NJH-395

摘要：抗体-药物偶联物（ADCs）是一种快速发展的靶向生物治疗药物类别，目前结合了单克隆抗体的选择性和由细胞毒素组成的有效载荷的效力。多年来，微管靶向和DNA嵌入剂一直是ADC开发的核心。最近，两种基于拓扑异构酶1抑制剂的ADC——曲妥珠单抗德鲁替康（Enhertu®）和萨奎图珠单抗戈维替康（Trodelvy®）的批准和临床成功，展示了将非传统有效载荷与差异化作用机制结合的潜力。在未来ADC领域的发展中，有效载荷多样化预计将发挥关键作用，这一点从越来越多的临床前和临床阶段非传统有效载荷偶联ADC的数量中可以看出。本综述提供了一个全面的概述，涵盖了不同作用机制的经过验证的、被遗忘的和新开发的载荷。 1.引言 使用单克隆抗体作为治疗载体是Paul Ehrlich在“神奇子弹”概念中提出的假设。生物学和化学方面的显著进步导致了抗体-药物偶联物（ADCs）的开发，这是新一代的生物治疗药物，结合了抗体的高度特异性和小分子细胞毒素的效力，目的是在目标细胞内传递高度有效的有效载荷。这些武装化的抗体在某些情况下可以显著提高细胞毒素分子的治疗指数，并减少它们的非靶向毒性，这是传统细胞毒素化疗的主要问题。 抗癌ADCs由三部分组成：一种特异性识别目标细胞上抗原的单克隆抗体（mAb）、一种在释放时触发细胞死亡的有效小分子，以及连接这两个元素的链接器。 这些药物的复杂性解释了它们艰难的开发过程，最好的例子是gemtuzumab ozogamicin的混乱历史，它最初在2000年获得批准，在2010年从大多数市场撤出，然后在2017年被FDA重新批准。在mAb设计、目标选择、偶联技术、有效载荷选择和质量控制标准化方面的主要进步，使这个家族演变成了抗癌药物的成熟组成部分，目前有13种药物获得批准用于治疗癌症，其中7种是在过去三年中获得批准的。 鉴于有效载荷的效力，抗体必须对其目标高度选择性，并在偶联后保持其半衰期和生物学特性。抗体工程，如Fc（可结晶片段）沉默或Fc容量增强，是一种强大的工具，分别用于平衡由T细胞靶向引起的抗体非靶向毒性或增加抗体功能，如ADCC和ADCP，两种方法都已在治疗性mAbs的背景下证明其临床益处。在ADCs的背景下，假设Fc沉默将显著减少非靶向毒性。血小板减少症和中性粒细胞减少症是接受ADCs治疗的患者常见的不良反应，可能与血小板表面FcγRIIa受体的表达有关。MEDI4276，一种减少了FcγR结合的曲妥珠单抗艾美坦辛（T-DM1，Kadcyla®）的类似物，已在临床试验中进行了研究，旨在减少与T-DM1观察到的血小板减少症（NCT02576548）。令人惊讶的是，这种ADC在首次人体试验中显示出显著的毒性。相比之下，Fc容量增强已通过brentuximab vedotin（Blenrep®）的批准证明了其益处，其mAb是岩藻糖基化的。最近mAb衍生物的开发扩大了载体的可能性，同时旨在改善ADC载体的基本特性。较小的格式，如mAb片段（scFv、单链可变片段和Fabs、抗原结合片段），在这种情况下进行了探索（小格式药物偶联物），目的是增强实体肿瘤的穿透和细胞内化。然而，到目前为止，这些候选药物没有进入临床试验，因为它们被发现面临快速消除，可能因此无法提供比传统mAb格式的好处。相比之下，另一类基于自行车肽的小格式药物偶联物似乎满足了与mAb格式偶联物竞争的挑战，具有竞争性的摄取效率，正如目前正在进行的三个自行车肽偶联物的临床试验所说明的（NCT04561362、NCT04180371和NCT03486730）。 除了大小之外，其他重要参数影响这些大分子的药代动力学（PK）和循环半衰期，包括化学修饰，影响它们通过肾小管上皮细胞的保留，以及它们通过新生儿Fc受体（FcRn）的回收率。小格式偶联物可能受益于这些参数的调节。多价结合实体，如二价抗体或双特异性抗体，正在开发中，以提高抗原亲和力、选择性或内化，并可能构成有前途的载体。 最广泛应用的生物偶联方法使用赖氨酸侧链胺和半胱氨酸链间硫醇。然而，所得混合物的异质性一直是ADC失败的主要问题。其他偶联策略已经开发出来，包括通过特定或工程化氨基酸的位点特异性偶联，但迄今为止未能在临床试验中证明改善结果。Iladatuzumab vedotin（DCDS0780A），一种FDA批准的polatuzumab vedotin（Polivy®）的THIOMAB™版本，在临床试验中进行了探索，但由于在测试剂量下的过度眼部毒性而未能进入II期。这种THIOMAB™药物偶联技术展示了巨大的潜力，但两个mAbs之间的区别和/或在临床设计上，包括选定的剂量、适应症和患者群体，可能导致一个获得批准而另一个没有。在这种情况下，重要的是要强调不仅技术很重要。正在探索新的偶联策略，如糖链和短肽标签（酶辅助连接）或最近通过ADP-核糖环化酶，目的是生成均匀且物理稳定的ADCs。 连接子在抗体药物偶联物（ADC）设计中扮演着重要角色，因为它强烈影响着ADC的安全性、效力和活性。最重要的是，连接子需要在循环中保持稳定，以避免药物过早脱落，同时允许其在目标细胞内释放。根据其可切割性，已经开发并区分出两类连接子。可切割连接子要么对pH敏感，如腙连接子，要么对谷胱甘肽或二硫化物异构酶敏感，如二硫键连接子，要么对蛋白酶敏感，如二肽键对卡他普辛B。不可切割连接子依赖于抗体部分的溶酶体降解，从而至少保留一个氨基酸，通常是赖氨酸或半胱氨酸，连接到载荷-连接子复合物。这种方法提高了连接的稳定性，因为需要抗体消化才能释放载荷。虽然强调连接子越稳定，引起的非靶向毒性就越少，但这些技术通常发现过于严格，无法支持抗肿瘤活性。ADC的安全性仍然是其设计中的主要挑战，靶向和非靶向毒性不仅由连接子-载荷的不稳定性驱动。实际上，靶向毒性总是由单抗及其对目标的亲和力/亲和力驱动，以及载荷的作用机制，这再次说明了肿瘤类型、目标抗原和ADC结构匹配的重要性。最近对连接子设计改进的兴趣导致了亲水性连接子的开发，以平衡载荷的疏水性。硫酸盐、聚乙二醇（PEG）、多唾液酸（PSAR）或最近基于DNA的连接子显著提高了ADC的稳定性和药代动力学，导致毒性更低、活性更高的ADC。 药物-抗体比率（DAR）直到现在一直保持在四个以下，以避免单抗聚集并限制ADC的整体疏水性，这与毒性、缩短的半衰期和狭窄的治疗指数相关。因此，增加DAR更适合于疏水性较低或得到良好补偿的疏水载荷，如新型连接子技术所示，包括掩蔽实体或连接子亲水插入物，其效率直接决定了DAR增加的能力。恢复亲水性和裸mAb药代动力学特性以及高DAR显著增加了载荷对肿瘤的暴露。这些新的连接子技术使得开发比DNA插入或微管干扰剂更少效力的载荷成为可能，如两个基于拓扑异构酶1的ADC在DAR8处的结合所示，曲妥珠单抗deruxtecan（Enhertu®）和sacituzumab govitecan（Trodelvy®）。这些高度装载的ADC与非传统载荷也可能潜在地扩大ADC的治疗适应症，通过解决高或低目标表达水平的肿瘤，如基于DESTINY-Breast04结果最近批准的Enhertu®在HER2低表达肿瘤中所示。相反，在高效力载荷的背景下，到目前为止，较低的DAR更受欢迎，如最近批准的loncastuximab tesirine（Zynlonta®），一个DAR2的极强吡咯苯并二氮杂卓（PBDs）载荷。值得注意的是，与在临床试验中评估的曲妥珠单抗deruxtecan和类似物在DAR8处结合不同，datopotamab deruxtecan的DAR降低到4，以减少其目标驱动的毒性，这表明了ADC设计的多维性。 载荷（也称为弹头）发挥了ADC的细胞内细胞毒性活性。通过连接子部分共价结合到抗体的细胞毒素的性质非常重要，因为它的作用机制将决定ADC作为抗癌化合物的效力及其可能的适应症。第一代ADC结合了传统化疗药物（紫杉醇、蒽环类），因为载荷不够有效，只有一小部分总偶联物成功地在目标细胞内传递了它们的载荷。肿瘤穿透、细胞表面的靶标拷贝数以及ADC的内化和降解强烈影响细胞内游离载荷的浓度。因此，载荷必须在低浓度下具有高度效力，其50%抑制浓度（IC50s）在低至亚纳摩尔范围内。其他因素，如分子在血浆中的稳定性和在酸性条件下的稳定性、结合位点的可及性或溶解度至关重要。多年来，载荷基本上由两类组成：微管抑制剂，包括美登素和auristatins，以及DNA烷基化剂，如calicheamicins。这些载荷导致了八个ADC的批准（图1）。 图1 FDA对抗癌ADCs的批准。根据其有效载荷的性质对ADCs进行识别：微管破坏剂；DNA靶向剂：卡利奇霉素，吡咯并苯并二氮杂环（PBD），拓扑异构酶1（TOPO 1）抑制剂。 新型且更有效的DNA烷基化剂，如PBD单体和二聚体、indolino-benzodiazepines（IGNs）或cyclopropabenzindolone（CBI）单体和二聚体，IC50值在皮摩尔范围内，一直处于ADC设计的前沿。这些分子是有史以来合成的最强大的抗肿瘤化学物质之一，它们通过ADC结构特异性靶向肿瘤细胞以产生高度有效的“魔法子弹”进行了研究。然而，强烈的剂量限制毒性限制了它们的临床发展，目前只有loncastuximab tesirine在2021年获得了FDA批准（图1）。已经做出了努力，使载荷家族多样化，以获得具有原始作用机制的分子，包括几个不直接针对DNA或微管的分子。效力较低的分子从ADC结构的重大突破中受益，通过改进的连接子设计允许更高的DAR值、更稳定的载荷附着或增强的旁观者杀伤活性。最近和引人注目的成功是拓扑异构酶1（topo-1）抑制剂的开发，这代表了载荷选择的转折点，自2019年以来批准了两个基于topo-1抑制剂的ADC（图1），曲妥珠单抗deruxtecan（Enhertu®，DS-8201a）和sacituzumab govitecan（Trodelvy®）。最近的综述已经描述了ADC的验证和探索性治疗靶标的格局。这篇综述旨在描述ADC背景下验证的、被遗忘的和新开发的载荷的格局，具有多种作用机制，不包括微管抑制剂和DNA烷基化剂。 2.成功的载荷家族：拓扑异构酶1抑制剂 拓扑异构酶1抑制剂是FDA最近批准的抗体-药物偶联物载荷家族，最初由曲妥珠单抗deruxtecan推动，随后是sacituzumab govitecan（表1，图2A）。这些基于中等效力载荷的偶联物的最近发展得益于生产了DAR值为8的高负载ADC。 图2 拓扑异构酶I抑制剂基础的ADCs结构图。A FDA批准的ADCs和有效载荷（紫色）以及正在临床评估中的ADCs和有效载荷（蓝色）。B 用于临床前开发的拓扑异构酶1抑制剂（绿色）。C 作为ADCs潜在有效载荷的下一代拓扑异构酶I抑制剂。图中注释：[ADC名称]，抗体，有效载荷。 拓扑异构酶酶位于细胞核内。它们的作用是控制和修复在DNA开放、上游转录和复制过程中发生的DNA超螺旋和纠缠。这些催化酶切割、修复超螺旋并重新连接DNA链。拓扑异构酶根据它们的切割活性分为两个家族：拓扑异构酶I切割单链DNA，而拓扑异构酶II切割双链DNA。拓扑异构酶抑制剂特异性结合到DNA-拓扑异构酶复合物的界面，从而抑制拓扑异构酶修复机制，导致DNA损伤和随后的细胞凋亡。然而，最有效的拓扑异构酶抑制剂的效力比美登素或calicheamicin低100到1000倍，这解释了在最初的ADC设计中对这种载荷类别最初缺乏兴趣。 这种载荷类别包括基于喜树碱和非喜树碱的化合物。喜树碱（CPT）是一种由五个化学环组成的天然植物生物碱，其水溶性差（图2B）。几种衍生物已经获得监管机构的批准，具有改善的生物利用度，即拓扑替康、伊立替康和贝洛替康。这些药物已获得批准用于多种适应症，包括卵巢癌、肺癌、宫颈癌和结直肠癌。伊立替康的脂质体制剂也已获得批准用于治疗晚期胰腺癌。还合成了几种其他CPT衍生物，如gimatecan，目前正在II期评估中，用于治疗卵巢癌、输卵管癌或腹膜癌（NCT04846842）。基于CPT的分子最严重的不良事件（SAEs）包括严重水样腹泻、中性粒细胞减少和血小板减少。 由于其中等细胞毒性效力，CPT衍生物最近被用作ADC载荷，其IC50值在低纳摩尔范围内。它们的效力介于非常有效的（皮摩尔IC50s）抗微管/DNA靶向剂和最初用于最初的ADC项目的传统（微摩尔IC50s）化疗药物之间，后者因缺乏效力而失败（甲氨蝶呤和多柔比星）。到目前为止，有两种CPT衍生物已成功结合到抗体上并获得批准：DXd和伊立替康的活性代谢物SN-38（表1）。 2.1.Exatecan及其衍生物 DXd是exatecan（也称为DX8951f）的衍生物，与CPT相比，该化合物具有增强的活性和改善的溶解性，并且被描述为不是ABCC2或ABCG1的底物。未偶联的exatecan在几项临床试验中进行了评估，但由于其狭窄的治疗窗口，剂量限制性中性粒细胞减少和血小板减少以及强烈的胃肠道毒性，没有提高生存率。最初尝试将exatecan生物偶联到抗体上取得了部分成功，但偶联物出现显著聚集。这个问题通过第一三共制药科学家使用稍微修改的exatecan衍生物，名为DXd，得到了解决。发现这种新化合物保留了exatecan的效力，同时能够成功生物偶联多达8个DXd分子每个抗体，而没有显著的聚集。这种deruxtecan药物连接子在几个专有ADC项目中使用，例如DS-8201a（Enhertu®）、U3-1402和DS-6157a，以DAR8偶联，DS-1062a和DS-7300a以较低的DAR（4）偶联以限制它们的毒性[39]，它们要么已经获得FDA批准（DS-8201a），要么目前正在临床评估中（表1，图2A）。尽管DXd载荷展示了比exatecan甲磺酸盐更低的被动膜渗透性，但发现它较少骨髓毒性，因此也被选择用于其改善的安全概况。 曲妥珠单抗deruxtecan（DS-8201a或Enhertu®）由已获批准的靶向HER2的抗体曲妥珠单抗组成，通过一个基于马来酰亚胺的mc-GGFG-am蛋白酶可切割连接子连接到8个DXd载荷（图2A）。这种创新的DAR8 ADC在优化的连接子和载荷方面，与第一代ADC相比，在临床前展现了改善的治疗窗口。在两项大型3期研究（DESTINY-Breast03, NCT03529110, DESTINY-Gastric01, NCT03329690）之后，曲妥珠单抗deruxtecan已于2019年获得FDA批准用于治疗不可切除或转移性HER2+乳腺癌（BC），并于2021年获得批准用于治疗晚期或转移性HER2+胃癌或胃食管癌，2022年稍后用于治疗不可切除或转移性HER2+非小细胞肺癌（DESTINY-Lung02）。值得注意的是，曲妥珠单抗deruxtecan在曲妥珠单抗emtansine治疗后复发的乳腺癌患者中展现了强大的抗肿瘤活性，并在胃癌患者中显示出比伊立替康更强的活性，在非小细胞肺癌（NSCLC）和结直肠癌中显示出持久的抗癌活性。另一个ADC批准的突破是由其在DESTINY-Breast04试验中的临床评估所展示，该试验导致其在2022年获得批准用于治疗不可切除或转移性HER2低表达乳腺癌。目前还有几项其他临床试验正在进行中，包括DESTINY-breast05和DESTINY-breast09，分别评估Enhertu在新辅助疗法后残留疾病HER2+BC患者中的使用或与当前一线标准护理方案在HER2+BC中的对比，再次展示了其成功。其他四个含有这种有前景的连接子-载荷的ADC目前正在进行临床评估，用于治疗实体瘤，分别靶向NSCLC中的HER3、转移性结直肠癌和乳腺癌、TROP2在NSCLC和三阴性乳腺癌（TNBC）、B7-H3在晚期实体瘤或GPR20在胃肠道间质瘤（GIST）中（表1）。 最近，由于开发了能够绕过化合物的疏水性和促聚集特性的亲水性可切割连接子结构，exatecan（图2B）已经在临床前作为潜在的ADC载荷进行了探索。这允许在不干扰ADC药代动力学特性的情况下以高DAR值偶联exatecan（表1）。这些ADC在肿瘤异种移植物中展现了强大的抗肿瘤活性，并由于与DXd相比exatecan改善的被动细胞渗透性，与基于deruxtecan的ADC相比显示出更强的旁观者杀伤效应。目前正在开发两种使用这种药物连接子策略的ADC：PRO1184和PRO1160，分别含有亲水性exatecan基连接子，以DAR8偶联到抗FRa和抗CD70抗体，并预计将于2023年进入临床试验。最近的体内研究还表明，exatecan不需要呋喃环功能就能发挥其抗肿瘤活性，从而扩大了该分子的功能化可能性，以生成可连接的衍生物（表1）。使用这种策略开发的最有前途的ADC（mAbE-21a，衍生物11，DAR7.5）在EGFR+模型中以0.25 mg/kg剂量展现了显著的抗肿瘤活性，完全缓解。 今年披露了一种新型专有exatecan衍生物AZ’0132，正在作为ADC AZD8205的载荷进行研究，靶向B7-H4（表1，图2A）。AZD8205目前正在进行I/II期研究，用于治疗乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌以及胆管癌（NCT05123482）。 2.2.伊立替康 伊立替康已获得FDA批准用于治疗各种实体瘤，如胃肠道恶性肿瘤、胶质母细胞瘤和宫颈癌，是拓扑异构酶1抑制剂SN-38的前药。SN-38水溶性差，会引起严重的毒性，包括强烈的骨髓抑制和高级别腹泻。因此，开发了伊立替康以改善生物利用度并获得可接受的治疗指数。IMMU-132（Trodelvy®）是一种抗TROP2抗体，与基于SN-38的药物连接子偶联（表1，图2A）。这种ADC已于2020年获得FDA批准用于治疗三阴性转移性乳腺癌和转移性尿路上皮癌，目前正在进行临床试验，用于治疗HR+/HER2-、前列腺和子宫内膜癌（NCT03725761和NCT04251416）。其他ADC也已开发出这种基于SN-38的连接子，包括IMMU-130（labetuzumab govitecan）[84–86]和IMMU-140，分别靶向CEACAM5和HLA-DR（表1）。Labetuzumab govitecan在I期（NCT01270698）中展现了可接受的毒性和活性，然而，II期评估在2020年因未公开原因终止（NCT01915472）。IMMU-140针对HLA-DR，在血液病和黑色素瘤中展现了有希望的临床前活性。SN-38载荷也在临床前评估中针对各种液体肿瘤（表1）。据我们所知，尽管临床前结果有希望，但这些ADC中没有一个进入临床试验，最近的相关出版物超过七年前。最近，为了治疗自身免疫疾病，绕过激素抵抗，开发了一种A7R-SN-38 ADC（表1）。 2.3.Belotecan衍生物 另一种拓扑异构酶1抑制剂KL610023，是FDA批准的分子belotecan的衍生物，正在作为ADC载荷进行研究。这种拓扑异构酶I抑制剂被开发用于生成抗TROP2 ADC（SKB-264），目前正在进行I/II期临床试验（NCT04152499）治疗各种实体瘤的患者（表1，图2A）。 2.4.其他拓扑异构酶1抑制剂 作为ADC载荷的喜树碱衍生物的一个限制是分子内缺乏可连接的化学胺基团。为了在不改变其抗肿瘤性质的情况下在载荷内插入可连接的功能，已经合成了其他CPT衍生物（表1）。在这些衍生物中，cAC10的临床前研究，一种抗CD30抗体偶联到8个AMDCPT分子，显示出非常有希望的结果（图2B）。最近开发了几种非喜树碱衍生物，包括吲哚异喹啉、二苯萘吡啶酮和氟吲哚异喹啉（图2C）。这些分子显示出与CPT衍生物相比具有几个优点，包括更高的细胞毒性、改善的稳定性或延长的活性，并且目前正在作为小分子进行早期临床试验。LMP-517，与氟吲哚异喹啉偶联，正在被研究；然而，据我们所知，还没有数据被披露。 3.已经进入临床试验的载荷：承诺和失败 虽然拓扑异构酶1抑制剂深刻地改变了ADC载荷格局，但其他几个药物已经在临床试验中进行了评估。表2总结了在患者中评估的原始载荷。主要类别包括拓扑异构酶2抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、Bcl-xL抑制剂和免疫刺激剂。此外，糖皮质激素现在作为超出肿瘤学适应症的ADC载荷出现了。 3.1.拓扑异构酶2抑制剂 拓扑异构酶2抑制剂在血液病恶性肿瘤和实体瘤的抗癌治疗中广泛使用。它们的机制复杂，可能不仅涉及直接抑制拓扑异构酶2活性，还包括DNA插入、ROS诱导和线粒体破坏。它们的毒性谱包括骨髓抑制、胃肠道毒性，在某些情况下还有高级别心脏毒性。多柔比星作为治疗乳腺癌、膀胱癌和甲状腺癌以及淋巴瘤和多发性骨髓瘤的一线治疗已经使用了几十年。多柔比星也是ADC开发中使用的第一批载荷之一，当时常规化疗小分子首次被偶联。第一个含有拓扑异构酶2抑制剂的ADC（SGN-15, BMS-182248）由多柔比星偶联到靶向Le-Y抗原的小鼠BR-96抗体（表2，图3）。SGN-15是在ADC发现的最初阶段与KS1/4-甲氨蝶呤（表2）一起在20世纪80年代开发的，用于治疗前列腺癌、乳腺癌和NSCLC。它的I期临床试验显示了可接受的耐受性，然而II期由于连接子不稳定和Le-Y靶标在正常组织中的表达导致了非靶向毒性。因此，ADC在可接受的剂量下缺乏效力。已经批准的化疗药物偶联观察到的令人失望的结果形成了共识，即ADC载荷应该比常规化疗药物更强效。这导致了第二代ADC的开发，它们被偶联到更强效的载荷上，如微管抑制剂和DNA损伤剂。 图3 展示了已经进入临床试验的抗体-药物偶联物的结构以及它们有效载荷（蓝色）的分类，这些有效载荷根据它们的作用机制进行了分类。图中注释：[ADC名称]，抗体，有效载荷。 尽管早期开发不尽人意，多柔比星后来被偶联到靶向CD74的抗体milatuzumab（IMMU-110）用于治疗多发性骨髓瘤（表2，图3）。这种ADC被带到临床试验中，但显示出令人失望的效力，其开发在2013年被终止（NCT01101594）。此外，多柔比星还被用作ADC载荷在临床前连接子概念验证研究中（表3），它被偶联到一个新的可切割连接子（NEBI）或一个不可切割连接子（SMAC）。SMAC研究的结果表明，不可切割连接子对于基于多柔比星的ADC开发可能过于严格，因为没有观察到细胞毒性。 鉴于多柔比星作为ADC载荷的效力不足，另一种蒽环类药物PNU-159682，其细胞毒性是多柔比星的100倍，后来被探索。除了比其他拓扑异构酶2抑制剂更强效外，PNU-159682不是efux泵的底物。被发现是efux泵底物的载荷是ADC开发中的限制因素。2020年，一种基于PNU-159682的新型ADC，NBE-002（表2，图3），针对ROR1，进入I/II期临床试验（NCT04441099）。有趣的是，NBE-002诱导了长期免疫保护，这表明它可以成功地与免疫检查点抑制剂（ICIs）结合。SOT102（前称SO-N102）是另一种有前景的基于PNU-159682的ADC，靶向CLDN18.2（表2，图3）。SOT102在低表达肿瘤中展示了大的治疗窗口，并已于2022年4月进入I期临床试验（EudraCT编号2021-005,873-25）。PNU-159682的许多临床前用途也被报道，结果证明了它能够绕过常用载荷如MMAE或DM1的抗性机制（表3）[110, 111, 114–118]。PNU-159682载荷还与MMAE一起偶联形成双药ADC（表3）。然而，尽管体外同时观察到了两种作用机制，但没有观察到协同作用。 在20世纪90年代的临床前阶段也开发了柔红霉素和伊达比星的偶联物（表3，图4），但显示出降低的效力。一种抗HER2 afbody-idarubicin偶联物最近在体外进行了评估，具有特异性针对HER2阳性头颈鳞状细胞癌（HNSCC）细胞而不是HER2阳性BC细胞（表3）。 图4 非传统ADC有效载荷的化学结构图，这些有效载荷处于临床前阶段。 3.2.转录抑制剂 转录在细胞发展、活动和增殖中具有基本作用，因此可以构成ADC载荷的一个创新和原始靶标。转录由RNA聚合酶II（RNApolII）调节，它直接与DNA结合，并涉及转录因子，这些因子与RNApolII形成复合体以启动转录（如TFIIH）和共同调节因子（如组蛋白去乙酰化酶，HDAC），这些因子介导染色质结构和可及性。尽管一些HDAC抑制剂已经获得批准，但由于耐受性差，目前还没有批准的RNApolII抑制剂。 毒蝇伞素是从毒蝇伞蘑菇中提取的天然且高效的RNApolII抑制剂。α-毒蝇伞肽和β-毒蝇伞肽连同其他七种大环衍生物构成了毒蝇伞素家族。尽管它们作为实验室试剂广泛用于探索转录机制，但α-毒蝇伞肽被证明毒性太大，特别是对肝脏，以至于不能作为抗癌药物进一步开发。然而，这种分子作为潜在ADC载荷具有许多优点，包括其原始的细胞内靶标、其有利的物理化学性质（包括亲水性）、其对efux泵的不敏感性，以及其在静止癌细胞中产生细胞毒性的能力。相比之下，毒蝇伞肽的亲水性预计将阻止通过旁观者效应杀死邻近细胞，这可能限制其在均匀分布的靶标中的使用。即使在这些情况下，完全缺乏旁观者效应可能导致由于患者之间的靶标分布不同而导致效力不足。 毒蝇伞肽衍生物β-毒蝇伞肽最早在1973年与白蛋白偶联，这种ADC前体证明了选择性杀死巨噬细胞（表3）。后来，这个衍生物被偶联到抗MUC1和抗PSMA抗体上，在临床前模型中展示了强大的选择性细胞毒性（表3）。它的类似物α-毒蝇伞肽及其衍生物偶氮-毒蝇伞肽也很早就被用作ADC载荷（表3）。偶氮-毒蝇伞肽-ADC比未偶联的分子显示出大约500倍的细胞毒性。这可以通过分子的亲水性来解释，这种亲水性降低了细胞膜的渗透性，同时作为ADC结构被有效内化。截至2021年5月，第一个毒蝇伞肽-抗体偶联物（ATAC®）候选药物HDP-101已经进入早期临床试验（表2，图3）。HDP-101是一个针对BCMA的ADC，目前正在评估用于治疗多发性骨髓瘤和浆细胞疾病的患者（NCT04879043）。ATAC最近被描述为免疫激活药物。它们被发现可以诱导免疫原性细胞死亡（ICD），并与ICI表现出协同作用，这为临床环境中的组合可能性开辟了新的视野。值得注意的是，针对其他靶标的一些α-毒蝇伞肽ADC（EpCam、HER2、PSMA、CD19）在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性（表3）。α-毒蝇伞肽还作为双弹头与MMAE偶联（表3）。这种DAR 1+1 ADC靶向FGFR1，在体外显示出强大的细胞毒性。其他高效的RNApolII抑制剂在20世纪90年代被偶联，如鬼笔环肽，以及霉菌毒素三烯醇、疣状菌素A和roridin A（表3，图4）。考虑到自90年代以来ADC设计的进步，以及这些化合物在各种细胞系中的纳摩尔细胞毒性，这些分子可能在未来几年成为进一步探索的对象。 另一种阻止DNA转录的策略是抑制转录因子（TFs）。TFs对RNApolII附着在DNA上的启动步骤至关重要。TF抑制剂（TFi）已经证明它们在临床试验中具有抗肿瘤活性，其中水溶性前药minnelide目前正在II期评估中（NCT04896073）。雷公藤内酯，一种来自被称为“雷公藤”的中草药的天然化合物，具有高度的细胞毒性，但也具有疏水性，具有较差的生物利用度和高毒性（图4）。因此，正在努力开发具有更好药物化学特性的类似物。另一种策略是将这种分子偶联到靶向实体上，从而绕过这些问题。雷公藤内酯最近首次被偶联到抗CD26抗体上，以靶向间皮瘤和淋巴瘤（表3）。这种不可切割的ADC在目标细胞中有效地停止了mRNA合成，并在体外和体内展示了有希望的抗肿瘤活性。还开发了一种针对EGFR阳性肺癌的cetuximab-triptolide ADC（表3）。这种ADC对EGFR过表达模型具有选择性，并比未偶联的雷公藤内酯具有更低的毒性。Cetuximab-triptolide有效地诱导了转录抑制，在体外和体内都具有强大的抗肿瘤活性。还评估了针对HER2的雷公藤内酯ADC，并取得了类似的结果。然而，对于每种基于雷公藤内酯的ADC，都需要高剂量才能在异种移植模型中观察到抗肿瘤活性，这些论文中没有报告最大耐受剂量，从而质疑了治疗指数的宽度。 组蛋白去乙酰化酶（HDACs）影响转录因子，因此参与包括转录在内的各种细胞过程。它们被发现在癌细胞中过度表达或过度激活，并被认为参与增加增殖、迁移和侵袭。Vorinostat和dacinostat是FDA批准的两个HDAC抑制剂（HDACi）的例子。然而，这些分子呈现出强烈的系统性副作用风险，如血小板减少和胃肠道毒性，以及较差的药代动力学（PK）特性。自2018年以来，它们已经在ADC设计中进行了研究：ST74612AA1是第一个生物偶联的HDAC抑制剂（表3，图4）。这种相对无毒的分子是第二代泛HDACi。这种分子被偶联到cetuximab和trastuzumab上，两种ADC都比未偶联的HDACi具有更安全的特性，同时在细胞系衍生的异种移植（CDX）和患者衍生的异种移植（PDX）模型中都具有活性。然而，正如观察到的基于TFi的ADC一样，异种移植模型接受了30 mg/kg的高剂量治疗。2020年，vorinostat和dacinostat也被偶联到cetuximab和trastuzumab上，在体外具有有趣的抗增殖活性（表3，图4）。 3.3.Bcl-xL抑制剂 Bcl-2家族成员可能是促凋亡蛋白（Bad、Bim、PUMA、Bik、Bak等）或抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1等）。在癌细胞中，这些蛋白之间的平衡通常倾向于生存，使得抗凋亡蛋白成为创新ADC载荷的有趣和原始靶标。 根据它们的化学功能骨架，Bcl-xL和Bcl-2抑制剂被分类为4大家族：N-酰磺胺类（navitoclax、venetoclax）、吲哚类（obatoclax）、棉酚乙酸（AT-101、sabutoclax）和苯并噻唑腙类（如WEHI-539）。Bcl-xL的抑制与严重的血小板减少有关，这证明了寻找高度特异性Bcl-2抑制剂的合理性，如venetoclax。目前venetoclax已获批准用于慢性淋巴细胞白血病的一个亚组患者和急性髓系白血病。 ABBV-155（mirzotamab clezutoclax）是一种抗B7-H3抗体，与Bcl-xL抑制剂clezutoclax偶联（表2，图3）。这种创新ADC于2018年进入正在进行的I/II期临床试验，作为单一药物用于晚期实体瘤的治疗，以及与紫杉醇联合用于晚期非小细胞肺癌和乳腺癌患者（NCT03595059）。在单一药物I期队列中包含的前31名患者中没有报告剂量限制毒性，SAEs包括贫血、淋巴细胞计数下降、疲劳和腹泻。在紫杉醇组合臂中观察到21%的患者部分缓解。 3.4.酪氨酸激酶抑制剂 人类激酶组包含超过500个激酶，其中150多个与各种疾病相关，包括癌症。蛋白激酶是催化磷酸化的酶，分为3类：丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸激酶。目前正在临床试验中研究的小分子中超过四分之一是蛋白激酶抑制剂，超过30个FDA批准的癌症治疗分子是激酶抑制剂。在癌症中，各种激酶家族参与细胞周期进展、细胞增殖、运动和血管生成。自2001年首个激酶抑制剂伊马替尼获批以来，激酶抑制剂被分为5类：I型和II型是ATP竞争性，分别针对激酶的活性或非活性形式；III型结合ATP的变构口袋；IV型结合激酶的变构口袋，V型结合多种结合模式。 虽然在癌症治疗中被广泛探索，但蛋白激酶抑制剂作为ADC载荷并未被广泛探索，可能是因为它们的效力较低。抗CD19抗体B43已与染料木素（一种含有大豆异黄酮的植物雌激素）偶联，发现它通过抑制表皮生长因子受体（EGFR），一种酪氨酸激酶受体，诱导凋亡和细胞增殖抑制（表2，图3）。体外和体内的临床前研究（小鼠、大鼠、非人灵长类：NHP）表明在100 mg/kg的累积剂量下没有毒性，并且在小鼠模型中比标准化疗具有更强的抗肿瘤效果。这些有希望的结果导致了它在1999年首次用于治疗ALL和NHL的人体研究。除了在人类中呈现有利的药代动力学特性外，没有报告毒性和有希望的抗肿瘤活性。不幸的是，这种化合物的状态此后没有进一步报告（NCT00004858）。另外两项研究调查了染料木素偶联到抗EGFR或17.1A mAb的抗肿瘤活性，后者针对上皮膜抗原（表3）。抗EGFR-染料木素ADC在高达140 mg/kg的剂量下显示出良好的耐受性，在临床前模型中1 mg/kg时显著的抗肿瘤活性。17.1A-染料木素被发现比未偶联的染料木素在结肠癌模型中更活跃。 最近，另外三种激酶抑制剂被评估为ADC载荷。这些分子包括neolymphostin（一种PIKK抑制剂），dasatinib和staurosporine，两种多激酶抑制剂（表3，图4）。Trastuzumab neolymphostin展示了选择性和体外细胞毒性，尽管比其他常用的基于trastuzumab的ADC效力较低。一种与dasatinib偶联的抗CXCR4 mAb选择性地将dasatinib输送到目标T细胞，并展示了强大的免疫抑制效果。最后，广泛使用的实验室试剂和多激酶抑制剂staurosporine被偶联到cetuximab，用于治疗KRAS/BRAS突变的结肠癌细胞。总的来说，酪氨酸激酶抑制剂在ADC格式中的效力有限，这个家族可能不会在更高级的设置中成功。 3.5.免疫刺激抗体偶联物 免疫刺激抗体偶联物是一类新的抗体-药物偶联物，目前有2个ADC正在进行临床试验（表2，图3）（NJH395，BDC-1001），另一个SBT6050，由于赞助商的战略决策，其临床评估已被终止（NCT05091528）。STING激动剂和TLR激动剂构成了两类主要的偶联免疫刺激剂。 针对适应性免疫系统的免疫检查点抑制剂的成功极大地增强了利用先天免疫系统刺激的努力。然而，最有力的剂如STING和TLR激动剂的系统性给药与严重的系统毒性相关，由细胞因子释放综合征引起，从而将当前研究限制在肿瘤内注射。它们与蛋白质或mAbs的偶联因此是利用它们强大的抗肿瘤潜力同时改善耐受性配置文件的有希望的手段。 几种含有TLR激动剂的免疫刺激ADC目前正在临床环境中进行评估。NJH395，结合了一个小分子TLR7/8激动剂和抗HER2 mAb，是第一个达到临床评估的（表2，图3）。在18名非乳腺癌HER2+恶性肿瘤患者的I期临床试验（NCT03696771）中，发现严重的毒性，包括细胞因子释放综合征和淋巴细胞耗竭，没有显著的抗肿瘤活性。同样，BDC-1001，一种由抗HER2抗体与TLR7/8激动剂偶联的免疫刺激偶联物，目前正在进行I/II期评估，作为单一药物或与nivolumab联合用于治疗实体HER2+肿瘤的患者（NCT04278144，表2，图3）。它的临床前评估显示了强大和持久的免疫介导的抗肿瘤效力，并且临床评估显示出有希望的结果，包括在测试剂量下没有毒性和临床活性的证据。上述TLR7/8类似物也被偶联到抗PD-L1抗体，旨在结合免疫检查点抑制、抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）和肿瘤内髓系重编程。这种免疫刺激ADC在临床前模型中优于抗PD-L1的抗肿瘤活性。SBT6050是一种pertuzumab-TLR8激动剂偶联物，目前正在作为单一药物以及与抗PD1抑制剂（NCT04460456）和与trastuzumab deruxtecan联合用于治疗HER2阳性实体癌（NCT05091528）进行评估。Pertuzumab不与trastuzumab结合相同的HER2表位，研究表明trastuzumab和SBT6050之间存在协同潜力。 已经报告了其他免疫刺激ADC的有希望的临床前结果，它们分别与UC-1V150、CL264或T785 TLR 7/8激动剂偶联（表3，图4）。最近披露了一种与TLR7/8激动剂D18偶联的抗PD-L1，其中包括在B16黑色素瘤模型中具有强大的抗肿瘤活性，该模型对PD1有抗性（表3，图4）。最近，作为一种免疫刺激ADC载荷，研究了一种更具选择性的激动剂，即TLR7激动剂。另一类新兴的免疫刺激剂载荷是STING激动剂。TAK-500是第一个进入临床试验的STING激动剂免疫激活ADC，目前正在招募患者（NCT05070247）。这种针对CCR2的ADC（TAK-676）正在评估用于治疗实体瘤（表2，图3）。此外，还有三种STING偶联的ADC正在进行临床前阶段的开发：CDR-550、XMT-2056和最近一种针对FcγR的免疫刺激ADC，与STING激动剂XMT-1621偶联（表3）。最先进的XMT-2056（STING激动剂：XMT-1621，图4）在小鼠异种移植中以1 mg/kg剂量导致肿瘤完全缓解，并在非人灵长类中耐受，没有临床迹象或不良组织病理学发现，并且与ICI显示出协同活性。这种有希望的ADC应该在2022年进入首次人体研究的临床试验。 4.在临床前阶段的非传统载荷 由于肿瘤细胞具有增加的合成活性，几种载荷候选物已经针对蛋白质合成的各个步骤进行了靶向，包括转录、剪接和翻译抑制剂以及蛋白质分解。另一种方法是针对在肿瘤细胞中过度活跃的其他普遍存在的细胞过程。然而，只有经过精心设计的ADC才能支持这类载荷，因为即使肿瘤中的ADC浓度高于周围组织，大多数静脉注射的化合物并没有定位到肿瘤。 4.1.HSP90抑制剂 HSP90（热休克蛋白90）是一种主要的分子伴侣蛋白，已被证明在多种肿瘤中异常表达。已经开发并测试了几种源自格尔德霉素（GA，图4）骨架的HSP90抑制剂在临床环境中。抑制剂与HSP90结合后，阻止其保护其客户蛋白免受蛋白酶体降解的能力。迄今为止发现的主要限制是显著的剂量限制毒性和不良的药代动力学特性。在21世纪初，人们努力化学修饰GA，合成了一种适合生物偶联的马来酰亚胺可切割药物连接子（表3）。结果产生的trastuzumab-GA ADC与用trastuzumab治疗的小鼠相比，提高了荷瘤小鼠的整体生存率。Streptonigrin和17-aminogeldanamycin被用于在DAR4处产生抗CD70和抗CD30可切割ADC，并在临床前模型中被发现活性（表3）。GA在载荷领域中的最近复苏重新定位了这种分子，通过生成一种HER2 scFv HBD/GA ADC，在HER2阳性肺癌临床前模型中展示了抗肿瘤活性（表3）。 4.2.剪接抑制剂 转录后，前mRNA通过剪接体去除内含子，加工成成熟的mRNA。snRNPs（小核糖核蛋白）U1、2、4、5和6构成了剪接体的主要snRNPs。这些复合体对成熟mRNA的生成至关重要，并且在癌细胞中通常被调节异常。靶向U2的SF3B1亚基已被证明可以有效地抑制剪接。已经发现几种药物是有效的剪接抑制剂，包括pladienolides、spliceostatins和thailanstatins。然而，这些高度细胞毒性分子的IC50s在纳摩尔范围内，由于化学不稳定性而没有进一步开发。E7107，一种pladienolide类似物，在临床试验中进行了评估（NCT00499499），但由于安全问题，特别是严重的眼部毒性，已停止使用。Tailanstatin A-trastuzumab偶联物在临床前模型中显示出高度活性，某些体内模型中的效力大于T-DM1（表3，图4）。 4.3.翻译抑制剂 开发可耐受的翻译抑制剂已被证明是具有挑战性的，因为翻译在健康组织中的普遍重要性。Omacetaxine（之前指定为homo-harringtonine）是第一个获得FDA批准的翻译抑制剂，它干扰蛋白质合成的初始延伸步骤。已经开发了其他几种翻译抑制剂用于治疗各种癌症，靶向核糖体、EIFs（真核生物翻译启动因子）或mTOR。迄今为止，只有pymberin被用作潜在的ADC载荷（表3，图4）。Pymberin，也称为irciniastatin A，是一种从海绵中分离出的天然碳水化合物。它通过β-葡萄糖醛酸苷连接子与抗CD30和抗CD70抗体偶联，在体外展示了选择性和抗增殖活性，IC50s在亚纳摩尔范围内。 4.4.蛋白酶体抑制剂 蛋白酶体抑制剂是一种极其有效的抗癌剂。Bortezomib在2003年被批准用于治疗多发性骨髓瘤患者，从那时起显著改善了患者的预后。已经开发出几种其他抑制剂，具有减少神经毒性和/或允许口服给药的特点。环氧酮衍生物，如卡马霉素B类似物，强烈抑制20S蛋白酶体，已被结合到曲妥珠单抗上（表3，图4）。尽管未结合的有效载荷在体外细胞毒性方面令人满意，但相应的ADC（抗体药物偶联物）证明比基于MMAE的ADC效力要低。 4.5.PROTACS 靶向蛋白降解的嵌合分子（PROTACs）是双功能分子，它们将E3连接酶与目标蛋白结合在一起，从而允许其泛素化并通过蛋白酶体降解。PROTACs不是直接抑制其目标蛋白，而是触发其降解，具有几个潜在的临床优势，如延长效果、催化活性，因此具有非常强的细胞毒性。降解剂-抗体偶联物（DACs）构成了ADC领域中一个令人兴奋的新兴家族。在DAC设计中，PROTACs可以从被mAb（单克隆抗体）内部运输到细胞中获益，以克服它们有限的细胞渗透性。当前DACs的构建、生物活性和挑战已在最近的综述中报道。BRD4/BET降解剂GNE-987被结合到抗CLL1抗体上，导致恢复了药代动力学特性，并在小鼠异种移植中显示出强大的体内活性（表3，图4）。MZI类似物结合到曲妥珠单抗或抗STEAP1抗体也被评估了体外，证明了选择性BRD4降解和细胞毒性（表3，图4）。其他包含VHL或CRBN配体的BRD4降解剂-抗体偶联物最近也被生成了（表3，图4）。同样，雌激素受体（ER）、TGFbR2和BRM降解剂正在作为DAC有效载荷进行研究，通过结合到抗HER2、抗B7-H4和/或抗CD22抗体（表3，图4）。ORM-5029，最新披露的DAC或抗体新降解剂偶联物（AnDC™），旨在通过Pertuzumab将GSPT1降解剂（Smol006）输送到HER2表达细胞。这种AnDC™显示出比其他GSPT1降解剂更强的细胞毒性和与DS-8201a相当的抗肿瘤活性。ORM-5029的毒性目前正在研究中，结果将构成关于DACs治疗窗口的首次报告。 4.6.其他分子 有效载荷多样化的努力导致了最近非传统抗体-药物偶联物的临床前开发，这些偶联物提供具有独特作用机制的有效载荷。通过靶向烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂（NAMPTs）改变细胞代谢构成了一种新颖而原创的ADC技术。FK-866类似物被结合到抗CD30抗体上，随后的ADC在体外和体内选择性地耗尽了NAD（表3，图4）。CD30-NAMPTi在L540cy模型中以3 mg/kg剂量显示了有希望的体内抗肿瘤活性，实现了完全缓解。在大鼠中，以100 mg/kg以上的MTD（最大耐受剂量）勾勒出了有利的治疗指数。其他NAMPTis也被合成并结合到针对c-Kit的mAb。尽管在体外具有选择性和强大的细胞毒性（亚纳摩尔IC50s），这些不可切割的ADC在体内活性中等，仅在20 mg/kg剂量下实现了部分反应。 KSP（动力蛋白纺锤体蛋白）抑制剂，也称为Eg5抑制剂，构成了一个新兴的ADC有效载荷家族。Eg5是抗肿瘤治疗的一个有希望的靶点，因为它的表达仅限于增殖细胞，并且不在神经系统细胞中表达。因此，这些有效载荷不应该呈现与微管靶向剂相关的经典神经系统副作用。KSP抑制防止了细胞分裂期间的中心体分离，从而导致有丝分裂停滞。KSP抑制剂衍生物，具有亚纳摩尔效力，被结合到HER2和TWEAKR/Fn14靶向抗体（表3，图4）。TWEAKR-KSPi ADC在尿路上皮PDX中实现了完全缓解，而小分子KSP抑制剂ispinesib仅在这个模型中延缓了肿瘤生长。通过与flanesib结合，也生产了ADC，具有可接受的PK特性和良好的体内效力。 5.结论 抗体-药物偶联物已成为治疗日益增多的癌症指征的重要组分，并且正在进行数百项临床试验以探索新的靶点和指征。ADC领域取得的惊人进展主要得益于将它们的设计量身定制到特定靶点上。这得益于几项成就，包括（1）对越来越多靶点的探索和验证，（2）专为ADC设计而进行的mAbs（单克隆抗体）的适当筛选，重点关注交叉反应性、pH变化帮助下的优先肿瘤结合、降低到低纳摩尔范围的亲和力以避免粘性并促进内化和FcRn循环，（3）结合技术的进步，使药物-抗体比率更高，和/或恢复裸mAb样的药代动力学特性，以及（4）有效载荷的多样化（如图5所示），正如最近通过拓扑异构酶1抑制剂取得的突破所例证。 图5 展示了ADC有效载荷的靶标景观图，这些靶标超出了微管和DNA插入剂的范围。注释：FDA批准的ADCs，正在进行临床试验的ADCs。 在未来的发展中，具有原创作用机制的有效载荷的持续多样化预计将发挥关键作用。在晚期疾病中，通常通过结合具有互补作用机制的药剂来实现治愈，并且尽可能地结合非冗余的毒性。虽然目前批准的ADC拥有与传统化疗药剂相似的作用机制，但未来的有效载荷可能会针对迄今为止因毒性过大而难以处理的关键细胞现象。正如以前观察到的，与可切割链接物结合的auristatins和maytansinoids，topo-1 ADCs的旁观者效应已经证明了其对低或异质性肿瘤治疗的有效性，并且应该在后续开发中越来越受到关注。这些新型有效载荷的另一个主要优势可能在于它们能够针对静止的肿瘤细胞，这些细胞构成了患者肿瘤储备的大部分。此外，在新兴的有效载荷家族中，目前与严重副作用相关的几种激酶抑制剂将从更大的治疗指数中受益。就PROTACs而言，它们受益于亚化学计量活性，理论上可以降低细胞毒性的有效载荷阈值。 有效载荷的多样化也预示着ADC治疗武器库向尚未从靶向治疗中受益的其他癌症的开放。Sacituzumab govitecan导致TROP2在TNBC中的验证，而正在进行临床评估的基于SN-38的ADC突出了在ADC领域中代表性不足的癌症类型中的新靶点的潜力（HER3、CEACAM5、B7-H3和GPR20）。有趣的是，针对TNBC的临床试验展示了越来越多的包含原创有效载荷的抗体-药物偶联物，包括Dxd、PNU-159682和SN-38。 正如我们在这篇综述中所描述的，已经确定了几个潜在的有效载荷，并且许多已经显示出有希望的临床前结果。其中一些化合物已经进入临床试验，但由于毒性特征不满意而没有继续进行。在这方面，应该强调的是，主要的技术进步，特别是安全获取高药物-抗体比率的ADC的可能性，支持这样一个事实，即许多在ADC生产和表征不够理想的时候探索的有效载荷应该用目前可用的技术重新考虑。 整合原创有效载荷的新ADC格式，如双重有效载荷（表3）、治疗诊断和非内化偶联物，在最近的临床前研究中显示出巨大潜力，可能构成ADC研究中不断增长的领域。非内化ADC将特别受益于具有强烈旁观者杀伤效应或针对细胞外或基质靶点的新型有效载荷，正如基于PNU-159682的ADC针对tenascin-C、基质金属蛋白酶细胞外蛋白的抑制或最近的碳酸酐酶抑制（表3）。有趣的是，ADC技术也在非肿瘤学指征中被探索。两种原创ADC（ABBV-3373和ABBV-154），含有糖皮质激素受体调节剂（GRM），正在临床评估用于治疗类风湿性关节炎和克罗恩病（表2, NCT03823391, NCT04888585, NCT05068284和NCT04972968）。其他免疫学ADC有效载荷正在临床前环境中进行研究，并可能构成ADC设计中的新兴类别。此外，一种在临床前评估中显示出有希望结果的A-利福霉素衍生物，已经在患有金黄色葡萄球菌菌血症的患者中进行了1期临床试验（NCT03162250）。非细胞毒性有效载荷也进入了有效载荷领域，例如通过将肝X受体（LXR）激动剂结合到抗CD11b抗体来针对脂质代谢的细胞内靶向，用于治疗动脉粥样硬化（表3）。 尽管符合条件的疾病范围扩大了，但开发这些新型有效载荷的一个关键问题将是减轻它们的副作用。目前批准的ADC已经显示出它们与预期的（骨髓抑制、神经毒性）或意外的（如眼部或肺部）毒性相关。因此，获得令人满意的治疗指数将是未来创新ADC有效载荷发展的基本属性。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：抗体-药物偶联物（ADCs）为癌症患者提供了新的治疗选择和显著的希望，特别是在现有治疗有限的情况下。全球范围内正在进行大量的ADC开发工作，目前已有13种ADC获得批准，还有更多的ADC正在开发中。ADCs的治疗优势在于它们能够通过抗体结合选择性地靶向癌细胞，相对保留非恶性组织，并实现细胞毒性有效载荷的靶向传递。因此，这类药物已经在多种对标准治疗选择有抵抗性的恶性肿瘤中显示出活性。尽管如此，仍然存在一些限制，包括狭窄的治疗窗口、独特的毒性特征、治疗抗性的发展以及适当的生物标志物选择。本综述将描述ADCs的开发、它们的作用机制、关键试验、批准的适应症，并识别共同的主题。本文将讨论这类药物在癌症治疗中的当前挑战和机遇，这是一个在抗体疗法、免疫疗法和靶向药物方面正在发生重大发展的时期。 1.引言 寻找定向有效的细胞毒素治疗一直是癌症治疗的圣杯，自一个多世纪前被假设为癌症治疗方法以来。尽管如此，半个多世纪以来，直到今天，化疗仍然是主要的治疗手段。化疗在许多癌症中都有效，但常伴有频繁的非靶向效应，导致显著的毒性。抗体药物偶联物（ADCs）是由三个不同组分组成的化合物，有效靶向癌细胞：单克隆抗体、细胞毒素有效载荷和连接这两个组分的连接子。ADCs之所以成功，是因为它们通过抗体结合到特定的肿瘤抗原，选择性地将高度有毒的有效载荷靶向癌细胞，同时避免对非恶性组织的损害。 ADCs的理论最早在20世纪60年代发展起来，第一次动物研究在20世纪80年代进行。第一代ADCs的挑战包括不稳定的连接子组分，这导致药物过早地释放到循环中。稳定药物分子、确定药物与抗体的适当比例以及提高ADC半衰期一直是ADC开发中的主要挑战。传统的化疗药物如蒽环类药物最初被用作有效载荷，但由于效力相对不足而无效。早期使用的抗体主要是嵌合体、人源化或小鼠来源的，与人源化抗体相比，与更高的免疫原性和药物反应相关。ADCs的另一个障碍是抗原靶点数量有限。自那以来已取得显著进展，现在已有越来越多的ADCs被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床，与当前护理标准相比，在第三阶段试验中取得了积极结果。2.ADC结构和作用机制 ADCs具有独特的配方，由三个主要部分组成：抗体、通过化学连接子结合的细胞毒素有效载荷，如图1和图2所示。每个部分在靶向癌症、有效传递和期望的细胞毒素结果中都发挥着其独特的作用。 图 1：抗体-药物偶联物的作用机制。使用 BioRender.com 创建。 图 2：抗体-药物偶联物的结构。缩写：BCMA，B细胞成熟抗原；B7-H3，B7同源蛋白3；DAR，药物与抗体比率；DLL3，delta-like蛋白3；ENPP3，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3；FRα，叶酸受体x；MMAE/F，单甲基奥瑞他汀E/F；SMCC，N-马来酰亚胺甲基-4-环己烷-1-羧酸酯；PBD，吡咯并苯并二氮杂环；PSMA，前列腺特异性膜抗原。使用BioRender.com创建。 2.1.抗体和目标抗原 单克隆抗体虽然已用于癌症治疗多年，但单独使用并未在大多数癌症中提供期望的治疗效益。因此，包括抗体在内的绝大多数癌症治疗方案是与化疗联合给予的。抗体药物偶联物（ADCs）是利用这两类治疗药物特性的合理方法。理想的目标抗原应该在癌细胞上选择性过度表达，而在非恶性组织上表达极少，这提高了疗效并限制了毒性。然而，大多数抗原是“肿瘤相关”的，而不是“肿瘤特异性”的，这意味着抗原在非恶性细胞上仍有一些表达。抗原需要是细胞外的或位于细胞表面，如 Trop-2 和 HER-2，因为细胞内抗原可能不会被抗体识别。此外，抗原应该是展示型的而不是分泌型的，因为后者可能导致 ADC 在系统循环中结合，增加了系统毒性的风险。 ADCs的效率取决于ADCs与目标抗原结合后的内化效率，以及它们的内部处理方式。例如，与不循环利用并经历溶酶体处理和有效载荷释放的ADCs相比，抗原-ADC复合物在内化后循环到细胞表面的效率会降低ADCs的效率。抗原脱落，即抗原从细胞表面移除的过程，也限制了ADCs的效率。目标抗原的内化效率是影响ADCs效率的另一个重要因素。快速内化的ADCs比慢速内化的ADCs更少穿透实体肿瘤。同样，与抗原有非常高亲和力的ADCs通常主要与血管周围区域的恶性细胞结合，并且与具有较低结合亲和力的ADCs相比，扩散性较低。抗原-抗体复合物的内化速率是复杂的，并受多种因素的影响，包括其他细胞表面受体的共表达、抗原的表达程度和抗原的结合亲和力。例如，针对CD19的ADCs可以有效地内吞，但只有在不表达CD21的情况下。因此，最佳的内化动力学高度依赖于肿瘤和药物。 当前的ADCs涉及完全人源化的抗体，减少了免疫原性。大多数ADCs基于免疫球蛋白G(IgG)抗体，已知有四种亚型。最常用的亚型IgG1的好处包括其能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性吞噬作用。 2.2.有效载荷 任何ADC的第二部分是细胞毒素有效载荷，通常在现有文献中称为“导弹”或“弹头”。由于仅有2%的ADCs能够到达目标肿瘤细胞，因此这些化合物的效力对于其有效性至关重要。目前大多数获批的药剂采用了两类有效载荷：DNA损伤剂和微管抑制剂。DNA损伤剂包括导致DNA双链断裂的药剂（例如，卡利切阿霉素），DNA嵌入（例如，拓扑异构酶抑制剂），DNA烷基化（例如，二喹诺酮类）和DNA交联（例如，吡咯并苯并二氮杂环）。这些强效的DNA损伤剂的IC50在皮摩尔范围内。微管是细胞分裂中起重要作用的关键细胞骨架元素。微管抑制剂包括奥瑞他汀衍生物，如单甲基奥瑞他汀E和F（MMAE和MMAF），以及美登素衍生物，如DM1和DM4。它们通常具有纳摩尔范围内的IC50值。药物-抗体比率（DAR），定义为可以附着在抗体上的有效载荷分子数量，影响ADCs的效力和治疗指数。DAR还影响结合的生理属性、药物的药代动力学及其半衰期。大多数目前获批的ADCs的DAR范围在2-8之间。 2.3.连接子 连接子在确保ADC稳定性和优化向肿瘤细胞传递细胞毒素有效载荷方面发挥着关键作用。理想的连接子在循环中稳定，防止过早释放有效载荷和系统毒性，但在恶性细胞内化后迅速被切割，促进有效的细胞死亡。根据有效载荷释放机制，连接子分为两类：可切割和不可切割。可切割连接子设计为在细胞内降解，响应从细胞外环境到细胞内环境的变化。可切割连接子的降解有多种触发因素，包括特定的溶酶体蛋白酶如组织蛋白酶B（切割Val-Cit和Val-Ala连接子与PABC结合），酸性pH值（切割腙键），以及谷胱甘肽（切割二硫键）。大多数目前获批的ADCs使用可切割连接子，如曲妥珠单抗德鲁替康（T-DXd）和奥木妥珠单抗奥佐米星。可切割连接子的优点是细胞内释放有效载荷和循环稳定性，而缺点包括在周围循环中可能过早切割。相比之下，不可切割连接子由稳定的键组成，对蛋白酶水解有抵抗力。含有不可切割连接子的ADCs依赖于抗体组分被细胞质和溶酶体蛋白酶近乎完全降解，这使得有效载荷附着在连接子上，以及来自抗体的氨基酸残基。含有不可切割连接子的ADCs的例子包括曲妥珠单抗美坦辛（T-DM1），它含有N-马来酰亚胺甲基-4-环己烷-1-羧酸酯（SMCC）和belantamab mafodotin，它含有马来酰亚胺己酰连接子。不可切割连接子的潜在优点在于限制由于过早释放有效载荷导致的非靶向毒性；然而，缺点是氨基酸残基仍然附着在有效载荷上，这可能影响有效载荷的药代动力学和药效学。 2.4.偶联化学 优化偶联化学对于提高ADCs的效力至关重要。化学偶联和酶促偶联是用于将抗体与其有效载荷结合的两种主要传统随机方法。化学偶联涉及抗体上的氨基酸残基与连接子上的活性位点之间的反应。化学偶联方法的例子包括赖氨酸酰胺偶联（用于T-DM1），以及半胱氨酸偶联，其中有效载荷分别与抗体上的赖氨酸或半胱氨酸残基结合。这些方法通常产生具有可变DAR的异质性ADC物种，这些物种与具有广泛DAR分布的ADCs一样次优，并且比具有狭窄DAR分布的ADCs效力较低。例如，在典型的抗体上，大约有10个化学可接近的赖氨酸残基；因此，赖氨酸偶联可能导致具有广泛DAR分布的可变ADC物种。基于半胱氨酸的偶联涉及抗体上还原的链间半胱氨酸残基与有效载荷上的硫醇基团之间的反应，由于偶联位点数量更有限，生成具有更均匀DAR的ADCs，优于赖氨酸偶联。传统偶联方法的另一个关键限制是有效载荷附着在抗体上的位置是随机分布的。这种随机分布导致不可预测的药代动力学效应，例如，有效载荷结合到参与抗原结合的抗体位点可以显著改变ADC的药代动力学和生物活性。体外测定和异种移植模型的药代动力学分析引入了在各种抗体位置上的半胱氨酸偶联，并将其与使用微生物转谷氨酰胺酶在轻链或重链上的酶促偶联进行了比较。使用酶促偶联到轻链或抗体上的Q295位置生产的ADCs具有更优越的药代动力学行为，同样，通过L328位置的半胱氨酸偶联工程化的ADCs也是如此。这项研究突出了不同偶联位点可能发生的药代动力学特征差异。定点偶联方法比经典偶联方法有几个优点，即提高了ADC的均匀性，并将有效载荷结合到不参与抗原结合的抗体区域。自2020年以来，定点偶联已成为主要的偶联方法。存在几种定点偶联方法。THIOMAB是最早开发的定点偶联方法之一，是一种工程化的基于半胱氨酸的技术，能够生产具有DAR为2的高度均匀的ADCs。THIOMAB技术的局限性包括DAR有限和使用基因工程，这可能是昂贵且耗时的。使用非天然氨基酸是另一种化学定点技术。这涉及设计含有非天然氨基酸的抗体，这些氨基酸随后与连接子反应，导致严格控制的DAR和均匀的ADCs。然而，这些好处是以显著的成本和由于非天然氨基酸可能产生的不期望的免疫原性为代价的。另一种化学定点技术是“AJICAP”技术，它涉及使用肽试剂在IgGs上的三个赖氨酸残基上引入硫醇功能团，并避免了抗体工程的需要。第一代AJICAP技术有几个局限性，包括需要长时间的还原和氧化反应以及一小部分生成的ADCs的聚集。这些问题在新开发的第二代AJICAP技术中得到了改进，该技术能够生产具有均匀DAR为2和改善的治疗指数的各种ADCs。存在各种分析ADCs的方法，包括疏水作用色谱、反相液相色谱和凝胶排阻色谱等。由于ADC的异质性和广泛的DAR分布，这些技术在分析传统随机ADCs方面存在各种局限性。使用定点技术可以提高ADC分析的准确性。化学酶促偶联方法使用酶，如Sortase、转谷氨酰胺酶和糖基转移酶，以定点方式将连接子结合到抗体上。酶促方法可以避免昂贵且耗时的抗体工程的需要，但酶促方法的挑战包括成本、大规模酶生产的困难以及从偶联反应基质中去除酶的困难。使用的免疫球蛋白类型也影响偶联效率。虽然IgG1是使用最广泛的抗体，但理论上IgG2提供了更多的偶联位点，这可能会增加ADCs的效力。 2.5.ADC纯化 ADC生产涉及几个步骤。简单来说，第一个过程涉及在缓冲液中重新构建单克隆抗体以稳定抗体。下一个阶段是去除小分子并提供适合发生偶联反应的溶液。抗体修饰后进行偶联，形成粗ADC。随后，粗ADC通过单一或连续的纯化过程，结合色谱和切向流过滤（TFF）进行纯化。ADC的纯化导致ADC浓度提高和药代动力学改善。存在多种ADC纯化方法。首先是TFF，这是一种广泛采用的技术，可以去除溶剂、小分子杂质和药物-连接子杂质。这种技术的限制在于不能去除聚集体，它们会保留在最终的ADC中，而且不同的DAR物种无法分离。高DAR物种导致ADC产品的聚集，因此体内清除率更高。这导致效率和安全性降低，而低DAR物种则存在效力问题。细胞培养中的单克隆抗体可以通过色谱法进行纯化。可以通过亲和色谱法大规模生产抗体。这种技术分离蛋白质，有助于ADC的分析、表征，以及分离和纯化。存在多种类型的色谱法，包括凝胶排阻色谱、疏水作用色谱、离子交换色谱和羟基磷灰石色谱。凝胶排阻色谱利用分子大小分离蛋白质，而疏水作用色谱则利用不同条件下的疏水性帮助DAR分析。这种技术的限制包括回收率低和潜在的抗体聚集。 3.ADCs的药代动力学和药效学  ADCs通过静脉注射给药，可以在系统循环中传播而不被代谢，基本上保持不活跃状态。它的代谢和消除对于确保药物输送和排泄至关重要。循环中的代谢可以影响药代动力学、效力和毒性特征。ADC的分布最初依赖于血管和间质空间的“分布体积”。它还可能受到抗原表达和ADC达到目标后随后的内化的影响。如果与非目标组织发生作用，分布可能导致非目标组织的毒性。ADC的代谢是复杂的，涉及偶联位点、连接子和有效载荷。通过脱偶联或酶促连接子切割释放药物进入血浆是最常见的方式。ADC的内化或动员导致与溶酶体融合，连接子发生切割。这代表了ADC通过受体介导的内吞作用从循环中清除和清除的机制，随后溶酶体室降解。然后，细胞毒素有效载荷可以自由到达目标，结合并触发目标细胞的死亡。释放到细胞质中的游离药物据报道可以穿过质膜，导致旁观者效应，使周围细胞也暴露于细胞毒素有效载荷。这的一个优点是，肿瘤细胞上所需的抗原表达较低，允许针对更广泛的癌细胞群体，而不仅仅局限于表达最高目标抗原的肿瘤细胞。蛋白水解降解或分解代谢有助于消除ADC的单克隆抗体部分，它被重新用作蛋白质或新的碳源。它们不能通过肝脏排泄或通过肾小球滤过从系统循环中排出。相反，有效载荷的排泄通过肾脏和肝脏器官进行，并因ADCs而异。例如，T-DM1的有效载荷主要通过肝脏系统排泄，几乎不通过肾脏排泄，而brentuximab vedotin主要通过肝脏途径排泄在粪便中。关于新型ADCs如sacituzumab govitecan的排泄过程及其对肝脏或肾功能的影响，发表的数据有限。 旁观者效应 旁观者效应是ADCs中日益公认的机制。这发生在接近目标癌细胞的细胞暴露于ADCs的抗肿瘤效应，无论抗原表达如何。旁观者效应主要取决于连接子和有效载荷的性质。具有可切割连接子和疏水性有效载荷的ADCs在体外模型中已被证明可以通过细胞膜扩散并引起旁观者效应。有效载荷和连接子对引起旁观者效应能力的影响通过比较两种类似ADCs的机制来说明，它们都具有曲妥珠单抗抗体，T-DXd和T-DM1。T-DM1由不可切割连接子组成，药物进入抗原阳性细胞后，曲妥珠单抗被降解，而来自连接子的肽链仍然与emtansine结合。这种化合物在生理pH下带电，因此保留在细胞内，不会扩散到周围细胞。因此，T-DM1的旁观者效应有限。然而，使用曲妥珠单抗和emtansine，但具有可切割连接子的ADCs已被创建，并且可以诱导旁观者效应，因为内部化后，连接子被降解，留下可以扩散到周围细胞的疏水性美登素。相比之下，T-DXd由可切割连接子组成，T-DXd在抗原阳性细胞内化后，连接子被降解，留下疏水性的有效载荷deruxtecan。这种疏水性有效载荷能够扩散到邻近的抗原阴性细胞，诱导旁观者效应。此外，增加有效载荷的疏水性，例如，通过向美登素添加更多的亚甲基，已被证明可以增加旁观者杀伤。与T-DXd类似，trastuzumab duocarmazine是另一种展示显著旁观者效应的ADC。Trastuzumab duocarmazine也是具有可切割连接子的二喹诺酮类有效载荷。其他获批的ADCs在体外模型中也展示了旁观者效应，包括enfortumab vedotin（EV）、tisotumab vedotin（TV）和sacituzumab govitecan（SG）。从海兔中提取的MMAE和MMAF是常用的细胞毒素有效载荷。MMAE表现出旁观者效应特性，因为它不被细胞膜束缚，而MMAF则不然，因此被发现效率较低且毒性较低，这是由于这一关键差异。尽管在血液学领域对旁观者效应的具体研究有限，但基于MMAE的ADCs brentuximab vedotin和polatuzumab vedotin已分别获批用于霍奇金淋巴瘤和难治性弥漫大B细胞淋巴瘤。Brentuximab vedotin在表达CD30阳性和阴性细胞的生殖细胞肿瘤中也展示了旁观者效应。由于基于MMAE的ADCs通常使用已知保留膜通透性的可切割连接子，这些特性支撑了它们产生旁观者效应的能力。 4.抗体-药物偶联物在癌症中的开创性II/III期试验  目前，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准13种ADCs用于各种恶性肿瘤，自2017年以来批准的速度特别快。在这里，我们总结了ADCs在实体瘤和血液学恶性肿瘤中的关键试验（见表1和表2）。 4.1.ADCs在实体器官恶性肿瘤中的试验 目前已有3种ADCs获得FDA批准用于治疗乳腺癌。这并不令人意外，因为治疗性抗体已在治疗该疾病中得到广泛应用，ADCs代表了这种方法的延伸。T-DM1是首个获批用于乳腺癌的ADC，由人源化HER2导向的单克隆抗体曲妥珠单抗通过不可切割连接子连接到微管抑制剂DM1，DAR约为3.5。与卡培他滨加拉帕替尼相比，它已被证明能改善二线治疗的转移性HER2阳性乳腺癌患者的中位总生存期，风险比为0.68（95% CI 0.55至0.85，p < 0.001）。它也已获批用于接受新辅助HER2导向治疗和化疗后仍有残留HER2扩增乳腺癌的患者，与辅助曲妥珠单抗相比，它已被证明能将侵袭性无病生存期提高50%（HR 0.50，95% CI 0.39至0.64；p < 0.001）。随后的研究表明，与T-DM1相比，T-DXd改善了治疗结果。T-DXd是一种新型ADC，由相同的HER2导向的单克隆抗体曲妥珠单抗通过可切割四肽连接子连接到有效载荷deruxtecan，这是一种拓扑异构酶1抑制剂。DESTINY-Breast03试验比较了二线治疗转移性HER2阳性乳腺癌患者中T-DXd与T-DM1，报告了一个令人印象深刻的疾病进展或死亡风险比0.28（95% CI 0.22至0.35，p < 0.001）。此外，DESTINY-Breast02试验是首个也是唯一一个探索在另一种ADC，T-DM1治疗后进展的患者中使用ADC的试验。它表明，与医生选择的治疗相比，T-DXd在先前用T-DM1治疗过的转移性HER2阳性乳腺癌患者中更为优越，无进展生存期（PFS）的风险比为0.36（95% CI 0.28至0.45；p < 0.0001）。从历史上看，HER2阳性乳腺癌一直以二元方式定义，要么定义为HER2阳性，即免疫组化（IHC）得分为3+或IHC为2+且原位杂交（ISH）阳性，要么定义为HER2阴性，即IHC得分为0-1或IHC为2+且ISH阴性。然而，在III期随机对照DESTINY-Breast04试验中，T-DXd被证明对“HER2低”乳腺癌患者有益，定义为IHC得分为1+或IHC为2+且ISH阴性，总生存期的风险比为0.64（95% CI 0.49至0.84）[68]。这项关键研究重新定义了乳腺癌的治疗算法和分类。在毒性方面，在接受T-DXd治疗的DESTINY-Breast 04试验中，有12.1%的患者发生了与药物相关的间质性肺病或肺炎，其中包括3例（0.8%）致命事件。在DESTINY-Breast 03试验中，有10.5%的患者发生了与药物相关的肺炎，没有死亡。最近，基于不同肿瘤类型之间共享的受体生物学，药物适应症在肿瘤类型上的扩展。例如，T-DXd现在已获批用于HER2阳性的转移性胃癌和肺癌。在接受两种或以上先前治疗后病情进展的转移性胃癌或胃食管结合部癌患者中，与化疗相比，T-DXd与中位总生存期提高41%相关（HR 0.59，95% CI 0.39至0.88）。目前正在进行多项试验，使用T-DXd治疗各种HER2阳性恶性肿瘤。另一个类似的ADC是disitamab vedotin，由HER2导向的单克隆抗体、可切割连接子和MMAE有效载荷组成。在单臂II期试验中，disitamab vedotin在HER2阳性晚期尿路上皮癌患者中取得了有希望的结果，客观反应率为51.2%。Sacituzumab govitecan由靶向Trop-2的抗体通过可切割连接子连接到SN-38，一种拓扑异构酶1抑制剂有效载荷。Trop-2是一种在三阴性乳腺癌和许多其他实体恶性肿瘤中过度表达的抗原，与癌症进展和预后不良相关。Sacituzumab govitecan已被证明能改善与医生选择治疗相比的晚期转移性三阴性乳腺癌患者的总生存期（HR 0.48，95% CI 0.38至0.59；p < 0.001）。最近，它还被证明能改善与医生选择治疗相比的转移性激素受体阳性乳腺癌患者的PFS（HR 0.66，95% CI 0.53–0.83；p = 0.0003）。此外，sacituzumab govitecan在单臂II期试验中也显示出对接受铂类和免疫治疗后病情进展的转移性尿路上皮癌患者的临床益处。目前至少有19项试验正在进行，研究sacituzumab govitecan在一系列恶性肿瘤中的应用，包括胶质母细胞瘤和难治性转移性上皮性癌症，以及乳腺、非小细胞肺癌、尿路上皮癌、前列腺癌、头颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌。Enfortumab vedotin结合了一种靶向nectin-4的单克隆抗体，通过可切割连接子连接到MMAE。尽管与sacituzumab govitecan的抗体靶点、连接子和有效载荷不同，但它在铂类和免疫治疗后病情进展的转移性尿路上皮癌患者中显示出类似的益处。在铂类和免疫治疗后病情进展的患者的III期试验中，与化疗相比，enfortumab vedotin被证明能改善总生存期（HR 0.70；95% CI 0.56至0.89；p = 0.001）。两种ADC最近已根据II期试验的数据获批用于难治性晚期妇科癌症。Mirvetuximab soravtansine由叶酸受体α（FRα）抗体、可切割连接子和DM4有效载荷组成，另一种微管抑制剂。FRα是一种细胞表面糖蛋白，介导各种细胞过程，如细胞分裂、增殖和组织生长。它在90%以上的卵巢癌以及子宫、肺和乳腺癌中过度表达。一项II期单臂试验评估了mirvetuximab soravtansine在1-3线化疗加贝伐珠单抗后病情进展的高FRα表达铂类耐药卵巢癌患者中的疗效。ORR为32.4%，中位PFS为5.5个月，中位总生存期为13.8个月。相比之下，化疗加贝伐珠单抗治疗铂类耐药复发卵巢癌的标准治疗与27.3%的有效率和6.7个月的中位PFS相关。同样，一线治疗后病情进展的转移性宫颈癌患者的预后也很差。Tisotumab vedotin是一种针对组织因子的ADC，具有可切割连接子和DM4有效载荷。组织因子在生理上表达在血管外膜细胞上，并在内皮损伤后释放；然而，它在各种癌症的肿瘤细胞和内皮细胞表面病理性过度表达，包括胰腺癌、宫颈癌、肉瘤、肺癌、三阴性乳腺癌和急性淋巴细胞性白血病。Tisotumab vedotin在贝伐珠单抗双药化疗后或化疗期间病情进展的患者中单臂II期试验显示ORR为24%，中位PFS为4.2个月，中位总生存期为12.1个月。Mirvetuximab soravtansine（clinicaltrials.gov标识符NCT04209855）和tisotumab vedotin（clinicaltrials.gov标识符NCT04697628）的确认性III期试验正在进行中。 4.2.ADCs在血液学恶性肿瘤中的应用 有多款ADCs已获批准用于血液学恶性肿瘤，如表2所示。首个获得FDA批准的ADC是吉妥单抗奥佐米星，用于治疗复发的CD33阳性急性髓性白血病成人患者。吉妥单抗奥佐米星是一种靶向CD33的ADC，具有可切割连接子和卡利奇霉素有效载荷。在III期SWOG S0106试验显示，使用吉妥单抗奥佐米星（6 mg/m^2）加标准化疗的死亡率为5.5%，肝毒性高，而单独使用标准化疗的死亡率为1.4%，之后批准被撤销。后来，使用较低剂量3 mg/m^2的吉妥单抗奥佐米星的随机III期临床试验显示了临床效益和改善的安全性，这导致它在2017年重新获得FDA批准。靶向CD22的伊诺妥珠单抗奥佐米星，带有可切割连接子和卡利奇霉素有效载荷，与医生选择的治疗相比，已被证明与改善的总生存期相关（HR 0.74，97.5% CI 0.57–0.99，p = 0.01）。同样靶向CD22的莫昔妥莫单抗帕苏多毒素，使用与伊诺妥珠单抗奥佐米星相同的可切割连接子，但使用不同的有效载荷（帕苏多毒素），在一项针对复发或难治性毛细胞白血病患者的小型单臂II期试验中显示出益处，中位PFS为41.5个月。 布妥昔单抗韦多汀，靶向CD30，具有可切割连接子和MMAE有效载荷，已获批准用于几种血液学恶性肿瘤。在未经治疗的III-IV期经典霍奇金淋巴瘤的III期ECHELON-1试验中，布妥昔单抗韦多汀加多柔比星、长春新碱和达卡巴嗪与多柔比星、博来霉素、长春新碱和达卡巴嗪进行了比较。加入布妥昔单抗韦多汀后，5年PFS有所改善（HR 0.68，95% CI 0.53–0.87，p = 0.0017）。当与环磷酰胺、多柔比星和泼尼松相比，加入布妥昔单抗韦多汀也显示出改善CD30表达的外周T细胞淋巴瘤的5年总生存期（HR 0.72，95% CI 0.53–0.99）。同样，在复发的原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤或CD30表达的蕈状肉芽肿的小规模III期试验中，布妥昔单抗显示出改善的响应率和PFS。Polatuzumab vedotin靶向CD79b，具有可切割连接子和MMAE有效载荷。在一项针对复发或难治性弥漫大B细胞淋巴瘤患者的小型Ib/II期试验中，当与苯达莫司汀和利妥昔单抗联合使用时，与单独使用苯达莫司汀和利妥昔单抗相比，已被证明可以改善OS（HR 0.42，95% CI 0.24至0.75，p = 0.002）。同样，靶向CD19的Loncastuximab tesirine，具有可切割连接子和吡咯并苯并二氮杂环二聚体有效载荷，在一项针对复发或难治性大B细胞淋巴瘤患者的小型单臂II期试验中，与高响应率48.3%和中位总生存期9.9个月相关。此外，靶向B细胞成熟抗原的Belantamab mafodotin，具有不可切割连接子和MMAF有效载荷，在一项针对接受过大量预处理的多发性骨髓瘤患者的小型II期试验中显示出活性，根据不同剂量使用的响应率在31-34%之间。 5.ADCs临床开发的挑战和当前ADCs的限制  由于与传统化疗相比疗效提高，ADCs持续受到欢迎。尽管如此，存在限制，超过50种潜在的ADCs因有限的疗效或毒性而停止开发。ADCs的早期阶段研究提出了独特的挑战，需要与常规细胞毒性治疗试验不同的方法。例如，I期试验传统上被设计为在毒性和反应正相关的基础上找到药物的最大耐受剂量（MTD）。然而，在靶向治疗和免疫疗法试验中，已显示剂量和效力之间没有可预测的线性相关性。在ADC试验中尚未很好地研究这种关系。尽管如此，它可能与传统的细胞毒性化疗不同，因为除了剂量之外，还有许多因素可以影响ADC的效力和治疗窗口。这些因素包括肿瘤组织上目标抗原的均一性或不均一性以及表达水平，正常组织上目标抗原的表达程度，由于连接子不稳定导致的ADC过早细胞外解偶联，以及有效载荷跨细胞膜的渗透性，因此，旁观者效应的程度。ADCs可能存在阈值效应，即超过特定剂量的ADC不会增加暴露或效力。已经提出了各种策略来改善ADCs的最佳剂量递送。这些包括体重剂量封顶、治疗持续时间封顶、改变剂量频率、响应引导剂量以及随机剂量寻找研究。迫切需要在使用ADCs的早期阶段试验的设计和剂量寻找方面进行进一步改进。 由于离靶效应导致有效载荷释放到其他组织而产生的毒性是ADCs开发和采用的另一个障碍。这些通常是肝脏、神经、血液学、呼吸或眼科性质的。毒性的关键例子包括HER2和Nectin-2在心肌细胞和皮肤上的表达，分别引起心脏毒性和皮肤毒性。由于不同ADCs的独特组成，不良效应概况不同，可能对ADC独特，强调了能够为个别药物提供参考指南的重要性。在ADC开发的早期，由于连接子不稳定导致的ADC有效载荷过早释放与更高的毒性有关。为了减少这种毒性，需要ADC的半衰期是有效载荷本身的10倍。另一个关键参数是连接子的极性，以最小化过早药物释放和毒性。这种平衡增强了有效载荷的耦合并减少了免疫原性，同时保持了适当的有效载荷递送。如果细胞毒素过于疏水，这可能会改变抗体的特性，导致聚集或偶联。这些平衡可以影响药物的效力和耐受性。中性粒细胞减少症是ADCs的常见且重要毒性，特别是基于MMAE的带有缬氨酸-瓜氨酸连接子的ADCs。对于含有缬氨酸-瓜氨酸连接子和MMAE有效载荷的ADCs，中性粒细胞减少症发生的原因是骨髓中的中性粒细胞产生丝氨酸蛋白酶，这些蛋白酶随后切割缬氨酸-瓜氨酸连接子，导致MMAE过早细胞外释放和中性粒细胞死亡。ADCs的另一个潜在限制是具有密集肿瘤基质的癌症。包括ADCs在内的高分子量药物穿透密集肿瘤基质到达所需目标的能力有限。 ADCs的抗药性机制 理解ADCs的抗药性机制是一个新兴领域，需要进一步研究。癌症可以利用的弱点包括内化过程、有效载荷机制以及抗原和抗体之间的相互作用。尽管有效载荷的效力很高，但仍然可能产生抗药性。促成因素可能是ABC转运蛋白（药物外排泵），历史上已知这些泵会影响并降低化疗药物的有效性。表达ABCC1（多药耐药蛋白1）的乳腺癌细胞的体外模型在三个月的周期性治疗后对T-DM1表现出256倍的抗药性增加。暴露于长期未偶联微管抑制剂给药的癌细胞也可以诱导药物转运蛋白MDR1，这被假设在DM1抗药性中发挥作用。这种转运蛋白和MRP1可能因长期暴露而上调，导致获得性抗药性、外排上调和药物沉积。获得性或固有抗药性是ADCs的挑战，包括抗体抗药性、无法运输所需药物、溶酶体功能障碍和有效载荷效力不足。目前，没有抗药性模型将ADC活性丧失与偶联内化相关联。蛋白质组学分析在识别涉及内化过程不同方面的蛋白质改变方面显示出实用性，包括溶酶体生物合成、载体运输、细胞骨架和抗体的运输。溶酶体转运蛋白的丧失也可能降低ADC的效力。 ADC载荷抗性和挑战在多种癌症亚型中都有观察到。例如，一名长期暴露于sacituzumab govitecan的患者死后进行了活检。发现了携带已知编码拓扑异构酶-1的TOP1突变和编码TROP2的TACSTD2突变的肿瘤亚克隆。可能发生并行的抗性机制，同时影响载荷和抗体。在持续ADC暴露后，HER-2受体激酶或激酶信号通路的改变是一种抗性机制。T-DM1抗性的体外模型KPL-4-T-DM1-R显示出HER2和HER3水平降低，而其他激酶如EGFR增加。抗原表达和异质性已被证明是体外研究中的抗性机制，如在JIMT1系（抗性细胞系）中所描述的，用T-DM1处理的异种移植肿瘤表现出较低的HER2表达，这与较高的复发率和较低的生存率相关。在治疗前后改变目标表达与血液恶性肿瘤的潜在较差结果相关，包括表达低CD33的髓性白血病。 6.未来方向  正在进行大量关于ADCs的研究，有超过一百种ADCs处于临床前和早期临床研究阶段。虽然历史上靶向治疗针对的是致癌驱动突变，但鉴于ADCs的疗效，我们正在看到ADC设计上的转变，即抗原目标不一定是致癌驱动因素，而只是一个在恶性细胞中优先过度表达的目标。由于血液恶性肿瘤具有更多可识别的目标，由于其谱系特异性抗原，使它们成为完美的靶标，而抗原目标在实体器官肿瘤中通常表达更为异质性，特异性较低。 6.1.开发新的抗原目标和抗体 正在实体瘤中探索的一些新抗原目标包括前列腺特异性膜抗原（PSMA）、前列腺-1的六跨膜上皮抗原（STEAP-1）、组织因子、delta-like蛋白3（DLL-3）、间皮素、ENPP3和B7-H3蛋白家族。DLL-3是抑制性Notch通路配体，通过多种机制在黑色素瘤、膀胱癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胰腺癌和肺癌中介导肿瘤形成，包括血管生成、肿瘤基质重塑和对肿瘤基质中免疫细胞的影响。PSMA是一种在前列腺癌中高度选择性表达的膜糖蛋白，使用MMAE载荷和缬氨酸-瓜氨酸二肽连接子的PSMA ADC在I期试验中显示出安全性和活性。STEAP-1是一种细胞膜蛋白，作为离子通道或转运蛋白，高表达于前列腺、乳腺、胰腺、膀胱、胃肠道、睾丸、卵巢和宫颈癌，ewing肉瘤和黑色素瘤。DSTPL0862S是一种由人源化IgG1通过蛋白酶可切割连接子连接到MMAE的ADC，已在I期试验中显示出可接受的安全性和转移性去势抵抗性前列腺癌的活性证据。针对大多数透明细胞肾细胞癌表达的ENPP3的ADC的I期试验报告了可耐受的毒性和疗效。B7-H3是一种免疫检查点蛋白，在许多儿童癌症以及非小细胞肺癌和前列腺癌中过度表达。目前正在研究B7-H3 ADCs用于髓母细胞瘤、腹膜癌、神经母细胞瘤、胶质瘤、前列腺癌、头颈癌、非小细胞肺癌、尿路上皮癌、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、ewing肉瘤和肾母细胞瘤。例如，AbBV-155（mirzotamab clezutoclax），一种抗B7-H3 ADC，已在非小细胞肺癌和乳腺癌中进行了评估。在单一药物I期队列中没有报告显著的剂量限制毒性，21%的患者发生了部分反应。间皮素是一种细胞膜糖蛋白，在间皮瘤、肺腺癌、胰腺腺癌、结直肠癌、浆液性卵巢癌、胃腺癌和乳腺癌中表达。目前正在开发针对间皮素的各种其他ADCs。正在为血液恶性肿瘤探索各种其他目标，包括用于复发和难治性弥漫大B细胞淋巴瘤患者的CD37的naratuximab emtansine，用于多发性骨髓瘤的CD138的indatuximab ravtansine，用于弥漫大B细胞淋巴瘤和急性淋巴细胞性白血病的CD19的coltuximab mertansine，用于表达CD56的血液恶性肿瘤的CD56的lorvotuzumab mertansine，以及用于弥漫大B细胞淋巴瘤和滤泡性非霍奇金淋巴瘤的CD22的pinatuzumab vedotin。正在探索使用双特异性抗体的ADCs作为提高异质性抗原表达肿瘤疗效的潜在手段。双特异性ADCs可以靶向两种不同的抗原或同一抗原的不同位点。靶向同一抗原上的两个不同位点被认为可以更有效地内化化合物并改善受体聚集。例如，使用靶向HER-2和催乳素受体的双特异性抗体的ADCs已被证明可以改善ADC内化，并在体外与常规HER2导向ADC相比具有更高的抗肿瘤活性。还在增加对肿瘤微环境中细胞的研究。人们认为癌症相关成纤维细胞促进治疗抗性和癌细胞存活。两种新型ADCs，成纤维细胞激活蛋白α单克隆抗体结合DM1和成纤维细胞激活蛋白α结合假单胞菌外毒素38，已在肺、头颈、胰腺和乳腺癌的异种移植模型中显示出高效性。 6.2.提高细胞毒素和其他有效载荷的开发 还在探索新的有效载荷和有效载荷结构。为了提高在异质性目标表达的实体肿瘤中的响应性，正在探索双重有效载荷。正在开发中的新有效载荷包括吡咯并苯并二氮杂环单体或二聚体、吲哚喹啉-苯并二氮杂环和环丙基苯并吲哚酮单体和二聚体，IC50值在皮摩尔范围内。一些由于高毒性率而受到阻碍。例如，设计并测试了一种含有MMAE和MMAF双重有效载荷的HER2靶向ADC在HER2+乳腺癌的异种移植模型中。含有双重有效载荷的ADC在体内杀死肿瘤细胞非常有效，比使用两种基于单一有效载荷的ADCs更为有效。正在开发的其他有效载荷包括BCL-XL抑制剂，这些抑制剂可以在依赖BCL-XL的肿瘤中选择性诱导凋亡。BCL-XL的过度表达通常见于黑色素瘤和胶质母细胞瘤等癌症。酪氨酸激酶抑制剂也被作为有效载荷进行了研究，因为激酶家族已知在细胞周期进展、增殖、血管生成和细胞在体内的移动中扮演重要角色。目前，基于酪氨酸激酶抑制剂的ADCs的疗效并不如预期。正在研究酪氨酸激酶抑制剂加ADC组合，以抵消肿瘤异质性和抗性。例如，T-DM1和tucatinib（一种HER2选择性酪氨酸激酶抑制剂）已联合使用。这在以前用曲妥珠单抗和紫杉醇治疗过的患者中显示出47%的客观反应率，以及36%的脑特异性反应。正在进行这种特定组合的招募。光免疫疗法是另一种新兴治疗方式，其中单克隆抗体与光激活染料结合，激活后会破坏肿瘤细胞，导致细胞死亡。例如，cetuximab sarotalocan结合了EGFR单克隆抗体和光激活染料IR700，在三名复发性头颈鳞状细胞癌患者的I期试验中，三名患者中有两名经历了反应，并具有可管理的安全性。 6.3.免疫治疗和ADCs 人们越来越关注开发能够增强免疫系统能力的ADCs，这与ADCs部分通过抗体依赖性细胞毒性作用的方式特别相关。目前正在进行两项研究方法：第一，将免疫疗法与ADCs联合使用；第二，将免疫疗法整合到ADCs中。ADCs通过激活树突状细胞、激活T细胞，以及提高损伤相关分子模式（DAMPs）的表达，与局部肿瘤免疫微环境相互作用，并已在体外模型中显示出增强免疫疗法的抗肿瘤效果。在II期KATE2研究中尝试了将HER2导向的ADCs和免疫疗法结合，比较了T-DM1和atezolizumab与T-DM1和安慰剂在经预处理的HER-2阳性乳腺癌患者中的疗效。联合免疫疗法和HER2治疗未能改善PFS，但在PDL-1表达的患者中观察到了受益趋势。尽管这种联合疗法没有达到预期效果，但在早期阶段研究中将ADC和免疫疗法结合在多种癌症中显示出前景，包括小细胞肺癌、卵巢癌、三阴性乳腺癌和尿路上皮癌。 在第二种方法中，设计ADCs以刺激免疫系统。目前开发中的这两类免疫刺激性ADCs主要包含STING激动剂和TLR激动剂。传统的STING和TLR激动剂由于毒性高，特别是以细胞因子释放综合征为特征，至今未能成功。第一个进入临床试验的免疫刺激性ADC，NJH395，将小分子TLR7/8激动剂与抗HER2单克隆抗体相结合。然而，在18名非乳腺癌HER2阳性恶性肿瘤患者的I期临床试验中结果令人失望，以高细胞因子释放综合征和有限的疗效为特征。 总结来说，ADCs代表了一种将治疗性抗体和强效化疗药物的优势结合起来的新疗法类别。尽管ADCs最近取得了显著的成功，但该领域仍处于起步阶段。还有许多领域尚未得到充分研究，例如抗药性机制、ADCs的最佳剂量，以及免疫系统与ADCs之间的相互作用。随着更多ADCs进入临床使用，其作用机制和毒性的重复主题可能会出现，尽管每种ADC都可能因其抗体、有效载荷和连接子的独特组合而具有独特性，每个组成部分都有改进的重大机会。 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。