Angiotensin II Acetate

安捷伦随机突变技术助力 GPCR 功能恢复与定向进化——从酵母筛选到药物靶点优化 G 蛋白偶联受体（GPCR）作为人体内最大的蛋白质家族，是当前药物研发的重要靶点，约三分之一的已上市药物以其为作用目标。然而，GPCR 在异源表达系统中常面临功能丧失或稳定性不足的挑战，尤其在酵母这类便捷表达宿主中。如何在不改变其天然配体结合与信号传导特性的前提下，恢复或增强其功能，一直是蛋白质工程与药物发现领域的关注焦点。 近年发表于《Scientific Reports》的一项研究中，东京理科大学的团队通过“易错 PCR（error-prone PCR）结合体内筛选策略”，成功恢复了在酵母中丧失信号传导活性的“人源组胺 H₃ 受体（H₃R）”。该研究不仅为 GPCR 的功能恢复提供了可行路径，也展示了随机突变技术在膜蛋白工程中的强大应用潜力。 研究背景与方法流程 研究中，团队选用了酿酒酵母（S. cerevisiae） YB1 工程菌株，该菌株携带人源化 Gα 嵌合蛋白，可与外源 GPCR 偶联并激活下游报告基因 HIS3 的表达，从而在组氨酸缺陷培养基中实现基于受体活性的生长筛选。 最初，野生型 H₃R 在酵母中虽能表达，却无信号传导活性。为此，研究团队采用了以下关键步骤： 1. 构建受体突变库 使用“安捷伦 GeneMorph II 随机突变试剂盒”对 H₃R 基因进行错误倾向 PCR，在第三胞内环缺失的受体变体（H₃R_13d）中引入随机突变，构建多样性突变库。 2. 酵母体内筛选 将突变库与线性化载体共转化酵母，并在含有组胺（激动剂）的组氨酸缺陷培养基中进行筛选。最终从约 11 万个转化子中，筛选出 7 个在组胺依赖下恢复生长的克隆。 3.突变位点鉴定与功能验证 测序分析发现多个突变位点，其中四个关键突变（L73M、F193S、S359Y、C415R）被证实对活性恢复至关重要。进一步实验表明，这些突变体仍保留对 Gᵢ 蛋白的特异性偶联能力，且配体结合特性与野生型相似。 关键发现与机制解析 突变集中于激活相关结构域 其中 L73M、S359Y 和 C415R 位于 GPCR 高度保守的 DRY 与 NPxxY 基序附近，这些区域与受体激活过程中的构象变化密切相关。突变引入的侧链体积增大或电荷变化，可能促进受体从失活态向激活态转变。 功能保留与特异性不变   突变体在酵母中仍特异性响应 Gᵢ 蛋白通路，且对不同激动剂和拮抗剂的响应趋势与哺乳动物细胞中报道的一致，说明突变并未改变受体的基本药理特性。 为稳定化构象提供新思路   该研究提示，通过随机突变与功能筛选，可在酵母中直接获得处于“活性构象”的 GPCR 突变体，这为后续开展结构生物学研究（如冷冻电镜、晶体学）提供了更稳定的蛋白样品来源。 这项研究展示了，酵母作为 GPCR 功能进化平台的实用性与高效性，随机突变结合体内筛选是恢复膜蛋白功能的可行策略；安捷伦随机突变技术在该流程中起到关键作用，为后续其他 GPCR 或难表达蛋白的功能研究提供技术支撑。未来该策略可扩展至更多在酵母中失活的 GPCR，甚至用于设计稳定在活性构象的受体突变体，助力基于结构的药物设计与膜蛋白动态学研究。 技术亮点： 安捷伦随机突变技术的应用价值 本研究使用了“安捷伦 GeneMorph II 随机突变试剂盒”，该试剂盒通过优化突变率与保真度平衡，可在目标基因中高效引入多样性的点突变，兼顾突变库的质量与数量，非常适用于膜蛋白等难表达靶点的定向进化。 在 GPCR 工程、酶功能改造、抗体亲和力成熟等领域，类似的随机突变与筛选策略已逐渐成为标准化流程。安捷伦提供的不仅是一个突变试剂盒，更是一套支持“蛋白质功能复活、稳定性提升与信号通路重构”的整体解决方案。 从酵母展示到结构解析：安捷伦突变试剂盒助力解锁 GPCR 激活新机制 在心血管疾病与肾脏功能调控中，血管紧张素 II 型 1 受体（AT1R）扮演着至关重要的角色，是重要的药物靶点。然而，由于其结构的动态性与复杂性，尤其是活性状态下与肽类配体的结合机制长期处于“黑箱”状态。一项发表在《Cell》上的突破性研究，利用“合成纳米抗体（Nanobody）稳定技术”，首次解析了人源 AT1R 在活性状态下与肽类配体的高分辨率晶体结构，揭示了其独特的激活机制。 本研究的关键技术环节之一——对纳米抗体进行“亲和力成熟”——正是借助“安捷伦 GeneMorph II 随机突变试剂盒”完成的，体现了高效、可控的体外突变策略在现代结构生物学中的强大助力。 导言背景： AT1R 与 GPCR 结构生物学的挑战 G 蛋白偶联受体（GPCR）是人类最大的膜蛋白家族，调控着几乎所有生理过程。AT1R 作为其重要成员，是高血压、心力衰竭等疾病的核心治疗靶点。传统拮抗剂（ARBs）虽广泛应用，但揭示其与内源性肽类激动剂（如 AngII）结合并激活受体的精确三维结构，对于理解受体功能、开发新型（尤其是偏向性）药物至关重要。 然而，获得活性态 GPCR 的晶体结构极其困难。受体本身构象高度动态，且肽类配体结合诱导的构象变化使得晶体形成难以捕捉。传统的基于动物免疫的纳米抗体获取方法在该受体上屡屡失败。本研究团队另辟蹊径，采用“合成酵母展示纳米抗体库”进行体外筛选，并运用“安捷伦突变试剂盒”对先导抗体进行快速优化，最终成功攻克了这一难题。 研究流程： 从纳米抗体筛选到结构解析 1.“合成纳米抗体库筛选” 利用已构建的合成酵母展示纳米抗体库（含 5×10⁸ 克隆），通过磁激活细胞分选（MACS）和流式细胞分选（FACS），成功筛选出可特异性结合“激动剂（AngII）”结合态 AT1R，而不结合“拮抗剂”结合态的纳米抗体 Nb.AT110。 2.“亲和力成熟（关键步骤）” 虽然 Nb.AT110 具有优异的选择性，但其亲和力不足以用于结晶。研究团队随即对其进行亲和力成熟。他们使用“安捷伦 GeneMorph II 随机突变试剂盒”对 Nb.AT110 的基因进行易错 PCR，构建了突变文库（1.5×10⁸ 克隆）。随后通过两轮基于低抗原浓度的 FACS 筛选，富集到了高亲和力克隆。测序分析发现四个高频突变位点（A31V, N58D, I98V, Y113N），将其组合后得到了亲和力提升超过 100 倍的优化变体—“Nb.AT110i1”。安捷伦试剂盒在此过程中提供了高效、稳定的突变引入，是获得高品质结晶用抗体的技术保障。 3.“受体工程化与复合物制备” 为避免先前结构中所用受体构建体对配体亲和力的负面影响，团队设计了将融合蛋白（BRIL）插入第三胞内环的新 AT1R 构建体。将纯化的受体、部分激动剂肽 S1I8 以及 Nb.AT110i1 纳米抗体在体外组装成复合物。 4.“晶体生长与结构解析” 采用脂质立方相技术成功获得了复合物晶体。通过 X 射线衍射，最终在 2.9 Å 分辨率下解析了 **AT1R–S1I8–Nb.AT110i1** 的三元复合物晶体结构。 关键解析： 独特的激活机制与肽结合模式 肽结合模式的革新认知 肽 S1I8 以伸展构象结合，其 N 端与受体 N 端及胞外第二环（ECL2）共同形成了一个“部分 β -桶状结构”。这种“ β 链加入”的结合模式在肽能受体中可能是普遍策略，但在此前未被清晰揭示。 激活机制的独特性 研究发现 AT1R 的激活由肽 C 末端第 8 位异亮氨酸（I8）引发的“立体碰撞”启动，进而通过 TM5 / TM6间的苯丙氨酸“棘轮”（F208/F249/F250）等一系列独特的构象锁进行传递，最终导致 TM6 的外移和 TM7 的内移，形成经典的活性胞内表面。这一机制显著不同于以往研究较多的生物胺类受体。 钠离子结合位点的替代方案 在大多数 GPCR 中，保守的钠离子结合位点（涉及 N3.35 和 S7.46）有助于稳定非活性态。而在 AT1R中，S7.46 被天冬酰胺（N295）取代，形成了直接的 N111–N295 氢键来稳定非活性态，从而“规避了对钠离子的依赖”。这解释了为何 AT1R 的配体结合通常不受钠离子调节。 为偏向性信号提供结构基础 研究表明，肽 C 末端第 8 位残基的大小直接影响激活信号的“偏向性”。该结构显示，较小的侧链（如 I8，或更小的 Ala）无法像 AngII 的 Phe8 那样完全触发前述的构象锁级联反应，这从结构上解释了为何某些 AngII 类似物（如 S1I8）是 Gq 信号的部分激动剂，而更小的类似物则可能倾向于激活 β-arrestin 通路。 结果与意义 本研究首次获得了肽类激动剂结合的活性态 AT1R 高分辨率结构；揭示了一种全新的 GPCR 激活与肽结合机制，扩展了对 GPCR 家族功能多样性的认知；展示了“合成酵母展示纳米抗体库”结合“安捷伦体外突变技术”，作为一种强大、通用的平台，可用于获取稳定特定构象的动态膜蛋白（如 GPCR）结构，突破了传统免疫方法的局限；为基于结构的 AT1R 偏向性药物设计提供了精确的分子蓝图。 展望： 开启精准药物设计新篇章 这项研究不仅深刻阐释了 AT1R 的生物学机制，更展示了一条通往复杂膜蛋白结构解析的通用技术路径。未来，利用类似的“合成纳米抗体+体外进化”策略，有望解析更多 GPCR 与其他动态蛋白在不同功能状态下的结构，特别是那些被“偏向性配体”稳定下的独特构象。 对 AT1R 而言，下一步的关键在于解析其与 β-arrestin 等不同效应器结合的复合物结构，从而在原子层面完整描绘“配体结构-受体构象-效应器选择-细胞功能”的全景图。这将极大推动针对心血管疾病、乃至更多 GPCR 相关疾病的“新一代精准、高效、低副作用药物”的研发进程。 内容引自：优宁维分子生物学公众号 关于安捷伦细胞与基因组学 秉持专业赋能理念，聚焦基础研究、转化医学、生物制药、农业、微生物、应用检测等核心客户，整合微孔板成像、细胞能量代谢、流式细胞术、二代测序、核酸蛋白分析等领域的前沿技术资讯、行业动态、应用案例及市场活动信息，为客户提供全方位、高质量的信息支持。同时构建高效信息通路，成为客户获取安捷伦细胞与基因组学相关服务及资源的重要平台。 长按识别二维码，关注安捷伦细胞与基因组学