P-110 (Stanford University)

炎症细胞应激期间的线粒体功能障碍已被确定为一些未满足临床需求的疾病的重要驱动因素，例如败血症、神经退行性疾病和缺血性损伤等，不可控的细胞应激和炎症可能导致广泛的代谢崩溃和器官衰竭。因此，病理性线粒体裂变的药理学抑制是一种有希望的策略，可以平息过度活跃的炎症并预防多种细胞类型和疾病的线粒体功能障碍。线粒体分裂的主要驱动源是动力蛋白相关蛋白 1（dynamin-related protein 1，Drp1），它是一种大型的胞质GTP酶，可以从胞质转移到线粒体外膜，通过收缩环介导线粒体分裂。Drp1通过蛋白Fis1、Mff、MiD49和MiD51被招募到线粒体上。Drp1-Mff介导的裂变对于维持线粒体质量极为重要，而Drp1-Fis1则介导病理性线粒体裂变。目前虽已有一种Drp1-Fis1互作的选择性七肽抑制剂——P110，其展现出了良好的体外活性且无明显的体内毒性，但却受制于稳定性和难以口服而无法转化临床应用。最近，来自斯坦福大学医学院的研究团队发现P110结合在Drp1上的一个开关I相邻的凹槽（switch I-adjacent grove，SWAG），并筛选得到结合SWAG的小分子SC9，并在细胞和内毒素血症小鼠模型中模拟了P110的益处。首先，研究人员探究了P110的作用机制。P110的同源序列来自Drp1上开关1(switch I)的前半部分，而开关I是许多GTP酶中参与GTP水解的一段非结构化环，他们比对GTP结合前后的Drp1结构发现，GTP的结合会使switch I向GTP位点摆动从而打开一个凹槽，即SWAG。计算分析发现SWAG口袋成药潜力大，因此可针对该口袋设计小分子来调节Drp1的GTP酶活性和功能。为了评估SWAG作为潜在P110结合位点的作用，他们将Drp1上开关I上的两个残基D49和R53突变，发现会导致Drp1对cP110不再敏感，证明P110 结合依赖于 SWAG 残基 D49 和 R53 来调节 Drp1 GTP 酶活性。此外，体外环化的P110（cP110）能够减小Drp1 的GTP酶酶活的Vmax和Km值，并且GMPPCP（GTP类似物）能增强P110和Drp1的亲和力，说明P110作为Drp1的反竞争性抑制剂能稳固结合GTP形式的Drp1。接下来，他们在商业化合物集合文库虚拟筛选可能结合SWAG的小分子，并依据预测的亲和力排序命名，最终挑选出3个化合物SC1、SC3和SC9进行生化评估。与P110一样，SC1，SC3和SC9也是Drp1 WT的非竞争性抑制剂，在1μM 时，它们都降低了Drp1的Km和Vmax。D49A Drp1突变体被cP110，SC1和SC3抑制，但不受SC9抑制。与cP110一样，SC1和SC9对D49A/R53A双Drp1突变体的抑制活性显著降低。竞争性结合实验显示，SC1、SC3和SC9会与P110竞争结合Drp1寡聚体。另外，他们为了探究这些化合物的靶标选择性，对比检测了与Drp1有最高同源性的SWAG动力蛋白2（dynamin2, Dnm2）的GTPase酶活影响，发现cP110、SC3和SC9仅抑制Drp1的GTP酶活性。进而，研究人员研究了这些化合物是否拥有类似P110的细胞活性。他们使用细菌内毒素脂多糖（LPS）处理H9c2心肌细胞产生病理性的线粒体裂解表型，再用这些化合物处理，发现只有SC9能与P110一样维持线粒体的正常大小，SC1有微弱的恢复完整线粒体的作用，而SC3甚至会加剧线粒体的片段化，表现出细胞毒性。另外，LPS导致的线粒体膜电位下降也会受到P110和SC9的抑制，而SC1和SC3无效果。基于此，研究人员决定使用SC9进行后续研究，并发现SC9和P110一样能降低LPS诱导产生的高ROS水平的细胞数量至未处理的基线水平，即SC9能复刻P110在LPS诱导H9c2细胞产生的线粒体紊乱的治疗作用。接着他们探究了SC9的作用机制，看是否与P110一致。首先，他们检测了LPS诱导的与线粒体连接的Drp1寡聚体的含量，发现SC9和P110一样在不改变细胞整体Drp1含量情况下，将Drp1寡聚体的含量降低到空白对照组以下，即能阻断压力诱导的Drp1的寡聚化。另外，他们使用邻近连接实验检测了单细胞内Drp1-Fis1和Drp1-Mff的结合，SC9能减少LPS模拟的病理性Drp1-Fis1的结合水平，甚至比生理条件水平更低。而且SC9对介导线粒体生理性裂解的Drp1-Mff互作没有影响。由此可知，P110和SC9通过选择性抑制Drp1-Fis1相互作用阻断Drp1向线粒体移动。进一步对SC9在体外、细胞以及小鼠模型的活性表征发现，SC9抑制Drp1的GTP酶酶活的IC50为270 nM ± 60 nM，而抑制LPS诱导的细胞线粒体膜去极化的EC50为750 nM ± 290 nM。他们基于小鼠体重下降和小鼠败血症得分的两个指标，确认了SC9的剂量可以达到50mg/kg也不产生明显毒性。20mg/ml的单词腹腔注射后，血浆中的SC9浓度约为细胞实验EC50的17倍，说明该剂量可以在小鼠中产生药效，SC9在小鼠中透过血脑屏障的比例低，而两次注射SC9能延长SC9的半衰期；另外，他们还进行了标准安全毒理学筛查发现SC9无明显体内毒性。随后他们进行了LPS的盲法剂量递增实验，结果显示，虽然不同检测的最适LPS剂量不同，但SC9能增加检测的所有LPS剂量处理下的小鼠存活率，并且SC9治疗在LPS处理小鼠的体重、MSS、严重事件如呼吸困难的发生等指标都展现出良好效果。为了找到导致SC9这种治疗效果的参与调控的炎症因子，他们进行了小鼠免疫监测实验，发现SC9治疗的小鼠相比只有LPS处理的对照组的炎症因子水平明显下降，尤其是IL-13、IL-33R和M-CSF等，而抗炎因子如IL-10水平上升了28%。为了更好的建立临床内毒素血症的模型，研究人员在LPS诱导出内毒素血症的症状后，即LPS处理4h后再使用SC9治疗小鼠，导致脓毒症峰值评分降低 45%，说明SC9在诱导炎症反应后给药也仍然有效。综上，研究人员找到Drp1中的一个变构位点并命名为SWAG，并且发现了一个选择性结合SWAG位点从而抑制Drp1 GTP酶活的小分子SC9，该分子能选择性抑制病理性的Drp1-Fis1互作及其导致的线粒体紊乱并且与多肽抑制剂P110作用机制相同，并在LPS诱导的细胞和小鼠模型中都表现出良好的治疗效果。尽管SC9的半衰期较短且通过血脑屏障的能力较差，需要进一步的药物化学的优化，但该研究为其它GTPase的抑制剂开发提供了思路和途径，并且这种通过选择性抑制蛋白互作从而区分病理性和生理性线粒体裂解的化合物为解决许多疾病中线粒体失调导致的免疫代谢稳态提供了工具分子，对线粒体功能障碍引发的免疫代谢相关的疾病治疗和药物开发具有重要指导意义。参考文献：Rios, Luis, et al. "Targeting an allosteric site in dynamin-related protein 1 to inhibit Fis1-mediated mitochondrial dysfunction." Nat Commun. 2023, 14: 4356.