MLN 591-DM1

ADC 药物的研发生产壁垒抗体药物偶联 物（antibody-drug conjugate，ADC）是一类通过特定的连接头将靶标特异性的单克 隆抗体与高杀伤性的细胞毒性药物偶联起来的靶向生物药剂，以单克隆抗体为载体 将小分子细胞毒性药物以靶向方式高效地运输至目标肿瘤细胞中。ADC 药物进入患 者体内循环后，抗体部分特异性地结合到肿瘤细胞表面，肿瘤细胞的细胞膜内化； 随后酶类降解 linker 释放毒素。图：ADC结构ADC是将单克隆抗体通过偶联臂（linker）与小分子药物共价偶联形成的复合物。ADC药物分子包含抗体、linker、小分子细胞毒素三个结构模块。与传统的完全或部分人源化抗 体或抗体片段相比，ADC 因为能在肿瘤组织内释放高活性的细胞毒素从而理论上疗 效更高。和融合蛋白相比，它具有更高的耐受性或较低的副作用。ADC 药物对靶点 的准确识别性极大地提高了药效并减少了毒副作用，使得近年来 ADC 药物一度成 为肿瘤精准治疗领域的热门研究方向之一。ADC 结构组成复杂，影响药物临床效果的因素繁多，较高的开发难度带来多重壁垒：1）技术平台是 ADC 药企的首要壁垒，全球来看，重磅 ADC 药物均源自专利性技术平台，毒素和偶联方式 是 ADC技术的主要创新方向，目前已获批的 14款 ADC药物共使用了 9种毒 素；2）ADC 药物的 CMC 难度更高，毒素、连接子及抗体的化学性质各异， 偶联反应进一步增加了工艺开发的工作量，CMC 工作需要高效的工具及丰富 的经验；3）ADC 药物的放大生产综合能力要求高，单抗的放大生产，小分子 毒素的合成以及在工厂进行偶联反应需要不同的技术、物料及生产设施，企业独立研发生产的难度较大。图：ADC 药物结构数据来源：《药学学报》 ADC 药物作用机制ADC药物经注射进入血液循环，其抗体部分与肿瘤细胞表面的抗原特异性结合，结合形成的复合物被细胞吞入。在细胞内，可剪切连接子对肿瘤细胞内的环境因素敏感，会被特定pH值环境、蛋白酶、或某些化学物质裂解；携带不可剪切连接子的ADC药物被溶酶体消化，从而释放药物，发挥作用杀伤细胞。某些ADC药物的小分子可以穿透细胞膜进一步杀伤周围的癌症细胞，即旁观者杀伤效应。此外，ADC也具备CDC、ADCC、ADCP等抗体的免疫效应。ADC 设计 抗体设计原理1. 确保 ADC高效识别2. 降低 ADC清除速率3. 兼顾抗体穿透性与稳定性4. 确保 ADC高效识别肿瘤5. 毒性小分子需要进入细胞发挥作用抗体设计原则亲和力高2. 免疫原性低3. 分子量大小适宜4. 靶抗原在肿瘤细胞表面高表达，具备肿瘤特异性5. 靶抗原可诱导内吞连接子设计原理1. 减小脱靶作用，提高安全性 2. 确保有效性 3. 旁杀效应的小分子需穿透细胞膜连接子设计原则1. 在血液循环中保持稳定2. 在肿瘤细胞内可断裂释放药物3. 当采取旁杀效应设计时，连接子-药物复合物的亲水性 不宜过强小分子设计原理1. 抗体转运小分子到达肿瘤细胞内的效率有限，因此需要提高 小分子亲和力 2. 亲水性低面临的问题：1）易导致抗体聚集（降低保质期、 加快体内清除、增加免疫原性），2）易被 MDR 转运出细胞，产生耐药小分子设计原则1. 高活性：IC50 在 10-10-10-12M 之间，毒性比化疗药 物高 100-1000 倍 2. 一定程度的亲水性 3. 生产成本可控 4. 易于连接技术平台是 ADC 企业的首要壁垒。毒素种类、偶联化学方法、连接子的稳定性均对药 物最终的临床效果有重大影响。毒性过低的毒素会限制药物的临床有效性；疏水性 过强的毒素会导致 ADC 分子发生聚集，提高成药难度；均一性、可控性较差的偶联反应会 导致 ADC 药物异质性过高，降低临床有效性；稳定性差的连接子会增大脱靶毒性，带来较 大的安全性风险。ADC 药物的 CMC 工艺开发难度更高与单抗药物不同，ADC 药物需要将生物大分子 与高活性细胞毒小分子结合，小分子和抗体部分的分子量、亲水性等物理、化学性质差异 较大。ADC 药物除需要针对抗体和毒素各自进行单独的工艺开发外，还需就偶联反应进行 特殊的工艺开发。例如，在利用还原半胱氨酸生成的巯基进行偶联时，需要进行相应的工 艺开发以确定还原剂的最优剂量、反应温度等因素。另一方面，各组件的物理、化学性质与药物的关键质量属性互相影响，因此工艺开发受到的制约更多。例如小分子毒素的亲水 性、偶联的氨基酸位点均会影响药物的载药分布及 DAR 值。ADC 药物的结构复杂且设计呈现多样化，为CMC研究相关的生产制造、质量控制带来挑战；此外体内作用过程和代谢过程的复杂性，使非临床研究 & 临床研究也面临挑战，ADC药物每一环节的技术门槛都较高。ADC 生产制造流程复杂，整体工艺与质控体系研发能力关键图表：ADC 药物生产制造流程 数据来源：ADC 药物质量控制和临床前评价专家共识，中信建投ADC 药物的生产涉及抗体生产、毒素与连接子合成、偶联过程和纯化，以及制剂灌装等流程。偶联反应需要关注反应浓度、投料量、时间、缓冲体系、pH 等因素，且过程中涉及放热反应，需要进行温度控制。连接子与抗体进行偶联的过程中，需要控制抗体上所连接的毒素数量（DAR），从而保证了药品的均一性。若毒素药物的连接不能准确控制，产出的 ADC 药物均一性较差，裸抗、连接子毒素、DAR过高和过低的 ADC 的混合物会影响全身毒性暴露从而带来安全性问题。ADC 药物涉及高活性毒素，需要进行设施设备清洁管理杜绝交叉污染，同时需要做好人员和环境的安全防。为了保障稳定性 ADC 药物往往以冻干形式存在，涉及到冻干灌装的工艺。ADC 药物技术随机偶联技术目前已获批的 ADC 药物主要采用随机偶联方式，具体而言可按照 抗体表面参与偶联反应的氨基酸分为 1）赖氨酸随机偶联或2）半胱氨酸随机偶联采用随机偶联的ADC药物往往均一性较差，实际上是由偶联了不同数量小分子的抗体组成的混合物，部分ADC药物中甚至还有一定比例的裸抗。均一性差的ADC 药物，裸抗会和搭载了小分子的、真正具有治疗效果的ADC分子竞争靶点蛋白，降低ADC药物的抗癌活性。例如Mylotarg有50%的抗体为裸抗，而Kadcyla、Adcetris的裸抗比例相对较低。利用基因工程等新一代的生物技术，多家企业开发了均一化偶联技术。均一化偶联可以大幅收窄ADC药物的载药分布，改善药物的结构和药学性质，从而提高药物抗癌活性。定点偶联技术接子与抗体结构中的某些氨基酸通过化学反应相连接，偶联反应（偶联方式）可分 为随机偶联和定点偶联。目前全球范围内有多种定点偶联技术，主要包括工程半胱氨酸、非天然氨基酸、酶辅助连接等方法。其中工程半胱氨酸技术历史最早，主要通过对抗体引入半胱氨酸（及其表 面的巯基）进行定点偶联；非天然氨基酸技术通扩展翻译系统实现定点偶联。工程半胱氨酸偶 联 原 理人为地向抗体引入新的半胱 氨酸，并利用其巯基作为偶 联位点技术特点关键在于建立高效简洁的引入方 法，以及在抗体上寻找合适的引入 位点，从而精准控制巯基发生的化 学反应发展历史基因泰克早在 2008 年报道的 Thiomab 技术即属于 工程半胱氨酸技术。Seagen、辉瑞等多家公司均尝 试开发过此类技术。目前尚无基于此类技术的、处 于晚期研发阶段的 ADC药物非天然氨基酸偶 联 原 理通过引入新的 tRNA 及氨酰 tRNA 合成酶将非天然氨基酸 插入到抗体上作为偶联位点技术特点关键在于将正交的 tRNA 及氨酰 tRNA 合成酶引入真核表达系统并 实现抗体表达，此外这种方法还存 在免疫原性的问题    发展历史Ambrx 和 Sutro Biopharma 分别于 2014 年报告了 其非天然氨基酸定点偶练技术，Allozyne 于 2015 年报告了其定点偶联技术，以上三种技术均被广泛 授权给 Big pharma，浙江医药的 ARX788 是首款基 于该类定点偶联技术的 ADC，目前处于晚期临床中。酶辅助连接偶 联 原 理通过特殊的酶向抗体中引入 某些氨基酸ADC 适应症靶点新方向ADC 药物适应症全球ADC药物主要集中在肿瘤领域，占比约97%。中国ADC药物均为肿瘤领域。全球在研ADC药物的适应症前三分别乳腺癌、胃癌和肺癌。中外重点布局的适应症实体瘤领域具有较高的一致性。ADC 药物广泛布局肿瘤领域，头部癌种临床需求广阔：据统计，目前全球 ADC 在 研管线重点布局在非小细胞肺癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌以及乳腺癌五大主要病 种，中国在研管线主要分布在非小细胞肺癌、胃癌、胃食管交界处癌、乳腺癌以及 尿路上皮癌五大瘤种。图：全球ADC研发适应症分布数据来源：2021年医药魔方ADC分析报告，东吴证券研究所整理根据近日美国肿瘤协会发布的 2022 年的美国癌症年度报告 数据显示，在刚刚开始的 2022 年中，美国将会有 191.8 万例新发癌症，60.9 万人因 癌症死亡。到 2022 年，美国每天约新增 5000 例癌症患者。乳腺癌、肺癌、结直肠 癌胃癌以及乳腺癌占比约为 48%；而根据中国国家癌症中心发布的最新癌症报告显 示，2016 年中国新增癌症病例约 406.4 万例，新增癌症死亡 241.35 万例。我国平均 每天有超过 1.11 万人被诊断为新发癌症，有将近 6600 人因癌症死亡，肺癌、结直 肠癌、胃癌、肝癌和女性乳腺癌是 5 种常见癌症，占新发病例总数的 57.4%；肺癌、 肝癌、胃癌、结直肠癌和食道癌是死亡率排名前 5 的恶性肿瘤，占死亡总数的 69.3%。ADC 在研管线集中布局较高患病率领域，基于中国人口众多，有望补充现有疗法满 足更大临床需求。TROP-2Trop-2为一种在多种实体瘤中高度表达的表面抗原，广泛存在于多种肿瘤之中。Trop-2 蛋白在人体正常组织中低表达，而在乳腺癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、肺癌、 尿路上皮癌等多种癌症中过度表达，具体来说，宫颈癌、三阴乳腺癌和尿路上皮癌中的 Trop-2 表达率分别高达 89%、88%和 83%。有文献认为 Trop-2 赋予了肿瘤细胞增殖及侵袭的能力。考虑到 Trop-2 过表达的癌症患者数量巨大（云顶新耀认为我国 Trop-2 过表达的癌症患者共 计约 350 万人，占全部癌症患者的的 78.9%），未来 Trodelvy 进一步拓展其市场的潜力巨 大。图:国内部分 anti-TROP2 抗体偶联药物资料来源：招股说明书，医药魔方，公司官网，华安证券研究所戈沙妥珠单抗（Trodelvy TM）近日，云顶新耀Trop2 ADC新药戈沙妥珠单抗（Sacituzumab Govitecan）获批上市，用于治疗三阴乳腺癌。戈沙妥珠单抗（Trodelvy TM）是同类首创的TROP-2 靶向抗体药物偶联物（ADC），由一种 7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38）（一种拓扑异构酶 I 抑制剂及伊立替康的活性代谢物）组成，并经 Immunomedics 专有的可裂解接头 CL2A 偶联至靶向人 TROP-2 的人源化单克隆抗体 hRS7IgG1。其是美国NCCN 指南对复发性/Ⅳ期乳腺癌，尤其是 TNBC 的推荐治疗药物。Trodelvy是由Immunomedics公司开发一款靶向 Trop-2（人滋养层细胞表面糖蛋白抗 原）的 ADC 药物。2019 年 4 月，云顶新耀与 Immunomedics 签署授权引进协议，依据协议，公司 将拥有戈沙妥珠单抗在大中华区、韩国和部分东南亚国家的研发、注册和商业化的 权利，有权在授权地区开展戈沙妥珠单抗治疗 TNBC 以及其他经批准的适应症的研 究。戈沙妥珠单抗适应症在全球的获批情况 2020 年 4 月，Trodelvy（戈沙妥珠单抗在美国的商品名）在美国上市，用于治疗 mTNBC 患者，是全球首个获批的靶向 Trop-2 的 ADC。2020 年 9 月，Gilead 宣布以 210 亿美元收购 Immunomedics，获得了 Trodelvy 的所有权。目前 Trodelvy 已获得 FDA 正式批准用于二线治疗三阴性乳腺，以及加 速批准用于二线治疗晚期尿路上皮癌。2021 年 Trodelvy 获 FDA 全 面批准用于治疗曾接受至少二线治疗转移性疾病疗法的 mTNBC 成年患者；2022 年 2 月其作为二线及后线转移性 mTNBC 的治疗药物获得新加坡的上市批准。戈沙妥珠单抗能够将高浓度伊立替康活性代谢物 SN-38 递送至肿瘤细胞，进而抑制肿瘤细胞的 DNA 及 RNA 合成，其靶向 TROP-2 和定向递送 SN-38 的能力使其有可能用于治疗多种上皮性肿瘤及其他中国高发癌症类型并降低标准药物治疗带来的系统毒性。戈沙妥珠单抗易于管理，具有可预测的安全性。对 mTNBC，最常见的不良反应 均属常见不良事件，可通过常规支持性治疗来控制。且试验的 108 名 mTNBC 患者 均无因中性粒细胞减少而终止治疗。最常见的 3/4 级不良事件（>5%）为中性粒细胞 减少、白细胞减少、贫血、低磷血症、腹泻、疲劳、恶心及呕吐。3/4 级腹泻较为少 见（9%）且可控，且该 108 名 mTNBC 患者均无因腹泻而终止治疗。并无出现严重 神经病变。2%患者因不良事件而停药，例如过敏反应、厌食/疲劳及头痛。但值得注 意的是，戈沙妥珠单抗应警惕严重中性粒细胞减少症和严重腹泻。 针对 HR+/HER2-mBC，患者一般对戈沙妥珠单抗的治疗耐受良好，并无与治疗 相关的死亡，且仅有 2 例患者（3.7%）因不良事件而停药。中位剂量为 11（范围：1-74），而中位治疗时间为 4.0 个月（范围：0.2-26.0 个月）。频率高于 10%的唯一 3/4 级毒性为中性粒细胞减少（42%），这与在 mTNBC 中观察到的安全性相符。 针对 mUC，最常见的 3/4 级不良事件为中性粒细胞减少（38%）、贫血（11%）、 低磷酸盐血（11%）、腹泻（9%）、疲劳（9%）及发热性中性粒细胞减少（7%）。5/45 的患者因不良事件而终止治疗，并无有关治疗相关死亡的报告。叶酸受体α ADCFRα是一种在卵巢癌中过度表达的蛋白质，在大部分（80-96%）上皮性卵巢癌呈持续高水平表达，而在正常卵巢上皮中没有表达，因此是一个很有吸引力的治疗靶点。Mirvetuximab Soravtansine与FRα结合后，FRα可将Mirvetuximab Soravtansine转移到细胞内部，从而其携带的细胞毒性分子DM4便可抑制癌细胞的有丝分裂，达到治疗癌症的效果。FRα靶向药优势：FRα在多种实体瘤中高表达，开发“通用型”抗癌药前景较乐观。FRα安全性较好，暂无研究表明该靶点具有明显的靶点毒性。临床需求大，目前FRα靶点与卵巢癌治疗的相关度较高，而仅我国2020年新发卵巢癌病例就有6万人，每年复发和维持治疗的病例有数十万，但目前尚无特效疗法来满足巨大的临床需求。图：FRα靶点药物2020 年，华东医药与美国 ImmunoGen, Inc.达成独家临床开发 及商业化协议，获得后者美国临床 III 期在研产品 Mirvetuximab Soravtansine （MIRV）在大中华区（含中国大陆，香港、澳门和台湾地区）的独家临床开发 及商业化权益。中美华东将向 ImmunoGen 支付 4000 万美元首付款和最高可达 2.65 亿美元的里程碑付款，以及约定比例的销售额提成MIRV 针对的适应症为 FRα高表达的铂类耐药卵巢癌（包括卵巢上皮癌、输卵管 癌或原发性腹膜癌）。作用机理：FRα在实体瘤如卵巢癌，肺癌和乳腺癌中高 表达，在正常细胞中表达很低。MIRV 通过与肿瘤细胞膜表面的 FRα结合，通过 内吞效应进入肿瘤细胞，在肿瘤细胞内酶的作用下，释放抗微管药物 DM4，通 过抑制微管蛋白聚合和微管聚集，导致细胞周期中止和细胞凋亡。叶酸受体α阳性卵巢癌 ADC MIRV 是全球首个针对叶酸受体α（FRα）阳性卵巢癌的 ADC 在研药物，用于 治疗叶酸受体高表达的铂类耐药卵巢癌。目前在美国处 于 III 期临床阶段。同时，ImmunoGen 也正在开展临床试验，探究 MIRV 联合用 药方案的可行性。FRα ADC新药MORAb-202 卫材（Eisai）和百时美施贵宝（BMS）的MORAb-202由Farletuzumab（叶酸受体α[FRα]抗体）与甲磺酸艾日布林（微管抑制剂）通过组织蛋白酶-B可切割接头偶联而成，药物抗体偶联 比(DAR)为4.0。 MORAb-202的有效载荷eribulin（产品名称：Halaven，通用名：艾立布林）是首个软海绵素类微管动力学抑制剂，具有一种新型作用机制。    BCMA 靶点 ADCBCMA作为多发性骨髓瘤(MM)的关键诊断标志物和治疗靶点，诸多公司相继布局。目前，靶向BCMA的CAR-T细胞疗法和ADC药物已经获批上市。BCMA全称B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen)，属于肿瘤坏死因子受体家族成员。BCMA主要表达于晚期B细胞、短寿命增殖浆母细胞和长寿命浆细胞表面，而在初始B细胞、CD34阳性造血干细胞和其他正常组织细胞中不表达。凭借特异性的表达能力，BCMA成为多发性骨髓瘤(MM)良好的诊断标志物和治疗靶点。BCMA的配体主要是BAFF和APRIL。当BCMA与BAFF结合后，可活化经典及非经典NF-κB通路和JNK信号通路，上调抗凋亡蛋白表达，下调促凋亡蛋白的表达;当BCMA与APRIL结合后，上调免疫检查点表达水平，创造一个免疫抑制的骨髓微环境。目前全球范围内共有 4 款 ADC 产品靶向 BCMA 靶点，其中进度最快 的是 GSK 公司研发的 Belantamab Mafodotin，处在临床 3 期阶段。华东医药与 Heidelberg 合作的 HDP-101 是全球范围内临床进度第二的产品，目前在临床 1/2a 期，适应症为复发或难治性多发性骨髓瘤。华东医药通过与德国公司 Heidelberg 签署协议， ADC 产品 HDP101 和 HDP103，分别靶向 BCMA 和 PSMA 靶点，充实公司抗肿瘤产品管线 。 表：BCMA 靶点在研 ADC 产品资料来源：NCBI，公司官网PSMA 靶点 ADCPSMA是一种非分泌性膜酶，具有羧肽酶和叶酸水解酶的活性，具有较大的细胞外结构域。PSMA受体在前列腺癌细胞中具有致癌信号作用，作用于谷氨酸受体并激活Pi3 K和Akt生长途径。它在90%的转移性前列腺癌中过表达，而在正常组织中生理表达水平较低（前列腺、小肠、唾液腺和泪腺以及肾脏）。在过去的十年中，已经创建了许多针对该蛋白的疗法，许多临床研究已经积极证明了靶向PSMA放射性配基治疗（PRLT）的耐受性和有效性。目前，针对放射性药物靶向性的改进以及与其他肿瘤药物的联合正在研究中，以进一步提高其治疗效果。这些令人鼓舞的结果导致了以PSMA为靶点的其他疗法的发展，如PSMA CAR-T细胞治疗、PSMA靶向ADC和PSMA靶向双特异性T细胞导向疗法。PSMA靶向ADC的早期研究结果显示出一定的活性。目前全球范围在研的靶向 PSMA 靶点的 ADC 产品有 5 款，多数在研产品目前都还处在比较早期的阶段，HDP103 尚处 pre-IND 阶段资料来源：MDPI，ClinicalTrials，公司官网MLN2704包含与有效载荷maytansinoid-1连接的人源化J591抗体。在一项对62名采用不同治疗方案的患者的研究中，5名患者（8%）出现PSA50反应。观察到包括周围神经病变在内的不良事件，10%为3级或以上。Petrylak等人报告了另外一种PSMA ADC的II期研究结果，这种PMSA靶向ADC是与单甲基auristatin E（MMAE）偶联的完全人源化IgG1单克隆抗体。在119名接受abiraterone或enzalutamide治疗后进展的患者中，14%的患者出现PSA50反应。不良反应包括粒细胞减少（32%），以及3级神经病变（8%）等，最终导致31%的患者停止治疗。MEDI3726是一种使用吡咯苯二氮卓二聚体（PBD）有效载荷的PSMA靶向ADC。在报告的33名患者中，在不同剂量水平的治疗下，有3名（9%）患者出现PSA50反应。然而，包括毛细血管渗漏综合征和皮肤毒性在内的不良事件导致39%的患者停止治疗。基于这三项研究，以PSMA为靶点的ADC在CRPC中确实具有一定的活性，然而，与治疗相关的不良事件限制了其治疗的能力。靶向CEACAM5所有CEACAM蛋白均属于Ig超基因家族，在正常成人组织中，CEACAM5位于胃、舌、食管、子宫颈、汗腺和前列腺。在进展期NSCLC、小细胞肺癌（SCLC）、胰腺癌、胆囊癌、膀胱癌、粘液性卵巢癌、子宫内膜癌、结直肠癌和胃癌肿瘤细胞中均可检测到CEA。上皮细胞上CEA的表达可能通过肿瘤细胞或肿瘤-间质细胞之间的CEA–CEA桥直接影响肿瘤的发展。靶向CEACAM5将成为一种抗肿瘤的新方法，并且将具有更小的副作用。 CEACAM5通过同嗜性和异嗜性结合（与CEACAM1或CEACAM6）参与细胞间接触并抑制失 巢凋亡。CEACAM5对失巢凋亡的抑制作用表明其在促进肿瘤发生和转移中发挥作用。研究发现，CEACAM5在多种癌症组织中表达上调。Tusamitamab ravtansine（SAR-408701）是Sanofi自ImmunoGen引进的一款ADC产品，是全球唯一一款靶向CEACAM5的ADC药物。由靶向CEACAM5（又称CD66e）的人源化 抗体（SAR408377）通过ImmunoGen开发的N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) butyrate (SPDB)可切割链接子与细胞毒素DM4偶联。国内外ADC 创新药物国内ADC药物近日，中国国家药监局发布消息显示，云顶药业提交的注射用戈沙妥珠单抗（用于治疗既往接受过至少2线治疗的转移性三阴乳腺癌患者）上市申请已经获得批准。戈沙妥珠单抗是全球首个且唯一获批的靶向Trop-2的ADC药物（抗体偶联药物）。戈沙妥珠单抗是一款靶向TROP-2的抗体与拓扑异构酶1抑制剂组成的ADC。TROP-2全称为人滋养细胞表面抗原，是一种在许多上皮癌（包括转移性TNBC和转移性尿路上皮癌）中均过度表达的蛋白，其中高表达与癌症的低生存率和复发相关。戈沙妥珠单抗能够通过与TROP-2蛋白相结合，将化疗药物伊利替康的活性代谢物递送到癌细胞内部。辉瑞的「注射用伊珠单抗奥唑米星」由 CD22 靶向单抗 inotuzumab 与细胞毒制剂卡奇霉素偶联而成，适应症为成人复发或难治性前体 B 细胞急性淋巴细胞性白血病。罗氏的恩美曲妥珠单抗（adotrastuzumab emtansine，Kadcyla）是由抗 HER2 靶向药物曲妥珠单抗与抑制微管聚集的化疗药物美坦新（DM1）通过硫醚连接子连接而成的 ADC。武田的维布妥昔单抗（Brentuximab vedotin，Adcetris）是由 CD30 靶向的单克隆抗体 Brentuximab、微管破坏剂 MMAE 和一种蛋白酶敏感的交联剂组成，主要适应症为霍奇金淋巴瘤、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、系统性间变性大细胞淋巴瘤等。维迪西妥单抗是荣昌生物自主研发的一款 ADC，由人源化 HER2 抗体和毒素载荷一甲基澳瑞他汀 E(MMAE)通过可被组织蛋白酶剪切的连接子彼此偶连而成的，2021 年 6 月在国内被 NMPA 批准用于治疗至少接受过 2 种系统化疗的 HER2 过表达局部晚期或转移性胃癌（包括胃食管结合部腺癌）患者。性大细胞淋巴瘤、系统性间变性大细胞淋巴瘤等。全球ADC药物主要创新企业与产品管线国外企业由于起步较早，因此ADC研发管线较为丰富，其中 ImmunoGen、Seagen、第一三共等企业有较为丰富的 在研产品梯度。国内企业方面，荣昌生物已经实现商业化，乐普生物、多僖生物、科伦博泰等产品处于临床开发阶段，国内其他企业的ADC管 线多处于早期临床阶段。 ADC药物领域的商业授权和技术转让是Biotech和Bigpharma合作的热点。国外以Pfizer\Abbive\Roche为代表的MSD和以Seagen\第一三共 为代表的Biotech构建了合作授权网络。国内如荣昌生物和科伦博泰核心产品均实现了高额授权合作。图：ADC药物主要创新企业与产品管线

Linker-drug (LD) 与抗体的偶联是产生ADC和确定ADC关键质量属性的关键步骤，其可以从根本上改变ADC的药代动力学和治疗指数。目前超过95%的ADC基于两种偶联技术：半胱氨酸烷基化或赖氨酸酰化。前十个获批的ADC中有7个基于半胱氨酸偶联(Adcetris、Polivy、Padcev、Enhertu、Trodelvy、Blenrep和ZynLonta)；3个基于赖氨酸偶联制备(Kadcyla、Mylotarg和Besponsa)。除了传统的这两种方法外，目前新的技术正在迅速涌现，不仅涉及半胱氨酸(烷基化和交联化)和赖氨酸(酰化或烷基化)偶联的创新方法以产生更加均质的ADC并提高治疗指数，而且还扩展到新的偶联技术，例如基于羰基、酰胺、叠氮基的偶联技术。本文将分两个部分对ADC的这些偶联技术做一个介绍。巯基(-SH)巯基(-SH)是ADC领域中最普遍的反应之一，主要基于三个元素。(A) 巯基是最亲核的氨基酸侧链官能团(比胺更亲核)；(B)抗体中适合结合的链间半胱氨酸的数量相对较少(对于IgG1和IgG4为8个)，并且对抗体的稳定性不重要，这使得相对可控制的DAR成为可能；(C)链间半胱氨酸，存在于铰链区，连接重链(HC)和轻链(LC)，在连接后可以‘隐藏’疏水有效载荷。目前基本上硫醇偶联 ADC 均基于马来酰亚胺化学（图 1）。已经开发了多种马来酰亚胺类试剂用于烷基化，烷基化发生在天然链间半胱氨酸或工程半胱氨酸上。图1.基于马来酰亚胺化学偶联ADC硫醇的基团马来酰亚胺的烷基化反应马来酰亚胺是顺丁烯二酸酐与胺衍生物反应的结构元素，很容易通过亲核Michael加成硫醇基团而发生烷基化反应，形成稳定的硫醚键(图2)。马来酰亚胺在pH为6.5-7.5范围与硫醇反应，其反应速度是胺反应的1000倍，从而可以用最小的试剂量实现完全转化。马来酰亚胺烷基化的主要缺点是Michael加成的可逆性，其速率高度依赖于它所连接的特定半胱氨酸残基的pKa。这种逆Michael反应可能导致连接子药物（LD）在循环中过早释放，并可能导致不良事件，这也一直是开发更稳定的马来酰亚胺变种的重要驱动因素。图2.各种马来酰亚胺试剂与半胱氨酸烷基化单抗中的半胱氨酸都参与了二硫键的形成，因此需要在与LD结合之前进行还原步骤以释放硫醇基团。通过优化还原剂（通常为TCEP或DTT）的量，以释放特定的自由硫醇基团(对于IgG1和IgG4，最多释放8个)。通过与半胱氨酸偶联制备的上市的ADC有Adcetris、Polivy、Padcev、Enhertu、Blenrep、Trodelvy、Zynlonta、RC48等。由于缺乏位点特异性，这些ADC通常以随机混合物的形式产生，平均DAR在2.3-4之间。然而，有两个例外，Enhertu和Trodelvy是通过所有链间半胱氨酸的接近定量水平结合产生的，DAR分别为7.7和7.6，因此具有位点特异性。尽管在绝大多数使用马来酰亚胺-己基连接子。然而有一些电子不足的氨基乙基或乙二醇间隔基的ADC可能抑制逆迈克尔反应，例如基于β-氨基乙基的AbGn-107、Zynlonta、ADCT-502、IMGN632、JBH492、MEDI2228和TR1801-ADC；基于乙二醇的SYD985、MORAb-202和ZW49。一些苯基取代的马来酰亚胺，据报道也更稳定，目前还处于临床前开发中。后续研究者开发了将LD与抗体特定设计的半胱氨酸进行定点结合的ADC，相比随机ADC混合物，其可能会提供更高的治疗指数。目前，多个位点特异性的ADC已进入临床，如SGN-CD19B、CD123A和CD352A(均为HC-S239C突变)；RG7861/DSTA4637S(LC-V205C突变)；IMGN632(S442C突变)；BAT8003(A114C突变)；以及基于双半胱氨酸突变的ADC，如PF-06804103(LC-K183C HC-K290C)。还开发了两种其他的技术，即半胱氨酸插入，如MEDI2228(HC-i239C)；以及HC-末端多肽融合，如ALT-P7(C-末端ACGHAACGHA融合)。然而，半胱氨酸工程抗体的使用并不能保证临床成功，一些已经放弃开发，例如，BAT8003和上面提到的Seagen的 三个ADC。通过对硫醚-琥珀酰亚胺加合物进行水解以提供顺丁烯二酸衍生物，可以抑制不希望发生的逆Michael反应。这种水解可以通过在pH为9的条件下对ADC进行长时间的处理来实现；然而，这可能导致蛋白质降解事件，例如脱酰胺或焦谷氨酸的形成。Seagen通过使用DPR技术，在烷基链的a位上带有氨甲基，解决了此问题 (图3)。在加入硫醇后，氨基诱导琥珀酰亚胺结合物的自发自水解，从而阻止了逆Michael反应。引入该技术的ADC产品有SGN-CD48A(现已停产)、 SGN-CD228A。图3. 半胱氨酸与基于二氨基丙酸(DPR)氨甲基的马来酰亚胺试剂进行烷基化反应，然后自水解得顺丁烯二酸偶联物其他半胱氨酸烷基化试剂各种替代马来酰亚胺烷基化的技术近年来也被开发出来。例如，a-卤代乙酰胺试剂的高反应性是众所周知的，其中 2-碘乙酰胺是游离半胱氨酸封端的无可争议的可选择试剂。更重要的是，其形成的硫醚键的是完全不可逆的，因此在稳定性方面优于硫醇-马来酰亚胺醚。另外Alley的研究使用a-溴乙酰胺丙基连接子为硫醚ADC提供了极好的血浆稳定性，在小鼠体内注射2周内没有可测到的系统性药物释放。由于甲磺酰基苯并噻唑(MSBT)是一种选择性的硫醇封闭剂，Barbaset等人开发了一系列芳香族甲磺酸试剂，用于硫醇蛋白质的烷基化反应。类似地，甲磺酸基嘧啶与硫醇通过亲核芳香取代机理进行反应（图4），这一概念应用于SKB264。Glythera（现为 Iksuda）的研究人员报告了通过将游离半胱氨酸硫醇基团与 4-乙烯基吡啶反应获得的高度稳定的硫醚 ADC，这种技术称为 PermaLinks（图4）。所得 ADC 具有被证明具有良好的稳定性。柏林大学开发的亚膦酸膦技术，现在已被Tubulis商业化使用，其与传统的马来酰亚胺相比，具有缺电子三键的芳基膦酰亚胺化合物显示出极好的半胱氨酸选择反应活性，同时所得到的(Z)-乙烯基硫醚具有极好的稳定性(图4)。图4. 半胱氨酸烷基化的替代技术双马来酰亚胺或双马来酰胺酸烷基化/交联化马来酰亚胺烷基化的能力也被应用于各种交联双马来酰亚胺试剂（图5）。每个试剂将捕获两个游离的半胱氨酸硫醇基团，从而在所有八个链间二硫键完全还原后导致DAR4 ADC。例如，New Bio 的 NBT828 中使用了双马来酰亚胺交联剂。图5. 双马来酰亚胺试剂交联半胱氨酸来自阿斯利康的研究人员报道了用双马来酰亚胺修饰的有效载荷(PBD)重桥半胱氨酸工程抗体，以获得DAR1 ADCs（图6）。图6. 双马来酰亚胺修饰的有效载荷重桥半胱氨酸工程抗体β-sulfone的烷基化/交联反应游离硫醇的高亲核性和简便易行的Michael加成也被用于不同类型的交联剂中，最初被Del Rosario和Wilbur报道，并由Poly-Therics (现为Abzena；THIObridge技术)为ADC开发。重桥可以通过使用双硫醇反应基团重新连接形成的硫醇来增加还原抗体的稳定性，从而更好地保持最终连接物中的构象完整性。用由双-a,a-甲苯磺酰基甲基酮前体原位形成的α-甲苯磺酰基甲基-α,β-不饱和酮试剂处理还原抗体会导致一系列反应，例如，Michael加成，β-消除 甲苯基亚磺酸，并再次Michael加成以提供稳定的交联产物（图7）。THIObridget 技术目前用于 OBI999 ADC（phase 1 阶段）。图7. 半胱氨酸与甲苯磺酸丙烯酸酯试剂的交联(THIObridge技术)双溴甲基试剂的烷基化/交联反应第三种DAR4 ADCs的交联方法是由Concortis (现为Sorrento)以C-lock技术开发的。C-lock技术结合了硫醇的亲核性和溴化苄基亲核SN2取代。因此，通过还原链间二硫化物，然后与双溴甲基芳基试剂反应，例如双溴甲基喹恶啉，发生不可逆交联制得硫醚(图8)。一款使用C-lock技术的ADC(CD38-ADC) 已经进入临床。图8. 半胱氨酸与双溴甲基喹恶啉的双烷基化交联(C-lock)。二溴并氮杂二酮的烷基化/交联化受二溴马来酰亚胺基团对还原二硫键重新桥联的启发， Chudasamaa等人开发了一种基于氮杂二酮(PD)基团的核心结构的的重桥技术。与马来酰亚胺衍生物不同，氮杂二酮环更稳定，不会通过水解开环，从而得到更均匀的共轭化合物。研究者开发了一溴PD(MBPD)和二溴PD (DBPD)的衍生物，并证明了这两种衍生物都能够在pH 8.0的条件下与硫醇基团发生特异性反应。使用DBPD硫醇重桥化学技术已被用于创建具有高度受控的有效载荷修饰的ADC（图9）。图9. 抗体硫醇基团与二溴并氮杂二酮衍生物的交联二硫键的形成虽然不直接连接到抗体半胱氨酸上，但ADC早期开发中就应用了二硫键作为连接子的一部分，例如MLN2704、CMD-401、BIWI-1和IMGN242。在细胞毒有效载荷和抗体之间含有二硫键的连接子设计可以推动可逆连接，这种连接可以通过肿瘤细胞内的谷胱甘肽还原来裂解以释放毒素。然而，由于溶解的半胱氨酸的存在，循环中二硫键的过早断裂经常发生，这导致进入肿瘤细胞之前释放有效载荷。在二硫化物附近的碳原子上添加保护基团制造空间位阻来增加循环的稳定性，但在许多情况下，它们也会降低肿瘤细胞内毒素的释放速度。此外，即使受阻二硫化物的稳定性增加，ADC也不如药物结合在抗体序列中最佳位置的工程半胱氨酸残基上有效。Pillowet等人是第一个将小分子药物直接连接到抗体不同位置的工程半胱氨酸上（图10)。通过使用受阻或不受阻二硫键的ADC进行比较，确定LC-K149C位置上的工程半胱氨酸是结合含有二硫键的药物最稳定的结合部位。使用LC-K149C位点创建的ADC表现出极好的循环稳定性，同时允许肿瘤细胞内谷胱甘肽的有效切割。图10. 通过工程半胱氨酸产生二硫键以制备抗体结合物氨基 (–NH2)氨基天然存在于赖氨酸侧链中，是与单抗偶联最方便的官能团，其不需要预先的化学修饰步骤。虽然由于其高的pKa(~10.5)，大部分蛋白质在中性pH下被质子化，但蛋白质中仍有一小部分氨基将以中性、未质子化的形式存在。氨基在亲核性方面仅次于硫醇基团，但明显领先于其他的氨基酸的侧链(如精氨酸、丝氨酸、色氨酸、蛋氨酸)。而且，赖氨酸的氨基不像半胱氨酸硫醇那样需要还原释放，并且大量可用，例如，抗体可能包含多达80个暴露在溶剂中的赖氨酸残基。胺类化合物修饰的初级偶联反应通过两种主要的途径：酰化或烷基化。一般来说，这些反应是快速和选择性的，产生稳定的键(酰胺键或仲胺键)，并导致高产率。然而，由于赖氨酸的大量存在，有限数量的选择性酰化是非常具有挑战性的，因此赖氨酸偶联的ADC通常显示出广泛的DAR分布，结合发生在大量的位点上(图11)。图11. 通过酰化(A)或还原烷基化(B)与天然赖氨酸发生随机偶联随机酰化羟基丁二酰亚胺(NHS)酯是最常用的用于氨基酰化反应的羧酸的活性衍生物。NHS含酯试剂很容易在碳二亚胺存在下由羧酸盐和NHS反应生成，随着NHS leaving基团的释放，与胺类亲核试剂反应生成稳定的酰胺键(图12)。这种酯与其他亲核试剂，如醇或水的竞争反应慢了几个数量级，而与硫醇或组氨酸氮基的反应产生不稳定的硫酯或咪唑基酯，很容易水解或仍与邻近的胺交换形成酰胺键。除了中性的NHS酯外，还可以制备具有更好水溶性的磺化衍生物(sulfo-NHS)。例如，在制造Kadcylas中使用的SMCC试剂。图12. 氨基与NHS酯的酰化反应通过赖氨酸酰化制备的代表性ADC有 Mylotarg、Besponsa、IMGN853和SAR408701。法国斯特拉斯堡大学的Wagneret等人报告了一种通过4-叠氮苯甲酰氟(ABF)与赖氨酸氨基反应的新方法。该试剂与抗体上的伯胺快速反应形成酰化产物，比使用基于NHS酯的试剂效率更高（图13）。其末端叠氮基可以用于偶联毒素、荧光染料和寡核苷酸。图13. 4-叠氮苯甲酰氟与赖氨酸侧链反应生成叠氮化抗体位点特异性酰化虽然赖氨酸侧链的直接酰化是抗体偶联的最直接和最容易的方法，但广泛的DAR分布的是其一个显著的缺点。因此，开发了位点特异性酰化技术。例如，Concortis Biosystems 公司(现为Sorrento Therapeutics)报道了一种名为K-lock的一步赖氨酸结合技术，该技术可以通过将细胞毒性有效载荷连接到预先选择的抗体位点来产生位点特定的ADC。尽管该技术的细节尚未披露，但已经被用于各种项目，例如，与 Lova Therapeutics合作的靶向5T4的 ADC药物（ZV05）。Bernardes等人也报道了特定部位的赖氨酸酰化反应。使用从计算机辅助预测的具有最低pKA的抗体赖氨酸的试剂，在略碱性pH的酰化反应将在动力学上有利的。研究发现磺酰基丙烯酸酯仅使用单摩尔当量(37℃，pH 8.0)就能快速进行反应，使得曲妥珠单抗轻链Lys207的定量和不可逆修饰，并完全保留天然二级结构和功能(图14)。图14. Lys207与磺酸甲酯的反应，然后氨基官能化的有效载荷的aza-Michael加成Ajinomoto的研究人员报道了一种两阶段、定点赖氨酸偶联Ajicap技术。这项技术的核心是精心设计的来自protein A的高亲和力环肽，其与抗体的Fc部分具有高亲和力。研究发现，如果环肽带有反应性的酯部分，则抗体-多肽复合体附近的Lys248的酰化反应具有极高的选择性。随后还原二硫键部分，同时从抗体中去除亲和肽，并释放出一个自由的硫醇基团，用于与有效载荷进行反应(图15)。图15. 基于抗体Fc与高亲和肽结合的Ajicap技术官能团相互转化(NH2 to SH)BMS的BMS-986183和BMS-936561(MDX-1203)优雅地结合了氨基和硫醇的化学成分。用 Traut’s试剂（一种五元亚氨基硫酯）处理抗体会导致赖氨酸上amidine(脒)基团的形成、环打开和游离硫醇的暴露（图16）。除去多余试剂后，用马来酰亚胺官能化的接头反应很容易得到所需的ADC。显然，用这种方法制备的ADC，虽然有趣，但可能同时具有赖氨酸偶联的广泛分布和硫醇基团潜在的逆Michael反应的缺点。图16. 抗体与Traut试剂反应，引入游离的硫醇基团，通过基于马来酰亚胺的连接子进行偶联HTI-1066/SHR-A1403（恒瑞）采用了一种将氨基转化为硫醇的替代方法。首先使用S-(3-氧丙基)硫代乙酸酯处理c-Met抗体，使其在天然赖氨酸上安装了游离的硫醇基团。然后通过马来酰亚胺共轭引入有效载荷(图17)。图17. S-(3-氧丙基)硫代乙酸酯与抗体的赖氨酸烷基化反应引入游离的硫醇基团，通过马来酰亚胺共轭引入有效载荷官能团相互转化(NH2 to马来酰亚胺)最常见和成功应用的官能团相互转化方法之一是双功能活性酯/马来酰亚胺试剂SMCC或其磺化变体(磺化SMCC)来处理天然赖氨酸。然后通过Michael加成来引入硫醇功能化的连接子-有效载荷(图18)。或者，如果用硫醇部分适当官能化，则可以引入有效载荷自身，例如，DM1就是这种情况，已应用于多种ADC，最著名的是Kadcyla(T-DM1)、DEBIO-1562和Avid100。图18. 首先用SMCC试剂处理天然抗体，然后添加硫醇功能化的有效载荷，制备ADC参考文献1.Chemical Linkers in Antibody–Drug Conjugates (ADCs).2.Characterization of disulfide bond rebridged Fab–drug conjugates prepared using a dual maleimide pyrrolobenzodiazepine cytotoxic payload.3.Site-specific conjugation of native antibodies using engineered microbial transglutaminases.4.Structure and dynamics of a site-specific labeled Fc fragment with altered effector functions.