iHIVARNA-01

两种基于mRNA的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）疫苗在病毒序列公布约11个月后获得紧急使用授权（EUA），突显了这种核酸技术平台的转化潜力。迄今为止，大多数mRNA的临床应用都集中在传染病和癌症疫苗上，由于某些mRNA种类和配方固有的免疫刺激特性，因此低剂量、低蛋白表达和局部传递也可能有效。此外，关于mRNA编码蛋白或细胞免疫疗法的研究工作也已开始进行，但由于需要最小的免疫刺激、靶细胞和组织中的高蛋白表达以及重复给药，导致了临床转化上制造与配方的挑战。在这一势头的基础上，去年mRNA技术在COVID-19疫苗、Omicron特异性加强针和季节性流感疫苗、Epstein-Barr病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）和癌症疫苗方面取得了临床进展。在此，我们回顾了mRNA治疗的临床进展，并对这些基于mRNA的药物背后的转化技术进行了概述和展望。­­随着两种针对COVID-19的mRNA疫苗：Comirnity（BNT162b2）和Spikevax（mRNA-1273）的全面批准，mRNA的医学前景终于实现。2020年3月16日，在2020年1月11日公布病毒序列后的几周内，Moderna的mRNA-1273（针对SARS-CoV-2 spike（s）蛋白的几种mRNA疫苗之一）首次给人类志愿者注射。这一显著成就得益于近十年来感染性疾病和癌症mRNA疫苗的临床经验（见图1）。图1   2020年抗SARS-CoV-2 mRNA疫苗快速发展的时间线1990年，Wolff等人证明了在小鼠中肌肉注射（i.m.）mRNA可产生靶蛋白，首次在体内验证了使用mRNA编码蛋白质用于疫苗接种或蛋白质替代的概念。然而，这项技术的前景经过几十年的临床验证后才得以实现，部分原因是由于mRNA稳定性和传递方面的技术瓶颈，以及2000年期间研究重点、资金投入和行业重点向DNA疫苗的暂时转移。与此同时，mRNA作为疫苗的潜在优势（设计和测试的容易性和速度、固有免疫原性、快速扩大和制造以及插入突变的风险可忽略不计）使得少数学者继续对这种单链核酸展开研究。­­­mRNA技术的一个特别重要的优势来自其作为蛋白质翻译模板的生物学作用。传统疫苗技术依赖于在生物反应器中使用哺乳动物细胞或鸡胚批量生产疫苗，而mRNA疫苗只在患者细胞内一次转化为最终产物。事实上，mRNA利用人体作为自己的疫苗生产设施，具有一些附带的优势。首先，它允许人类对蛋白质产品进行翻译后修饰（PTM），具有降低免疫原性和完整功能的潜力。其次，不适合在生物反应器中生产的多聚体蛋白质可以在患者细胞中正确翻译、折叠和组装（例如，Moderna为研究性巨细胞病毒（CMV）疫苗（mRNA-1647）设计了五种mRNA混合物，产生五聚体蛋白）。第三，mRNA疗法可以产生跨膜和细胞内蛋白质，并将其运输到细胞环境中的适当位置。­与基于病毒载体的方式相比，mRNA还降低了针对载体的预先存在的抗体或产生给药后抗体的可能性（会降低后续给药的疗效）。尽管临床前模型中观察到了RNA纳米制剂的抗载体抗体，但已开发出消除这些反应的方法，使重复给药不会降低疗效。当然，也有一些成功的重复人体给药和重复人体给药相关短干扰 RNA 纳米制剂的例子。与其他药物类似，mRNA的剂量可以很容易地上下调整，间隔更长或更短，具体取决于个体患者的需要、体重和疾病状态。此外，作用的持续时间本质上是有限的，从而降低了不可逆副作用的可能性并能够治疗急性适应症；由于mRNA降解受正常细胞过程的调节，因此可以通过对分子和递送方法的修饰来调节体内半衰期。­mRNA作为医疗产品mRNA药物分为三个基本类别：预防性疫苗、治疗性疫苗和蛋白质编码疗法。尽管每个应用程序都有其独特的挑战，但所有应用程序都面临一个共同的挑战，即在保持mRNA稳定性的同时，需要将mRNA部分在细胞内输送到靶细胞。RNA本质上是一种不稳定的分子，早期将mRNA药物的概念转变为现实的许多工作都集中在稳定性上。为此使用了各种技术，包括优化5′帽结构和3′聚（A）尾长度，以及5′和3′非翻译区域内的调节元件。除了在改善mRNA稳定性方面取得的进展，有效的体内mRNA药物还需要高效的细胞内传递。研究探索了将mRNA浓缩成纳米制剂，逐渐集中于脂质制剂以实现传递。典型的脂质纳米颗粒（LNP）配方由（1）与聚阴离子RNA相互作用的可电离或阳离子脂质组成，（2） 一种辅助磷脂（例如，1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）），类似于细胞膜中的脂质并支持双层结构（3） 一种胆固醇类似物，用于调节脂质双层的流动性和（4） 聚乙二醇（PEG）-改善胶体稳定性和减少调理作用的脂质（图2）。图2   mRNA递送纳米颗粒的组成尽管在临床上远不如LNP先进，但聚合物纳米颗粒（PNP）也显示出作为输送系统的前景。这些配方通常由可生物降解的含胺聚合物组成，可与RNA自组装。根据应用情况，PNP也可与辅助磷脂、胆固醇和PEG脂质调配（图2）。LNP和PNP都可以用特定配体进一步修饰，以促进细胞特异性靶向。正在开发的非病毒载体制剂的具体成分差异很大，可能对细胞内传递的效率、纳米粒子-mRNA复合物靶向的细胞类型以及所给mRNA药物的免疫原性产生重大影响。­­在需要时激发适当的免疫原性（疫苗）或为其他适应症（mRNA蛋白替代疗法）而逃避它是制造和配制mRNA药物时需要考虑的一个重要方面。RNA作为RNA病毒的遗传物质或DNA病毒复制的副产品，可以对先天免疫系统产生强大的刺激。微生物RNA具有许多结构和序列特征，这些特征将其与宿主细胞中模式识别受体可以识别的自身RNA区分开来。模式识别受体的两个系统通过产生I型干扰素（IFN）和炎性细胞因子来协调适当的免疫反应：第一个是Toll样受体（TLR）系统，位于上皮细胞和免疫细胞（包括DC，单核细胞和巨噬细胞）的质膜、内体和溶酶体中；第二种是视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体，位于大多数细胞的胞浆中。TLR3由双链RNA（dsRNA）激活，而TLR7和TLR8由单链RNA激活。RIG-I和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）在胞浆中分别被5′-三磷酸化短（18–19 bp）dsRNA和长（>1000 bp）dsRNA差异激活。TLR3激活导致通过含TIR结构域的适配器分子1（TICAM-1）途径产生I型IFN，而其他TLR使用MYD88依赖性级联，导致核因子（NF）-κB依赖性或IFN调节转录因子（IRF）3依赖性产生促炎性细胞因子。这些途径被mRNA产物及其传递载体激活的程度在很大程度上取决于应用，是mRNA药物开发的一个关键方面。­­­mRNA的生物医学应用前景继续快速发展。下面，我们将分三个方面进行讨论：直接体内注射用于预防传染病疫苗的mRNA（表1）、治疗性癌症的mRNA疫苗（表2）和mRNA编码的免疫疗法（表3）。表1   过去和正在进行的感染性疾病mRNA疫苗II期或III期临床研究总结表2   过去和正在进行的仅用于癌症II期或III期的mRNA疫苗临床研究总结表3   过去和正在进行的mRNA用于蛋白质替代应用的II期或III期临床研究总结传染病疫苗在美国食品和药物管理局（FDA）批准COVID-19疫苗后，mRNA现在被认为是传染病中潜在的转化疫苗形式（表1），针对SARS-CoV-2以外病原体的mRNA疫苗的进一步验证十分迫切。­mRNA分子固有的免疫刺激性质和作为免疫佐剂的功能被视为疫苗应用的关键优势，但将这些特性转化为一种安全有效的临床产品面临着平衡免疫刺激与编码抗原表达之间的挑战。迄今为止，临床上最先进的产品是具有化学修饰和未修饰核苷酸碱基的非复制性mRNA疫苗。辉瑞生物科技公司的BNT162b2和摩德纳的mRNA-1273这两种经批准的mRNA产品，是含有化学修饰的尿嘧啶碱基的疫苗。相比之下，迄今为止，针对COVID-19的未修饰RNA疫苗试验的结果令人失望。尽管最终数据仍有待公布，但CureVac报告称，其未经修饰的CureVac 2019冠状病毒疾病疫苗（CVnCOV）对冠状病毒感染的保护率仅为47%。对于未经修饰的CureVac疫苗与经修饰的疫苗相比的效力较低，学者提出了各种解释。CureVac在试验过程中提出SARS-CoV-2变异情况的变化，而BNT162b2或mRNA-1273的情况并非如此；其他学者注意到，与BNT162b2（30µg）和mRNA-1273（100µg）相比，CureVac使用较低剂量（12µg）（选择为未修饰RNA比修饰RNA更具反应性）可能不足以产生有效的中和抗体反应；另有学者假设，未修饰RNA的翻译效率可能较低，导致表位水平较低。­­­除了上述非复制性mRNA疫苗外，还有几个研究小组也在研究编码RNA依赖性RNA聚合酶的自我扩增结构，这些RNA依赖性RNA聚合酶可以扩增传递的RNA，从而增加抗原蛋白表达。到目前为止，这些药物只完成了早期临床试验。最后一种疫苗的一个潜在缺点是任何mRNA递送技术都必须应对与自我复制mRNA疫苗相关的显着更大的mRNA构建体大小。与重组蛋白疫苗类似，上述所有mRNA疫苗都具有不产生传染性颗粒的优点。因此，与减毒活病毒疫苗或具有复制能力的病毒载体相关的担忧及其恢复为致病形式或导致某种形式的加重疾病的可能性（如在呼吸道合胞病毒（RSV）减毒活疫苗中观察到的）不适用。与DNA疫苗或某些病毒载体相比，mRNA疫苗的另一个主要优点是没有因整合到受体DNA中而导致插入突变的风险。加快发现和开发时间SARS-CoV-2大流行在全球的迅速传播突出了能够快速部署用于人体试验的疫苗技术的重要性。mRNA疫苗的发展速度如此之快，以至于在非人灵长类动物的研究证实通过感染SARS-CoV-2或通过DNA疫苗可以实现保护性免疫之前，首批产品已经进入临床试验。­­图1所示的时间顺序说明了mRNA公司以前所未有的速度转向生产SARS-CoV-2候选疫苗。Pfizer-BioNTech和Moderna两项独立工作的时间线非常相似，表明监管机构从病原体的基因鉴定到EUA的发展轨迹，比典型的疫苗开发时间短11个月或几年。其他mRNA公司也能够以相对快速的方式利用其先前在疫苗开发方面的专业知识。例如，CureVac宣布批准于2020年6月开始CVnCOV的I期临床研究（NCT04449276），并于一年后获得其第II-III试验的中期结果（HERALD，NCT04652102）；2020年11月9日，Arcturus宣布了ARCT-021（NCT04480957）I期研究的中期结果；Sanofi Pasteur–Translate Bio（NCT04798027）、伦敦帝国理工学院（ISRCTN17072692、Eudract 2020-001646-20）和云南华威生物技术（ChiCTR2000034112）都在SARS-CoV-2序列公布后不到一年的时间内将mRNA疫苗用于人体试验。­COVID-19大流行挑战了疫苗开发的传统方法，并为促进mRNA疫苗研究创造了独特的环境。一个关键的区别是公司从生物医学高级研究与发展局和防疫创新联盟获得的大量注资。突发公共卫生事件推动了开发工作的快速发展，并促使制造商找到缩短临床时间的方法（例如，通过并行化系列开发过程的不同部分，尽量减少试点研究和进行最低限度的产品质量发布测试）；相反，针对已建立疫苗的新mRNA技术的广泛验证（正如之前在mRNA疫苗CV7202与灭活菌株疫苗Rabipur的并行评估中所做的那样）被取消了优先级。制造和扩大规模mRNA（和某些类型的DNA）疫苗的许多优点与制造的速度和灵活性有关，而制造的速度和灵活性在很大程度上取决于含有化学成分的体外过程。由于mRNA编码相关免疫原性蛋白，不需要活病毒，因此不需要专门的设施或生物安全实验室。与以鸡胚为基础的疫苗相比，mRNA疫苗不受鸡胚生产能力的限制，允许对鸡蛋过敏的个人进行疫苗接种。在无细胞系统中生产可将细菌污染的风险降至最低，无需生物反应器工艺。所有基于核酸的疫苗（无论是mRNA还是DNA）都编码感兴趣的免疫原，但其特性独立于该免疫原。具有mRNA平台的不同疫苗的制造依赖于相同的化学成分，这意味着，一旦对该平台进行了投资，就可以很容易地适应新的病原体。在为新出现的流行病或季节性疫苗做好准备的情况下，这是一个特别有吸引力的特点。­此外，相同的制造工艺可用于疫苗和其他基于mRNA的药物，提供了效率和灵活性。鉴于在第一代疫苗推出的同时出现了新的SARS-CoV-2株，这种在同一运载工具中切换编码mRNA的灵活性尤其有用。尽管对制造成本没有达成共识，但预计该技术比旧方法更具成本效益。快速的抗原特异性序列优化mRNA技术的另一个优势是能够在引入核酸变化的基础上设计和重新设计抗原，与不同蛋白质或肽的生物工程相比，这是一个相对简单的过程。对于SARS-CoV-2，则主要是以引入脯氨酸的形式将免疫原性S蛋白稳定在融合前结构中。BioNTech应用了这种技术灵活性，将不少于五种不同的COVID-19 mRNA疫苗候选疫苗投入临床（三种使用核苷修饰的mRNA，一种使用含尿苷的mRNA，一种使用自扩增mRNA）。BNT162b1候选疫苗使用核苷修饰的mRNA编码SARS-CoV-2 S蛋白受体结合域，该结合域通过添加T4原纤维蛋白衍生的foldon三聚体结构域进行修饰，以增加其免疫原性。最终选定的候选基因BNT162b2编码由两个脯氨酸取代修饰的全长S蛋白，以将其锁定在融合前构象中。来自CureVac29、47、Moderna48和Translate Bio49的其他COVID-19 mRNA疫苗也使用经过各种修饰的S蛋白。目前正在开发的几种疫苗至少经历了一个迭代优化步骤，这是mRNA产品开发的一个特点。例如，针对RSV的mRNA-1777在一期试验中进行了测试，临时数据显示，单次给药后通过中和抗体水平测定的体液免疫反应。然而，这种药物的开发已经暂停，转而支持mRNA-1172，在动物模型中，它被证明比mRNA-1777更有效。类似地，寨卡病毒疫苗候选基因mRNA-1325（NCT03014089）的开发也被暂停，取而代之的是mRNA-1893，该基因使用了不同的序列，据报道在非人灵长类动物研究中的效力是mRNA-1325的20倍。截至2020年2月，90名黄病毒血清阳性和血清阴性的参与者接受了mRNA-1893或安慰剂的给药方案，两次给药间隔1个月，剂量分别为10、30和100µg（NCT04064905）。编码多种蛋白质和/或蛋白质亚单位­­对于SARS-CoV-2，S蛋白免疫原是同源三聚体，因此只需引入单个mRNA序列。对于主要免疫原由多个亚单位组成的病原体，生产重组蛋白亚单位并以正确的化学计量将其成功重组为完整蛋白质的挑战很容易想象。相比之下，mRNA很容易用于此应用。单独的亚单位可以编码在单个长mRNA中，也可以作为单独的mRNA链。例如，针对CMV的疫苗mRNA-1647包含六种mRNA，其中五种编码五种不同的蛋白质，结合形成五聚体蛋白质，第六种编码CMV糖蛋白B（gB）蛋白质。在一种相关的方法中，单一疫苗可以针对两种不同的病原体，如mRNA-1653，它结合了两种mRNA，针对人类偏肺病毒（hMPV）和副流感病毒3型（PIV3）的F蛋白。调节mRNA免疫原性除了反复优化序列以优化抗原的免疫原性外，还可以利用完整mRNA转录本本身和其制造过程中产生的其他RNA产物的固有免疫原性来增强对mRNA疫苗的免疫应答。RNA的先天潜在免疫原性在疫苗接种中可能是有利的，因为它可以激活免疫反应途径，如TLR系统，从而导致DC成熟，随后产生强大的B和T细胞免疫反应。如前所述，CureVac的CVnCoV具有未经修改的mRNA。然而，这种RNA驱动的免疫抑制也可能是有害的，导致临床副作用以及相关蛋白的表达减少。例如，RNA依赖性蛋白激酶R（PKR）的激活与翻译抑制有关。­­近年来，学界在如何调节体外转录mRNA免疫原性方面取得了进展。调节mRNA免疫原性的主要方法之一是用化学修饰的核苷酸替代未修饰的核苷酸。Kariko、Weissman及其同事的研究报告称，某些核苷修饰，如假尿苷和5-甲基胞苷，显著降低TLR信号传导和PKR激活，导致小鼠中蛋白质表达水平增加。值得注意的是，BioNTech和Moderna批准的COVID-19 mRNA疫苗（BNT162b2和mRNA-1273）均以尿苷被N1甲基假尿苷完全替代为特征。然而，与带有修饰核苷的mRNA相比，其他人随后证明，未修饰核苷的掺入实际上会导致HeLa细胞中蛋白质表达水平较高，而在小鼠的肝脏中表达水平相似。我们假设，mRNA纯化的改进和RNA污染物的去除可能部分解释了这些与早期工作的差异。通过柱纯化（高压液相色谱（HPLC）或快速蛋白质液相色谱）去除dsRNA，以及最近通过较便宜的过滤结合技术去除dsRNA，可显著提高翻译效率。CureVac的研究人员报告，HPLC纯化、序列优化、未修饰的核苷mRNA没有免疫原性，在小鼠体内产生的蛋白质表达水平高于化学修饰的核苷mRNA。最近， Genentech的科学家报道，白细胞介素（IL）-1β和白细胞介素-1受体激动剂（IL-1RA）是控制系统对mRNA反应的关键调节因子，表明小鼠体内这些调节因子之间的差异，灵长类动物和人类可以解释观察到的尿苷修饰和未修饰mRNA在这些物种体内的反应性差异。­­­­­­­用于 mRNA 递送的纳米制剂尽管早期的mRNA疫苗交付工作主要集中在裸mRNA或鱼精蛋白的使用上，但mRNA疫苗开发的最新趋势集中在mRNA交付的LNP上。早期狂犬病疫苗（CV7201）是用鱼精蛋白配制的，但由于免疫原性水平似乎严重依赖于疫苗接种方法，只有无针系统在皮内（i.d.）给药（NCT02241135）后才能提供所需的免疫反应，因此研发被中断；该产品的开发被暂停，以支持LNP配方的候选疫苗CV7202（NCT03713086）。在其他地方，结合TriMix（三种编码组成性活化TLR4、CD40配体和CD70的mRNA物种的混合物，所有这些都是免疫刺激分子）和HIV免疫原的裸mRNA试剂（iHIVARNA-01）在三次血管内注射（NCT02413645）后对HIV患者的安全性和有效性进行了评估；然而，由于缺乏免疫原性，这项研究已经中止（NCT02888756）。­目前，临床上大多数mRNA药物都使用LNP进行递送。FDA批准的第一种基于RNA的寡核苷酸药物（patisiran，一种用于治疗遗传性转甲状腺素（TTR）介导的淀粉样变性多发性神经病的短干扰RNA药物）是一种LNP制剂，包含可电离脂质d-Lin-MC3-DMA（MC3）和DSPC，胆固醇和1,2-二甲基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（PEG2000-DMG）。BioNTech 的COVID-19疫苗BNT162b2是使用（（4-羟基丁基）氮杂二烯基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）（ALC-0315）、2-（PEG）-2000）-N，N-二贸易酰乙酰胺（ALC-0159）、DSPC和胆固醇配制而成的。看来，在确定进入临床试验的速度方面，识别、测试和生产合适的脂质制剂可能很重要。例如，mRNA-1273使用与mRNA-1647（CMV病毒疫苗）和mRNA-1653（hMPV–PIV3病毒疫苗）相同的LNP，已经建立了一些临床和监管先例（表1）。­­LNP制剂的组合物可显著影响细胞内递送效率，确定递送的细胞特异性并调节免疫原性。尽管所有脂质成分对LNP的功能都很重要，但LNP的可电离脂质成分在RNA传递的多个方面起着关键作用，包括颗粒形成、细胞摄取和内体逃逸，因此受到了广泛关注。在LNP配方中发现的可电离脂质的结构多样性很大，为了促进可电离脂质的快速合成和评估，已经开发了用于合成大型新脂质库并在体内对其进行评估的组合、高通量方法。能够在体内传递mRNA的有效可电离脂质的列表继续扩大，通过引入生物可降解链接，传递载体的效力和耐受性都有所提高。虽然脂质发展的最新趋势集中于加入水解键以促进清除，但这些可降解键可能会影响配方稳定性，这仍然是LNP配方的一个挑战。mRNA LNP冻干的进展似乎有可能改善配方稳定性，但对于低剂量应用（例如疫苗），抗水解脂质可能证明是有利的。­­­­­­除了系统输送的RNA纳米粒外，其他RNA应用模式也有可能为神经系统、眼睛、心脏和肺提供治疗。特别值得注意的是，基于生物可降解聚合物和低聚聚合物以及脂质的纳米制剂已经开发出来，以便于通过雾化输送到肺上皮。例如，囊性纤维化患者反复服用MRT5005，MRT5005是一种LNP配方mRNA的雾化制剂，编码囊性纤维化跨膜调节蛋白（NCT03375047）。­储存和运输与配方相关的一个重要方面是储存和运输条件。2014-2016年埃博拉疫情期间，维持疫苗冷链运输和储存的挑战凸显出来，当时基于减毒重组水泡性口炎病毒（2019年批准为Ervebo）的研究疫苗必须储存在−80°C至−60°C，这在非洲最需要疫苗的地区并不总是可行的。COVID-19影响所有大陆；从全球应急准备的角度来看，当务之急是数百万剂可以在全球范围内，跨越一系列极端温度，运往医疗保健基础设施标准迥异的国家。据报道，CureVac的CVnCoV在标准冰箱温度+5°C（+41°F）下储存至少3个月，在室温下储存最多24小时，在规定的规格范围内保持稳定。Moderna的mRNA-1273在−20°C，最多6个月，在制冷条件下最多30天，在室温下最多12小时。相比之下，BioNTech的疫苗最初需要储存在−70°C时，BioNTech的合作伙伴辉瑞公司开发了含有干冰的特定装运箱，以便于物流配送。随后，申办方提交了额外信息，支持在标准冷冻柜温度下最多储存2周。­­第一次人体试验通常只涉及有限数量的参与者和临床试验地点，有时使用不太理想的配方进行，改善储存条件的开发与临床计划并行进行。例如，摩德纳的mRNA-1647是一种CMV候选疫苗，在I期研究中作为冷冻液体配方提供，但在II期研究中作为冻干配方提供，在冷藏温度下稳定18个月。­­­靶向CMV磷蛋白65 T抗原的mRNA-1443突出了运输、储存和稳定性考虑的重要性。这在与mRNA-1647相同的试验中进行了评估，但2018年8月，mRNA-1443的临床材料在储存1年后未达到内部规范，随后被临床封存。这种疫苗的研制似乎已经暂停。将配方转变为干粉形式是许多药品运输和长期储存最常用的方法之一。然而，冻干过程中结晶和真空脱水产生的应力可能会降低大分子或LNP的稳定性，导致活性损失。据报道，添加适当的低温保护剂，如海藻糖、蔗糖和甘露醇，可以在特定配方的甘露醇中保持LNP的稳定性。辉瑞已经启动了一项III期研究，以比较冻干BNT162b2配方与其冷冻液体BNT162b2配方（NCT04816669）的安全性和耐受性。­给药途径尽管已批准的SARS-CoV-2 mRNA疫苗采用i.m.给药，但对于最佳给药途径尚未达成共识。大流行性流感疫苗的全球推广理想的支持方式是采用低技术的给药途径­只需对众多被要求接种疫苗的医疗保健提供者进行少量培训。通过腹腔注射给药BTN162b2、CVnCoV、ARCT-021和mRNA-1273。伦敦帝国理工学院的一个研究小组正在考虑研究他们吸入后自我扩增mRNA的COVID-19疫苗，类似于对季节性流感所做的研究。吸入疫苗或鼻内疫苗可引起细胞和体液反应，这些反应在中和传染性呼吸道病毒（如SARS-CoV-2）方面特别有效；然而，鼻内mRNA疫苗的研究仅限于临床前动物模型，进一步开发LNP载体可能需要有效靶向上呼吸道的适当细胞类型。­­在更广泛的mRNA领域，i.d.和i.m.注射都用于评估候选疫苗，有时用于同一研究中的同一疫苗。这两种给药途径在免疫原性和耐受性方面可能产生不同的结果。针对H10N8流感毒株的血凝素（HA）蛋白的mRNA-1440（VAL-506440）在健康志愿者（NCT03076385）的一期研究中进行了测试，使用i.m.（25–400µg）和i.d.给药（25–50µg）路线。­­­­与i.m.途径相比，i.d.途径引起的注射部位反应更多，因此没有进行研究，即使在25μg时，它似乎比i.m.途径更具免疫原性。三名接种400µg i.m.疫苗的参与者中有两名经历了头痛和红斑等严重不良反应，安全委员会停止了在此水平下的进一步给药。如我们所见，狂犬病疫苗CV7201仅在通过无针系统注射时才引发免疫反应，这是针对i.m.和i.d.途径（NCT02241135）的。联合国注射了早期HIV疫苗（iHIVARNA-01），但这似乎是唯一的此类研究。目前，注射i.m.似乎是最广泛使用的传染病mRNA疫苗给药途径，与蛋白质和DNA疫苗的情况相同。­给药方案理想的给药方案，尤其是对于全球预防，是单次给药，给药后不久100%血清转化。但由于增强免疫力的现象，大多数给药方案包括至少两次注射，通常间隔几周。SARS-CoV-2 mRNA疫苗也是如此：BNT162b2分两次注射，间隔21天；对于CvnCOv和mRNA-1273，在初始注射4周后进行强化注射。BNT162b2和mRNA-1273获得了各自给药方案的EUA。然而，由于早期疫苗短缺和单次注射后观察到的部分保护，一些人主张免疫更大的人群使用单剂量，而不是为第二次注射保留部分供应，或将注射间隔的时间长于关键临床试验的研究。一项针对80岁以上成年人的小型试验数据表明，两次BNT162b剂量间隔约3个月而非3周，可提高抗体生成峰值，而有关细胞免疫的结果则不太清楚。与此同时，公众越来越认识到，第三次（助推器）射击是为了实现最佳控制。最近的数据显示，疫苗的有效性在6个月后略有下降以及新毒株变体的出现，为这个问题注入了新的紧迫感。­­­自扩增mRNA疫苗，如ARC-021和BNT162c2，打算作为单剂量给予。还描述了更为详细的治疗方案。例如，在I期研究（NCT03382405）中，对健康志愿者施用针对CMV的mRNA-1647，健康志愿者在第0、2和6个月接受了三剂30、90、180或300µg mRNA-1647或安慰剂。RSV疫苗mRNA-1345作为三剂注射方案（间隔2个月）正在一项I期研究（NCT04258719）中进行研究，该方案现已作为单剂方案进入III期。­尽管在技术和抗原选择上有相似之处，但正在研制的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的剂量范围很广。正如基于该技术所预期的那样，自扩增mRNA疫苗每剂使用的量较小：帝国理工学院自扩增mRNA 2019冠状病毒疾病疫苗正在以0.1至1μg的剂量进行试验。ARCT-021在1至10μg的剂量下进行了单次剂量试验，并采用了prime-boost方案；7.5μg的剂量将用于进一步开发。BNT162b2和mRNA-1273分别在30μg和100μg剂量下成功预防了约95%的COVID-19病例。CVnCOV正在进行III期试验，剂量为12μg（NCT04652102）。在SARS-CoV-2领域之外，剂量范围同样广泛。在不同的疫苗中，研究的剂量水平为300倍，从1μg（CV7202）到300μg（mRNA-1653和mRNA-1657）。给药剂量和方案，以及mRNA疫苗的储存物流，对全球免疫计划有着巨大的影响：最具影响力的COVID-19疫苗或针对未来大流行病毒的疫苗可能不是第一个接受EUA的疫苗，而是第一个生产数百万剂并将其有效交付服务点的疫苗。­­作为佐剂的作用如上所述，RNA可以具有固有的免疫激活特性。作为通过天然RNA感应进行免疫刺激的补充或替代，一些研究小组已经在疫苗中添加了刺激分子，以增强对编码抗原的免疫反应，并取得了不同程度的成功。例如，CureVac使用CV8102，一种与阳离子肽载体复合的非编码无盖单链RNA，以增强狂犬病疫苗的免疫原性。CureVac的RNActive疫苗技术平台是之前提到的已停产CV7201疫苗的基础，它依赖于一种双组分mRNA疫苗，其中裸mRNA用于抗原表达，而与鱼精蛋白复合的相同mRNA用作激活TLR7和TLR8信号-ING的佐剂。然后，刺激TLR信号通路导致DC激活，作为鱼精蛋白复合物天然免疫反应的一部分。另一种产品，iHAVARNA-01，结合了编码TriMix的DC激活mRNA物种和编码HIV免疫原的mRNA（来自HIV-1分支A的普遍Gag蛋白和一系列CD8+T细胞表位）。然而，在mRNA疫苗中使用佐剂似乎是一个例外；BNT162b2和mRNA-1273都只依赖mRNA-LNP配方，不使用佐剂，大多数公司在临床上开发mRNA疫苗都遵循无佐剂的方法。这可能是因为LNP成分本身刺激免疫系统的特定元件，如IFN-γ（STING）途径的刺激因子和先天免疫反应的TLR-RIG-I样受体（RLR）-非依赖性介质。纳米制剂既能将mRNA传递到适当的细胞靶点，又能通过设计选择性刺激免疫系统，这是mRNA作为疫苗平台的另一个优势。不良反应由于其作为预防性、非治疗性药物的性质，针对传染源的疫苗具有高标准的安全性和耐受性。迄今为止，本综述中讨论的RNA疫苗的安全性与基于蛋白质的疫苗的安全性一致。局部注射疼痛和局部或全身炎症反应（发热、不适）是最常见的不良反应。这两种COVID-19 mRNA疫苗已接种于300000多名健康志愿者，包括老年人，是评估副作用的最佳数据集，但比较时必须记住，BNT162b2（30μg）和mRNA-1273（100μg）之间的剂量水平（因此给药的mRNA和脂质）有三倍的差异。此外，这些试验有排除标准，排除了一些风险最高的参与者（例如，既往过敏史），因此不一定代表需要保护的全部人群。在BNT162b2和mRNA-1273 III期研究中，超过80%的疫苗接种者报告了局部不良反应，主要是疼痛。全身事件主要为头痛、疲劳、体温升高、肌痛和关节痛。对于mRNA-1273，第二次给药后，不良反应的频率和严重程度往往更为明显。目前尚不清楚mRNA和LNP对这些不良反应的相对作用，因为在这些III期试验中，安慰剂是0.9%的生理盐水，而不是裸mRNA或空LNP。­­­第二次给药后不良反应严重程度的增加可能反映出反应性的增加，并且在mRNA-1647的II期研究的较小数据集中也观察到了这一点。mRNA-1647是一种CMV疫苗，用于CMV阳性和CMV阴性参与者。两个患者组之间的安全性没有差异，但在第二次接种疫苗后，出现更频繁和更严重的不良反应的趋势。­即使是非常大的试验，例如两种mRNA COVID-19疫苗，其检测非常罕见但潜在令人担忧的不良反应的能力也有限。关于年轻男性在接种疫苗后几天到几周内发生心肌炎的报告促使FDA免疫实践咨询委员会审查COVID-19疫苗的益处和风险。根据他们的计算，年轻男性人群患心肌炎的风险最高（预计12-29岁组每百万次接种疫苗39-47次），但其益处（预防11000例新冠肺炎、139例重症监护病房入院和6例死亡）大于风险。­­­­­­癌症治疗疫苗最近，癌症免疫疗法的迅速发展和成功引发了人们对使用mRNA疗法进行此项应用的兴趣（表2）。对于mRNA癌症免疫治疗，一种方法是通过表达缺失或改变的肿瘤抑制蛋白来改变免疫抑制肿瘤微环境。然而，目前的mRNA传递方式不太可能到达患者体内的每一个癌细胞。相反，人们越来越关注使用mRNA作为治疗性疫苗来训练免疫系统寻找并杀死癌细胞。mRNA疫苗的关键特性使其能够成功地作为SARS-CoV-2疫苗和一般传染病疫苗，包括快速开发和制造mRNA药物的能力以及mRNA编码整个抗原的能力，使其作为癌症疫苗的用途特别有希望。此外，许多患者对当前免疫靶向药物具有耐药性的肿瘤，为基于mRNA的方法创造了新的机会。­治疗性癌症疫苗的开发，无论其形式如何，都面临着许多挑战，必须解决这些挑战才能成功地进行临床翻译。与传染病预防性疫苗不同，治疗性癌症疫苗的抗感染保护在很大程度上（如果不是完全的话）是由强大的体液反应提供的，治疗性癌症疫苗还必须确保诱导强烈的细胞毒性CD8+T细胞反应，以根除癌细胞。尽管有可能为癌症接种预防性疫苗，但目前只有两种FDA批准的癌症相关疫苗，这两种疫苗都是针对已知的致癌病毒（人乳头瘤病毒（HPV）和乙型肝炎病毒）。另一个挑战是选择能够诱导高度肿瘤特异性免疫反应的适当抗原，因为不同个体间抗原的高度可变性。越来越多的患者特异性新抗原旨在应对这一挑战。最后，即使抗原能够诱导细胞免疫反应，抑制性肿瘤微环境也可以阻止T细胞浸润到肿瘤中，并可能导致T细胞衰竭。因此，治疗性疫苗可能需要与另一种旨在克服抑制性微环境（如免疫检查点抑制剂）的治疗方法结合使用，如下文所述的BNT111。肿瘤相关抗原肿瘤相关抗原（TAA）优先表达于肿瘤细胞表面，是肿瘤细胞免疫杀伤的靶点。针对TAA的癌症疫苗涉及生产用于多种肿瘤的固定、现成的TAA。其中最先进的是BNT111，它是四种黑色素瘤相关抗原（纽约食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）、酪氨酸酶、黑色素瘤抗原家族A3（MAGE A3）和具有张力蛋白同源性的跨膜磷酸酶（TPTE）的混合物，目前正在1-2期试验（Lipo-MERIT，NCT02410733）中作为单一疗法或与检查点抑制剂联合进行评估。该疫苗以反复静脉注射（i.v.）的形式注射，从一系列八次注射开始，并可能每月额外注射，现在与cemiplimab联合治疗晚期黑色素瘤（NCT04526899）已发展到II期。­­­­上述研究中BNT111的免疫作用已有详细报道。四种TAA的mRNA序列均针对未成熟DC的翻译进行了优化。每个序列还包含一个信号肽和破伤风类毒素CD4+表位P2和P16，以及增强人类白细胞抗原（HLA）呈递和免疫原性的主要组织相容性复合体（MHC）I类转运域。脾脏的F-氟-2-脱氧-2-d-葡萄糖正电子发射断层扫描显示，脾脏的代谢活性增加，从而显示淋巴组织的激活。通过酶联免疫吸附斑点试验，50名接受评估的患者中约75%对四种TAA中的至少一种表现出IFN-γ反应，表明诱导了免疫反应。抗原特异性T细胞为OD1+CCR7−DD27+/−D45RA− 刺激后效应器记忆表型和分泌的IFN-γ和肿瘤坏死因子。在继续接受疫苗接种的患者中，TAA特异性细胞保持稳定，甚至数量增加，而在停止接受维持性疫苗接种的患者中，T细胞保持数月，随后下降。通过将克隆的TAA特异性T细胞受体转染健康供体CD8+细胞，并评估其裂解黑色素瘤细胞系的能力，证明了这些细胞杀伤黑色素瘤细胞的能力。­每次给药后，患者的IFN-α、IFN-γ、IL-6和其他细胞因子的血浆水平均升高，通常在注射后数小时达到峰值，并在24小时内恢复正常。这与观察到的不良反应特征一致，其特征是轻度至中度流感样症状，同样短暂且具有自限性。首次对42名患有放射图形可评估疾病的患者进行评估令人鼓舞。在接受疫苗单一疗法的25名患者中，3名患者出现部分反应，7名患者出现稳定反应，而接受疫苗-抗PD1联合疗法的17名患者中，有6名患者出现部分反应。一个有趣的观察结果是，两名在接受抗PD1治疗期间有所进展并接受过疫苗单一治疗的患者后来再次对抗PD1治疗作出反应，这与诱导的T细胞属于PD1+效应记忆表型的观察结果一致。BNT111目前正在进行黑色素瘤的II期研究（NCT04526899）。mRNA-5671（V941）是一种串联体，设计用于向免疫系统呈现KRAS抗原，并编码四种最常见的KRAS替换（G12D、G12V、G13D、G12C）。目前正在进行一期研究（NCT03948763），作为单一疗法，并与pembrolizumab联合使用。­­其他示例包括BNT112（编码五种前列腺癌特异性抗原）和BNT113（编码HPV16衍生的肿瘤抗原E6和E7（病毒癌蛋白））、BNT114（编码所选乳腺癌抗原的混合物）和BNT115（编码三种卵巢癌TAA编码RNA物种的混合物）。CureVac对编码TAA的未修饰mRNA物种进行了早期研究，包括作为免疫治疗方案的自体扩增肿瘤mRNA的裸mRNA物种、编码六种肾癌相关抗原的裸mRNA 和六种不同黑色素瘤相关抗原（NCT00204516、NCT00204607）的鱼精蛋白稳定mRNA。这些研究主要提供所用制剂的安全性和耐受性信息。研究肿瘤相关抗原的其他研究包括CV9103（前列腺癌四种抗原的混合物）、CV9104（前列腺癌六种不同抗原的混合物，由六种不同的mRNA物种编码和CV9201（五种非小细胞肺癌抗原的混合物）。所有这些项目和/或候选药物似乎都已停止开发。CV9202包含六种mRNA物种，它们编码六种不同的抗原（NY-ESO-1、MAGE C1、MAGE C2、滋养层糖蛋白（TPBG（5T4））、survivin和黏蛋白-1（MUC1）），目前仍在进行研究（NCT03164772）。­­­个性化新抗原在癌变过程中，恶性细胞获得体细胞突变，导致产生正常细胞不表达的蛋白质序列。这些蛋白质通过蛋白酶体加工成肽，呈现在与MHC I类受体结合的细胞表面，并在那里被T细胞受体识别。这些新抗原通常对每个患者都是独特的，因此代表了与肿瘤特异性和患者定制免疫治疗相关的机遇和技术挑战。­­­为了产生针对患者特异性新抗原的mRNA疫苗，切除单个患者的肿瘤，并通过下一代测序鉴定患者特异性新抗原。然后将编码这些新抗原的mRNA注射到同一名患者体内，期望它能诱导免疫反应，攻击患者的肿瘤。当然，整个过程必须花费最少的时间，以便在癌症发展和进展之前对患者进行治疗，据报道，治疗周期短至30-40天。这给制造业带来了额外的挑战，制造业必须满足人类使用试验产品的标准。­迄今为止，个性化新抗原疫苗的大部分工作涉及基于肽的新抗原疫苗而非mRNA疫苗的部署；总的来说，这些方法取得的成功有限。具有最高突变负担的肿瘤，理论上是这种新抗原方法的最佳候选，也最有可能对治疗产生耐药性。与肽疫苗相比，我们假设mRNA编码的新抗原疫苗具有适当的免疫刺激，可能提供更强的免疫原性反应和临床益处。与基于肽的疫苗不同，mRNA可以编码整个抗原，从而确保呈现多个表位，而不局限于定义的HLA型。此外，mRNA可以合成表达多种新抗原，既可以作为单独的分子，也可以作为多个编码序列的串联。某些类型的肿瘤可产生多达几十种新抗原，从诱导广泛免疫反应的角度来看，表达可能引起T细胞反应的多个表位是可取的。­­­­­­BioNTech已经开发了几种用于治疗癌症的临床新抗原候选疫苗。通过对13例转移性黑色素瘤（NCT02035956）患者的腹股沟淋巴结重复给药研究BNT121。这项研究的结果令人鼓舞，有强大的免疫反应和一些临床活动的证据。BNT122（RO7198457）可包含多达20个个体化患者新表位，静脉注射，目前正在四项研究中进行评估（表2）。初步结果表明，BNT122，无论是否含有抗PD-L1抗体阿替唑单抗，都具有可接受的安全性，主要是短暂的不良反应，如输液相关反应和/或细胞因子释放综合征，表现为发热和寒战。BNT122也正在胰腺癌I期研究（NCT04161755）中进行评估，非小细胞肺癌研究（NCT04267237）以及一项未公开的辅助指标研究预计将很快开始。­­­­­­mRNA-4157是另一种个性化的癌症疫苗，可包含多达34种编码在单个mRNA链上的新抗原（“新抗原结合物”），并在LNP中配制并经静脉注射。该药物目前正在对切除的原发性实体瘤患者（单药治疗）和转移性未切除肿瘤患者进行1期研究（NCT03313778）。截至2020年2月，据报道共有71名患者接受了至少一剂mRNA-4157。最常见的不良反应是疲劳、注射部位疼痛、结肠炎和肌痛。同时，还正在进行一项随机2期研究，将其作为辅助药物与彭布罗利珠单抗联合用于高危黑色素瘤患者（NCT03897881）。化合物NC-I4650与mRNA-4157密切相关，主要区别在于使用的新抗原选择方案。­­­新抗原疫苗依赖于患者特异性mRNA序列的快速转变，肯定受益于mRNA–LNP平台固有的灵活性和速度。最后，肿瘤学中的各种给药途径值得注意：瘤内给药、i.n.和i.v.或i.m.，其中一些相同的LNP用于多种给药途径。这表明单一候选药物具有广泛应用的潜力：不能通过直接瘤内注射达到或没有可触及淋巴结的肿瘤可能仍然对静脉注射或注射相关mRNA疫苗有反应。目前的挑战是确定最有效的蛋白质或蛋白质组合进行编码，以引导免疫系统攻击癌症，使免疫系统能够深入肿瘤并为每位患者提供个性化的治疗。蛋白质和细胞免疫疗法一个新的兴趣领域是使用mRNA给药，以产生治疗水平的免疫或免疫调节蛋白（表3），如抗体或细胞因子。与传染病和癌症疫苗相比，需要生产更多的蛋白质才能使此类治疗有效，在某些情况下，可能需要终身重复给药治疗。­­­蛋白质免疫疗法的另一个挑战是将mRNA输送到所需的器官和细胞类型，以实现最佳的治疗效果。例如，某些表达的蛋白质需要进一步的PTM，如糖基化和蛋白水解处理，才能发挥完全的功能。然而，PTM对蛋白质的形成方式可能是组织依赖性的，并且可能不是简单地由mRNA序列决定的，因此强调需要组织特异性地传递mRNA。­­当mRNA物种与LNP复合系统给药时，由于载脂蛋白E与LNP表面结合，导致肝细胞受体介导的摄取，许多物种倾向于回到肝脏。非肝器官选择性可以通过改变脂质成分来实现，包括调整脂质比例和特性，从而产生靶向肺内皮或脾脏的LNP。最近，通过调节PEG脂质结构改变LNP表面化学，导致LNP靶向造血干细胞生态位中的骨髓内皮细胞。­因此，与疫苗相比，mRNA蛋白质免疫治疗在传递、蛋白质生产效率和耐受性方面提出了一些独特的挑战。这可以解释为什么mRNA的应用进展比mRNA免疫慢。mRNA编码的单克隆抗体治疗通过直接注射将mRNA传递到特定组织或器官是一大障碍。相反，暴露可以简化临床应用，只要它是安全的，并且表达足够水平的蛋白质以获得治疗效果。在mRNA药物中编码单克隆抗体（mAb）就是这种方法的一个例子，并以mRNA-1944为例，mRNA-1944是一种mRNA–LNP，编码一种抗基孔古亚病毒的中和mAb，在一名免疫患者（NCT03829384）中鉴定。第一批接受治疗的健康志愿者的结果表明，在所有试验剂量下（0.1、0.3和0.6 mg/kg，静脉注射），都可以检测到中和单克隆抗体水平。然而，在最高剂量时，四名受试者中有三名出现输液相关反应，其中一名受试者出现3级心动过速和白细胞计数升高，心电图上还有2级恶心、呕吐、发热和短暂的倒置T波。同一剂量水平但经类固醇预处理的单独队列没有3级不良反应，但产生的基孔肯雅特异性抗体（Chikungunya-specific antibodies）（Emax）水平较低1.7倍。一个队列的数据显示，两次给药0.3 mg/kg，间隔2周，第一次给药与第二次给药后，不良反应没有恶化，也没有脂质积聚。­­­­利用mRNA生产抗体的应用仍然令人感兴趣，目前正在进行多个行业合作，例如CureVac和Genmab（基于mRNA的抗体抗癌疗法148）之间的合作，以及Neurimmune和Ethris（编码抗SARS-CoV-2单克隆抗体的吸入式mRNA（参考文献149））之间的合作。这里一个重要的考虑因素是从mRNA表达单克隆抗体的好处，而不是使用通过传统重组制造的相同抗体。最终，最有希望的方法将是所需剂量、作用持续时间、所需PTM类型以及输送系统和相关抗体的相对治疗指数比的函数。­­mRNA编码的免疫刺激蛋白用于癌症治疗另一种抗癌方法是注射预期具有直接治疗效果的mRNA编码蛋白，通常通过刺激免疫系统，如OX40配体（OX40L）或IL。其中一种产物mRNA-2416是编码免疫检查点调节器OX40L的mRNA，在肿瘤内给药。尽管首次报道的41名患有多种恶性肿瘤的患者的单药治疗结果不符合实体瘤部分疗效的疗效评估标准，但申办方目前正在将其纳入与杜洛单抗联合治疗卵巢癌的II期扩展队列（NCT03323398）。其他mRNA产物编码几种不同的免疫调节蛋白。一个例子是ECI-006，它是TriMix（编码DC激活分子（CD40L、CD70和caTLR4）的mRNA物种）和编码黑色素瘤特异性TAA（酪氨酸酶、gp100、MAGE A3、MAGE C2和PRAME）的mRNA的组合，该药物经静脉注射，正在切除黑色素瘤的I期研究（NCT03394937）中进行测试（TriMix单独用于乳腺癌的I期研究（NCT03788083）并给予瘤内注射）。另一个例子是mRNA-2752（编码OX40L、IL-23和IL-36γ的三种mRNA物种），它正在实体瘤和淋巴瘤的剂量递增研究（NCT03739931）中进行评估。类似地，BNT131（SAR441000）编码IL-12sc、IL-15SUSH、IFN-α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），目前正在研究作为一种旨在改变肿瘤微环境的瘤内注射。另一类产品是免疫调节融合蛋白。MEDI1191编码含有IL-12α和IL-12β亚单位的单链融合蛋白，亚单位之间有连接子。该药物是为肿瘤内注射而开发的，目的是与全身注射重组IL-12相比，提高耐受性。过继免疫细胞治疗中的mRNA过继细胞移植是一种相对较新的治疗方法，涉及收集和使用患者自身的免疫细胞来治疗癌症。这一点已在乳腺癌患者中进行了探索，Tchou等人观察到，肿瘤内注射转染了编码c-Met嵌合抗原受体（CAR）mRNA的T细胞的耐受性良好，并在乳腺癌肿瘤组织内诱导炎症反应；同样，Maus等报告了四名接受电穿孔自体T细胞治疗的个体，电穿孔的mRNA编码一种来自人类间皮瘤特异性小鼠抗体的CAR。其中一名受试者在第三次输注后几分钟内出现过敏反应和心脏骤停，作者将其归因于产生免疫球蛋白（Ig）E型人抗小鼠抗体（NCT01355965）。最近，Beatty等评估了转染了编码间皮素导向CAR的mRNA的T细胞作为胰腺癌的治疗，避免了T细胞启动；在I期研究中，这些细胞不会诱发细胞因子释放综合征，也不会引发神经症状。­­过去，利用逆转录病毒基因转移成功地生成了CAR T细胞，最近又利用CRISPR–Cas9介导的基因整合系统成功地生成了CAR T细胞。据报道，不仅使用mRNA，而且使用核糖核蛋白介导的传递系统都取得了成功。然而，如上所述，我们在体内中看到了生成CAR T细胞的潜力。尽管核糖核蛋白在体内的功能传递尚待描述，但最终，假设可以证明向T细胞安全有效地传递，mRNA在负载能力和氧化方面可能比病毒传递具有实质性优势。还描述了能够促进体内递送至多类免疫细胞的纳米制剂，包括巨噬细胞、B细胞和T细胞，为一系列免疫疗法提供了希望。例如，通过T细胞靶向mRNA递送，体内CART细胞的产生可能成为可能，从而为癌症创造新的治疗方法。通过识别有利于向这些细胞递送的特定脂质结构，已经实现了将LNP重新靶向T细胞。此外，靶向抗体的mRNA纳米颗粒（通过表面偶联赋予其特异性）能够对免疫细胞特异性受体（如CD4）具有亲和力。对于旨在在体内编辑免疫细胞的疗法，mRNA可能允许基因组编辑核酸酶或碱基编辑器的瞬时表达，由于RNA降解，它们会在细胞中短暂地持续表达。尽管到目前为止，已发表的关于将mRNA递送至T细胞的报告仅显示了体外绿色荧光蛋白标记物的破坏，但通过将mRNA全身递送至肝细胞的基因编辑成功已经在人类TTR淀粉样变性中得到证实，其中mRNA编码Cas9蛋白的LNP与靶向TTR的引导RNA一起被递送。在患者中，血清TTR蛋白浓度与基线相比呈剂量依赖性平均降低，只有轻微的不良反应。这一令人印象深刻的结果暗示了mRNA在系统基因编辑中的未来潜在用途。结论和未来方向mRNA在基因疗法和蛋白质疗法之间占有独特的地位，它结合了两者的许多优点，同时解决了任何一种面临的独特挑战。例如，对生物反应器中的生产造成无法克服的技术挑战的多聚体蛋白可以在患者自己的身体中通过编码不同亚基的mRNA或mRNA种类的组合来生产，这是一个已在候选者中使用的灵活性机会CMV疫苗和癌症应用，随着世界正在努力应对不同SARS-CoV-2毒株的出现，这些毒株对授权的SARS-CoV-2疫苗具有不同的敏感性。随着该领域对技术的优化和改进，mRNA药物很可能也将被开发用于传染病和癌症以外的适应症。靶蛋白表达的固有短暂持续时间使mRNA治疗成为需要单次或不超过少量蛋白质表达的情况的理想方式，例如传染病疫苗。重复给药、滴定剂量或改变给药间隔的能力为临床医生提供了经典药物治疗的灵活性，使其成为个体患者需求可能不同或对基因治疗可能存在犹豫的适应症的有吸引力的选择。从安全的角度来看，对于两个疫苗项目（SARS-CoV-2的mRNA-1273和mRNA-1647），似乎第二剂后的不良反应比第一剂后更明显。然而，这似乎不是一个普遍的观察结果。癌症疫苗BNT111已被给予超过8剂的一些患者，并且明显保持疗效。吸入mRNA治疗剂MRT5005每周给药多达五剂，在第一剂和第五剂之间没有出现安全性恶化的迹象。通过对工程化、非人类和人工蛋白质构建体的评估，mRNA疗法的潜力将进一步扩大。蛋白质治疗剂已被设计用于延长半衰期，例如，通过将Fc域与治疗域融合。同样可以在mRNA疗法中编码。也许更令人兴奋的是表达新细胞内疗法的能力。来自mRNA的基因编辑机制的瞬时表达对于减少持续表达的副作用很有吸引力。此外，抗体、抗体片段或其他蛋白质结合基序的细胞内表达提供了一种独特的治疗类别，可以与亚细胞定位结构域（例如细胞核）结合，以集中编码蛋白质的作用。mRNA的首次应用涉及刺激免疫系统，用于传染病疫苗或癌症疫苗。传染病应用一直是平台的试验场；迄今为止，癌症疫苗作为一个类别并不是特别成功，但BNT111令人鼓舞的结果暗示了高蛋白表达和免疫激活途径的结合可能会克服早期蛋白疫苗遇到的一些障碍。由于RNA通过TLR和RIG-I通路激活免疫通路的内在能力，在产品中利用RNA的免疫刺激特性非常有意义。这与编码蛋白无关，如CV8102所示，这是一种用作免疫佐剂的非编码RNA。在审查已进入临床试验的mRNA候选药物的安全性和耐受性概况时，这种免疫刺激特性的缺点就很明显了。新出现的情况是，与mRNA药物相关的最常见的不良反应是某种形式的炎症反应。这种潜在的途径可以通过多种方式表现出来：肌肉注射或皮下注射时的局部反应（局部疼痛、发红、酸痛），或者更广泛的发热综合征或静脉注射、肌肉注射或吸入药物的流感样反应.这些似乎通常可以用经典的抗炎药治疗，尽管在静脉注射编码基孔肯雅特异性mAb的mRNA的情况下，预防性类固醇的使用被用来减轻在接受最高剂量的队列中观察到的不良反应。这种干预似乎确实成功地抑制了不良反应，但也与蛋白质表达的减少有关。这些数据为研究重复给药mRNA疗法的一些潜在未来方向提供了有趣的见解。类固醇对于减轻mRNA编码的蛋白质疗法的炎症副作用谱是否有效并且是必需的？如果是这样，这是否以减少蛋白质表达为代价？同时观察到较少的副作用和减少的表达是否暗示一定程度的炎症实际上可能是良好蛋白质表达的先决条件？如果是这种情况，一个临床挑战将是穿上那根针并允许启动足够的亚临床炎症过程以促进良好的转化，而不会让它们上升到危及重复给药的临床可行性的严重程度。这些问题有些复杂，因为大多数mRNA应用不涉及简单的裸mRNA，而是封装在LNP或PNP中的mRNA，所有这些都有助于耐受性。已提议在临床试验的对照组中使用不含mRNA的“空LNP”，以帮助阐明mRNA与LNP对耐受性曲线的不同贡献。这种方法的一个理论上的限制是，当没有与带负电荷的mRNA复合时，空LNP具有不同的物理化学性质，因此不代表真正的比较器。尽管在单剂量（疫苗接种）或危及生命的疾病（肿瘤学）的情况下，短暂的炎症反应是可以接受的，但对于需要长期治疗的适应症，尤其是静脉给药时，选择适当的、耐受性良好的和安全的脂质和配方至关重要。似乎动物实验在这里的价值有限，因为注意到在人类中引发细胞因子释放的癌症疫苗BNT111的浓度在人类中比在小鼠中低1,000倍以上，并且在吸入后观察到的发热反应MRT5005不是基于动物毒性实验预测的。除了直接耐受性之外，还必须解决有关脂质积累潜力的长期问题。如果产生的蛋白质的半衰期短，那么维持表达和临床疗效所需的给药间隔可能比消除脂质的理想时间短。因此，重复给药可能导致靶组织或脱靶组织中的脂质积累，具有难以预测的长期安全风险。制剂科学将成为mRNA治疗学未来的一部分，就像进一步了解mRNA本身的生物学一样。引入临床的不同给药途径也说明了mRNA治疗的非凡潜力：i.m.、i.d.、皮下、i.n.、瘤内、i.v.、心外膜和吸入。其他应用很容易想象：鼻内疫苗、滴眼剂或滴鼻剂、皮肤软膏、栓剂、膀胱内滴注溶液、鞘内给药装置或Ommaya储液罐。我们相信未来mRNA治疗的广度将由递送纳米颗粒的进步来定义。越来越多的证据表明，可以对LNP和PNP进行工程改造，以输送到包括肝脏在内的一系列身体组织、内皮、肺、骨髓和免疫系统的多种元素。通过改进的递送材料和包含额外的靶向元件在效力和组织靶向方面的额外进展将继续为mRNA治疗的新治疗应用打开大门。两种接受EUA的SARS-CoV-2疫苗的成功凸显了mRNA的制药优势之一：临床试验材料的生产速度。最初开发用于将个体化新抗原疫苗从切除的患者肿瘤快速转变为可注射的临床产品的制造技术已通过在SARS-CoV-2发布后数周内启动候选mRNA疫苗的临床试验来证明其潜力序列。同时，我们在COVID-19疫苗方面的经验也凸显了该技术目前的局限性之一：对冷链储存和运输的依赖。能够处理-80°C温度的冷冻机是专用设备，并非在每个药房或临床试验场所都容易获得。对于打算在患者家中自行给药的治疗，即使在-20°C下储存也可能具有挑战性。将mRNA药物从实验室带到床边的下一个前沿领域很可能是制剂科学。在生产COVID-19疫苗的竞赛中，mRNA作为一个安全有效的平台的出现，为全世界提供了关于mRNA-LNP技术的益处和风险的加速教育。尽管BNT121和mRNA-1273的生产速度和储存条件以及两剂方案的副作用已经引起了很多关注，但科学和医学界正在关注这两种疫苗之外，并急切地等待进一步验证其他适应症的mRNA药物。原文标题：The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。