞）和浆细胞样树突细胞（pDCs）的克隆扩展，动员CD14+ CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。Imiquimod（R837，图5）目前已获批准并用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和日光角化病。另一种异喹啉衍生物resiquimod（R848）具有抗病毒和抗癌治疗用途，正在评估用于黑色素瘤治疗。已经开发了不同的结构相关的oxoadenine化合物，尽管需要其他临床前研究来证明它们的疗效。CL075是一种结构相关的杂环化合物，具有融合的喹啉-噻唑环。 3.3.7.TLR9激动剂 TLR9识别细菌DNA基序胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸，通过MyD88途径激活免疫系统。CpG是已被修改以防止蛋白酶降解并用作佐剂的分子基序。CpG-CDNs能在自然杀伤细胞、B细胞和pCCS中引起强烈的趋化因子、细胞因子和抗体产生，并引发强烈的Th1型免疫反应。CpG1018是一种能够引发Th1型免疫反应的寡核苷酸。CpG1018是过去20年中批准的四种新型佐剂之一。即使它的使用最初在Hepliisav-B疫苗中受到限制，但目前正在评估用于对抗黑色素瘤和SARS-CoV-2的疫苗。MGN1703属于TLR9激动剂，是一种包含CG基序并呈现线性结构的小DNA分子。它由中间的双链DNA部分构成，两侧是单链结构。它作为疫苗的佐剂在癌症疫苗中进行了测试，在那里它激活了先天和适应性免疫反应，仅有轻微或暂时的副作用。它目前正在作为免疫调节剂单独或联合用于治疗恶性肿瘤，如黑色素瘤、小细胞肺癌和结直肠癌的I/II期研究中进行评估。 3.4.CLR配体 C型凝集素受体（CLRs）是病原体和受损组织来源脂质的免疫传感器，参与激活先天和获得性免疫。免疫反应可以通过CLRs细胞信号通路和其他PRRs（如TLR）的串扰来引发，导致不同信号通路的激活和特定细胞因子的表达。CLR触发的佐剂包括Curdlan、PGA-45、海藻糖二硬脂酸酯（TDB）和海藻糖二肉豆蔻酸酯（TDM），它们诱导强烈的Th17和Th1反应。 Curdlan在铜绿假单胞菌疫苗中使用，并诱导高水平的IL-17A和CD44+ CD62L-CD69+ CD4+ TRM细胞产生。Curdlan还能够激活树突细胞（DCs）并增强基于DC的抗肿瘤免疫，因此正在评估用于抗肿瘤免疫疗法。由于Curdlan的高度疏水性，开发了部分氧化的Curdlan衍生物β-1,3-聚葡萄糖醛酸，PGA-45聚合物，它能够刺激IKK-β的磷酸化并降低磷酸化Akt的表达，表明PGA-45可以激活多种细胞表面受体，包括TLR4和dectin-1。 海藻糖-6,60-二肉豆蔻酸酯（TDM）及其合成类似物海藻糖-6,60-二硬脂酸酯（TDB），能够通过与C型凝集素受体Mincle结合来激活巨噬细胞和树突细胞。TDB在结核病亚单位疫苗的临床研究中。TDB还可以独立于Mincle发挥作用，通过PLC-γ1/钙/CaMKKβ/AMPK途径诱导小胶质细胞极化为M2表型，使这种佐剂成为治疗神经炎症性疾病的治疗剂。 3.5.RLR配体 视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）是病毒感染的传感器，诱导产生I型和III型干扰素和炎症细胞因子，激活参与先天和获得性免疫反应的信号通路。RLRs可以检测病毒和宿主RNA，导致抗病毒反应，但如果RLR途径被无控制地激活，也会导致免疫病理。聚(I:C)激活RLRs途径，因为它模仿细胞中的病毒入侵，导致MAVS-IRF3/7级联的激活和IFN-β和ISGs的产生。IFN-β的表达取决于聚(I:C)的长度；短序列在髓样细胞中诱导IFN-β表达，而长序列在成纤维细胞中诱导IFN-β表达。这意味着使用特定激动剂刺激RLR途径将导致细胞特异性IFN-β表达的诱导，特别是在成纤维细胞中，与单核细胞和巨噬细胞相比，可以赋予更强的抗病毒状态。 4.辅助佐剂和佐剂配方  市场上的大多数疫苗只包含一种佐剂，然而，保护性免疫反应通常不足以实现疫苗的有效性。为了增强疫苗的效果，开发了许多佐剂配方。佐剂和抗原可以一起传递，使用两种流行的方法之一，共价偶联或将抗原和佐剂包装在传递机制中。适当的佐剂组合选择可以导致对疫苗免疫反应的补充或协同改善。例如，AS04中的明矾和MPL的联合使用在乙型肝炎病毒（HBV）和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗中显示出比仅使用明矾盐的相同疫苗更好的免疫反应。 4.1.脂质体 脂质体是球形颗粒，可以包裹抗原和免疫刺激性分子，保护它们免受降解并将其传递给APCs。脂质体由可生物降解、生物相容、无毒的磷脂组成，允许灵活的结构修改，以实现可调节的特性，如大小、表面电荷、膜柔韧性和药物装载模式。作为疫苗佐剂传递系统（VADS）的脂质体使用带来了许多优点，如高安全性和强烈的免疫反应。市场上的脂质体配方包括Epaxal和inflixal，分别用于对抗甲型肝炎和季节性流感病毒。另一种基于脂质体的疫苗是GSK（GlaxoSmithKline）开发的Shingrix，已获得FDA批准，用于带状疱疹病毒的老年人预防。 4.2.乳液 作为疫苗佐剂开发的乳液可以分为两种主要形式，完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）。这两种佐剂都是油包水乳液，具有运输抗原和激活先天免疫系统的能力。CFA由矿物油、乳化剂和热杀死的结核分枝杆菌组成，促进免疫反应的刺激。然而，CFA可能会引起强烈、持久的局部炎症，并有在注射部位形成溃疡的潜力。IFA与CFA的成分相同，但不含有杀死的细菌M. tuberculosis。这种佐剂可以产生比没有它的相同疫苗更强大和持久的抗体反应。然而，IFA在疫苗配方中的使用受到其强烈副作用和毒性的限制，这是由高水平的非生物降解油和质量差引起的。 4.2.1.Montanide Montanide 是一个包括油包水和水包油乳液在内的大型家族，它已被用于兽医和人类疫苗中。MontanideTM 的生物可降解性质减少了与 IFA 类似物理结构的许多细胞毒性特征。在注射部位形成储存库，有助于抗原的逐渐释放，这是这种基于油的佐剂的作用机制的一部分。产生集中并防止恶化的抗原，并促进吞噬作用 。Montanide ISA 51 和 ISA 720 已在涉及癌症、艾滋病、疟疾或自身免疫疾病的疫苗的多项临床试验中使用。Montanide ISA 201 和 ISA 206 则被用于口蹄疫疫苗。 4.2.2.MF59 MF59 是一种水-油乳液佐剂，由角鲨烯组成，角鲨烯是一种生物可降解且与人体兼容的油，是人体的正常成分，在 pH 6.5 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中通过表面活性剂 Tween 80 和 Span 85 稳定，平均粒径小于 200 纳米。它首次在 1997 年在欧洲被批准用于人类疫苗（Fluad），现在已在超过 30 个国家的超过 1 亿人中使用。其作用机制类似于明矾盐，具有在注射部位的储存活性，刺激局部先天免疫反应。肌肉中 MF59 的给药激活了强大的细胞和体液免疫反应，释放 ATP 并上调细胞因子和趋化因子，这反过来促进了白细胞的募集、抗原摄取和迁移到淋巴结以激活 B 细胞和 T 细胞，结果比明矾盐更有效。MF59 具有可接受的安全性和良好的耐受性，自 1997 年以来已施用了数百万剂。 4.3.AS0佐剂系统 AS0 佐剂系统基于经典佐剂分子的组合，如明矾、乳液和脂质体。它们由葛兰素史克公司开发，以实现最大的佐剂效果和可接受的耐受性，结合免疫刺激分子，如 TLR 配体等。这些经典佐剂和免疫刺激剂的各种组合旨在针对目标人群（包括儿童、老年人和免疫功能低下的个体）的病原体个性化适应性免疫反应。 4.3.1.AS04 AS04 由 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL）组成，这是从革兰氏阴性细菌 Salmonella minnesota 分离出的脂多糖（LPS）的去毒形式，吸附在明矾盐上 。MPL 在保持较低毒性的同时，通过 TLR4 激活保留了 LPS 的免疫刺激性，当吸附在明矾上时。TLR4 在先天细胞上的信号传导介导了 AS04 的佐剂作用，与明矾的内在免疫调节特性相结合。我们可以在乙型肝炎病毒（HBV）Fendrix  和人乳头瘤病毒（HPV）Cervarix  疫苗中找到 AS04，与仅用明矾盐佐剂的相同疫苗相比，显示出更好的免疫反应。 4.3.2.AS03 AS03 是一种角鲨烯油包水乳液佐剂，与 MF59 类似，结合了表面活性剂聚山梨醇酯 80 和 α-生育酚（维生素 E），结果具有较低的反应原性并具有更好的安全性。2009 年，欧洲委员会批准了 AS03 佐剂疫苗 Pandemrix 的商业化，2013 年食品药品监督管理局授权了 AS03 佐剂流感 A（H5N1）单价疫苗 。它也用于 SARS-CoV-2 重组蛋白疫苗（CoV2 preS dTM）。α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性与 MF59 相比，促进了免疫增强反应，调节了某些细胞因子和趋化因子的表达，如 CCL2、CCL3、IL-6 和 GM-CSF。此外，AS03 通过刺激 NF-κB 激活免疫系统，这导致肌肉和引流淋巴结中细胞因子和趋化因子的释放，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03 可以促进 CD4+ T 细胞特异性免疫反应，这可能导致持久的中和抗体产生和更高水平的记忆 B 细胞 。为了增加其免疫原性，使用两种强效免疫刺激剂，QS-21（来自 Quillaja saponaria 的皂苷）和 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL），产生了 AS02。 4.3.3.AS01 AS01 佐剂是两种强效免疫刺激组分的组合，TLR4 配体也在 AS04 中使用（MPL）和分离纯化的皂苷部分（QS-21），在脂质体中配制。它用于带状疱疹疫苗 Shingrix 和疟疾疫苗 Masquirix 。临床前研究表明，QS-21 作为佐剂增强了抗体以及细胞介导的免疫反应 ，但作为疫苗中的单一组分佐剂，它的耐受性较差。在 AS01 中，脂质体中的胆固醇允许它结合 QS-21 并抑制其反应原性。MPL 通过 TLR4 激活先天免疫系统，而 QS-21 激活引流淋巴结中副皮质窦巨噬细胞（SSMs）中的 caspase 1。两种已建立的佐剂分子的结合引发了先天免疫的协同激活，结果大于独立组分的总和，激活了不是由任一组分单独触发的新途径，增加了表达 IL-2、IFNγ 和 TNF 的多能 CD4+ T 细胞。AS01 作为佐剂在带状疱疹疫苗中的使用已获批准，该疫苗用于老年人，具有高疗效，并在非洲有限的运动中实施的疟疾疫苗。 4.4.免疫刺激复合物 免疫刺激复合物是另一种具有强大佐剂活性的疫苗传递载体。它们是球形的，笼子状的自组装颗粒，大小约为 40 毫米。ISCOMs 由 Quillaja 皂苷、胆固醇、磷脂和抗原组成。没有抗原的颗粒被称为 ISCOM 基质。ISCOM 抗原可以是原生病毒的包膜蛋白、细胞膜蛋白或通过极性相互作用含有疏水域的肽 。ISCOMATRIX® 是使用与 ISCOMs 相同的材料开发出来的，但没有抗原，可以在疫苗配方中添加，使得使用更加多样化，并消除了疏水抗原的限制。树突状细胞（DCs）和 ISCOM 相互作用可以改善结合抗原的交叉呈递 。因此，有效地诱导了 CD4+ 和 CD8+ 抗原特异性 T 细胞反应。诱导细胞毒性 T 细胞、平衡的 Th1/Th2 反应和持久的抗体反应都是 ISCOM 疫苗的记录效果 。其他 ISCOM/ISCOMATRIX 疫苗已针对 HIV、HPV 和癌症利用抗原 NY-ESO-1 进行了临床试验。在所有情况下，研究都显示出良好的安全性和耐受性，以及诱导体液和细胞免疫反应。尽管具有这些特点，但由于一些皂苷在高浓度下具有毒性，因此对人类疫苗中使用 ISCOMs 的安全性问题已经阻止了其使用 。 4.5.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是与病毒大小相似的二十面体纳米颗粒（范围在20至800纳米之间），它们具有自我组装衣壳蛋白的能力。它们是非感染性颗粒，因为它们没有遗传物质。VLPs由具有重复表位的外部病毒壳组成，这些表位被免疫系统识别为非自身，并产生快速且持久的免疫反应，即使没有佐剂。它们可以通过使用不同的技术和细胞系统，如大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞或无细胞系统，由各种病毒类型生产。 历史上的VLPs制造方法包括一个称为“先组装后纯化”的多步骤方法。第一步包括衣壳蛋白在表达细胞载体内的自发组装。第二步则提供新形成颗粒的纯化。有时需要将VLPs拆解后再重新组装，以获得纯化的颗粒并提高质量。另一种VLPs的制造方法提供了使用无细胞体外组装，颠覆了传统的自我组装方法。特别是，体外系统被用作一个平台，在衣壳蛋白表达和纯化后诱导其自发组装，无需拆解新形成的VLPs。在市场上，两种重要的佐剂疫苗使用这种类型的纳米颗粒，即乙型肝炎（HBV）和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。当前的乙型肝炎疫苗是一种利用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA疫苗，包括用于预防乙型肝炎感染的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。这种疫苗已被证明至少可以提供10年的免疫力。 在HPV疫苗中，非包膜HPV病毒颗粒包含双链DNA（dsDNA）。L1和L2蛋白组成衣壳的主要和次要结构蛋白，具有二十面体对称性。酿酒酵母是目前用于表达L1蛋白的载体。VLPs和佐剂（AlP）的结合导致强烈的免疫反应和90%的宫颈癌保护。 4.6.病毒体 病毒体是一种药物传递系统，由病毒包膜和病毒或其他病原体的成分组成。它们由重组流感病毒包膜形成，包含血凝素（HA）、神经酰胺酶（NA）和磷脂，并且像VLPs一样缺乏病毒遗传物质。第一个基于病毒体的疫苗是在1975年开发的，这允许研究这种类型疫苗的有效性。自那以后，有两种疫苗已经上市，用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。 病毒体结构中HA的存在允许保持受体结合能力，增加免疫原性和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，病毒体在结合后不能在细胞中诱导感染。病毒体可以将抗原输送到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞反应，使它们成为完美的传递系统。然而，由于佐剂质量较差，病毒体在激活APCs和鼓励交叉呈递方面效果不佳。使用更强的佐剂可以克服这种固有限制。最近开发了一种基于病毒体的创新流感疫苗，结合了TLR4配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA。病毒体可以诱导强烈的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂相当。由于其极高的耐受性和安全性，这种传递系统已获得FDA批准用于人类。除了针对流感和甲型肝炎的两种基于病毒体的疫苗外，还有几种疫苗正在进行临床试验，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。 5.佐剂设计和开发的新见解 如前所述，在过去20年中，发现了新的免疫激活佐剂类别，能够增强免疫功能低下和老年人等脆弱人群的免疫反应。有几种佐剂类别可用，每种都有其自身的优势和劣势。油包水乳液等传递系统是有效且安全的系统，尽管有可能产生局部或系统性不良效应。最近的研究表明，PRR信号在几个人群中可以改变，降低了疫苗配方的保护效果。例如，防止胎儿排斥的免疫机制以及老年人中TLR途径的失调或遗传多态性的存在。出于所有这些原因，选择适当的佐剂配方对于提高效果而不降低风险-效益比至关重要。从化学角度来看，蛋白质数据银行存储库上有几种与特定配体共晶的蛋白质晶体结构，有助于通过计算机辅助药物设计寻找新化合物。报道的STING和TLR小分子激动剂的大多数结构是杂环化合物，模仿核苷酸。即使在这种情况下，也已经开发了许多具有不同应用的结构相关化合物，包括在癌症疾病中广泛应用的激酶抑制剂和作用机制不太明确的配体或人类辅因子的配体。另一个需要考虑的方面是存在用于合成肽的高通量全自动仪器。最近已经做出了努力来合成复杂的高分子量肽和糖蛋白。此外，已经开发了使用天然成分的新型复杂纳米配方，如来自昆虫的功能化聚合物。所有这些方面都非常有前景，并为佐剂发现的发展开辟了新的场景。 6.结论 佐剂是疫苗配方的关键组成部分的大家族。它们的使用在历史上最重要的疫苗接种活动中至关重要，包括脊髓灰质炎、猪流感和最近的COVID-19大流行。即使已经取得了良好的结果，但还需要更多的努力来增加疫苗对耐药病毒的保护，并减少额外加强针的需要。重组技术、DNA筛选和生物信息学研究已经阐明了新的机制和免疫信号通路的关键参与者。还需要更多的努力来识别更有效的佐剂，以对抗未来的大流行并增加对抗癌症的成功率。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注药物递释系统用于肝纤维化的开发与思考来源《中南药学》2022 年 6 月 第20 卷 第 6 期作者许青，刘莉莎，杨磊，尹莉芳中国药科大学药学院药剂系国家药监局药物制剂及辅料研究与评价重点实验室摘要肝纤维化是由多种致病因素导致的一种进程性慢性疾病，低渗透性的病理环境及肝内非特异性的细胞摄取使得传统药物递送系统的疗效并不显著。本文分析了肝脏中四种主要的细胞在肝纤维化疾病进程中的作用，并按细胞类型对肝纤维化的主要治疗靶点的药物递送系统进行综述。相较于传统剂型，纳米药物在提高小分子化药及大分子药物生物利用度和靶向效率优势明显，为后续新靶点和新机制的药物开发提供参考。同时，本文思考了肝纤维化治疗的局限性，从生理和病理条件进行探讨，为改善纤维化药物递送系统的开发提供新的思路。关键词肝纤维化；治疗靶点；药物递送系统_正文_1肝纤维化概述肝纤维化是由多种病因学因素引起的一种进程性慢性疾病,包括酗酒､慢性病毒性肝炎､酒精性肝炎､非酒精性脂肪肝炎(NASH)､原发性胆汁性肝硬化､自身免疫性疾病与代谢疾病等[1-2]｡该疾病主要以细胞外基质(ECM)过度异常的沉积为特征,是肝脏对各种病因导致的慢性损伤的一种自我修复机制,肝纤维化最终会发展为肝硬化､肝癌等晚期肝病[3-4]｡截至目前,全球仍没有任何一款治疗肝纤维化的药物成功上市,因此该领域亟需新的有效的治疗药物｡肝纤维化涉及多种细胞因子和肝脏细胞,肝实质细胞(HC)发生损伤和凋亡,同时免疫细胞会大量募集和浸润至损伤区域,释放多种炎性细胞因子和趋化因子,这些因子中大多对肝星状细胞(HSC)和成纤维细胞具有促炎或直接纤维化作用,共同参与疾病的形成[5-6]｡各类细胞在肝纤维化进程中的作用见图1｡图 1肝脏中的主要细胞类型在肝纤维化进程中的作用Fig 1Role of main cell types in the liver fibrosis1.1 肝星状细胞HSC 存在于肝血窦腔内(Disse 腔),占所有肝细胞的5% ~ 8%[7]｡HSC 在正常肝脏中处于静息态,α - 平滑肌动蛋白(α -SMA)的表达极低,主要承担存储和代谢脂肪,合成和分泌胶原及糖蛋白的功能,含有大量的维生素A 的脂滴,是体内维生素A 的储库｡HSC 是维持肝窦微环境稳态旁分泌､自分泌､近分泌和趋化因子的中心枢纽[8]｡在正常生理条件下,HSC 可以分泌胶原酶和基质金属蛋白酶,降解ECM,使ECM 处在一个动态平衡的状态｡然而在疾病状态下,HSC 的激活是一个广泛而复杂的调控过程｡其受到HC和非实质细胞相互作用,由邻近的窦状内皮细胞(LSEC)､库普弗细胞(KC)､内皮细胞和肝细胞以及血小板和白细胞的旁分泌刺激引发,HSC会进一步分化为成纤维细胞,快速增殖并大量形成胶原和其他ECM,驱动纤维化过程[9-10]｡这一调控过程对肝纤维化形成至关重要,影响肝脏的正常生理功能｡1.2 肝巨噬细胞巨噬细胞在抗原的处理和传递､机体免疫应答的调节､病原体的吞噬方面发挥着重要的防御作用,是肝脏固有免疫系统的重要组成成分[11]｡根据其起源可将肝脏内的巨噬细胞分为两类:一类是KC,作为肝脏中常驻巨噬细胞,存在于肝血窦内,KC 承担吞噬病原体､内毒素､生物碎片及抗原等,保护肝脏免受感染｡在肝脏发生炎症或组织损伤时,吞噬坏死的肝细胞,维持肝脏稳态[12-13]｡KC 可通过NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体､转化生长因子-β (TGF-β )和血小板衍生生长因子(PDGF)通路刺激HSC 活化从而促进肝纤维化｡此外,KC 会与肝滞留和血液循环中的其他免疫细胞比如NK 细胞､T 细胞和单核细胞等共同参与肝纤维化的形成,当肝脏受到严重损伤时,坏死肝细胞分泌的凋亡小体刺激KC 向M1 型转变,产生IL-6､TNF-α ､TGF-β 和IL-1β 等促炎因子及促纤维化因子｡另一类是单核细胞衍生的巨噬细胞(MoMF),利用趋化作用从骨髓单核细胞､脾脏单核细胞和腹腔巨噬细胞浸润至损伤的肝脏组织,通过释放促炎和促纤维化的细胞因子,参与肝纤维化的发生发展[12]｡其中,大部分的表型为Ly-6Chigh 单核巨噬细胞高度表达的趋化因子CCR2 通过CCR2 受体直接激活HSC 来促进肝纤维化进展[11]｡1.3 肝实质细胞HC 是肝脏中最丰富的细胞,占肝脏细胞总数的60% 以上,体积占整个肝组织的80% 以上｡HC 负责体内重要的代谢､内分泌以及分泌功能｡肝细胞富含粗面内质网､线粒体和高尔基体,而体内绝大多数细胞含量很少,使得肝脏合成蛋白质和脂质异常活跃,肝脏的修复能力很强｡慢性肝损伤后炎症反应引发持续性的HC 损伤,HC发生活化､变性､侵袭并产生一系列转录因子,产生的凋亡小体直接诱导HSC 活化和ECM 沉积,并伴随TGF-β 以及炎症因子的释放[14]｡损伤相关模式分子(DAMPs)由凋亡的HC 在细胞膜破裂后释放,间接激活静息状态下的HSC,促进其分泌ECM[15]｡此外,HC 凋亡后留下的细胞间隙将很快被ECM 和胶原占据,从而加速肝纤维化的发病进程｡因此,改善HC 损伤及凋亡是防治肝纤维化的有效治疗途径之一｡1.4 窦状内皮细胞LSEC 是肝脏中主要的非实质细胞,构成肝血窦的窦壁｡LSEC 缺乏隔膜和基底膜,使其成为人体内渗透性最强的内皮细胞,以便肝脏与血流进行物质交换,这一特征也与药物的肝脏高摄取及清除率相关｡除了构成肝窦屏障,LSEC 也具有过滤､内吞､抗原呈递和募集炎性细胞的功能,维持肝脏的免疫稳态并调控肝损伤期间的免疫反应[16]｡正常条件下,LSEC 可保护HSC 免受激活,甚至可以逆转激活的HSC｡当机体发生慢性肝损伤后,LSEC 发生毛细血管化,产生和释放可溶性因子,这一过程先于HSC 和巨噬细胞活化及肝纤维化的发生[17-18]｡LESC 产生的纤连蛋白可以影响HSC 表型,促进其活化｡内容由凡默谷小编查阅文献选取，排版与编辑为原创。如转载，请尊重劳动成果，注明来源于凡默谷公众号。2用于肝纤维化治疗的药物递送系统2.1 纳米药物的肝脏分布特征针对肝纤维化的纳米药物主要以静脉注射方式给药,直接进入血液循环｡30% ~ 99% 的未修饰的纳米粒在肝脏部位蓄积[19],有利于肝脏疾病的治疗｡纳米粒本身的性质,如粒径､表面电荷､表面修饰特性均会在制剂的体内生物分布发挥极为重要的作用,影响其安全性和有效性｡人和动物的肾脏布满10 nm 的细胞间隙, 以便分子通过尿液排出,如果尺寸大于10 nm 会引起其血液循环滞留时间延长｡在肝脏中,由于正常LSEC 孔隙为50 ~ 200 nm,因此粒径低于200nm 的纳米颗粒可以穿过肝血窦,从而有可能到达肝细胞或HSC,而更大尺寸的颗粒容易被KC吞噬[20]｡一般情况下,纳米粒易于在血液循环中被网状内皮系统(RES)清除,肝脏中的KC 也属于RES 的一部分,在纳米粒的体内消除中起着至关重要的作用,纳米粒尺寸大于100 nm 易在肝､肺和脾等组织中蓄积,加速清除效率｡聚乙二醇(PEG)修饰或其他亲水性表面的纳米颗粒可以降低其在RES 的非特异摄取,有利于在肝脏中的累积｡其次,纳米材料的表面电荷要在细胞内化能力和血清稳定性之间取得平衡,既需要具有适当的正电荷维持膜亲和力,又需要避免血液中各种蛋白的黏附,为便于纳米粒进入细胞,表面需要保持电中性｡2.2 肝纤维化药物递送系统类型临床上从未停止对肝纤维化药物开发的步伐,然而尚无针对肝纤维化的化药制剂批准上市｡Selonsertib在Ⅲ 期临床(NCT03053050､NCT03053063)未表现出纤维化明显改善,部分受试者因严重的不良反应而终止给药[21]｡Elafibranor 在治疗中重度非酒精性脂肪性肝炎(NASH)时,与安慰剂组无显著性差异(NCT02704403)[22]｡中药单体如黄芩苷､水飞蓟宾､白藜芦等在体外有明显的抗纤维化活性,然而水溶性差制约了其生物利用度,体内药效不尽如人意[23]｡为了达到更高的抗肝纤维化效果和较低的毒副作用,不断发展的药物递送技术为抗肝纤维化提供了新思路｡目前用于肝纤维化的新型药物递送系统包括脂质体､脂质纳米粒､胶束､无机纳米粒以及仿生载体制剂等(见表1)｡根据药物自身性质设计递送系统,改善药物的溶解性,实现药物缓释,提高生物利用度;通过改进纳米粒的处方和工艺以调整其表面性质,或修饰特定的靶向分子,实现肝脏相应靶点的精准调控与治疗｡2.3 用于不同肝脏细胞的药物递送系统有效的药物递送需要经历受体识别,入胞及胞内释药的级联过程｡除了优化纳米载体的粒径和电位等物理性质以提高药物在肝脏中的分布外,还可以将可识别肝细胞表面受体的靶向基团修饰在递送载体的表面,以提高药物的肝脏靶向能力,如维生素A 可以通过与视黄醇蛋白结合,作用于HSC 上的视黄醇受体,从而实现纤维化药物的HSC 靶向递送[36]｡CD44 在活化的HSC 中过表达,透明质酸(HA)是其特异性受体,聚乳酸(PLA)纳米粒经HA 修饰后靶向活化的HSC,释放活性成分姜黄素产生抗纤维化作用[37]｡通过甘露糖化修饰来靶向KC 细胞,递送抗炎药物,也是肝纤维化治疗的一种重要策略｡针对复杂的肝纤维化发病机制,需要研究者针对不同靶点进行药物筛选,实现精准的协同治疗｡2.3.1 抑制活化的肝星状细胞肝纤维化的主要病理特征是胶原和ECM 的过度表达,均由活化的HSC(aHSC)产生,因此,aHSC 是肝纤维化治疗的关键靶细胞｡TGF-β 由HSC 细胞产生,是肝纤维化的关键推动者,被认为是潜在的纤维化形成细胞因子｡TGF-β 1 被认为是aHSC 表达最多的一个亚型,当TGF-β 与TGF-βRⅡ结合时,TGF-βRⅠ发生活化,以Smad2/3 的磷酸化为主激活下游通路,最终促使HSC 的活化[38]｡目前很多研究都已发现miR 在HSC 活化时的表达发生显著变化,其中miR-142-3p 被证实随疾病进展而表达水平降低[39],其主要机制是通过靶向HSC 的TGF-βRⅠ,阻断TGF-β -Smad 通路,从而抑制HSC 的活化｡当Broermann 等[40] 用磷酸二酯酶5 抑制剂处理四氯化碳(CCl4)诱导的模型大鼠时,大鼠纤维化程度得到改善,血浆外泌体中的miR-142-3p 表达升高,这主要是由于miR 通常由细胞外泌体囊泡装载和传递,调节受体细胞的功能｡目前,已有课题组利用胞外囊泡手段将miR-142-3p 用于乳腺癌[41] 和特发性肺纤维化[42] 的研究,该指标在肝纤维化中作为疾病进展的诊断监测与治疗靶点的作用也不容小觑,但尚未开发针对肝纤维化的miR-142-3p 药物递送系统｡此外,aHSC 的甘露糖-6- 磷酸/ 胰岛素样生长因子受体(M6P/IGF-ⅡR)在肝纤维化发展过程中表达上调,正常肝脏中的静息态HSC 仅表达少量的M6P/IGF-ⅡR｡相关文献显示,TGF-β 结构中有2 个糖基化位点是甘露糖-6- 磷酸,使TGF-β能与M6P/IGF-ⅡR 结合[43],激活HSC,从而促进纤维形成｡通过合成M6P 修饰的人血清白蛋白,细胞摄取实验证明M6P 取代度愈高,肝脏蓄积量愈高,可实现对肝脏HSC 的靶向｡将18β - 甘草次酸与M6P26-HSA 共价结合,制备纳米制剂,其在胆管结扎的纤维化大鼠模型中,迅速在肝脏蓄积,显著减轻了纤维化程度[44-45]｡18β - 甘草次酸可通过抑制游离脂肪酸诱导的脂肪毒性发挥作用,同时TGF-β 能识别M6P/IGF-ⅡR 产生促纤维化作用,以M6P/IGF-ⅡR 为受体的药物递送载体可以竞争性抑制TGF-β 与M6P/IGF-ⅡR 的结合,本身也具有一定的抗纤维化作用｡由于配体M6P 带有负电荷,可能会与KC 或LSEC 表面的清道夫受体结合而消弱对HSC 的靶向性,需要寻找针对M6P/IGF-ⅡR 靶点的新思路和新策略｡PDGF 作为受体酪氨酸激酶家族的一员,是肝纤维化中参与HSC 的活化与增殖的最关键因素之一｡PDGF 家族存在四个亚型,其中二聚体PDGF-BB 是促进HSC 活化的最强推动剂｡在HSC 发生激活后PDGFR-β 表达显著上调, 当PDGF-BB 与HSC 上的PDGFR-β 结合后,诱导细胞质结构域内酪氨酸残基的自磷酸化,导致受体相关蛋白的募集和激活,促使HSC 的激活｡伊马替尼作为一种强效的酪氨酸激酶抑制剂,对PDGFR-β 半数抑制浓度仅为100 nmol·L- 1,El-Mezayen 等[46] 制备了载有伊马替尼的维生素A 修饰的脂质体,其中维生素A 用于靶向HSC,伊马替尼发挥TGF-β 和PDGF 双重抑制作用｡另一种酪氨酸激酶抑制剂——尼洛替尼,不仅对TGF-β及PDGFR-β 起到双重抑制作用,还具有一定的抗炎活性, 给药剂量分别为5 mg·kg- 1 和10mg·kg- 1,可显著改善大鼠模型中的纤维化指标[47]｡Fan 等[48] 设计了一个胶原酶和视黄醇修饰的胶束系统来递送尼洛替尼,一方面降解胶原以实现药物的ECM 穿透能力,另一方面由于视黄醇对HSC 有着天然的靶向性,可实现药物的HSC靶向递送,该纳米递药系统在小鼠肝纤维化模型中展现出良好的抗纤维化活性｡尽管PDGFR-β在aHSC 的表达随疾病进展而逐渐上调,进展到晚期肝硬化时该受体在肾脏中会过表达,因此采用PDGFR-β 的靶向策略需考虑肝纤维化的病程阶段,设计合适的递送系统｡PI3K/AKT/mTOR 作为PDGFR 的一条典型的下游通路,也是肝纤维化的重要治疗靶点之一(见图2)｡PDGFR-β 将刺激信号分子转导至细胞内,激活PI3K 信号,促使AKT 进一步激活,抑制TSC1/TSC2,促进mTOR 复合物的形成[49]｡其中,mTOR1 促进血管内皮生长因子(VEGF)的表达,推动HSC 的激活[50],mTOR2可调控AKT｡两者在不同的生理病理条件下比例发生改变,发挥双向调控作用｡Ji 等[51] 设计了一种cRGDfK 修饰的PEG-PLGA 纳米粒共递送Germacrone 和 miR-29b,其中cRGDfK 靶向HSC表面的整合素受体 α v β 3,小分子药物和基因药物联合应用后,对aHSC 产生显著的细胞毒性,改善了CCl4 诱导的小鼠肝纤维化症状｡Ren 等[52]利用HA 天然靶向aHSC 的CD44 受体的特性,共同递送LY294002 和Oridonin, 经PI3K/AKT通路发挥抗炎和抗氧化的功效,从而改善纤维化程度｡HSC 另外一个靶点是细胞核中的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR),这是执行转录控制的核激素受体,与肝纤维化有关｡HSC 从静息状态转化至成纤维细胞时,PPARγ 表达降低｡PPARγ 可以抑制TGF-β 1 和PDGFRβ 诱导的HSC激活[53],具有明确的抗纤维化作用｡罗格列酮增加PPARγ 表达,从而抑制HSC 激活｡在CCl4 刺激的大鼠慢性肝损伤模型中,基于M6P-HSA 的罗格列酮的递送增加了药物的肝脏积聚,抑制了HSC 的激活并减轻了纤维化[54]｡替米沙坦具有PPARγ 激动和AT1R 阻断双重作用,将其制备成纳米乳制剂,提高了肝纤维化的治疗效果[55]｡2.3.2 调控肝巨噬细胞在肝纤维化疾病中,驻留的KC 在损伤因素的刺激下发生激活,促使肝脏产生局部的炎症反应,并通过招募外周的MoMF,共同加剧了肝脏的纤维化程度｡巨噬细胞为纤维化治疗的重要靶细胞,本文从抗炎､抗氧化以及细胞极化相关治疗靶点的纳米制剂对其进行阐释｡ ① 抗炎:肝脏受到损伤时,KC 通过损伤相关分子模式(DAMPs)和病原体相关分子模式(PAMPs) 而发生激活｡主要是Toll 样受体(TLR)损伤信号[56],产生炎症小体,分泌炎症因子和趋化因子,并进一步加剧肝损伤和纤维化程度｡TLR 介导的肝脏炎症反应主要通过两条途径实施:TLR-TIRAP/MyD88-NF-κB 和TRIF/TRAMIRF-NF-κB(见图3)[57-58]｡Younis 等[59] 研究发现牛磺酸可以通过TLR4/NF-κB 信号转导的调节,产生抗纤维化作用｡Eritoran 作为一种TLR4 拮抗剂,当作用于纤维化小鼠时,显著下调了MyD88 和NF-κ B p65 的表达,缓解了小鼠的肝脏炎症及纤维化程度[60]｡ ② 抗氧化:当肝脏受到损伤时,巨噬细胞会释放大量的活性氧(ROS),诱导HSC 转型和HC 凋亡,从而加速纤维化进程,因此应用抗氧化剂可以抑制肝纤维化的发展｡据报道MoMF 释放的NOX2 所产生的ROS 会加重肝纤维化进程｡Maeda 等[61] 制备了一种甘露糖修饰的多巯基化人血清白蛋白纳米制剂(SH-Man-HSA),甘露糖修饰可使其靶向巨噬细胞的相关受体,多巯基化可以产生抗氧化作用,在小鼠肝纤维化模型中,SH-Man-HSA 明显改善了小鼠的纤维化症状,降低了氧化应激水平｡Shin 等[62] 采用 8- 羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)NOX 抑制剂,显著改善了模型大鼠的肝纤维化程度,并且证明了该药物可以抑制HSC 中NOX1 和NOX2 的表达｡肝脏中多种细胞均表达NOX,该抑制剂可以作用于多个细胞,抑制ROS 的生成以治疗疾病｡可以通过特定修饰,用纳米载体递送外源性的8-OHdG,实现对巨噬细胞的精准靶向｡此外,部分氧化还原型纳米粒也具有抗氧化和降低肝脏中氧化应激的作用,比如CeO2 纳米粒具有抗氧化和清除自由基的能力,利用其在KC 中的蓄积效应,显著降低NF-κ B 的表达,发挥抗炎活性,改善CCl4 诱导的急性肝损伤程度[63]｡氧化应激和炎症存在紧密联系,两者相互诱导并加重肝纤维化的恶性循环,如何发现高效抗氧化应激治疗肝纤维化的药物,需要明确相关通路的复杂联系及调节机制等｡ ③ 细胞极化:肝脏中未成熟的巨噬细胞可极化为M1 型(促炎型)和M2 型(抗炎型),其中Notch 通路可通过促进巨噬细胞向M1 表型和抑制其向M2 型转化,从而促进肝纤维化[64-65]｡当用γ - 分泌酶抑制剂(GSI)抑制 γ - 分泌酶对Notch 受体的加工,Notch1 的表达下调[66]｡γ - 分泌酶是一种膜内蛋白水解酶,参与Notch 蛋白的切割和水解,使其进入细胞内,实现信号的转导｡当采用γ - 分泌酶抑制剂后,Notch 信号被阻断,导致TNF-α ､IL-6 和IL-10 等炎症因子表达降低,抑制巨噬细胞转型｡例如,DAPT 是一种小分子GSI 药物,当按50 mg·kg- 1 的剂量连续给药4 周后,大鼠的肝纤维化得到一定程度的缓解[67],其机制可能是DAPT 通过阻断Notch 途径抑制了aHSC,降低了HC 的凋亡｡然而,Notch受体有四个亚型,并且在多种细胞内广泛表达,GSI 的Notch 抑制作用范围较广,可能存在较大的毒副作用,针对特定细胞中具体亚型的Notch受体的靶向纳米制剂尤为重要｡二苯并氮杂䓬也是一种小分子GSI 药物,Richter 等[68] 将其包裹于PLGA 纳米粒(GSI NPs)用于缓解肥胖引起的肝纤维化,实验结果证明GSI NPs 不仅减少了小鼠肝脏葡萄糖的合成,改善了NASH 相关的纤维化和肝脏炎症,还显著降低了药物的胃肠道毒副作用｡2.3.3 抑制肝实质细胞凋亡肝细胞损伤及凋亡是引发肝纤维化恶化的根本原因,将药物高效递送至肝细胞发挥保肝护肝的功效是开发肝纤维化疗法尤为重要的研究领域｡脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是一种在肝细胞高度表达的受体,可以与半乳糖或N- 乙酰半乳糖胺发生特异性结合｡将N- 乙酰半乳糖胺与寡核苷酸偶联后,可实现肝细胞靶向递送[69]｡Saraswathy 等[70] 开发了一种肝脏特异性诊断和治疗的探针,支链淀粉可以与ASGPR 特异性结合,将其修饰在超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)的表面,显示出优异的磁弛豫性,在磁共振(MRI)成像中展现出高对比度｡当与近红外染料Atto-700 结合,赋予材料双重成像能力｡该纳米制剂有望应用于肝纤维化的早期诊断以及后续磁热疗法,具备良好的临床应用价值｡清道夫受体B1(SR-B1)是一种高度糖基化的膜蛋白,在HC 中表达,介导由高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)相关的胆固醇的细胞摄取和转运,在脂质调控方面发挥重要作用[71]｡肥胖是一种脂质堆积的生理状态,脂质代谢受阻,会诱发NASH,使肝脏发生损伤,诱发肝纤维化｡Wang 等[72] 研究发现在遗传性肥胖小鼠中miR-24 过表达,抑制SR-B1 的作用,抑制HDL 对胆固醇的代谢和类固醇激素的合成,影响脂质代谢通路｡可通过纳米药物递送至肝脏,降低miR-24 表达,恢复脂质正常代谢途径,与抗纤维化药物共递送,发挥协同作用｡目前尚无该通路的纳米药物用于肝纤维化的治疗｡2.3.4 恢复LSEC 渗透性引起肝纤维化的各种损伤因素首先是作用于LSEC,导致LSEC 表型和功能变化,ECM 大量沉积继而形成肝窦毛细血管化,一方面严重阻碍了肝脏的物质交换从而降低了药物的递送效率,另一方面释放激活HSC 的信号,促进纤维化的发生发展｡因此,针对肝窦毛细血管化开发靶向LSEC 纳米制剂具有广泛的应用前景｡Yu 等[73] 开发了一种靶向LSEC 的辛伐他汀纳米粒,通过甘露糖修饰靶向LSEC 的甘露糖受体,刺激LSEC 中的KLF2-NO 信号传导将HSC 从活化转变为静止,缓解纤维化肝癌模型中的纤维化程度｡3肝纤维化治疗的局限性3.1 肝脏药物摄取低ECM 由成纤维细胞分泌,主要由胶原蛋白和非胶原糖蛋白构成,控制细胞的表型和功能｡在肝纤维化疾病中,HSC 被激活为成纤维细胞,分泌ECM,使其过量表达,在Disse 腔发生沉积｡致密的ECM 成为阻碍药物渗透的物理屏障,使药物无法到达响应的靶细胞而降低药效｡同时,ECM 过量表达,使得肝窦血管周围基质中的非致密胶原Ⅳ被致密的胶原Ⅰ和Ⅲ替换,影响基底膜的结构｡ LSEC 作为肝窦壁的组成细胞,在正常生理状态下,其带有窗孔结构,缺乏基底膜,使得肝血窦通透性高,便于进行物质交换｡当肝脏发生损伤时,Disse 间隙发生纤维化,异常表达的ECM 影响窗孔渗透性｡ 在纤维化疾病中, VEGFR 上调导致LSEC 发生毛细血管化､窗孔减少及组织渗透性逐渐降低,使得药物无法穿过ECM 屏障到达HSC 或KC 等靶细胞,显著降低了纳米药物的递送效率｡ECM 也是肿瘤细胞微环境的重要组分之一,其结构致密并具有刚性,可阻碍药物的穿透从而降低药物的有效摄取｡因此,可以考虑将针对肿瘤的治疗策略应用于肝纤维化的治疗中,针对ECM 的主要成分改善药物的渗透性｡早在2004 年,Eikenes 等[74] 已将胶原酶用于骨肉瘤的研究中,通过降解ECM,使肿瘤摄取药物增加了2 倍｡至于肝纤维化,目前已有报道利用胶原酶修饰递送载体以降解ECM 广泛分布的胶原,使得致密的ECM 出现孔道,便于纳米药物到达HSC 而发挥药效｡将抗纤维化药物联合赖氨酰氧化酶抑制剂､透明质酸酶､透明质酸合成酶抑制剂,均是提高药物跨越LSEC 或ECM递送屏障的策略｡3.2 非特异性细胞摄取递送效率低纳米制剂可以通过特定修饰突破细胞外基质屏障,共递送改善LSEC 毛细血管化,提高制剂渗透性｡然而,非特异性的细胞摄取也是降低纳米药物递送效率的一个重要因素｡肝脏中的细胞丰富,驻留的KC 对纳米粒产生较强的非特异性摄取,加速纳米粒的内吞和清除,使得药物到达靶细胞的药量降低,因此大部分的纳米制剂递送效率并不理想｡外泌体是一种包含核酸和蛋白的囊泡,可由多种细胞产生｡在正常和疾病状态下,细胞均可分泌外泌体,外泌体携载多种miRNA,并且随疾病进展其表达水平不同,比如前面提到的miR-142-3p,可将高表达特定miR 的外泌体应用于肝纤维化的新靶点或新疗法的开发｡再者,外泌体可以从机体内获取,具有良好的生物相容性,不同细胞来源决定了外泌体功能的差异,比如来源于NK 细胞的外泌体可抑制TGF-β 诱导的HSC的激活,显著改善了CCl4 诱导的肝纤维化[75]｡来源于间充质干细胞(MSC)的外泌体通过修复损伤的肝组织,表现出较好的治疗作用[76]｡与传统纳米制剂相比,这一类胞外囊泡除了具备良好的生物相容性,其归巢效应可产生更高效的靶向｡此外,HSC､LSEC 以及胆管细胞等非实质细胞也可分泌外泌体在细胞间传递生物信息｡其中,肝细胞来源的外泌体可以促进肝脏的修复和再生[77],对于治疗肝损伤有着重要意义｡要将外泌体用于临床转化,其大规模的工业化生产还存在挑战:首先,其对体内的作用机制和功能尚未完全阐释,不同来源的外泌体差异较大;其次,外泌体的分离和纯化技术仍有待提高;最后,如何确保批次间稳定性也是值得思考的问题｡3.3 早期诊断手段缺乏肝纤维化是由多种致病因素导致的肝脏病理损伤,若得不到及时的治疗,清除致病因素,不可避免会发展成肝硬化和肝癌,甚至危及生命｡肝脏在受损初期难以诊断,只有当肝纤维化或肝硬化程度相当严重时,才可通过一些影像学手段检查得以发现｡随着药物诊疗学的不断进步,肝纤维化的定量诊断目前也是肝病领域的研究热点,尤其是针对肝纤维化的早期诊断与分级对患者的治疗至关重要｡其中,开发高灵敏度､无创伤及强特异性的造影剂或小分子探针仍是肝纤维化诊断领域的主流方向,比如超顺磁性氧化铁纳米作为MRI 造影剂[62] 被广泛应用于诊断领域,可以采用特异性的靶头修饰进行不同肝脏细胞的标记,并联合具有治疗作用药物的进行共递送,构建多功能的诊疗药物递送系统｡再者,ECM大量分泌的胶原也是评价肝纤维化的重要指标之一,Pomper 等[78] 首次采用环状多肽EP-3533 修饰Gd 纳米粒,特异性靶向Ⅰ型胶原用于多种纤维化疾病的高效成像｡此外,近年来超声弹性成像的诊断效果接近病理诊断,优于血清标志物的检测,已成为目前肝纤维化诊断的常用方法之一｡有学者采用cRGD 修饰的PLGA 包裹的全氟辛基溴(PFOB)纳米粒,通过靶向整合素α v β 3受体可以显著区分肝纤维化区域与临近的正常肝组织[79]｡然而,上述手段均存在肝毒性以及对体内其他脏器组织损害的风险,制约其转化至临床应用｡4结论与展望肝纤维化是一个由多种致病机制相互作用､相互促进的极其复杂的病理过程｡从LSEC 毛细血管化到HSC 的活化,ECM 的沉积,巨噬细胞的炎症反应以及HC 的凋亡等病理过程,环环相扣,对其中的任何一个或多个关键过程进行有效干预都将对逆转肝纤维化起着积极的作用｡现有的纳米药物主要以HSC 为靶点,通过直接或间接手段抑制HSC 的激活通路或促进 aHSC 凋亡,从而改善肝纤维化的程度｡此外,通过纳米载体递送抗氧化及抗炎药物以降低巨噬细胞产生ROS的水平,调控招募炎症细胞浸润以及巨噬细胞极化也是重要的治疗策略｡为提高药物递送的效率和治疗效果可以从以下几个方向思考:① 优化纳米载体的理化性质以提高药物在肝脏的分布;②筛选多靶点的药物进行共递送治疗,通过协同机制缓解肝纤维化;③ 结合新型诊断技术,深入研究不同阶段肝纤维化对药物递送的影响,从而为开发新一代的药物递送载体以增强肝纤维化治疗效果提供参考｡参考文献详见《中南药学》2022 年 6 月 第20 卷 第 6 期文章信息源于公众号凡默谷，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 欢迎订阅+医药大数据|行业动态|政策解读