Vinpocetine

背景 活性导向蛋白质组学（Activity-Based Protein Profiling, ABPP）技术，由Benjamin F. Cravatt教授于1999年在《Science》期刊首次提出。该技术最初聚焦于蛋白酶的靶向捕获与活性鉴定，而在随后十年间，随着两步法策略的建立、点击化学（Click Chemistry）的引入以简化探针合成流程、以及光反应基团的联用等技术革新，ABPP的应用边界被不断拓宽，成功实现了全蛋白质组范围内非共价配体-蛋白相互作用的精准发现，成为药物从头研发与结构优化领域的核心利器。  在ABPP技术的研究脉络上，本研究第一通讯作者、来自斯克里普斯研究所（Scripps Research）的Christopher G. Parker教授及其团队于2017年在《Cell》期刊提出了全功能片段（FFF）探针技术[1]。该技术创新性地将分子量约200 Da的化学砌块改造为全功能片段探针（Fully Functionalized Fragment Probes），旨在实现人类蛋白质组层面的广谱配体挖掘。依托这一核心技术，团队已成功开发出SLC15A4的首个共价抑制剂[2]，为相关疾病药物研发提供了全新靶点与先导化合物，充分彰显了其研究在探针技术创新与转化应用方面的显著潜力。 不过，FFF探针仍存在明显局限：这类探针多为商业化的富芳烃低分子量片段，不仅存在结合亲和力低、作用靶点谱混杂的问题，还因结构过于简单而难以进一步优化选择性与活性。与此同时，相较于传统高通量筛选，蛋白质组学筛选的通量相对较低，这对探针文库的设计提出了更高要求。 在此背景下，天然产物（NPs）的独特优势逐渐进入研究视野。历经亿万年自然选择的天然产物，具备无可比拟的“优势架构”：其骨架富含sp³碳且结构多样、立体化学复杂度高、氧合程度与极性表面积适配生物体系、可旋转键数量少，这些特性使其极易与生物大分子产生特异性功能性结合，是构建新型化学探针的理想模板。值得注意的是，此前天然产物在化学蛋白质组学领域的应用多集中于作用机制解析，而本研究则另辟蹊径，创新性地利用天然产物的结构优势构建探针文库，为拓展人类蛋白质组的化学可靶向范围开辟了全新路径。 方法 研究团队以萜类（硬壳藻内酯、樟脑酸、异冰片乙酸、雪松醇、石竹烯）和生物碱（育亨宾、长春西汀）两类天然产物为核心骨架，通过半合成策略构建了含30个成员的全功能天然产物（FFNP）探针文库。 图1.以市售天然产物原料经半合成法制备全功能天然产物（FFNP）文库 FFNP探针整合两大关键组件：一是兼具光活化重氮环丙烷基团和正交炔烃手柄的全功能标签，可通过点击化学实现荧光基团或生物素的偶联，用于蛋白可视化或富集；二是天然产物来源的“分子识别”基团，保障与蛋白的特异性相互作用，对天然产物探针立体构型的差异化修饰参考了该课题组先前的一项研究。[3] 研究先在HEK293T细胞中通过凝胶电泳进行FFNP-蛋白相互作用的定性分析，再利用串联质量标签（TMT）定量质谱技术，对探针结合的蛋白进行全局鉴定与定量。 图2.全功能天然产物（FFNP）探针在基于凝胶和质谱的化学蛋白质组学流程中的应用 结果 1.FFNP探针靶向独特且多样的蛋白质组 通过凝胶电泳和荧光扫描，呈现了 FFNP 在 HEK293T 细胞可溶性蛋白质组中的初步结合情况。在 20 μM 浓度下，不同 FFNP 探针呈现出截然不同的蛋白标记条带，比如萜类探针中部分骨架修饰体可特异性标记特定分子量蛋白，生物碱探针也展现出独特的结合谱。这种差异化条带直接证明 FFNP 对蛋白的结合具有显著的骨架选择性，为后续精准筛选靶点奠定了基础。 图3.HEK293T细胞中FFNP-蛋白相互作用的凝胶分析 随后研究者依托串联质谱技术，并结合串联质量标签（TMT）定量技术开展蛋白靶点的精准筛选，同时设定了明确的靶蛋白鉴定标准： 1.某一探针的目标蛋白平均丰度＞3倍 对照探针（Ctrl）相应蛋白的平均丰度 2.生物学重复样本间的p值＜0.05  3.某一探针的目标蛋白平均丰度＞2倍 同一实验分组中所有探针相应蛋白的平均丰度 共鉴定出182个FFNP靶向蛋白，其中81%的蛋白仅与单一FFNP结合，体现了探针的高特异性。功能分类显示，这些靶蛋白涵盖代谢酶、结构蛋白、应激反应蛋白等多个类别，且63%的靶蛋白此前无报道的化学探针，包括传统认为难以成药的转录因子、核酸结合蛋白、分子伴侣等。此外，77%的FFNP靶蛋白为该策略特有，未在之前的光立体探针、片段对映体探针等文库中被识别，证实了天然产物探针拓展可靶向蛋白质组的独特价值。 图4. 基于质谱的化学蛋白质组学技术鉴定得到全功能天然产物（FFNP）蛋白靶点的特征 2.天然产物骨架的细微修饰显著影响蛋白相互作用 研究团队选取同一天然产物骨架衍生的不同 FFNP 探针进行两两对比，精准锁定了结构修饰与蛋白靶向谱的关联逻辑：比如樟脑酸衍生探针中苄基取代与否，会使其分别优先靶向甲基转移酶 SMYD2 和线粒体调控蛋白 MSTO1；硬壳藻内酯的烯烃位置异构体因标签基团角度差异，结合的蛋白组截然不同；石竹烯衍生物的联芳基取代从对溴苯醚变为 N-甲基吡唑后，完全丧失对去泛素化酶 MINDY3 的结合，同时新结合谷胱甘肽转移酶 GSTO1 等蛋白；育亨宾与长春西汀生物碱探针因五环连接方式差异，前者优先结合核糖体停滞释放相关的 PELO 蛋白，后者则靶向去泛素化酶 OTUB1。这些数据清晰证实，FFNP 探针的取代基、立体构型、拓扑结构等细微改动，会直接决定其在活细胞内的蛋白靶向特异性，为后续设计高选择性探针、挖掘新型药物靶点提供了关键依据。 图5. FFNP探针的细微结构差异对蛋白靶点结合的显著影响 3.FFNP探针可靶向蛋白功能位点且结合具有可竞争性 研究人员通过下拉实验和免疫印迹完成了FFNP探针与关键靶蛋白结合的正交验证，直观证实了质谱筛选结果的可靠性：针对甲基转移酶SMYD2，异冰片衍生探针born-1的结合能力显著优于樟脑酸探针cam-1，且能呈剂量依赖性富集该蛋白；对于核糖体停滞释放相关蛋白PELO，育亨宾探针yoh-1的结合特异性远超长春西汀探针vin-1，凸显了分子拓扑结构对结合的关键影响；去泛素化酶OTUB1则对长春西汀探针vin-1表现出特异性结合，且结合能力强于其二氢类似物vin-2；此外，重组蛋白过表达实验进一步验证，石竹烯探针cary-1可剂量依赖性标记去泛素化酶MINDY3，硬壳藻内酯探针scler-3a对丝氨酸/苏氨酸激酶TAOK2的结合具有明显区域选择性，充分证明了FFNP探针与靶蛋白结合的特异性和靶向性。 图6. 基于质谱的化学蛋白质组学技术鉴定出的特定蛋白在HEK-293T 细胞中与FFNP 探针结合的生化验证 4.FFNP探针可靶向蛋白功能位点且结合具有可竞争性 通过竞争性实验证实了 FFNP 探针能够靶向蛋白的功能活性位点，且天然产物核心骨架是分子识别的关键。具体来看，SMYD2 的已知抑制剂 LLY-507 可剂量依赖性阻断 born-1 探针的标记，OTUB1 抑制剂 OTUB1/USP8-IN-1 也能抑制 vin-1 对 OTUB1 的结合，表明探针结合于蛋白的功能位点；育亨宾母体化合物可阻断 yoh-1 对 PELO 的标记，证实 PELO 是育亨宾的潜在靶点；而缺失光活化基团的 cary-1-nor 能竞争 cary-1 对 MINDY3 的结合，进一步说明天然产物核心骨架而非光亲和标签主导了与靶蛋白的特异性相互作用，为 FFNP 探针作为功能探针和后续药物先导化合物优化奠定了重要基础。 图7. 竞争对照实验 综上，近年来PAL-ABPP（光亲和标记-活性导向蛋白质组学）技术已经成为了药物从头发现及修饰改造、药物关键靶点鉴定以及有成药天赋的天然产物衍生物开发的有力工具，在多个研究领域均有成功应用：如辉瑞在片段药物筛选中，借助该技术实现了对候选片段分子靶点的高效捕获与验证，大幅提升了早期药物筛选的精准度与效率[4]；在青蒿素相关研究中，科研人员通过设计青蒿素光亲和探针，利用PAL-ABPP技术鉴定出其在疟原虫内的关键作用靶点，为阐明青蒿素抗疟机制及结构修饰优化提供了核心依据[5]；在大戟叶植物内生菌相关研究中，该技术成功锁定了内生菌代谢产物的潜在作用蛋白，为从天然产物中挖掘新型药物先导化合物提供了重要技术支撑。[6] 本研究创新性地以天然产物为核心骨架，构建了兼具高结构复杂度与靶向特异性的FFNP探针文库，通过凝胶电泳结合定量质谱的化学蛋白质组学策略，成功解锁了182个人类蛋白质组靶点，其中超六成靶点为无已知化学探针的“难成药”蛋白，且近八成靶点仅与单一FFNP探针结合，展现出该技术在拓展蛋白质组化学可靶向范围上的独特优势。同时，研究明确了天然产物骨架的细微修饰（取代基、立体构型、拓扑结构等）对蛋白靶向谱的精准调控作用，通过生化验证与竞争实验进一步证实FFNP探针可特异性结合靶蛋白功能位点，且天然产物核心骨架是分子识别的关键。该研究不仅为新型化学探针设计提供了“天然产物优势架构”的新范式，也为挖掘未被靶向的疾病相关蛋白靶点、推进药物先导化合物的开发提供了重要的理论与技术支撑，有望为化学蛋白质组学和药物研发领域带来全新突破。 总结 重要性：该研究有效填补了天然产物靶点鉴定领域的技术空白，所开发的FFNP 探针系统为精准捕获天然产物靶向蛋白提供了全新工具与研究视角，填补了以往功能化砌块与人类蛋白质组互作Map的空缺，为基于片段的药物开发提供了新思路。 挑战性：以六种天然产物母核拓展的 30 种探针（取代基、立体构型、拓扑结构差异），开展人类蛋白质组配体全局搜索。且标记技术具有一个通病，即：对原有化合物的探针改造可能会改变化合物本身的药理活性。本文通过设置竞争对照组，对该问题作出了一定的解释，使结果具有说服力。 可行性：依托于团队前期探索的FFF探针化学合成技术以及对映体化合物改造技术，同时结合了成熟的定量蛋白质质谱技术与生化验证手段，使得天然产物探针从合成到验证成为可能。 拓展性：研究具有广阔的应用前景，可用于面向修饰差异的先导药物优化、原代肿瘤细胞靶点鉴定等方向，同时也为天然产物来源的抗体药物偶联物（ADC）弹头及活性片段的研发提供了思路。 通用性：该技术对结构明确且具备可修饰性的天然产物展现出良好适用性，且可将该实验体系套用于原位肿瘤组织研究。 局限性：研究局限于单一HEK293T细胞模型，且仅聚焦于靶点结合验证，对靶点结合后功能调控机制的探究较为有限，同时本文作者提出该策略仅能寻靶标蛋白，并不具备结合位点的鉴定能力。 原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202502648 参考文献 [1]Parker C G, Galmozzi A, Wang Y, et al. Ligand and target discovery by fragment-based screening in human cells[J]. Cell, 2017, 168(3): 527-541. e29. [2]Chiu T Y, Lazar D C, Wang W W, et al. Chemoproteomic development of SLC15A4 inhibitors with anti-inflammatory activity[J]. Nature chemical biology, 2024, 20(8): 1000-1011. [3]Wang Y, Dix M M, Bianco G, et al. Expedited mapping of the ligandable proteome using fully functionalized enantiomeric probe pairs[J]. Nature chemistry, 2019, 11(12): 1113-1123. [4]Offensperger F, Tin G, Duran-Frigola M, et al. Large-scale chemoproteomics expedites ligand discovery and predicts ligand behavior in cells[J]. Science, 2024, 384(6694): eadk5864. [5]Gao P, Wang J, Qiu C, et al. Photoaffinity probe‐based antimalarial target identification of artemisinin in the intraerythrocytic developmental cycle of Plasmodium falciparum[J]. Imeta, 2024, 3(2): e176. [6]Huang J L, Wu L M, Wu S Q, et al. A small molecule targets LIC1 to suppress lung tumor growth by inducing autophagy[J]. Nature Chemical Biology, 2025: 1-12.

研究背景近年来，信使RNA(mRNA)纳米药物作为一种新兴的治疗策略，展现了巨大的临床潜力。与传统药物相比，mRNA药物能够精确编码特定蛋白，具有高度的灵活性和调节性。然而，mRNA分子本身存在易降解、递送效率低以及靶向能力有限等挑战，限制了其在临床中的广泛应用。为了克服这些问题，研究者们通过设计具有靶向功能的递送系统，优化了mRNA药物的稳定性、靶向性和疗效。这些纳米载体能够通过主动靶向、被动靶向及内源性靶向等特定机制，将mRNA递送至特定细胞或组织，从而提高疗效并降低全身性的副作用。因此，开发具有靶向功能的mRNA纳米药物，已经成为当前纳米医学领域的一个重要研究方向。Developing mRNA nanomedicines with advanced targeting functionsJi Wang, Lijun Cai, Ning Li, Zhiqiang Luo, Haozhen Ren*, Bing Zhang*, Yuanjin Zhao*Nano-Micro Letters (2025)17: 155https://doi.org/10.1007/s40820-025-01665-9本文亮点1. 本文综述了mRNA的结构、递送载体及相关的修饰策略，并阐明了它们在靶向递送中的作用。2. 本文总结了近年来mRNA纳米药物的研究进展，重点介绍了针对各类器官的靶向策略。3. 本文讨论了具有靶向功能的mRNA纳米药物在临床转化上面临的挑战与未来的发展方向。内容简介新兴的信使RNA(mRNA)纳米药物在疾病治疗中展现出了巨大的潜力。近年来，靶向性mRNA纳米药物的开发成为了一个备受关注的研究热点，因为它们能够精准地递送到特定的器官或组织，进而提高治疗效果并减少副作用。东南大学赵远锦等人全面综述了具有靶向功能的mRNA纳米药物的最新研究进展。首先，本文详细介绍了mRNA的结构、递送载体及相关的修饰策略；其次，本文概述了被动靶向、内源性靶向和主动靶向的机制，并讨论了mRNA在体内递送过程中可能遇到的各种生物屏障；最后，本文重点总结了基于mRNA的器官靶向策略，并评估了mRNA纳米药物在临床转化中的优势与挑战。本文旨在为该领域研究人员提供理论参考，推动mRNA靶向技术的创新发展。图文导读I mRNA纳米药物1.1 mRNA的结构内源性mRNA首次由Brenner及其同事于1961年发现，是一种结构简单但功能高度专一的生物分子。mRNA的序列和长度根据其编码蛋白不同而有所差异，但其基本结构特征在所有真核生物中大致相同。mRNA的基本结构包括以下几个部分：帽结构、非翻译区、开放阅读框(ORF)和多腺苷酸(poly(A))尾。这些结构通过相互作用精准调控基因的翻译过程，协同促进mRNA的高效表达。帽结构位于mRNA的5'端，可以在转录过程中或转录后添加。它能够保护mRNA免受核酸酶降解，并发出核糖体识别的信号，确保蛋白质合成的起始。mRNA的非编码区包括5'非翻译区(5' UTR)和3'非翻译区(3' UTR)。这些区域不具备编码蛋白质的能力，但在基因表达调控中起着至关重要的作用。5' UTR位于帽结构与编码区之间，调控翻译效率及核糖体的结合；而3' UTR位于蛋白质编码区与多腺苷酸尾之间，参与定位、翻译调控及与miRNA的相互作用。这些非翻译区通过多种机制确保基因在适当的水平、时间和位置进行表达。ORF位于5' UTR与3' UTR之间，包含了合成特定蛋白质所需的遗传信息。通过读取ORF序列，核糖体能够将其翻译成相应的氨基酸链，进一步形成功能性蛋白质。据报道，在ORF中引入化学修饰的核苷酸或对其密码子进行优化，有助于增强mRNA的表达水平。在mRNA的3' UTR后，通常会有几十至几百个腺苷酸残基组成的多腺苷酸尾，这个尾部有助于增强mRNA的稳定性，防止mRNA的降解。mRNA修饰策略涉及多个关键区域，以确保其稳定性、翻译效率、正确的细胞定位等(图1)。例如，带有120个poly(A)尾的mRNA比带有16、42和51个poly(A)尾的mRNA具有更高的表达水平。近期的一项研究开发了具有多个分支尾的mRNA，其产生的荧光信号比传统mRNA高出4.7到19.5倍，并且能够持续表达14天。此外，在连续的腺苷之间插入一个短的连接子或胞苷序列也有助于增强mRNA在细胞中的功能。mRNA结构的修饰为基因调控带来了重要创新和进展，为基因疗法的高效发展提供了强有力的支持。图1. mRNA结构的调控策略。(a)常见5'帽及其类似物的化学结构。(b)化学修饰的核苷酸用于改善mRNA的性能，包括稳定性、翻译效率和免疫原性。(c)据报道，携带多poly(A)尾的mRNA分子相比传统单尾的mRNA分子表现出更持久的表达。1.2 mRNA的载体mRNA作为一种高度脆弱且带负电荷的分子，难以直接进入细胞。为了有效地将mRNA运输到细胞内并发挥其生物学功能，通常需要借助递送系统。通常，传统载体通常只能被动地将mRNA递送到肝脏，要实现器官的选择性靶向会存在一定的挑战。为了克服肝脏积累问题，研究人员正在探索新的递送系统和靶向技术，例如脂质载体、聚合物载体、外泌体载体和仿生载体等。这些载体的开发不仅提高了mRNA的稳定性和递送效率，还促进了器官特异性的靶向。1.2.1 脂质载体作为高效的药物递送系统，脂质为基础的纳米载体已经研究了60多年。自Bangham首次发现脂质体以来，一系列基于脂质的递送系统被开发，包括脂质纳米颗粒(LNPs)、脂质-聚合物杂化纳米颗粒(LPNs)、固体脂质纳米颗粒(SLNs)、类脂质纳米颗粒(LLPs)、纳米结构脂质载体(NLCs)和脂蛋白颗粒(LPTs)等。其中，LNPs载体在抗击COVID-19疫情中的表现尤为突出，因为FDA批准的两款mRNA疫苗均利用了LNPs作为载体。LNPs是由不同脂质分子组成的纳米级载体系统，包括可电离脂质、聚乙二醇(PEG)脂质、辅助脂质和胆固醇，这些脂质分子协同作用，形成保护性球形纳米结构，保护mRNA免于降解，同时促进其有效穿透细胞膜并在细胞内释放。据报道，可电离脂质对于mRNA的封装和释放至关重要，因为它们会根据pH值的变化改变电荷，促进内体逃逸。胆固醇主要用于稳定LNP结构并增强其流动性和完整性。此外，辅助脂质的添加有助于形成模拟天然细胞膜的脂质层，增强细胞摄取能力。PEG化脂质通过减少免疫系统的调理作用和清除作用，延长LNPs在体内的循环时间。基于上述特性，LNPs的设计展现出显著的可调控性，这一优势使其在众多传统载体中脱颖而出。可电离脂质是LNPs递送系统中最为关键的脂质成分，通常占比高达50%。作为传统永久阳离子脂质(如1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷，DOTAP)的升级版本，可电离脂质不仅保持了高效的递送能力，还显著降低了细胞毒性。这些脂质在中性或弱碱性环境中呈现出近中性的电荷，但在酸性环境中会发生质子化并携带正电荷。这一特性使其能够与带负电荷的核酸分子有效结合成复合物，保护核酸免于降解并促进其进入细胞。当进入酸性的内体环境后，这些脂质可再次质子化，促进内体破裂并释放核酸，实现有效的基因表达。值得一提的是，DLin-MC3-DMA、SM-102和ALC-0315作为三种已获FDA批准的可电离脂质，其整体化学结构相似，主要由氨基头部、连接基团和疏水性支链尾部组成。从化学结构的角度来看，深入研究可电离脂质的构效关系有助于减少mRNA纳米药物在肝脏中的积累，同时提高其对特定器官的靶向性(图2)。受神经递质类药物的启发，一项研究通过迈克尔加成反应设计了一系列神经递质衍生的可电离脂质。与其他脂质混合后，所得的神经递质衍生LNPs能够在不添加靶向配体的情况下，有效携带载物(核酸、两性霉素B或蛋白质药物)跨越血脑屏障。目前，将生物制剂递送至原代T淋巴细胞仍面临重大技术挑战。针对这一问题，Zhao及其同事合成了一系列基于咪唑的脂质库，专门用于靶向CD8⁺ T细胞。他们进一步优化了脂质尾部的长度和化学结构，发现含有长碳链和二硫键的脂质尾对T细胞具有更高的亲和力。鉴于功能化巨噬细胞能够抑制脓毒症，Hou等人开发了维生素接枝的可电离脂质，旨在将治疗性mRNA递送至巨噬细胞。研究发现，与其他维生素修饰的LNPs相比，维生素C修饰的LNPs在RAW264.7巨噬细胞中表现出最高的递送效率，并在脓毒症治疗中展现出了理想的治疗效果。此外，通过在可电离脂质尾部引入活性氧(ROS)响应的硫缩酮单元，mRNA能够被选择性递送至肿瘤细胞并抑制结直肠肿瘤的生长。据该报道，这是首次设计ROS响应性LNPs，为癌症治疗提供了更多候选方案。上述研究表明，深入研究可电离脂质的构效关系有助于提高mRNA纳米药物的靶向性能和递送效率。图2. 具有靶向功能的可电离脂质的介绍。(a)神经递质衍生可电离脂质的化学结构。(b)通过使用神经递质衍生的LNPs递送系统，mRNA纳米药物能够穿透血脑屏障。在接受静脉注射后，小鼠大脑中出现了大量的生物信号。(c)维生素修饰的可电离脂质衍生的LNPs制剂能够靶向巨噬细胞并对抗脓毒症。(d)ROS响应性的可电离脂质的化学结构。(e)经ROS响应性的LNPs纳米药物治疗后，小鼠的结直肠肿瘤得到了显著的抑制。1.2.2 聚合物载体除了脂质载体，聚合物载体由于其多样性和可调节性，也成为mRNA递送的关键研究方向。常见的聚合物载体包括聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺胺(PAMAM)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚β-氨基酯(PBAE)等。尽管已经取得了一些研究进展，但聚合物载体的毒性、免疫反应以及体内的清除机制仍需进一步优化，以确保mRNA能够安全有效地转运至靶细胞并发挥功能。聚合物载体的靶向策略包括开发新型聚合物载体、优化聚合物结构或分子量、对聚合物载体表面进行配体修饰以及引入脂质或刺激响应单元等(图3)。这些策略有望增强聚合物载体的靶向能力，减少非特异性分布和潜在副作用。图3. 聚合物载体及相关的靶向策略。(a)用于mRNA递送的代表性的聚合物载体。(b)两性离子聚合物载体促进mRNA向脾脏和淋巴结的转运。(c)通过调节聚合物载体的柔韧性，显著提高了mRNA在肺部的生物利用度。(d)甘露糖修饰的PBAE聚合物载体的示意图。(e)利用甘露糖修饰的PBAE载体，mRNA能被高效递送至巨噬细胞，并促使M2巨噬细胞向M1巨噬细胞的转化。1.2.3 外泌体载体外泌体是由细胞分泌的粒径约为30-150 nm的细胞外囊泡，能够参与细胞间的分子通讯。外泌体被认为是理想的药物递送载体，原因如下：外泌体的天然生物相容性使其能够有效与体内的靶细胞融合，避免了传统药物递送系统可能引发的免疫排斥反应。其高度稳定性有助于药物的持续释放，同时具备跨越多种生物屏障的能力，特别对于治疗神经系统和肿瘤等难以到达的疾病部位至关重要。此外，经过修饰的外泌体载体能够实现对肝外组织的靶向递送，提升药物在靶点的浓度(图4)。据报道，将mRNA负载到外泌体的方法主要分为两类，即预加载方法和后加载方法。在预加载过程中，使用非病毒或病毒载体将编码目标mRNA的质粒转染到细胞中。当细胞生成并分泌外泌体时，这些mRNA会自发地被封装在外泌体内。一项研究将编码低密度脂蛋白受体的DNA转染到细胞中，结果显示转染组的mRNA表达水平比未转染组提高了百倍以上，同时在分泌的外泌体中也检测到了相应的表达。后加载方法，也称为外源性加载方法，是在适当条件下将外泌体与目标mRNA共孵育，使mRNA自然地被外泌体吸收。这种方法简单易操作，但加载效率相对较低。为提高加载效率，近年来引入了商业试剂或电穿孔等技术，这些技术可以暂时改变外泌体膜的通透性，从而增强mRNA的加载效率。此外，工程化外泌体以实现靶向递送也是该研究领域的一个重要方向。图4. 外泌体载体及相关的靶向策略。(a)将货物加载到外泌体中的两种技术：预加载方法和后加载方法。(b)在超声作用下，修饰后的外泌体能够选择性转运至脂肪细胞，用于肥胖病的治疗。(c)与未处理组相比，HE染色显示外泌体处理组的脂肪褐变显著增强。(d)CP05-TK-mPEG工程化外泌体的流程。(e)CP05-TK-mPEG修饰外泌体的透射电子显微镜(TEM)图像。1.2.4 其他纳米载体通过精确调控纳米药物与生物体之间的各种物理和化学作用，mRNA载体的靶向特异性、生物相容性和转染效率有望得到进一步优化。这种复杂的调控策略为mRNA载体的设计提供了无限的可能，有望推动精准医学迈向新高度。随着对载体设计理念的深入理解，越来越多的新型纳米载体不断涌现，包括无机纳米颗粒、杂化载体、仿生系统、病毒样颗粒等。尽管这些新兴载体在设计、结构或组成上各具特色，但它们在靶向治疗中发挥了关键性的作用(图5)。图5. 其他纳米载体及相关靶向策略。(a)基于GO、PEI和R484的混合载体用于mRNA的靶向递送。(b)基于Mg²⁺的仿生载体的制备及其工作机制。(c)PEG10基因的结构域。(d)SEND递送平台的组成，包括货物RNA、融合蛋白结构和PEG10。II mRNA纳米药物的靶向机制和生物屏障2.1 mRNA纳米药物的靶向机制当mRNA纳米药物进入血液，一系列复杂的生物过程将共同影响其在体内的命运。为了最大限度地提高mRNA疗法的疗效和安全性，关键在于如何将mRNA纳米药物精确递送至特定的靶器官或靶细胞。mRNA纳米药物的靶向机制主要涉及三个层次：被动靶向、内源性靶向和主动靶向(图6)。在设计靶向递送系统时，可以充分利用这些机制，以精确控制纳米颗粒在体内的定位。2.1.1 被动靶向mRNA纳米药物的被动靶向利用药物载体固有特性来增强药物在特定组织或细胞中的积累，这种靶向方式不依赖于特定的生物分子或配体进行识别。通过调整纳米药物的尺寸、形态、表面电荷等特性，被动靶向使药物能够在体内自然分布。此外，靶器官的生理结构特征与被动靶向也密切相关，影响纳米颗粒在体内的滞留和分布。2.1.2 内源性靶向内源性靶向是一种特殊形式的被动靶向，它利用细胞内的自然机制或信号通路，实现治疗药物或基因的靶向递送。这种方法通常依赖体内存在的小分子、核酸或蛋白质等分子工具，直接干预或调节细胞内的信号通路。尽管内源性靶向不需要额外的靶向配体，但在药物设计过程中，必须考虑内源性蛋白质的组分。2.1.3 主动靶向主动靶向是一种先进的纳米药物递送技术，通过在纳米载体上工程化特定的生物分子(如抗体、肽段或小分子配体)，使其能够特异性识别并结合靶细胞。与被动靶向相比，主动靶向显著增强了药物在特定细胞或组织中的积累，并降低了全身性的毒副作用。在临床前研究中，mRNA纳米药物依赖主动靶向机制在肺部疾病、脑部疾病和骨髓疾病等领域展现出了显著的治疗潜力。Parhiz及其同事通过用抗CD31修饰PEG脂质表面，制备的LNPs纳米药物能够在不依赖ApoE的情况下有效递送至肺部。通过在载体上修饰抗血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，工程化的mRNA制剂能够高效跨越血脑屏障，促进mRNA药物在大脑内的翻译。图6. 被动靶向、内源性靶向和主动靶向的机制图。(a)被动靶向机制。被动靶向与纳米颗粒的理化特性密切相关，包括尺寸、形态、表面电荷等。(b)内源性靶向机制。内源性靶向是生物体内的一种天然运输机制。mRNA纳米药物进入体内后，会与血浆中的特定蛋白质结合，随后被转运至靶器官。(c)主动靶向机制。主动靶向是指在递送系统上进行特定的生物分子或配体修饰，使纳米药物具备靶向特定器官的能力。2.2 mRNA纳米药物的生物屏障作为一种新兴的治疗手段，mRNA纳米药物展现出巨大的潜力。然而，要实现其临床应用，mRNA纳米药物必须克服一系列生物屏障，包括循环屏障、内皮屏障和内体屏障。循环屏障涉及纳米药物的稳定性及其在血液中的分布；内皮屏障聚焦于纳米药物如何穿过血管壁到达靶组织；而内体屏障则主要与细胞内运输和释放机制相关。深入理解并有效解决这些屏障问题，对于开发高效的mRNA纳米药物至关重要。2.2.1 循环屏障在mRNA纳米药物的开发过程中，一个关键挑战在于确保药物能在体内长期循环并精准进入目标细胞，同时避免被非目标细胞摄取。一种常用的策略是在纳米载体表面引入PEG衍生脂质。据报道，添加PEG化脂质可以提供“隐形”涂层，逃避免疫系统的识别，减少血液中的非特异性蛋白吸附，并能够有效延长药物在体内的半衰期。一项研究通过将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)配体与PEG脂质结合，显著提高了所制备纳米药物的循环时间和稳定性。值得注意的是，仅通过将PEG化密度增加两倍，肿瘤部位的mRNA表达水平便提升了十倍。另一项研究将热响应材料聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)引入cRGD修饰的PEG-聚赖氨酸(PLys)表面，形成了具有稳定热力学结构的聚合物胶束。在血液中，修饰后的纳米制剂比未修饰的制剂表现出了更长的循环时间。2.2.2 内皮屏障内皮屏障主要由排列在血管壁上的内皮细胞组成，这些细胞排布成了连续的单层结构。该屏障作为选择性通透屏障，能够控制离子、营养物质和其他分子在血液与周围组织之间的通行。维持这一屏障的完整性对于调节物质进出血管至关重要。在纳米药物递送中，内皮屏障是一个关键障碍。设计用于治疗目的的纳米颗粒必须有效跨越这一屏障，才能到达体内的靶组织或细胞。然而，内皮屏障的紧密结构和调控机制为纳米颗粒的递送造成了一定困难。该屏障的存在严重限制了纳米颗粒的自由渗透，因此需要创新的举措来提高它们的递送效率。2.2.3 内体屏障内体屏障是指纳米药物进入细胞后遇到的一系列复杂障碍。当药物进入细胞，它们通过内吞作用被内体捕获，形成内体囊泡。随着内体的成熟，内部pH逐渐降低，酶活性显著增加。这种酸性环境和酶的激活可能导致纳米药物的降解或失活，严重影响其功能的发挥。为了发挥预期的药理作用，mRNA纳米药物必须从内体中逃离，并有效地进入细胞质，以便实现基因的表达。III mRNA纳米药物的器官靶向策略3.1 肝脏靶向通常情况下，大多数LNP-mRNA纳米药物在静脉注射后倾向于在肝脏而非其他器官中积累，这主要归因于以下几个因素：(1)作为人体内血管丰富的器官之一，肝脏接收大量血液，这有利于纳米颗粒与肝细胞的接触。(2)当LNP-mRNA纳米药物进入血液后，PEG脂质逐渐从LNP表面分离，使得ApoE能够与LNPs结合。这种相互作用增强了低密度脂蛋白受体(LDL-R)对LNPs的摄取。(3)肝脏中含有丰富的巨噬细胞，这些细胞在免疫监视和防御中起关键作用，能够识别并吞噬血液中的纳米颗粒、病原微生物、细胞碎片等物质。在一个典型例子中，Lam等人利用不同可电离脂质衍生的LNPs递送萤火虫荧光素酶(Fluc)mRNA，并观察其在体内的表达部位。正如预期，所有实验组小鼠的肝脏区域均显示出最强的生物信号，表明LNP-mRNA纳米药物主要在肝脏中积累。3.2 肺靶向肺是人体呼吸系统的关键组成部分，主要负责吸入氧气并将其输送到血液中，同时将二氧化碳从血液排出到外部环境。由于肺独特的生理结构，吸入给药已成为一种可行的选择。肺泡的巨大表面积和丰富的血管网络为吸入药物提供了有效的吸收途径，使药物能够快速进入血液并实现全身生物利用度。通过吸入给药，Liu等人成功地将外泌体包裹的IL-12 mRNA(IL-12-Exo)递送至肺部，实现了对肺癌的有效治疗。这种基于吸入的递送方法利用细胞外囊泡的天然特性，促进了mRNA在肺部的吸收和利用。重要的是，与传统的脂质体载体包裹的IL-12 mRNA(IL-12-Lipo)相比，IL-12-Exo在LL/2细胞系中表现出更高的摄取效率，表明IL-12-Exo在肺部疾病中的潜力。另一项研究筛选了166种聚合物纳米颗粒制剂，发现聚合物P76具有更高的递送效率。通过雾化给药，聚合物P76介导的纳米药物在SARS-CoV-2挑战的小鼠模型中诱导了更强的抗体水平，同时表现出良好的耐受性。在其他动物模型(如雪貂、仓鼠、恒河猴等)中也证实了类似的实验结果。同时，本小节也讨论了通过静脉注射将mRNA递送至肺部的方法，但这种方法在体内会遇到更多的生物挑战。在一项开创性研究中，Cheng及其团队开发了一种称为选择性器官靶向(SORT)的策略，通过在传统LNPs中添加额外组分，确保mRNA精确递送至特定器官(肺、脾脏或肝脏)。如图7所示，在LNP组分中加入1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EPC)或DDAB等永久阳离子脂质，显著提升了药物在肺部的特异性递送效果。对内源性靶向机制的进一步研究表明，这种肺部特异性靶向在很大程度上受到血液中组成蛋白冠的蛋白类型和数量的影响。图7. 在LNPs中添加阳离子脂质实现mRNA的肺部递送。(a)在传统的四组分LNPs中添加阳离子脂质DDAB或EPC，实现了肺部靶向mRNA递送。(b)8-9D蛋白的三维结构。(c)使用五组分递送系统和mRNA制备肺部靶向的LNPs制剂的示意图。(d)与对照组相比，lung-LNPs@mRNA8-9D组对SARS-CoV-2变体显示出近100%的保护效率。(e)组织病理学结果表明，lung-LNPs@mRNA8-9D治疗未引起肺损伤。3.3 脾靶向脾脏是人体重要的免疫器官，能够清除衰老的红细胞和病原微生物，促进抗体的产生。近年来，针对脾脏的mRNA疗法逐渐受到关注。这种治疗方法通过引入特定基因来修复脾脏内的基因缺陷或蛋白缺失，从而增强免疫反应或治疗与脾脏相关的疾病。脾脏靶向mRNA疗法为遗传性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病和癌症的治疗提供了前景，并有望降低治疗成本并减少不良反应。据报道，mRNA纳米药物在静脉注射后通常被转运至肝脏和脾脏。尽管脾脏靶向递送看似简单，实际上超过80%的mRNA纳米药物最终被肝脏摄取。对于脂质材料，常见的脾脏靶向递送策略包括调整配方(图8)、开发新的可电离脂质或两种方法的联合应用。如前文所述，在传统的四组分脂质中添加第五种阳离子脂质增强了mRNA向肺部的递送。相比之下，在传统的四组分脂质中加入1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(18PA)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸(14PA)和sn-(3-油酰-2-羟基)-甘油-1-磷酸-sn-3'-(1',2'-二油酰)-甘油(18BMP)等永久阴离子脂质显著改善了mRNA的脾脏递送。从机制上讲，这种绕过肝脏的脾脏靶向是由于脂质表面吸附的不同蛋白质所致。一项类似的研究在四组分LNPs中引入了额外的硬脂酸，不仅增强了其结构稳定性和递送潜力，也成功地将OVA mRNA递送至脾脏。通过添加TLR4激动剂，制备的mRNA疫苗引发了强大的免疫反应，并通过持续的记忆保护阻止了EG.7-OVA肿瘤的生长。尽管五组分递送系统在实现精准递送方面非常有效，但一些研究表明，这种药物递送策略进一步复杂化了原有的配方，可能会延缓药物审批进程。鉴于此，四组分、三组分、双组分甚至单组分载体也引起了研究人员的极大兴趣，尤其是在脾脏靶向递送领域。这些简化组分的设计不仅能够降低制剂的复杂性，还可能提高药物的稳定性和递送效率，为脾脏相关疾病的治疗提供更优解决方案。图8. 五组分脂质系统实现mRNA的脾脏靶向。(a)在传统的四组分系统中，添加18PA、14PA和18BMP等阴离子脂质能够实现mRNA的脾脏靶向递送。(b)五组分递送系统和TLR4激动剂组成的增强型mRNA疫苗，用于癌症的免疫治疗。(c)储存七天后，五组分递送系统仍具有脾脏靶向功能。(d)接受不同治疗后，小鼠肿瘤的HE染色显示sLNPS-OVA/MPLA制剂能够有效抑制黑色素瘤的生长。3.4 心脏靶向心肌内注射是一种有前景的药物递送途径，因为它使药物能够更快地到达心肌组织，同时避免mRNA纳米药物被肝脏摄取(图9)。血管内皮生长因子(VEGF)是生长因子家族的关键成员，主要刺激细胞增殖、迁移和血管生成，已被建议作为增强心肌功能的治疗剂。通过心肌内注射，修饰的VEGF mRNA显著改善了梗死区域的血管密度和心脏功能，而其他实验组未能达到预期效果。这归因于VEGF mRNA加速了心外膜祖细胞的迁移和定向分化。需要注意的是，这项工作使用了裸露的mRNA，没有依赖任何功能性载体。一项类似的研究报告称，将溶解在柠檬酸盐-生理盐水缓冲液中的VEGF mRNA注射到心脏，成功表达了预期蛋白并减少了心肌纤维化的面积。这些结果也在小型和大型动物的永久性闭塞性心肌梗死模型中得到验证。鉴于细胞疗法的持久性和修复功能，将mRNA技术与细胞疗法结合有望重新编程细胞，并治疗心脏相关疾病。据报道，Ai及其团队通过将化学修饰的VEGF mRNA与诱导多能干细胞来源的心肌细胞(iPSC-CMs)相结合，深入研究了心肌修复的效果。为了可视化蛋白表达，他们选择增强型绿色荧光蛋白(eGFP)mRNA用于转染iPSC-CMs。转染168小时后，实验组仍观察到强烈的绿色荧光，表明细胞内目标蛋白一直在持续表达。重要的是，动物实验证实这些工程化的iPSC-CMs增强了细胞生长，缓解了梗死区域的缺氧，促进了心脏功能的恢复。图9. 心肌内注射实现mRNA的心脏靶向。(a)向心肌注射VEGF mRNA后，梗死区域的血管密度显著增加。(b)免疫荧光图像显示，VEGF mRNA有效促进了心外膜祖细胞的动员和分化。(c)一项研究利用VEGF mRNA的柠檬酸溶液治疗心肌梗死。治疗两个月后，收集实验小鼠心脏并进行切片。(d)细胞疗法结合mRNA技术治疗心脏相关疾病的示意图。(e)用eGFP mRNA转染iPSC-CMs细胞168小时后，仍能检测到少量的绿色荧光。(f)用VEGF mRNA转染的iPSC-CMs治疗四周后，收集大鼠心脏并进行切片分析。3.5 大脑靶向mRNA疗法作为一种新兴的生物医学技术，在治疗脑部疾病方面显示出良好的效果。尽管脑部注射是一种直接的靶向递送方法，但它带来了重大挑战，不仅需要高水平的技术专业知识和设备支持，而且风险极高。因此，科学家们正在设计各种载体系统，通过全身给药促进mRNA通过血脑屏障，进一步降低风险并提高治疗效果(图10)。近期，一项研究成功开发了甘露糖修饰的脂质纳米颗粒(MLNP)，用于封装白细胞介素-10(IL-10)mRNA，并精准靶向缺血性脑区的M2极化小胶质细胞。这种约90纳米的纳米制剂能够穿过血脑屏障并进入脑实质。表达的IL-10能够驱动小胶质细胞的M2极化，提高营养因子的水平，并恢复受损脑组织的功能。长春西汀是一种从小长春花叶中提取的化合物，已被建议作为脑相关疾病的治疗剂。Bian等人利用长春西汀衍生的化学结构作为主要支架，开发了一系列新型可电离脂质。与FDA批准的可电离脂质MC3相比，基于长春西汀的递送系统有效地将eGFP递送到模型小鼠的大脑中。进一步的研究证实了这些纳米颗粒在治疗脑部疾病方面的潜力，可能归因于长春西汀保留的内在药理活性。据报道，用P-选择素、胰岛素受体、转铁蛋白受体、细胞内粘附分子-1和VCAM-1等配体修饰的载体具有靶向脑组织的能力。一项研究利用VCAM-1修饰的LNPs进行药物递送，并在细胞实验中检测到了mRNA的表达。在动物实验中，通过静脉给药，mRNA制剂被成功转运至发炎的脑区，缓解了TNF-α诱导的脑水肿。值得一提的是，微泡辅助聚焦超声(FUS)也是一种促进LNPs脑部转运的新兴策略。在FUS的辅助下，血脑屏障可以有效打开，使LNPs封装的mRNA成功到达大脑。纳米颗粒的摄取分析表明，外源蛋白主要在小胶质细胞和CD31阳性内皮细胞中表达，而在星形胶质细胞或神经元中未检测到表达。图10. 修饰的脂质材料实现mRNA的脑部递送。(a)MLNP封装IL-10 mRNA用于治疗缺血性中风的示意图。(b)与LNPs相比，MLNP递送系统促使更多的mRNA在大脑中积累。(c)基于长春西汀的可电离脂质的化学结构。(d)与MC3脂质相比，长春西汀衍生的LNPs有效地将eGFP mRNA递送至小鼠大脑。3.6 骨靶向骨骼是人体的重要组成部分，支撑着整个身体结构并提供运动功能。然而，骨骼容易受到各种疾病的影响，包括骨折、骨质疏松和骨肿瘤。近年来，mRNA技术用于骨骼疾病的治疗备受关注。通过将合成性的mRNA定向转运至骨组织，可以刺激骨细胞的增殖和分化，加速骨相关疾病的愈合。骨靶向mRNA递送策略与前面提到的方法类似，主要包括局部给药、联合干细胞疗法、LNPs的配体修饰等(图11)。重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)是一种重要的生物活性蛋白，在促进骨折愈合、修复骨骼缺陷和促进脊柱融合方面特别有效。然而，这种蛋白替代疗法通常需要很大的剂量，导致副作用的发生和治疗成本的增加，而利用mRNA疗法表达rhBMP-2是解决上述挑战的有效候选方案。一项研究通过局部注射将编码BMP-2的mRNA制剂靶向递送至节段性缺损模型。研究发现BMP-2 cmRNA组在治疗四周后表现出最佳的骨修复效果，特别是在第八周时，骨缺损几乎完全愈合。与Empty组和NC cmRNA组相比，Masson染色表明BMP-2 cmRNA组能够更有效地诱导新生骨沉积。局部给药mRNA转染的干细胞也是实现骨靶向的有效方法。一项研究通过从髂骨骨髓中提取干细胞，经过扩增后使用VEGF-A和hBMP-2 mRNA进行修饰。随后，这些经过修饰的干细胞被接种到支架，并植入人体的骨缺损部位。研究结果表明，mRNA技术与干细胞疗法的结合不仅显著促进了骨愈合和再生，还兼具安全性和成本效益的双重优势。图11. mRNA的骨靶向递送策略。(a)局部给药八周后，化学修饰的BMP-2 mRNA促进了受损骨的完全愈合。(b)Masson染色显示，与其他治疗组相比，BMP-2 cmRNA组更有效地诱导了新生骨的沉积。(c)mRNA技术结合干细胞疗法修复颅骨的示意图。(d)BP衍生的LNPs用于骨靶向递送的示意图。(e)与PBS组相比，实验组的骨头中积累了更多的mRNA。IV 结论和展望目前，mRNA相关的靶向策略主要包括改变给药方式、优化LNP组分、开发新型递送系统以及对现有载体进行配体修饰。尽管前期研究取得了一系列成果，这些靶向策略仍面临诸多挑战。例如，改变给药方法可能增加治疗的复杂性，需要额外的药物递送系统或设备，进而提高治疗成本，给患者带来更大负担。其次，载体表面的配体修饰可能影响纳米药物的稳定性，因为这一过程涉及化学反应选择、配体与载体的相互作用、生产过程的精细控制等多个因素。第三，修饰后的纳米颗粒可能与多种蛋白质相互作用，形成更为复杂的蛋白质冠。最后，尽管已有大量基于mRNA的靶向策略的研究报道，从实验室到临床应用的转化仍然有限，主要原因包括细胞内逃逸失败、潜在的免疫反应和脱靶毒性等问题。为了实现更精确的mRNA递送，以下几点建议被提出：(1)针对特定的疾病，可以考虑将mRNA纳米药物与更精确的递送平台相结合，如微针、胶囊、凝胶和微纤维体系等。例如，最近的一项研究利用微针递送含有mRNA的外泌体至真皮层，成功诱导了胶原蛋白的合成，并显著改善了皮肤衰老。(2)未来的研究可以深入探索mRNA的靶向机制。尽管已有许多关于靶向递送的研究，但对机制的解释仍然匮乏，相关研究亟需进一步完善。(3)mRNA的靶向策略应逐步从器官层面转向细胞层面。目前，大多数靶向策略聚焦于整个器官或组织，可能导致药物在器官的广泛分布，增加不良反应的风险。已有研究表明，配体或抗体与PEG化脂质的结合可实现选择性的器官靶向。在此背景下，将多个配体或抗体与PEG化脂质结合，可能是实现细胞靶向的一种有效途径。(4)mRNA纳米药物的靶向递送策略应在不同疾病模型和更高阶生物物种中进行测试。在不同疾病模型下，生物体内蛋白冠的组成或类型会有显著差异，因此研究蛋白冠时需考虑不同的疾病模型。此外，不同物种间的血流和蛋白组成差异意味着动物模型的数据可能无法直接转化为人类数据。先前已有研究表明在啮齿类动物或其他小型生物中取得的靶向递送结果无法在高等物种中复制。(5)研究蛋白冠信息能为靶向治疗带来更大优势。已有研究指出，蛋白冠不仅可用于疾病的诊断，还能有效减少脱靶效应。通过深入了解蛋白冠的组成和特性，有助于优化靶向递送系统，提高药物与靶细胞之间的亲和力。作者简介赵远锦本文通讯作者东南大学/南京鼓楼医院 教授▍主要研究领域(1)微流控与器官芯片；(2)仿生智能界面材料；(3)药物智能递送▍个人简介赵远锦，东南大学/南京鼓楼医院教授，博导。主要从事微流控与器官芯片、人造器官、药物智能递送、仿生界面及其医学应用等方面的研究。▍Email：yjzhao@njglyy.com撰稿：原文作者编辑：《纳微快报(英文)》编辑部