LC-06

摘要： 当下生物治疗市场以抗体分子主导，而双特异性抗体代表着下一代抗体治疗的主体。双特异性抗体可以同时靶向不同的抗原。例如同时靶向肿瘤细胞表面抗原，招募细胞毒性免疫细胞。双特异性抗体结构多样性正在快速增长，多种新颖的结构形式使抗体功能更加丰富。总结起来，市场上以不含Fc形式的单可变区基因片段scFv 串联和以全长IgG样的非对称结构最为常见。不同于传统的单克隆抗体，质量，数量，稳定性的挑战是制约双特异性抗体快速发展和实现临床应用的主要因素。本文主要集中描述以上两大类型的双特异性抗体，关于双特异性抗体分子最新的设计，生产，质量逐一描述，并对其临床应用前景做一概述。 背景 近些年来，以加强患者的免疫系统的免疫治疗，包括免疫检查点抑制剂，过继性细胞治疗，单克隆抗体，疫苗治疗，在抗肿瘤治疗中越来越凸显出自己的优越性。这些治疗拥有特异性的靶向肿瘤细胞以及肿瘤微环境而保持低毒性和低不良反应的优点。经过近30年的发展，治疗性单克隆抗体已广泛的应用多种肿瘤和自身免疫疾病的质粒。这些单克隆抗体可以特异性结合肿瘤表面抗原，通过激活病人免疫系统摧毁肿瘤细胞。最近，双特异性抗体显示出更高，更有益的免疫治疗价值。这些双特异性抗体可以结合两个不同的抗原位点，可以更加强烈，更加特异性的定向清除肿瘤细胞。 一个针对单一抗原表位，来自于单一浆细胞的的抗体称作单克隆抗体。而多克隆抗体士结合与抗原的多个表位，或者多个浆细胞产生针对不同抗原表位的单抗混合物。双特异性抗体是工程化的可以同时识别同一抗原两个表位或者识别两个抗原的人工抗体。人免疫球蛋白（IgG）是人类血清中最为普遍的抗体类型，可进一步分为IgG1-4,4种亚型。这些亚型的不同主要区别在于恒定区序列，尤其是γ链序列和二硫键，但是它们都拥有相同的结构基础。如图1A所示，IgG基本结构包含两条轻链（LC）和两条重链（HC）形成含有四条链的：“Y”形结构，拥有三个独立的蛋白结构域，被柔性的铰链区连接着。这些蛋白部分包括对称的抗原特异性结合片段Fab和一个易于结晶的Fc区。抗体特异性的结合与抗原依赖于Fab的重链轻链高可变区。天然抗体可以以高亲和力特异性的结合于天然或者人工抗原，其亲和力通常在108–1010。抗体的Fc段结合与受体或者宿主免疫细胞Fcγ受体(FcγRs)，C1q以及新生儿Fc受体(FcRn)来起始相应的效应功能。Fc段微小的氨基酸序列的不同以及糖基化形式的不同都将大大影响IgG的热稳定性，与FcγR结合引起的效应功能，以及血清半衰期。 图1.抗体结构及功能 肿瘤细胞是正常细胞分化而来的非正常细胞，但是很难被机体免疫系统发现和清除。单克隆抗体在癌症治疗中成功的应用主要是针对肿瘤细胞表面过表达的或者特异性表达的抗原。基于抗体的免疫治疗的机制总结如下：（1）阻断或者结合激活细胞死亡的因子，或者抑制肿瘤细胞持续增殖存活的细胞信号用途，最终导致肿瘤细胞死亡。例如，trastuzumab 靶向胃癌和乳腺癌细胞表面HER2受体，从而抑制肿瘤细胞增殖和存活。cetuximab 抑制结肠癌，肺癌细胞表面的表皮细胞生长因子受体（EGFR）。（2）抗体Fc通过与免疫细胞Fc受体FcR 结合介导的效应功能。其机制包括抗体依赖的细胞毒性（ADCC）作用，补体依赖的细胞毒性（CDC）作用，以及抗体依赖的细胞吞噬作用，如图1b。，以上三种机制可以有效诱导靶细胞死亡，助力治疗效果。 尽管有众多的抗肿瘤抗体药物取得了成功，然而，仍然存在诸多限制，严重影响着传统抗体的治疗。最重要的局限在于抗体治疗的低肿瘤组织渗透率和滞留率。很多针对肿瘤表面抗原特异性的抗体大量的存在于体液循环，仅有20%的抗体剂量到达肿瘤部位。这一失调的比例反映了抗体有效渗透和滞留实体瘤组织的挑战。另外，绝大多数阻断生长因子和其受体结合的抗体不能诱导细胞凋亡，这主要归因于患者的免疫反应低下，尤其是缺少重激活的T细胞杀伤肿瘤。对于抗体引起的效应功能（主要包括ADCC,CDC,ADCP作用）来说，精确地效应依赖与抗体的特异性结合。大量研究表明Fc段CH2,CH3的氨基酸序列以及糖基化影响着抗体的ADCC,CDC作用。另外，一些传统抗体疗效不佳来自于癌细胞，以及周围细胞大量的交叉信号通路抵消了抗体的治疗，这些抗体通常通过阻断信号通路诱导细胞凋亡发挥作用。 双特异性抗体的概念提出已有30余年，正在被广泛的研究用于克服传统抗体仅结合单一抗原表位治疗面临的限制。双特异性抗体可以同时靶向不同的抗原。例如同时靶向肿瘤细胞抗原和招募细胞毒性免疫细胞。这一明显提升的功能将有效降低不良反应和注射剂量。此外，从制药公司的角度考虑双特异性抗体更少的临床试验，生产成本的降低都是单独生产两种单抗无法比拟的。目前，多达100多种的双特异性抗体临床试验，双特异性抗体正处在高速发展，全面覆盖诊断，影像学，预防，治疗各个领域，正在成为肿瘤治疗领域最主要的候选药物。 经过几十年的研究，开发双特异性抗体及其衍生物，逐渐形成了两大类双特异性抗体：不含Fc片段的单链可变区串联结构和含有Fc的IgG样非对称结构。不同于传统的单克隆抗体，质量，数量，稳定性的挑战是制约双特异性抗体快速发展和实现临床应用的主要因素。与此同时，伴随更先进的设计策略，噬菌体文库的筛选技术，抗体样蛋白工程，四杂交瘤技术，knobs-into-holes 技术，共同轻链技术，CrossMAb 技术，蛋白设计被广泛的研究，基础知识的快速增长，结构多样化的快速发展，双特异性抗体将迎来高速发展的时代。本文着重关注两大类双特异性抗体分子的设计与生产，描述双特异性抗体在产能，质量方面的进展以及应用前景。 双特异性抗体产能和质量上的改善策略 单链可变区片段（scFvs）是抗体最小的功能单位，主要通过将重链可变区序列和轻链可变区序列通过多肽连接而成。scFv 分子分子量约为25kDa ，拥有的抗原结合位点来自于完整抗体的一个臂。很多scFv 研发的重要考量在于抗体片段的形式，多肽连接子的选择以及最终的产能。最近几年，scFv 令人振奋的另一个应用领域是CAR-T，过继性免疫细胞治疗。鉴于涉及的领域及篇幅，对于scFv 在CAR-T治疗领域的应用本文不再赘述。 抗体片段类型 目前，存在三种主要的双特异性抗体片段形式：针对T细胞的双特异性抗体(BiTE) ，双亲和重靶向蛋白(DARTs) ，串联双体(TandAbs)，如图2a 图2.三种双特异性抗体结构及blinatumomab作用机制 BiTE分子已经广泛的用于肿瘤免疫治疗，重定向T细胞到肿瘤细胞或者肿瘤微环境。研究者使用两个不同的单克隆抗体scFv片段，并将其通过多肽连接起来，保留他们靶向两种不同抗原的能力。运用短的柔性多肽连接两个scFv片段，使得多肽连接的两个臂可以自由旋转，这种连接的灵活性使得分子可以灵活的结合两个细胞膜表面的抗原分子（细胞毒性T细胞，肿瘤细胞），随后诱导T细胞激活。 一个成功的BiTE实例是药物blinatumomab (Blincyto®, DrugBank entry DB09052) ，已经由FDA获准用于前B细胞急性淋巴性白血病（ALL）。blinatumomab由抗CD19的抗体片段scFv以VL-VH的形式经GGGGS多肽连接子与抗CD3抗体片段scFv 以VH-VL的形式相连。blinatumomab的作用机制如图2B。由于其体积小，blinatumomab可以最大程度的将T细胞和靶细胞拉近。当然，由于其分子量小的特性，导致它可以被机体快速的清除，其半衰期仅为1.25±0.63h,据此推断，它应该经由肾脏清除。其结果是，BiTE需要持续高剂量（15-28μg/Day）的输注，才能募集适宜数量的T细胞到达靶细胞周围杀伤靶细胞。因此，治疗需要4周的持续输注维持足够的血药浓度，这就增加了生产临床级别药物的成本。单多肽链结构增强了BiTE抗体抗原识别，但是伴随着聚集体增加，蛋白稳定性降低产生的成本上升。 在一定程度上，为了解决这个问题，研究者开发了具有选择性潜能的双亲和靶向性蛋白（DARTs）。如图2a,一个DART由含有两个抗原特异性结合位点FV片段形成异二聚体。特别是，FV1由抗体A的VH和抗体B的VL,而FV2由抗体B的VH和抗体A的VL组成。不同于BiTE分子通过多肽连接，DART的结构模拟了天然抗体IgG分子。在每条重链的末端添加额外的半胱氨酸残基，通过C端形成二硫键来增加分子稳定性（如图2A）。与BiTE相比，DART分子无论在体外还是在体内都有明显的优势，只是在大规模制备中会产生小量的聚集。在最新的研究中，Moore et al 等人比较了CD19xCD3 DART 和BiTE分子对B细胞淋巴瘤在体外的杀伤效果，结果发现DART的效果要优于BiTE,在该实验中CD19和CD3抗体分子都来源于同一个母本分子。DART分子表现出优越的最大杀伤B淋巴细胞瘤的，达到半最大杀伤效果所需的抗体剂量更低，并且表现出明显的T细胞重激活。 目前，DART和BiTE蛋白可以进一步工程化更加兼容患者的免疫系统。例如，一些BiTE分子连接上了IgG的Fc结构域产生BiTE-Fc融合药物达到了按周给药的治疗效果。抗CD19x CD3 BiTE-Fc 融合蛋白以高亲和力结合于人和灵长类动物的CD19和CD3,在给灵长类以5μg/Kg的剂量单次注射，血清半衰期达到了210h,在实验动物和临床上都未见明显的毒性作用。在一项治疗多发性骨髓瘤的研究,抗BCMA BiTE-Fc 融合蛋白以15μg/Kg的剂量单次注射给灵长类动物，药物血清半衰期达到了112h。另外BiTE分子也可以结合人血清白蛋白增加半衰期。在一项抗CD33双抗实验中，向小鼠体内每4-5天注射-CD33 x CD3 BiTE-Fc或BiTE-HSA融合蛋白，以及每天注射BiTE给小鼠，其结果是，CD33 x CD3 BiTE-Fc 和BiTE-HSA的治疗效果类似，然而以每4天注射一次BiTE-HSA其疗效不及每天注射一次BiTE的疗效。DART结构也可以融合IgG的Fc片段，形成DART-Fc结构，而且这一结构与DART相比，可以明显地延长半衰期。一个研究小组设计了针对HIVxCD3 DART 和DART-Fc融合蛋白并分离HIV感染受试者单核细胞培养，对杀伤效果做评估。其结果显示，在与激活的的CD4T细胞共培样时。两种形式的DART都能减少细胞之间的病毒传播。另外，尽管HIVxCD3 DART -Fc和HIVxCD3 DART 的治疗效果类似，但DART -Fc将DART的血清半衰期从10h延长到了70.2h。 与天然抗体想比，scFv分子量小很容易被肾脏清除。另一种解决分子量小的策略是串联成双体结构TandAbs ，如图2A,这些四价的双特异性抗体针对每种抗原含有两个结合位点，保持着天然双价抗体的结合特性。另外TandAbs 分子量大约为105KDa,刚好超过被肾脏清除的第一道门槛，因此，相对于小分子抗体结构延长了半衰期。两个TandAbs 药物分子正在临床试验。AFM13 (CD30xCD16) 招募NK细胞，AFM11 (CD19xCD3) 招募T细胞。 连接子工程化 连接子是连接重链和轻链的重要区域，对抗体稳定起着举足轻重的作用，因此连接的优化对优化scFv非常重要。scFv可以通过连接子以VH-linker-VL 或 VL-linker-VH 的形式连接。连接子在VH和VL彼此的C端和N端架起了桥梁。研究表明在不同的抗体中重链和轻链的趋向性不同，有不同的偏好性，同时连接子的设计也影响着分子的生物物理特性。两个关于连接子必须考虑的要点是氨基酸的组成和序列长度。首先氨基酸的组成对设计一个可行具有柔性的多肽连接子很关键；例如一个亲水的氨基酸序列是不可或缺的，在蛋白折叠过程中要避免多肽连接子与连接子之间，连接子与可变区之间发生相互作用。当前，最为广泛的连接子氨基酸序列基序为(G4S)n ，(G:Gly;S:Ser)Gly和Ser的优点在于它们非常短的侧链赋予连接子更加灵活有柔性，以及免疫原性低，而Ser可以提高溶解性。除了传统的Gly-Ser连接子，其它的连接子设计像带电残基，包括Glu,Lys可以增加溶解性，高通量噬菌体筛选方法也有助于设计产生是和特异性优化特定抗体的连接子。 除了氨基酸组成，重链和轻链Fv结构域之间的连接子长度也对scFv形成正确的空间构像非常关键。据报道连接两个V区序列的连接子长度应该在35nm(35Å)才不会影响天然Fv的空间构像。连接子的长度在抗体多聚体的形成过程中发挥着重要作用，有研究表明连接子长度超过12个氨基酸，重链和轻链可变区结构域之间有足够的距离联系并形成单体形式。更短的VH和VL连接子将阻止二者之间的直接相互作用，增加了不同scFv分子之间VH和VL错配的可能。因此恰当的设计连接子的长度可以有效促进scFv的形成，以及双体形式，尤其是TandAbs 分子，或者形成所期待的多价形式。例如药代动力学研究显示对于一些特殊抗体，比如CC49,它的二聚体或者四聚体更加优秀，与单体相比有更好的肿瘤靶向性，从而在肿瘤局部和血液中更加有效维持活性。因此，合理设计连接子长度对维持scFv构象，分布以及多价形式形成非常关键。 scFv抗体稳定工程学  scFv分子的稳定性非常重要，研究表明scFv的稳定性与其生物活性直接相关。只有稳定的scFv分子才可以考虑构建有阻断生物学功能的双特异性抗体。一系列方法通过改变表达环境，引入辅助分子（如分子伴侣）来提高scFv的可溶性及稳定性方案正在讨论，并以此作为双特异性scFv表达和生产的条件。在这个环节，我们关注通过直接修饰scFv框架的方法获得优化蛋白稳定性的方案。两种常用的工程化scFv结构的方法包括loop环移植和突变。Loop环移植方法或许是最适宜产生治疗性scFv的方法，因为该过程通过向框架移植具有生物学特性和稳定性的抗原特异性互补决定区（CDRs）可以一步实现稳定化和人源化。例如，Borras et al报道了一个成功的案例，通过将15种不同的兔单克隆抗体的CDRs移植到人scFv支架，稳定化和人源化了兔可变区结构域，产生了与兔亲本抗体亲和力相当，生物学活性明显改善的抗体。另一种方法，合理的点突变或者直接的蛋白进化可以增强稳定性也是另一种优化结构的方案。对比工作量，直接进化需要重复的步骤才能达到优化，位点特异性突变相对容易操作和易于建立的方法。合理的设计位点特异性突变基于抗体基础知识，以及差异性突变可以结合同时引入，突变累积效应可以加和共同提高稳定性的假设。例如，最为常用的任意位点的特异性突变，在同源的Fv结构域中，认为位点一致性的序列是进化和自然选择的结果，该一致性的氨基酸有利于抗体稳定性，将位点突变向着这些一致性的氨基酸方向突变将有利于抗体的稳定性。除了一致性的方法，其他方法包括选择特定的氨基酸达到特定的优化目标，例如引入链内二硫键，创造分子间氢键，以及优化疏水性。运用以上突变的方法，一个成功的案例是Miller et al 等人结合基于序列的统计算法分析（氨基酸残基频率和一致性分析）以及结合基于结构的设计方法，鉴定出关于VH,VL需要突变的氨基酸残基。然后将突变的scFv通过抗原抗体结合的方式在高温加压环境进行高通量筛选。最中分离得到基于稳定性设计的scFv高产分子,在CHO细胞中表达相关分子，从上清中纯化得到21.5 mg/L) 高纯度和生物活性抗体。 双特异性抗体scFv表达和生产 恰当的宿主平台决定着scFv抗体的表达和生产，目前，已有多个可行的平台可以表达scFv,包括大肠杆菌，酵母菌，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞以及无细胞表达系统。鉴于双特异性scFv由两个或多个scFv分子构成，不同的表达系统对双特异性scFv的表达很可能大不相同。对于双特异性scFv抗体最好的表达至今没有定论，因为这决定于双特异性抗体分子不同的大小，不同的氨基酸序列，重组抗体不同的构象使得一个系统不可能普遍适用，针对每一个分子，任何一个表达系统都需要经过优化对于特定蛋白的表达产量，质量，而这一优化过程要考虑可溶性，稳定性等诸多的影响因素。 但是也有一些研究如下列表1报道了一些利用细菌，哺乳动物细胞成功表达双特异性scFv以及融合分子的例子。 表1.双特异性抗体在不同表达系统表达实例     E. coli 是scFv最为常用的宿主表达系统。E. coli 的优势在于快速增殖，生产成本低，异质性蛋白高产量，遗传系统明确，容易进行基因工程改造等。不同于完整糖基化抗体，scFv在大肠杆菌中很容易表达。然而，这一高产的表达系统同样存在着挑战，其一就是蛋白的可溶性问题。很多研究报道在E. coli中表达蛋白容易产生错误折叠和包涵体。这一系统在表达scFv时的低效率主要是因为在E. coli 的细胞质中缺乏分子伴侣，翻译后修饰的细胞器，以及还原性的微环境阻止了二硫键的形成。对于scFv分子来说，形成内部二硫键是免疫球蛋白折叠结构形成是必要的。因此，在大肠杆菌系统中成功的表达scFv分子需要一定的辅助程序和相应的优化。例如，在随后的蛋白重折叠和复性步骤中整合步骤包括加入变性剂例如尿素，盐酸胍等然后通过透析等方法重折叠蛋白去除促溶剂。Gruber et al. （表1）报道报道的表达双特异性scFv在重叠步骤就运用了以上方法。scFv分子的可溶性表达也可以通过向scFv用基因工程的方法在N端添加分泌信号肽，将scFv分泌到存在氧化环境的周质腔而实现。一系列研究报道了在E. coli周质腔表达BiTE结构的分子。除了以上解决可溶性的方法，还存在一些方法或许会用到以后解决双特异性scFv分子在大肠杆菌表达系统中表达。例如，将scFv与一些增强可溶性的标签蛋白如MBP, NusA, 和 TRx融合表达，这些标签都有助于蛋白的正确折叠，后续的操作过程中需要对这些标签进行切除，分离纯化得到正常的抗体。另外，一些研究表明，共表达一些分子伴侣如Skp, OmpH, HlpA 和FkpA 以及调节/催化二硫键形成代谢的酶有助于解决蛋白聚集错误折叠的问题。这种鸡尾酒式的解决方案已经被证实可以改善大肠杆菌表达scFv遇到的问题。 scFv也可以通过其他表达系统表达来实现大肠杆菌系统无法企及的优点。哺乳动物细胞代表着最广泛地治疗用蛋白生产平台，最有希望的scFv双特异性抗体表达系统，这归因于哺乳动物系统最先进的蛋白折叠，翻译后修饰系统。哺乳动物系统可实现稳定表达，高效生产可溶性的重组蛋白。例如Vendel et al和Jain et al. 等人通过CHO系统表达的生物活性scFv分子，其生物活性远高于大肠杆菌表达的scFv,二级结构也存在明显的差异。 除了大肠杆菌和哺乳动物表达系统，其它一些存在表达scFv优势的平台也将成为未来双特异性scFv大规模生产的平台。酵母菌作为真核微生物，不仅拥有表达正确折叠，全功能蛋白的能力，而且拥有在简单培养基快速增值的优点。另一种有趣的表达系统是昆虫细胞，通过杆状病毒表达外源基因。利用杆状病毒polh 启动子可实现病毒感染细胞基因高效表达。植物重组蛋白表达系统也是人们渴望可以实现抗体表达的系统，需要考虑的问题包括拓展性，成本效益和安全性。通过瞬间表达或者转基因稳定表达蛋白，后续通过叶片分离重组蛋白可以实现scFv分子的生产。除了基于宿主的蛋白表达系统，无细胞表达系统可以实现高通量蛋白库生产，这主要归因于该系统的高效性和灵活性，以及节省了表达scFv所需要的载体构建，转染等繁琐的劳动和时间成本。 全长IgG样非对称双特异性抗体 尽管IgG样非对称结构双特异性抗体具有一些和天然抗体类似的特性，但其属于工程化分子，并不是B细胞产生的典型抗体。因此，这种与典型抗体之间的差异造成了双特异性抗体生产的挑战。一个最大的挑战就是IgG样非对称结构双特异性抗体如何确保其正确的组装，这是双特异性抗体后续生产的先决条件。随机组装4条不同的多肽连（两条不同的重链，两条不同的轻链）将产生多达16种组合，10种不同的分子结构，其中只有2种分子结构是我们想要的非对称异质性双特异性抗体（12.5%有意义的组合），其余的配对结果都是非功能性或者单克隆抗体分子。所以不仅是质量而且在数量上产生双特异性抗体，无论是在大肠杆菌还是哺乳动物表达系统都需要进行大量的优化以确保形成正确的双特异性抗体组装分子。关于IgG样非对称结构双特异性抗体分子产生实例总结如表2。在产生IgG样非对称结构双特异性抗体，迫切需要解决两个问题：1.两条重链如何产生异质性的二聚体。2.区分两条轻链与两条重链之间的相互作用。一些巧妙的设计，细胞工程策略，例如双杂交瘤融合计入，knobs-into-holes ，共同重链，共同轻链策略，CrossMab ，共培养策略等已经运用到优化产生Y形IgG样双特异性抗体。接下来我们将逐个件数这些策略的要点。 表2.不同宿主平台表达IgG样双特异性抗体实例 双杂交瘤融合技术 起初，双特异性抗体靠双杂交瘤融合技术产生，如图3A所示。每个在杂交瘤细胞表达唯一的特异性单克隆抗体。然后，两种表达单克隆隆抗体的细胞融合产生杂交-杂交瘤细胞，表达两个亲本抗体的重链和轻链，形成既有两个母本抗体表达，又有杂合抗体表达的局面。双杂交瘤技术代表了双特异性抗体产生的起源和基础。但同时也面临着低产量高异质性副产物的考验。随机组合两种不同的重链，两种不同的轻链将产生10种不同的分子组合，而仅有一种是有功能的双特异性抗体。通过双杂交瘤产生有功能双特异性抗体的比例是不可预知的，工作量庞大，而且需要从大量的副产物中分离目标抗体，难度进一步加大。后来，一种嵌合的双杂交瘤技术应用在了双特异性抗体的制备中。利用小鼠和大鼠的杂交瘤细胞融合。嵌合双杂交瘤技术的核心内容是mouse/rat bsAb 明显的富集，其主要原因是种属限制的重轻链配对胜过传统的mouse/mouse ，rat/rat 双杂交瘤技术。进一步来说大鼠的重链不能和proteinA结合来实现纯化，而含有小鼠重链的双特异性抗体可以在PH5.8实现洗脱，小鼠亲本抗体需要在PH3.5才可以洗脱。这一特性给纯化提供了便利，通过ProteinA,离子交换层析就可以实现想要的双特异性抗体分离纯化。随着装杂交瘤技术的改进，第一款双特异性抗体Catumaxomab (anti-EpCAM x anti-CD3) 于2009年在欧洲获准上市，用于治疗恶性腹水病。Catumaxomab由双杂交瘤技术而来，构成了小鼠IgG2a和大鼠IgG2b的嵌合体。作为一个三功能抗体，抗体的一个Fab结合与T细胞的CD3受体，另一个Fab结合于肿瘤细胞表面抗原上皮细胞黏附分子EpCAM ,Fc行驶第三个功能结合与FcγRI, IIa 和 III受体，在治疗过程中，有时候，一些人伴有抗小鼠和人抗大鼠的不良反应。 图3.IgG样双特异性抗体改善策略 重链组装策略 Fc异质性二聚化是解决众多可能的组合形式，淘汰正常抗体的组合，排除非功能性抗体结构的关键设计。两条异性重链通过互补配对形成同一重链组合的抗体 Fc结构形式。每一条重链随可以不同的轻链，将产生四种可能的形式：1个双特异性分子，1个非功能的结构，两个单特异性分子。通过该方法一下子将两种的组合形式由原来的10种分子降低到了4种。Fc的二聚化通过两种抗体的CH3结构域彼此相互作用。不同的策略可以设计CH3结构域实现两种不同的Fc结构域彼此相互作用，如图3B。 Knobs-into-holes 技术，该方法设计两种抗体重链的CH3结构域一个产生knob ，一个形成一个hole,促进Fc形成异二聚体，这一技术已广泛应用于Fc工程化。Knobs-into-holes 技术由Francis Crick 首次提出。Ridgway et al. 等人将Knobs-into-holes 技术作为一种新颖的设计应用到Fc设计上产生了异二聚化Fc形式。将CH3中一个小氨基酸换成大氨基酸(T366Y) 形成一个Knob变体，而另一条重链CH3结构域中的大氨基酸替换成小氨基酸(Y407T) 形成一个Hole,两个Fc可以彼此固定形成异二聚体。进一步，一些额外的点突变包括S354C和T366W被发现可以形成Knob,CH3中的Y349C, T366S, L368A, and Y407V 突变可以形成Hole。另外，CH3上的L351C 突变有助于异二聚体之间进一步形成二硫键。位点突变工程化设计研究鉴定需要满足以下3个标准：（1）距离α-C应该在5.0-6.8Å范围内，这是发现的自然界二硫键形成的平均距离，最多达到7.6Å。（2）配对的氨基酸应明显区别于自然配对CH3界面的氨基酸。（3）二硫键的形成应该有利于空间构像。其结果是重链异质性配对进一步提升到95%，在共表达条件下易于形成稳定的产物。knobs-into-holes 异二聚体不仅解决了重链错配问题，同时赋予双特异性抗体稳定的空间构像，以及所产生抗体的纯化可以通过proteinA 亲和层析实现。Zhang et al. 等人比较了knobs-into-holes 异二聚体与holes-holes 同二聚体形式，进一步证明了knobs-into-holes 是一种理想的异二聚化设计策略。重链异二聚化不仅产生的功能性双特异性抗体，而且保留了Fc介导的效应功能，例如ADCC作用。与大肠杆菌表达的非糖基化抗体相比，哺乳动物宿主系统可以表达糖基化，具有效应功能的异二聚化抗体。一项研究表明利用knobs-into-holes 技术产生的非对称结构的CD20抗体，利用CHO系统表达，通过去岩藻糖化所产生的增强ADCC作用与对称结构的去岩藻糖化抗体作用相似。 另一种方法是，链交换设计结构域异质化代表另一种基于空间的突变设计策略，运用IgG与IgA之间CH3结构域之间可替换的氨基酸序列（AG SEED CH3 and GA SEED CH3）形成互补结构。IgG和IgA CH3衍生物产生互补序列，因此两种互补的重链可以装配产生异二聚体，从而避免了缺乏互补作用产生同二聚体的可能。根据Muda et al 等人的研究，Fab-SEED 融合蛋白既保留了母本抗体相应的亲和力以及其他母本抗体的生物学特性包括理想的药物动力学和稳定性。 除了早期提出的空间突变，静电引力相互作用也被广泛的用作促进重链形成异二聚体。该方法的核心内容是将一条重链CH3结构域上的个别氨基酸突变为带正电荷的Lys,将另一条重链的CH3中的个别氨基酸替换为带负电荷的Asp或Glu。然后带电荷的氨基酸通过静电引力容易形成异二聚体。Gunasekaran et al 等人第一次引入带电的氨基酸形成Fc异源二聚体的双特异性抗体。在他们的工作中，一种新颖的设计策略被引入，异二聚体通过带有相反电荷的CH3形成，同时阻止了带有相同电荷的CH3形成二聚体。该操作的细节是将一条重链的CH3 上的K409突变为E409,而将另一条链上CH3上的D399突变为K399。 的确，位点特异性突变由于解决了重链错配问题，可以显著提高抗体的产量和质量。然而，空间突变和引入带电荷配对都将降低双特异性抗体的热稳定性。Moore et al. 等人报道了一种有效的方法称作XmAb 双特异性抗体平台，该平台结合了电荷相互作用，CH3结构域的空间构象以及稳定性，从而提高了双特异性抗体的热稳定性。新的Fc突变包括对S364K和K370S异二聚体的侧链交换,在L368D / K370S形成氢键,以替代盐桥的相互作用。Fc工程化位点的特异性和选择依据是最小化暴露面积，来确保等体积的替换，不影响受体结合或产生额外的N连接糖基化位点。另外，由于结构和电荷配对的突变，存在空间位阻和静电引力排斥作用同源二聚体将急剧减少。此外,在两个CH3位点之间检测和设计了不同的等电点(pI)。这是非常有趣的改变，可以显著提升异源二聚体平台规模化生产，因为工程化异源二聚体的PI将显著区分同源二聚体，便于通过标准的离子交换层析纯化分离异源二聚体。 总结起来讲，双特异性抗体重链异质性作用，尤其是CH3区域，代表着快速增长的新兴技术，包括多种设计策略，例如空间突变，静电引力作用，重链电荷差异化以方便纯化。这些方法经常一起使用来达到双特异性抗体重链的异质二聚化，减少同源二聚体形式。然而，另一种策略是用共同重链，一条λ轻链，一条κ轻链，不包含其它任何修饰，该结构称作κλbody。在CHO细胞或者HEK293细胞共表达一条重链，一条κ轻链，一条λ轻链，产生单克隆抗体和双特异性抗体。据报道轻链的表达是双特异性抗体亲和力和特异性的决定因素。κ,λ特异性柱子将游离的κ,λ轻链分离，然后使用ProteinA纯化，尽管最后仅剩余50%的κλbody最终产物以及κ-κ，λ-λ的副产物。有趣的是，另一研究小组报道λ链序列密码子去优化将κλbody产量提升了两倍，而且提升了低表达κ链的κλbody表达宿主中双特异性抗体的相对分布。 重链轻链组装 Fc段CH3结构域的精心修饰是产生正确的异质化重链二聚体的关键，然而使用两条不同的轻链仍然导致双特异性抗体的产量受到限制。进一步改进的方法是提升轻链和重链之间的正确配对来解决重链和轻链之间的相互作用。例如共同轻链的方法和CrossMab，将Fab中VH和VL部分交换。这些策略通常与Fc重链修饰结合使用，如图3B。 首先，共同轻链策略用于组装IgG样双特异性抗体，可以跟knobs-into-holes 技术结合使用。其机制是共同轻链是基于抗体发现中噬菌体文库筛选针对不同抗原的抗体通常享有同样的轻链，意味着轻链的能动性非常有限。共同轻链的优点在于简化工业生产中抗体工程化和纯化进程。例如，基于计算机预测，Fc发生称作“DEKK”的突变配对，即一条重链发生L351D和 L368E 突变，另一条重链发生L351K 和 T366K 突变，有效驱动两条重链二聚化。通过共同轻链的策略产生的双特异性抗体MCLA-128 ，针对EGFR2,EGFR3的双特异抗体已经通过标准的CHO生产平台生产，经常规的纯化手段，在GMP条件下生产了出来。2017年，全长IgG样双特异性抗体药物emicizumab (Hemlibrafi) 由FDA获准上市,用于治疗A型血友病。该抗以设计为IgG4亚型，emicizumab 模拟激活的FVIII ，恢复FVIII 的功能结合与FIX和FX因子。emicizumab的生产结合了三种抗体工程化策略，共同轻链策略完成重链和轻链的组装，改变两条重链的电荷便于纯化，利用静电应力的方法促进两条重链的表达和结合。目前，越来越多的共同重链和共同轻链平台用于有效开发双特异性抗体的组装中。这其中包括且不限于固定轻链的转基因小鼠，以及共同轻链的噬菌体文库筛选。因此，共同轻链策略越来越多的应用在双特异性抗体领域用来克服双特异性抗体面临的稳定性，产量以及免疫原性等问题。然而，这一策略对于抗体工程化来说缺少灵活性，在某些情况下限制了抗体的优化。进一步来说，共同轻链的筛选需要动物免疫和/或噬菌体展示，这就增加了相应的开发时间成本。 有别于共同轻链策略，CrossMab代表着广泛使用的策略，通过Fab片段的重链和轻链交换来解决轻链的问题。CrossMab技术允许产生各种各样的双特异性抗体包括双，三，四价抗体，以及新的Fab抗体衍生物，图3b展示了三种不同的代表性结构。第一种形式是将双特异性抗体中一半的Fab中重链和轻链部位互换(CrossMab Fab)，这一结构仍然保持了抗体的亲和力。第二种结构是将抗体中一半的Fab中重链和轻链可变区VH和VL交换位置(CrossMab VH-VL)，这一设计是双特异性抗体的两个臂所包含的轻链与重链的相互作用关系发生变化从而阻止轻链的错配。类似的，第三种形式在双特异性抗体一条臂中CH1和CL的位置发生交换（CrossMab CH1-CL），便于重链和轻链之间正确结合。CrossMab CH1-CL 理论上不再产生副产物，而 CrossMab Fab)产生无功能的单价抗体，即形成第一个抗体的VL-CL与第二个抗体CH-CH1结合的结构。CrossMabVH-VL 产生本斯·琼斯氏蛋白样副产物即形成抗体1 “VL-CL”与抗体2 “VL-CH1” 配对的结构，形成了两种抗体轻链的组合臂。本斯·琼斯氏蛋白样抗体理论上可以通过两种抗体CH1与CL静电引力排斥而避免。 交叉策略设计已经被成功用于抗肿瘤药物。Vanucizumab 是利用CrossMabCH1-CL 结构靶向血管内皮生长因子A (VEGF)-A,促血管生成素2(Ang-2) 的双特异性抗体。该设计通过优化用于临床试验，采用未经突变的bevacizumab 靶向VEGF-A,对含有Ang-2结合位点的LC06采用CrossMabCH1-CL 突变。进一步的向重链引入二硫键以稳定knobs-into-holes 突变引起的重链组装。结果显示vanucizumab 有强大的抗肿瘤作用，并且通过靶向Ang-2的抗体抑制了微转移肿瘤的增殖，抗VEGF抗体没有影响正常血管的功能，未产生副反应。该技术已经广泛用于多种异质性双特异性抗体的设计。例如Zhao et al 等人利用knobs-into-holes和CrossMabCH1-CL 技术产生针对CD20和HLA-DR 的双特异性抗体，以及Huang 等人用该技术产生更具广谱抗HIV的中和性抗体。优化的CrossMab 更加高效，有力的改善了轻链选择性配对，尤其是与其他设计结合使用，例如knobs-into-holes 。综上，交叉设计已经显示出其高效解决轻链正确配对的问题以便保持正确的结合和相应的亲和力，从而保证高产量。 共培养策略 为了解决轻链错配问题，又要同时保持天然抗体的结构，Spiess et al. 等人提出在体外利用两种细胞系表达，让两种半抗体结合的策略。如图4描述半抗体通过纯化后以摩尔比1:1的比例混合产生功能性双特异性抗体。尽管该方法是有效的，但也需要注意一些本质的挑战。这就意味着要将两种细胞系在单独的容器中单独培养，收集，纯化等步骤在结合之前必须完成。共培养的方法首次是用于大肠杆菌，含有A,B两种半抗体的质粒分别导入大肠杆菌，两个半抗体运用了knobs-into-holes t 技术来阻止重链与轻链结合之前发生同聚化。培养完成之后收集菌体收获半抗体。由于上面提到的细胞，培养基一致，就可以用共培养的方式降低成本和风险。两种分别含有A半抗体质粒和B半抗体质粒的大肠杆菌在同一容器中以相同细胞数目共培养。起始细胞数目的相同来确保A,B产量的相同，通过共培养，检测功能性双特异性抗体成功表达，并最终收获。这一方法已经被证实简单且便于广泛生产稳定抗体。 图4 共培养在E.coli和CHO中表达IgG样双特异性抗体 最近，共培养技术用于CHO系统，尽管方式类似，但是在方法使用上还是有一定差异，主要表现在质粒设计，接种，收获等方面。对于CHO细胞来说重链和轻链通过单独的DNA质粒导入细胞来避免非同源重链和轻链配对，以确保足够的抗体滴度。对于CHO细胞系来说，两个细胞系所含半抗体的生产要以抗体滴度，细胞增长速率，最大化生产A,B半抗体等条件，调整A与B以1：1摩尔表达，这对整个系统来说非常关键。尽管CHO细胞产生最小量的Knob或Hole同源二聚体抗体，在收获之前，加入还原型谷胱甘肽使双特异性抗体的形成最大化。加入还原型谷胱甘肽以提供还源性环境有助于阻止同源性二聚体，以及二硫键的形成。在本研究中，使用了从0.04-40L的双抗共培养表达体系。最简单的抗体设计，相对低的风险和成本，兼容的技术像控制Fab交换技术和SEED,这一方法提供了简单易行的共培养产生双特异性抗体的案例。 IgG样双特性抗体的表达 工业生产中，哺乳动物系统表达占据主导地位，其平台可以广泛用于适合于临床试验及商业化抗体药物的生产。然而，双特异性抗体的生产更加复杂，典型的需要至少两种质粒形成异源二聚化重链，一个共同轻链质粒或者两条轻链质粒完成表达。显著地，分两个质粒表达重链和轻链更受欢迎，主要是因为易于人工调整质粒比例，便于优化蛋白组装以便达到产量最大化。随后事密集的劳动和耗时的工作进程，经过多轮大量的筛选，最终要从稳定转染的细胞池中筛选高表达稳定细胞系。CHO细胞系是众所周知的高产，低污染，人免疫球蛋白兼容性的表达细胞系。稳定的CHO细胞株抗体产量可达到>3g/L，有的可以达到>5g/L,甚至更高，而且以成功的实现生物反应器大规模发酵。然而，IgG样抗体在CHO中的表达量相对较低，通常在1-3g/L。 与稳转相比，瞬转可以无需重组DNA整合进宿主基因组在几天内完成表达。HEK293细胞，以及以293 为基础的Expi 293 是来自人的细胞系，适合于瞬时表达，可以用于早期抗体发现中。然而，由于双特异性抗体需要多个质粒，瞬时转染大规模表达IgG有时比较困难，主要是由于其相对低的滴度。作为一种替代方案，Rajendra et al 等人设计了一种质粒包含整个抗体的轻链和重链，适用于瞬转和稳转。双质粒瞬转的CHO细胞池，一个质粒中只含有一种抗体的重链和轻链，配对形成双特异性抗体其产量在0.09–0.15 g/L ，大约73–92% 是真确配对的双特异性抗体。瞬时转染的一个质粒中包含两个抗体的重链轻链，其产量和正确折叠的双特异性抗体比例都与双质粒瞬转类似。然而，一个质粒稳转的CHO细胞其滴度达到0.6-2.2g/L,正确的双特异性抗体率约为74%-98%。这一结果表明，单质粒系统比多质粒在滴度以及稳定细胞株形成上更有优势。 的确，在体内组装，共表达重链和轻链依赖于深度选择稳定表达的克隆。加上培养条件例如温度也会影响半抗体的表达，聚集体的形成。相比较而言下游的proteinA纯化CH3突变体，体外组装更具产生高质量分子的潜力。例如Duobody技术。在体内IgG4容易发生Fab臂交换（FAE），在体外，研究者设计了FAE相关的IgG4特异性突变与IgG1配对形成稳定的IgG1双特异性抗体，在体外实现了高表达和高稳定性的组装。另外，一些双特异性抗体可以通过无细胞表达体系利用大肠杆菌提取物来表达。这一系统的灵活性在于knob: hole 质粒比例更加容易调控，实现高效的HC异二聚体组装，这一系统可以在数小时内完成g/L的表达。无论如何，这些方法都存在着增加生产成本的限制。因此，稳定细胞株共表达是IgG样双特异性抗体的主导方案。 结论 本文主要关注双特异性抗体的设计，生产，以及双特异性抗体的质量。关键的挑战是如何表达均质的高质量双特异性抗体，减少副产物。对于scFv样双特异性抗体，蛋白稳定性，阻止渗透力都因scFv抗体类型的不同而不同。进一步来说，对于宿主细胞的选择最适宜的宿主系统要根据特异性scFv的大小，氨基酸序列，蛋白构想，溶解性，稳定性纯化，表达规模共同决定。对IgG样双特异性抗体来说纯的异二聚体的生产依靠完全的重链和轻链异二聚体化实现。Knobs-into holes 是非常有效的方法解决重链的问题。共同轻链，CrossMab 也是非常有效的解决轻链以及重链组装的策略。最新的共培养，无细胞表达系统也是产生双特异性抗体的一些补充平台。更先进的蛋白生产工程化技术正在快速发展，这些技术的应用正在不断提升双特异性抗体及衍生物的快速发展，同时也将助力双特异性抗体成为下一代抗体治疗的焦点。 原文来源： Wang Q, Chen Y, Park J,et,al.Design and Production of Bispecific Antibodies.Antibodies (Basel). 2019 Aug 2;8(3). pii: E43.   识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。