Agalsidase Beta(JCR Pharmaceuticals Co., Ltd.)

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注 1. 背景 蛋白药物因具有更高的靶点特异性和药理学效力，极大地扩展了分子药理学领域。然而，这类分子普遍存在的稳定性问题会对最终的治疗效果产生一定的负面影响，使其在制药应用中面临巨大的挑战。蛋白药物常见的不稳定性及典型应对策略见表1，目前开发长期稳定蛋白质药物的方法包括通过使用稳定辅料（如氨基酸、糖和多元醇等）影响周围溶剂性质的外部稳定，以及通过化学修饰（如突变、糖基化、聚乙二醇化等）改变蛋白质结构特征的内部稳定[1]。在化学修饰方法中，糖基化是最有前景的方法之一，即通过操纵关键的糖基化参数，例如糖基化程度、聚糖大小和聚糖结构组成，可以按需要设计蛋白质的分子稳定性。 表1. 蛋白药物的常见化学和物理不稳定性及典型对策 2. 蛋白糖基化 蛋白质糖基化是生物系统用于扩大蛋白质组多样性的最常见的结构修饰之一。它涉及将一种或多种聚糖连接到蛋白质的氨基酸侧链上。根据聚糖连接的分子，蛋白糖基化可分为N-糖基化、O-糖基化、S-糖基化和C-糖基化[2]。糖基化在结构上高度复杂，因为糖基化可以在聚糖附着的位置（宏观异质性）和聚糖的结构（微观异质性）方面存在异质性。 在真核细胞中，最普遍的糖基化位点发生在天冬酰胺残基（通过Asn-X-Thr/Ser识别序列进行N-链糖基化）和丝氨酸或苏氨酸残基（O-链糖基化），连接以下单糖：焦糖、半乳糖、甘露糖（Man）、N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸（N-乙酰神经氨酸）。N-链聚糖结构根据其单糖含量和结构分为三大类：高甘露糖型（Man2-6Man3GlcNAc2），混合型（GlcNAc2-Man3GlcNAc2）和混合型（Man3GlcNAc-Man3GlcNAc2）。这些聚糖的末端通常与人糖蛋白中的化学带电基团（例如，磷酸盐，硫酸盐，羧酸）进一步功能化，从而导致更大的结构多样性[1]。这些带电荷的聚糖很可能在某种程度上影响糖蛋白的整体稳定性，因为它们可以改变糖蛋白的等电点（如唾液酸），还发现在调节糖蛋白的循环半衰期中起关键作用。这使糖基化成为一种新的技术发展，通过设计蛋白药物的药代动力学特征来提高其治疗效果[3]。目前已有多种已上市的蛋白药物通过糖基化进行稳定，部分清单见表2。 表2. 通过糖基化稳定的已批准蛋白类药物部分清单 注：信息取自每种产品的处方信息（PI）。 a. 多种批准产品，更多信息可访问 FDA 和 biopharma 网站；b. 市售未糖基化蛋白。 3. 糖基化对蛋白稳定性的影响 3.1 提高化学稳定性 3.1.1 防止蛋白水解 蛋白质极易被蛋白酶水解降解，蛋白药物的体内分子稳定性和治疗效果与其蛋白水解降解的稳定性密切相关，研究表明糖基化可以保护蛋白免受水解降解。拥有 PEST 序列或者富含 P、E、S、T 残基的多肽很容易被磷酸化或其他机制降解，而研究表明被 O-G1cNAc 糖基化的蛋白序列富含 P、E、S、T 残基而未被降解，这可能是因为蛋白的糖基化阻碍了其磷酸化，使蛋白不那么容易被降解[4]。有研究发现，改变末端聚糖结构例如N-乙酰氨基葡萄糖，半乳糖和唾液酸，可使体外蛋白在木瓜蛋白酶消化时水解稳定性越来越高。从机制上讲，这种蛋白水解稳定性是由于糖基化位点附近聚糖的存在为附近的肽主链氨基酸周围提供了空间位阻，这阻止了糖蛋白表面和裂解蛋白酶活性位点之间的接触 [1]。 3.1.2 抗氧化 蛋白质药物在生产和储存过程中，因其氨基酸侧链（His, Met, Cys, Trp和Tyr）的氧化，可能会失去其生物活性，这主要归因于蛋白质配方中的微量金属元素、氧和紫外光照而产生的活性氧基自由基。研究发现促红细胞生成素作为一种蛋白质，其生物活性会受到氧化的影响，糖基化可以改善这种化学不稳定性。这种蛋白质生物活性的丧失与暴露于氧化条件下色氨酸的氧化水平有关。将天然糖基化的促红细胞生成素与其去糖基化形式的促红细胞生成素的氧化敏感性进行比较，发现糖基化降低了色氨酸的氧化速率和蛋白失活。这些结果表明，糖基化可以保护蛋白质结构免受活性氧自由基的破坏，不过还需要更多的研究来阐明这种稳定的机制。 3.1.3 防止化学交联 蛋白药物可以通过二硫键和非二硫键交联途径聚合形成共价二聚体和寡聚体，导致其丧失生物活性。此外还可能引发更大的可溶和不可溶蛋白质聚集体的形成。有研究发现糖基化可以阻止这些交联物质的形成，如人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）中单糖的存在阻止了聚合诱导的蛋白质失活；胰岛素的工程化化学糖基化，特别是在PheB-1氨基团上，抑制了蛋白质自组装形成二聚体和寡聚体变体，交联胰岛素的形成是由于AsnA-21和PheB-12之间的转酰胺反应，这些研究表明蛋白的稳定可以通过合理设计的糖基化来达成，机制是由于聚糖在蛋白质表面的存在增加了易于交联的蛋白质分子间的空间排斥[1]。 3.2 提高物理稳定性 3.2.1 增加溶解度 蛋白质的溶解度与蛋白质浓度成反比，并且还取决于溶液的pH值、温度、离子强度和赋形剂浓度。因此随着配方目标浓度的增加（如：100mg /mL），蛋白质沉淀成为一个关键的问题。研究表明糖基化能增加许多蛋白质的溶解度，比如干扰素β，α -半乳糖苷酶A，葡萄糖氧化酶和转化酶。有研究者对一系列糖基化偶联物进行了结构比较和能量分析，从计算机模拟中发现，随着糖基化程度的增加，整个糖蛋白的整体分子溶剂可及表面积呈线性增加。糖基化增加蛋白溶解度的机制是由于糖蛋白表面和周围溶剂分子之间可能的相互作用数量的增加，聚糖的存在导致了总体上更大的分子溶剂可及表面积[1]。 3.2.2 抗pH变性 蛋白质暴露于极端pH值环境下可能导致结构丧失，因为内部静电力和电荷-电荷相互作用被破坏。在远离等电点（pI）的极端pH值下，由于类似带电原子之间的静电排斥，蛋白质的展开倾向增加。此外在极端pH下，不同带电原子之间盐桥形成能力的减弱也会增加蛋白质结构展开的倾向。这种局部展开导致局部电荷密度的降低，从而进一步降低蛋白质的静电自由能使蛋白展开。有研究表明糖基化在维持蛋白质抗pH变性的构象稳定性方面是必不可少的。包括促红细胞生成素，酸性磷酸酶，淀粉酶，纤维连接蛋白，组织蛋白酶E，葡萄糖氧化酶和三肽基肽酶等[1]。Masarova[5]等人通过青霉素酰化酶的糖基化证明了糖基化可以增加蛋白的pH稳定性。与非糖基化蛋白相比，糖基化蛋白的半衰期在pH 3时增加了13倍，在pH 10时增加了7倍。从机制上讲，这种稳定性是由于糖基化导致蛋白质内部静电相互作用的增加而产生的。聚糖的存在充当了分子间隔物，增加了蛋白质静电和溶剂静电之间的有效距离。由于周围水分子对蛋白质的介电屏蔽作用减少，这可能会导致蛋白质内部静电相互作用强度的增加。 3.2.3 抗热变性 蛋白质可能因暴露在极端温度下而变性，因为稳定其天然状态结构的所有作用力对热变化都很敏感，因此用于确定蛋白配方稳定性的一个主要指标涉及其热变性敏感性的测定。通过糖基化提高热稳定性的蛋白质数量很多，包括促红细胞生成素、α 1-抗胰蛋白酶、G-CSF、干扰素- β、尿激酶和a-葡萄糖苷酶等[1]。蛋白质经糖基化修饰后能避免热力学降解，并且从天然糖基化的蛋白质上去除糖基侧链能降低其热力学稳定性，导致蛋白质聚集的可能性增加。利用糖基化的新技术将葡萄糖共价连接到胰蛋白酶和糜蛋白酶的Lys残基上，与未糖基化者相比，糖基化的这两种酶的热稳定性显著增强。糖基化的牛胰蛋白酶在 pH 8.0、50℃条件下孵育 3h 后，仍保持大于50%的活性，而未糖基化的牛胰蛋白酶在此相同条件下完全失活[4]。从机制上讲，糖基化在蛋白质的整体热力学稳定化中发挥不同的作用，糖基化程度主要通过增加内部非共价力和降低结构流动性来稳定蛋白的天然状态，而糖链大小可以通过降低蛋白展开状态的稳定性进一步影响蛋白质的整体热力学稳定性。 3.2.4 防止聚集 蛋白质由于其较大的分子尺寸和高的分子间相互作用而表现为胶体，这使得蛋白质结构容易受到pH、温度和蛋白质浓度的聚集倾向的影响。有报告表明，糖基化可以在一定程度上减少或阻止蛋白质聚集，例如通过小尺寸聚糖的化学附着，可以降低胰岛素的聚集动力学，从而改善胰岛素的物理稳定性。减少胰岛素聚集与预防转酰胺交联反应有关，这表明稳定机制涉及分子间的立体排斥现象。Ioannou[6]等人发现，对于A -半乳糖苷酶，需要Asn215处的糖基化来防止表面疏水斑块的暴露，从而避免蛋白质的聚集。从对蛋白质的研究中提出，对聚集的抑制可能取决于未折叠蛋白质状态下聚糖的空间位阻，由于聚糖在蛋白质表面的存在，易于聚集的蛋白质之间的位阻排斥增加，从而阻止了蛋白质聚集。 3.3 糖基化对蛋白稳定性的反作用 然而另有一些报道证明糖基化对蛋白质的稳定性没有作用或具有相反的作用。比如经糖基化修饰的辣根过氧化物酶（HRP）具有 8 个 N-连接的葡聚糖残基，但是其热稳定性、活性和未糖基化的HRP一致。通过嫁接糖基化的巨噬细胞活化因子（Gc-MAF）到一个稳定的支架上，构建了 Gc-MAF 的类似物 MM1，并且比较了糖基化和未糖基化的 MM1 的热力学稳定性和构象动力学，结果发现糖基化能使蛋白质稳定性降低约 1 kcal/moL[4]。分子动力学模拟显示这种效应和糖基化组分的迁移率增加相符；溶剂可及面积分析表明，糖基化使三维螺旋结构中的疏水残基更易暴露于溶剂中，疏水接触的数目也受到影响，这可能是糖基化使蛋白质稳定性降低的两个原因。 4.  总结 成功的蛋白质处方需要同时优化体外和体内的分子稳定性以及改进药代动力学和药效学，糖基化可以在这方面发挥重要的作用。但由于糖蛋白结构的内在复杂性和宿主表达系统中表达糖蛋白的困难性，例如糖蛋白表达量低，糖基化宏观和微观异质性，糖基化的制药应用仍然面临一些技术挑战，同时需要注意并非所有的糖基化修饰都能提高蛋白质的稳定性，这和蛋白质本身的结构、糖链的种类、糖链的位置等密切相关。糖基化工程在改善蛋白药物物理化学性质方面的巨大潜力值得进一步探索，以了解糖基化对蛋白质的作用，并指导糖蛋白药物的发展。 参考文献 [1] Solá RJ, Griebenow K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J Pharm Sci. 2009 Apr;98（4）:1223-45. [2] Chao Chen, Bo Ma, Yefei Wang, Qiu Cui, Lishan Yao, Yaohao Li, Baoquan Chen, Yingang Feng, Zhongping Tan,Structural insight into why S-linked glycosylation cannot adequately mimic the role of natural O-glycosylation,International Journal of Biological Macromolecules,Volume 253, Part 1,2023,126649,0141-8130. [3] Sinclair AM, Elliott S. 2005. Glycoengineering: The effect of glycosylation on the properties of therapeutic proteins. J Pharm Sci 94:1626–1635. [4]石玉梅, 郑磊, 李娟. 糖基化对蛋白质稳定性的影响研究进展[J]. 现代生物医学进展, 2011, 11 （S2）: 5190-5192. [5] Masarova J, Mislovicova D, Gemeiner P, Michalkova E. 2001. Stability enhancement of Escherichia coli penicillin G acylase by glycosylation with yeast mannan. Biotechnol Appl Biochem 34:127–133. [6] Ioannou YA, Zeidner KM, Grace ME, Desnick RJ.1998. Human alpha-galactosidase A: Glycosylation site 3 is essential for enzyme solubility.Biochem J 332:789–797. 文章信息源于公众号Biologics CMC，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。 学如逆水行舟，不进则退； 心似平原走马，易放难收。 行舟Drug 每日更新 欢迎订阅+ 医药大数据|行业动态|政策解读