TriMixDC-MEL

摘要:癌症的特征是无限的增殖和转移，传统的治疗策略通常会导致药物抗性的获得，从而突出了对更个性化治疗的需求。mRNA疫苗通过转录和翻译将外源性目标抗原的基因序列传递到人体细胞中，刺激身体产生针对编码蛋白的特定免疫反应，从而使身体能够获得针对这些抗原的免疫保护；这种方法可能被用于个性化癌症治疗。自近期冠状病毒大流行以来，mRNA疫苗的开发取得了实质性进展并得到了广泛采用。在当前的综述中，讨论了mRNA疫苗的开发、它们的作用机制、影响其功能的因素以及疫苗当前的临床应用。重点放在mRNA疫苗在癌症中的应用，旨在突出这种新颖且有前景的治疗方式的独特进展和剩余挑战。 1.引言 癌症仍然是对人类健康构成严重威胁的疾病，其发病率持续上升。近年来，新发病例数和癌症相关死亡人数呈显著上升趋势。癌症的发生是一个多因素、多步骤和复杂的过程，其病因尚未完全明确；然而，人们普遍认为它与吸烟、感染、职业暴露、环境污染、不健康饮食和遗传因素等多种因素密切相关。随着生命科学和技术的快速发展，我们对肿瘤的理解更加深入。寻找更有效的治疗方法以提高癌症患者的生存率，仍然是医学研究的核心话题。 mRNA疫苗是一种核酸制剂，可以通过特定的递送系统，通过转录和翻译的方式，将外源性目标抗原的基因序列传递到细胞内，转录的蛋白刺激身体产生特定的免疫反应，从而使身体获得免疫保护。mRNA疫苗是在灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和病毒载体疫苗之后的新一代疫苗。随着基于RNA的技术不断进步，这种创新的治疗模式预计将取代传统疫苗，并可能有能力解决与小分子和抗体疗法相关的问题。除了在传染病中的应用，mRNA疫苗还为包括癌症、罕见病和神经系统疾病在内的疾病提供了更有效和持久的治疗机会。mRNA疫苗不仅一次覆盖多种肿瘤抗原，还通过同时递送人类白细胞抗原（HLA）-I和HLA-II分子，激活更广泛的T细胞反应，从而实现更全面的多角度攻击。因此，mRNA疫苗具有显著的抗癌潜力。目前，全球有数十项与mRNA肿瘤疫苗相关的临床试验正在进行，包括（但不限于）黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌，某些试验中，mRNA疫苗与其他肿瘤免疫药物联合使用。最近开发的mRNA-4157疫苗，已被美国食品药品监督管理局（FDA）宣布为“突破性疗法认定”，并被欧洲药品管理局纳入“优先药品”计划，预计将成为首个上市的mRNA肿瘤疫苗。 本文综述了癌症的当前治疗方法以及mRNA疫苗的开发和现状。在此基础上，还讨论了mRNA疫苗在肿瘤治疗中的价值。 2.癌症治疗  癌症是全球主要的公共卫生问题。根据美国癌症协会发布的最新全球癌症数据，预计2023年美国将有1,958,310例新癌症病例和609,820例死亡。在不同类型的癌症中，前列腺癌、肺癌、支气管癌和结直肠癌几乎占男性所有病例的一半（48%），其中仅前列腺癌就占所有诊断的29%。对于女性，乳腺癌、肺癌和结直肠癌占所有新诊断癌症的52%，其中乳腺癌（BCa）单独占女性癌症的31%。在预计的癌症死亡中，男性中肺癌、前列腺癌和结直肠癌死亡人数最多，女性中肺癌、乳腺癌和结直肠癌死亡人数最多（图1A）。 图1. (A) 不同性别癌症的基本流行病学特征。(B) 肿瘤疫苗的主要类型。 由于医学方法的不断进步，治疗癌症的方法越来越多。根据癌症的类型和阶段以及患者的具体情况，选择合适的治疗可以显著延长生存时间并提高生活质量。癌症的治疗方法主要包括手术、化疗、放疗和免疫疗法。然而，单一的治疗方法对癌症的治疗是不够的，简单的治疗方案增加无法达到目标。因此，需要合理和全面地使用各种方法来更好地控制和消除肿瘤；即，应尽可能采用当前的综合多学科方法。 随着疫苗接种因数字时代的新兴创新而得到推广，接种具有个体肿瘤突变的患者可能成为癌症的第一种真正的个性化治疗。所有能够刺激身体产生对抗肿瘤发生病原体因素的制剂或激活特定免疫以对抗癌症的免疫逃逸效应并治疗肿瘤的疫苗都可以称为肿瘤疫苗。预防性疫苗与传统疫苗类似，主要针对与癌症直接相关的病原体微生物，如人乳头瘤病毒（HPV）和乙型肝炎病毒（HBV）。此外，还有针对已经患有癌症的患者的疗效疫苗，这些疫苗通过主要针对肿瘤中存在的“自身抗原”的免疫反应，促进持久的免疫记忆和长期的抗肿瘤反应的建立。 目前，肿瘤疫苗的主要类型如下：i）全细胞疫苗；ii）树突状细胞（DC）疫苗；iii）蛋白质或多肽疫苗；iv）核酸疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗（图1B）。 3.mRNA疫苗概述  mRNA疫苗的历史  在2019年冠状病毒（COVID-19）大流行期间，mRNA疫苗作为几家制药公司用于创建疫苗的尖端技术而受到关注。值得注意的是，第一个进入I期临床试验的潜在疫苗是mRNA疫苗。Brenner等人在1961年首次将mRNA识别为中枢神经系统中的中介遗传元素。Malone等人在1989年发现，当mRNA被包裹在阳离子脂质{N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵}中时，可以成功转染并表达在各种真核细胞中，这是mRNA基药物概念首次被构想出来的时候。20世纪90年代，mRNA疫苗研究蓬勃发展，临床前试验被应用于包括传染病和癌症在内的一系列疾病。1990年，首次成功进行mRNA体内表达的努力是直接注射体外转录的mRNA足以将mRNA引入小鼠骨骼肌细胞。这证明了mRNA疫苗的可行性。1992年，Jirikowski等人发现，将编码催产素和抗利尿激素的mRNA注射到遗传突变的糖尿病小鼠中，可以在注射后几小时内短时间内治愈病情。Martinon等人在1993年报告了一种体外生成的mRNA疫苗，编码流感病毒的核蛋白以激活小鼠的细胞毒性T细胞。Boczkowski等人在1996年首次发现，用mRNA脉冲的DC是触发T细胞反应的可行方法。Zhou等人在1999年展示了mRNA疫苗对抗癌症的潜力，通过直接将糖蛋白100 mRNA包裹在日本血凝病毒脂质体中注射到脾脏，导致黑色素瘤小鼠模型中肿瘤生长受限和生存时间延长。随着研究的进展和实验程序的改进，mRNA疫苗的安全性、有效性和工业制造能力在过去几十年中不断提高。目前，几种mRNA疫苗正在临床环境中进行测试，或随时可用，以对抗癌症和几种传染病，包括寨卡病毒、巨细胞病毒、流感病毒、偏肺病毒和副流感病毒。为了满足及时有效疫苗的需求，自全球严重急性呼吸综合征（SARS）CoV-2大流行以来，核酸疫苗的研究和开发激增。此外，mRNA疫苗的市值已增长至数十亿美元，预示着mRNA基药物，特别是mRNA疫苗的未来发展充满希望（图2）。 图2. mRNA疫苗的研究历史及肿瘤治疗进展。 mRNA疫苗的机制 mRNA疫苗的制造涉及几个相对复杂的步骤。首先，需要设计并合成所需的mRNA序列；该序列通常包括编码目标抗原或其他治疗蛋白的核苷酸序列，并且应包含适当的5'端帽和3'端尾序列以提高mRNA的稳定性和翻译效率。通过体外转录，合成相应的mRNA，体外转录系统通常由RNA聚合酶、缓冲溶液、核苷三磷酸、锌离子和辅助因子组成，以促进转录。将DNA模板与体外转录系统的其他组分混合，构成含有合成mRNA所有必要组分的反应混合物。然后将这个反应混合物放入适当的反应管中，并在适当的条件下进行体外转录反应。在这个反应过程中，RNA聚合酶识别DNA模板并利用它合成mRNA。合成的mRNA需要被纯化和修饰，以去除杂质并提高稳定性，某些mRNA疫苗可能还需要被包裹在脂质体中以提高其稳定性并促进体内细胞摄取。脂质体通常由磷脂和胆固醇等成分组成，可以在水相中形成具有脂质双层结构的微小脂质囊泡。可以添加表面活性剂（如聚乙二醇）以提高脂质体的稳定性和细胞摄取效率。合成的mRNA与脂质体混合形成脂质体-mRNA复合物。这些复合物可以通过内吞作用机制转染到目标细胞中，细胞膜形成内陷以将脂质体-mRNA复合物带入细胞内。内吞的囊泡将脂质体-mRNA复合物包裹在内体中，然后与细胞质中的其他细胞器融合，并将它们的内容物释放到细胞质中。脂质体-mRNA复合物的内容物释放到细胞质后，mRNA分子被细胞内的核糖体识别并翻译（图3）。 图3. mRNA疫苗的生产过程和主要结构。ORF（开放阅读框）、UTR（非翻译区）、PEG（聚乙二醇）。 一部分外来mRNA逃避了普遍存在的核糖核酸酶的破坏，并被个别细胞特有的自然过程（如发育中的树突状细胞的巨胞饮作用）内化为内体途径，由内体释放到细胞质中。宿主细胞的翻译机制将mRNA翻译成抗原蛋白。信号肽决定了编码蛋白一旦产生后的最终位置。这些可能是为了将蛋白质定位到宿主细胞内的适当细胞器而重组创建的，或者它们可能是原始蛋白质序列固有的。作为替代方案，这种编码的蛋白质可能通过其分泌影响附近细胞的功能，如果它被释放到血液中，它也可以影响远处的器官。细胞质中的蛋白酶分解对细胞重要的抗原蛋白，产生抗原肽表位。内质网是抗原肽表位转移、装载到主要组织相容性复合体（MHC I）类分子上并向CD8+细胞毒性T细胞展示的地方。为了获得更强力和持久的免疫反应，需要将蛋白质产品引导到抗原呈递细胞（APCs）中的MHC II类装载区。这可以通过向mRNA添加编码路径信号的序列来实现。一旦产生的抗原肽表位装载到MHC II分子上，就诱导了抗原特异性的CD4+ T细胞反应，并且装载的MHC II肽表位复合物出现在细胞表面（图4）。此外，通过一种称为交叉启动的过程，被DCs摄取的外来抗原也可以被处理并装载到MHC I类分子上。这允许设计、体外生产和递送任何所需序列到任何类型的细胞。当mRNA作为外来基因的载体时，由于其自我佐剂效应，它可能表现出与mRNA病毒相似的某些特征。APCs可以在翻译前识别mRNA，这种识别触发了模式识别受体的激活，包括Toll样受体（TLR）3、TLR7和TLR8。TLR3、TLR7和TLR8可以检测单链和双链（ds）RNA链，而短的和长的dsRNA丝可以在细胞质中被视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化相关蛋白5检测。因此，可能会激活I型干扰素（IFN-I）途径，可能会产生趋化因子和促炎细胞因子，并可能激活APCs，所有这些都可能触发强大的适应性反应。 图4. mRNA疫苗的一般作用机制示意图。MHC（主要组织相容性复合体）、TCR（T细胞受体）、PFN（穿孔素）、GzmB（颗粒酶B）。 mRNA疫苗的优势 mRNA肿瘤疫苗平台提供了其他癌症疗法所没有的独特优势。与传统的放疗和化疗不同，它们容易受到药物抗性的影响，mRNA疫苗允许同时覆盖多种抗原，从而克服了癌症治疗中的疫苗抗性。mRNA疫苗和免疫检查点抑制剂（ICIs）的结合可以在逆转抗性途径中发挥作用。因此，预计mRNA疫苗将是ICIs的有用辅助手段，两者的结合可能允许为患者实施精确和个性化的治疗。此外，传统的癌症治疗可能会对正常人体细胞造成重大损害，而mRNA疫苗可以更精确地针对肿瘤细胞。此外，mRNA表达的短暂性质确保了抗原刺激是暂时的，有效地降低了慢性炎症或自身免疫反应的可能性。与其他肿瘤疫苗平台相比，mRNA疫苗具有高度的免疫原性，能够刺激患者更广泛的免疫反应。 尽管mRNA肿瘤疫苗显示出临床潜力，但其经济价值也值得注意。作为一种新疗法，mRNA疫苗在方便性和生产成本方面优于其他细胞和基因治疗产品。市场上的其他基因/细胞疗法，如嵌合抗体受体T细胞免疫疗法（CAR-T），目前的价格为数百万美元，这对患者和社会构成了重大的经济负担。这是因为CAR-T需要为患者进行一系列过程，如细胞提取、修改、体外培养和重新输注，并且很难扩大生产规模，因此很难降低单一产品的成本。相比之下，mRNA疫苗是直接体外转录的。mRNA疫苗的合成和生产步骤是标准化的，允许产品的快速和大规模生产，这将导致产品的重大成本优势。因此，预计mRNA疫苗将为经济能力较弱的癌症患者提供福音，因此在当前的医疗环境中具有重要的经济潜力。 鉴于多种优势，mRNA技术比DNA甚至传统疫苗更具吸引力。体外转录（IVT）合成消除了对细胞的需求以及随之而来的监管障碍，使mRNA生产无疑比大规模蛋白质生产和纯化更容易、更快、更清洁，与传统的疫苗方法形成对比。抗原设计的准确性允许更快地响应新出现的大流行和流行病风险，及时有效地应对。mRNA之所以精确，是因为它只产生特定的抗原并触发定制的免疫反应，与减毒或灭活疫苗不同。mRNA可以通过结合模式识别受体触发和/或促进适应性免疫反应，无需佐剂，而亚单位疫苗需要佐剂来引发免疫反应。核酸疫苗受到HLA类型的限制较少，比肽疫苗更有可能引发更广泛的T细胞反应，因为它们可以编码全长肿瘤抗原，这允许APCs同时交叉呈现或呈现多个表位，具有I类和II类患者特异性HLA。 以下描述了mRNA疫苗相对于DNA疫苗的优越之处。由于DNA疫苗无法工作的核膜屏障被移除，因为只有mRNA需要在细胞质中转录，而DNA必须在细胞核中翻译。因此，有丝分裂和非有丝分裂细胞都可能成功转染mRNA疫苗。此外，mRNA很少整合到基因组DNA中，也不会经历插入突变。第三，由于mRNA被生物过程迅速分解，并且在2-3天后不留痕迹，编码抗原的生产只是暂时的。mRNA疫苗平台的灵活性也有助于生产，因为它允许标准化生产，因为对编码抗原的修改不会改变mRNA主干的物理/化学属性。第四，与其他平台相比，由于生产基于体外无细胞转录过程，因此病毒污染物和细胞衍生杂质的安全问题较少。此外，RNA疫苗通常比DNA疫苗引发更强的免疫反应。这一点的原因尚不完全清楚，但一些理论包括低表达DNA感应机制、不同的核酸感应模式识别受体的表达、DNA进入人类细胞的传递效率低下，以及DNA需要穿过细胞和核膜并在细胞核中转录才能成功转染细胞。 mRNA疫苗的潜在限制 尽管当前SARS-CoV-2 mRNA疫苗的成功促进了癌症mRNA疫苗的研究，但在以下章节中讨论了mRNA疫苗在癌症应用中仍然存在限制。 苛刻的保存条件。mRNA是一个不稳定的分子，由于核糖上的羟基存在，容易被环境中的生物核酸酶裂解。它可以在冷冻保存时保持稳定活性，但对于经济欠发达地区来说，存储成本太高。载体基保护剂如脂质纳米颗粒（LNPs）只能将mRNA疫苗保存最多3个月。Cichlidin也能保护mRNA免受酶促降解，但可能使其更难翻译，影响mRNA疫苗的效力。 单独使用时相对较低的抗肿瘤效果。由于mRNA疫苗的稳定性差、蛋白质的生产周期相对较短、肿瘤细胞的异质性以及晚期肿瘤的免疫微环境通常高度免疫抑制，单独使用mRNA疫苗很难在质量上提高抗肿瘤效果。因此，癌症mRNA疫苗的临床研究进展有限。 缺乏长期实验结果。癌症mRNA疫苗的临床试验目前正在进行，通常处于早期开发阶段。特别是个性化癌症mRNA疫苗的临床试验报告结果仍然有限，且治疗效果在患者之间差异很大。癌症mRNA疫苗的长期试验结果仍然缺乏，因此将其作为癌症常规治疗的路线图还很长。有报道称mRNA疫苗可能与某些罕见的致命血栓事件有关，因此mRNA疫苗接种的安全性也值得长期观察。总之，必须监测癌症治疗中mRNA疫苗的长期疗效和副作用。 监管挑战和伦理考虑。针对个体化新抗原的mRNA疫苗的开发和生产针对个人的基因组数据，因此疫苗可能带来监管和批准挑战。 影响mRNA疫苗的因素 尽管mRNA疫苗有所有的好处，它们的基本特性仍然对它们在癌症治疗中的使用施加了某些限制。例如，mRNA和细胞膜的负电荷使mRNA分布更具挑战性。皮肤和血液中含有胞外核糖核酸酶，这些酶容易分解mRNA。由于其固有的免疫原性，mRNA可能通过激活下游与干扰素相关的途径触发先天免疫。矛盾的是，这种固有的免疫原性促进了mRNA的降解，降低了抗原表达，尽管它可能被用作佐剂样效应来增加免疫反应。体外转录产品中经常发现dsRNA污染物。dsRNA可能通过增强I型干扰素的产生，进一步限制了mRNA的翻译并加强了先天免疫的激活。为应对这些问题，已经开发了几种技术来推进mRNA疫苗的科学。 mRNA疫苗的递送系统。众所周知，mRNA的半衰期约为7小时，没有递送系统的情况下其吸收很差。此外，mRNA是一个天然不稳定的分子，容易被内切核酸酶、3'外切核酸酶和5'外切核酸酶分解。将mRNA疫苗应用于癌症的最大挑战之一是在没有足够高的翻译水平的情况下，将mRNA送入足够数量的细胞。这需要高度针对性和有效的mRNA递送机制。迄今为止，已确定的癌症mRNA疫苗的递送载体包括LNPs、聚合物载体、肽载体、DC载体、细胞外囊泡载体和混合载体。 最发达、有前景且广泛使用的mRNA非病毒递送方法之一是LNP。它由四种组分组成，共同作用以包裹和保护脆弱的mRNA核心：胆固醇、辅助磷脂、阳离子或可电离脂质和聚乙二醇（PEG）化脂质。胆固醇用作稳定剂以增加LNP稳定性，可电离阳离子脂质可以促进mRNA的自主聚集形成约100纳米的颗粒，并通过电离在细胞质中释放mRNA，PEG可以延长LNP复合物的半衰期。天然磷脂支持纳米颗粒形成脂质双层结构。目前，有LNP-mRNA癌症疫苗正在进行临床试验，例如mRNA-4157。 mRNA疫苗的纯化。体外转录的mRNA产品主要是目标mRNA、非目标mRNA、核苷酸、寡核苷酸和蛋白质的组合。通常使用色谱法将目标mRNA从系统中的其他mRNA杂质中分离出来，而沉淀和提取技术则用于消除mRNA中的常见杂质。dsRNA可能通过增强I型干扰素的产生，而dsRNA是RNA病毒基因组复制中间体的模拟物。因此，通过纯化体外合成的mRNA产品，可以有效地减少mRNA疫苗对I型干扰素免疫反应，同时提高mRNA的翻译效率。在IVT期间，可以通过在更高温度下生成RNA或降低Mg2+含量来减少dsRNA物种。Engel等人检查了dT25共轭寡核苷酸亲和支持树脂（dT25-OAS）的纯化特性；由于其非常高的结合能力，dT25-OAS是大规模mRNA纯化的合适替代品。 mRNA疫苗的分子稳定化。提高蛋白表达通常涉及修改序列和/或结构以提高mRNA稳定性（增加半衰期）和翻译的技术。方法包括延长聚(A)尾、改变5'帽、设计非翻译区（UTR）和开放阅读框（ORF）序列模式以及改变特定的核苷酸序列。这些变化导致蛋白质的大量生产延长了一段时间，从几分钟到超过1周。PERSIST-seq，一个基于RNA测序的平台，最近被创建，用于全面表征各种mRNA库的细胞内mRNA稳定性。该平台已经并继续使mRNA药物增强的计算试验成为可能。 5'帽修饰。5'帽是一种保护结构，可以触发mRNA翻译，防止外切酶切割，并控制前mRNA剪接和核输出等功能。先天免疫系统使用5'帽来区分内源性RNA和外源性RNA。关于体外mRNA加帽，有两种标准方法。第一，通过在mRNA转录系统中加入正常的帽类似物m7GpppG结构，可以完成mRNA加帽和体外转录。第二，在第一次体外转录后，甲基转移酶将Cap 0甲基化为Cap 1以进行mRNA加帽。体外转录中用于mRNA加帽的最常用技术是使用帽类似物进行加帽。现在已经开发了几种帽类似物。在m7G内部的核糖部分改变的抗反向帽类似物（ARCAs）是最常报道的帽类似物。为了提高mRNA的质量，最近还开发了对ARCA结构的额外改变。例如，基于ARCA的磷修饰通过增加mRNA对eIF4E的亲和力，可能通过减少其对脱帽酶的敏感性并提高翻译效率来增加mRNA稳定性。在ARCA中插入一种新型化学改变的帽类似物可以增加mRNA的半衰期，防止它被mRNA脱帽酶2脱帽。2018年，‘CleanCap’，一种共转录加帽技术，被创造为另一种帽类似物。与传统的第一代帽类似物（如mCap和ARCA）相比，它们在较低的效率和反应产率下具有Cap 0结构，这要高效得多。 5'和3'-UTR的优化。mRNA编码区的上游（5'-UTR）和下游（3'-UTR）区域包括mRNA序列的非编码部分或UTR。UTR具有多种功能，包括控制mRNA稳定性、亚细胞定位、翻译效率和mRNA从细胞核输出。通过UTR优化，通常可以增加体内的mRNA表达水平，因此UTR是癌症mRNA疫苗设计的的关键部分。 ORF的密码子优化。ORF区域是mRNA的编码区，因此其翻译速率无疑非常重要。因此，通过选择该区域内的正确密码子，可以最大化mRNA的总翻译效率。为了实现序列优化的目标，使用的方法要么是选择高度表达的蛋白质共有的最佳密码子对，要么是保持目标细胞中高度表达的蛋白质自然存在的每种密码子的相同百分比。此外，为了加快翻译速度，ORF中不常见的密码子通常被替换为具有增加的转运RNA（tRNA）丰度的密码子。在这种情况下，可以确保在生产外来mRNA和/或使用宿主密码子增加高度表达基因的翻译时，具有足够的tRNA水平。为了控制翻译延伸速率，可以优化ORF的鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）含量。另一种与更高GC含量直接相关的密码子优化技术是尿嘧啶枯竭。RIG-I可以识别富含尿嘧啶的区域，当它被激活时，蛋白质表达可能完全停止。 聚(A)尾修饰。在mRNA构建的3'端是一个被称为聚(A)尾的聚腺苷酸区域。它对mRNA的酶稳定性和翻译都很重要。为了控制翻译效率，它特别与几种聚腺苷酸结合蛋白结合，并与mRNA序列5'端的7-甲基鸟苷帽（m7Gppp）合作。根据早期研究，聚(A)尾在控制mRNA的稳定性和翻译效率方面至关重要。发现较长的尾巴可以在多种细胞类型中增加蛋白质表达水平。另一方面，根据Lima等人的研究，较短的聚(A)序列可能会促进这种封闭循环形状以实现有效翻译。总之，为了最大化mRNA的翻译效率，应该根据不同的细胞类型修改聚(A)序列的长度。 修饰核苷酸。某些mRNA核苷酸在mRNA成熟期间经历转录后修饰。可以使用这些天然存在的修饰核苷酸（如5-甲基胞嘧啶和伪尿嘧啶）合成IVT mRNA。当IVT mRNA具有如伪尿嘧啶等修饰核苷酸时，表现出更好的翻译效率和稳定性。这被假设是因为核苷酸防止TLR、RIG-I和RNA依赖性蛋白激酶R（PKR）被激活，使IVT mRNA对细胞质TLR（如TLR3、TLR7和TLR8）以及RIG-I和PKR不可检测。然而，有建议称，未修饰的mRNA疫苗可以帮助免疫系统识别肿瘤细胞，在这种情况下，不需要修改癌症mRNA疫苗。 佐剂。佐剂是一类物质，无论是天然的还是人造的，都能被免疫系统轻易识别并用来增强预期的免疫反应。注射其相应的佐剂可以提高对抗原的免疫反应，即使mRNA疫苗本身具有自我佐剂效应。目前，向mRNA中添加佐剂是一个热门的研究课题。 一种名为TriMix的mRNA佐剂由三种免疫调节分子组成：CD70、CD40配体和活性TLR-4。对III期或IV期黑色素瘤患者进行TriMix mRNA治疗，连同额外的肿瘤抗原mRNAs，这导致持久的临床缓解和增强的免疫反应。最近建立了一种用于c16-r848的mRNA疫苗NP技术的佐剂脉冲。这种技术显著提高了ova特异性CD8+的扩增，这使得激活的T淋巴细胞能够穿透体内的肿瘤床，而在没有佐剂的mRNA疫苗NP中没有观察到这一点。RNActive（curevac Ag）疫苗平台和RNAdjuvant是其他流行的佐剂。此外，某些mRNA递送载体，如精蛋白和阳离子脂质，可能增强佐剂的效果。Pam2Cys是一种合成的中性脂肪酸，可以通过TLR2/6途径发出信号，已被证明能触发体液和细胞应用免疫反应，这使其成为一个有前途的候选佐剂。最近的一项研究将Pam2Cys整合到mRNA-LNP中以提高mRNA疫苗的效力。在使用这种疫苗的预防性和治疗性肿瘤模型中，CD4+和CD8+ T细胞依赖的抗肿瘤反应显著增强，同时记忆抗肿瘤反应也得到了建立。因此，Pam2Cys在开发未来的癌症mRNA疫苗中具有重要价值。 4.mRNA疫苗在传染病中的应用  mRNA疫苗主要用于治疗癌症和传染性疾病。目前，约有140项临床研究正在评估mRNA疫苗治疗各种疾病。自我复制或复制RNA疫苗和非复制mRNA疫苗是已经评估的两种主要类型的RNA疫苗。复制体是自我复制的mRNA，由RNA病毒产生，其结构病毒蛋白被替换为编码RNA聚合酶和抗原的mRNA。因此，这些mRNA增强了免疫原性并延长了蛋白质表达，从而提高了效率。 自我复制的mRNA有两种ORFs，一种编码目标抗原序列，另一种编码病毒复制机制，与传统的非复制IVT mRNA的“成熟”真核mRNA不同。这允许细胞内长期RNA扩增。非复制mRNA疫苗的递送机制可能进一步被识别，因为它可以直接注射到一系列解剖区域或通过体外装载DCs。虽然现在有几种机会使用自我复制的mRNAs来预防传染病，但其作为癌症疫苗的使用主要限于临床前研究，并且只有少数临床研究已经进行。 由病毒感染引起的疾病。基于核酸的疫苗通过在免疫期间在体内表达疫苗抗原，模仿病毒感染来诱导体液和细胞毒性T细胞反应。这一好处对于消除感染或细胞内病原体至关重要，需要强烈的体液和细胞免疫反应来提供有效的保护（图5）。 图5. mRNA疫苗在治疗多种疾病方面展现出巨大潜力。NSCLC（非小细胞肺癌）、HIV（人类免疫缺陷病毒）、HSV（单纯疱疹病毒）、SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）。 引起流感的病毒。避免流感的最有效方法是接种疫苗。与传统疫苗相比，编码流感病毒效应蛋白（s）的保守区域的mRNA疫苗可能诱导产生特定抗体，改善预防和理想的治疗效果。此外，由于开发过程更快，mRNA疫苗对新型流感病毒的开发更简单。这表明mRNA疫苗可以作为管理流感的快速和适应性工具，无论是季节性还是大流行性。 人类免疫缺陷病毒（HIV）。在首次使用裸露的mRNA（ihivarna）结合新的HIV免疫原序列（HTI免疫原）进行的人类临床试验中，使用DC激活方法（trimix：CD40配体（CD40L）+ CD70 + 编码组成性活性TLR4（CATLR4）RNA）和疫苗接种，疫苗安全且耐受性良好。它迅速增加了外周CD4 T细胞中的HIV-1 DNA和RNA，并触发了适度的HIV特异性T细胞反应。激活性佐剂trimix和来自HIV-1结构蛋白的16个保守片段（GAG、pol、Vif和Nef）组成了HTI trimix。它编码了一个强大的激活信号和一个高效的HIV重组抗原，使其成为mRNA基治疗HIV-1的有前途的新型疫苗候选物。根据临床前的发现，它可能成功刺激T细胞，成熟DC的释放和抗病毒细胞因子的释放（特别是IFN-γ）。HTI-TriMix的I期和IIa期临床研究在2019年底完成。IIa期研究中的HIV-1阳性个体在0-2周和4周接受了三次疫苗接种，这是通过超声引导使用腹股沟淋巴结确定的。 单纯疱疹病毒（HSV）。最近开发了一种针对HSV-2病毒颗粒上发现的C、D和E糖蛋白的三价疫苗。在HSV-2侵袭后，疫苗可以保护动物免受生殖器感染和随后的病毒脱落。此外，疫苗产生了交叉反应性抗体，中和了HSV-1并提供了对HSV-1感染的保护。因此，这种疫苗为生殖器HSV-1和HSV-2感染提供了强大的保护，并且是适合人体测试的候选疫苗（图5）。 黄病毒。许多黄病毒，如寨卡病毒、波瓦桑病毒、登革病毒和蜱传脑炎病毒，已使用mRNA疫苗进行治疗并预防感染。对寨卡病毒的mRNA疫苗引起了极大的兴趣。Richner等人创建了一个包含野生型或突变型ZIKV结构基因的LNP包裹的修饰mRNA疫苗，以评估小鼠的免疫原性和保护。在I/II期人类临床研究中，一个类似的疫苗称为mRNA-1893，在10或30微克剂量的初次加强免疫后，导致超过90%的血清转化（图5）。 COVID-19。对COVID-19的mRNA疫苗引起了极大的兴趣。迄今为止，已经生产了几种疫苗，包括mRNA-1273、BNT162、ARCT-021和cvncov疫苗（cv07050101）。mRNA-1273和BNT162b2 COVID-19疫苗几乎相同的94至95%的疫苗效力，以及它们快速的开发和测试周期一年，是科学和医学领域的显著成就。 在开发中的mRNA疫苗中，目前只有针对COVID-19的mRNA疫苗上市。根据已公布的临床数据，COVID-19 mRNA疫苗提供了高水平的保护和安全性。接种mRNA疫苗后，接种者产生的中和抗体水平显著高于那些从COVID-19中康复且未接种疫苗的人，并且表现出增强的免疫反应和记忆。mRNA COVID-19疫苗为16岁及以上个体提供了95%的整体保护，并且能够有效地对20多种病毒变体产生反应。大多数接种mRNA COVID-19疫苗的患者中没有发现临床意义上的安全问题。在一小部分接种新冠mRNA疫苗的人中观察到心肌炎，特别是在年轻男性接种第二剂疫苗后发病率最高。 由细菌感染引起的疾病。针对细菌和寄生虫抗原种类的mRNA疫苗开发尝试有限，其中许多仍处于临床前测试阶段。 Maruggi等人检查了表达A组链球菌抗原（GAS）和无乳链球菌（GBS）的自我放大mRNA疫苗的有效性和免疫原性。自我放大mRNA载体能够有效地产生两种原型细菌抗原：GBS的2a型菌毛骨干蛋白和双突变的GAS溶血素O。在感染GAS和GBS的小鼠中，自我放大mRNA疫苗产生的抗体反应能够持续提供保护。Jawalagatti等人开发了一种创新策略，用于创建可口服的mRNA疫苗。 5.mRNA疫苗在各种肿瘤中的应用  大约25年前，首次展示了基于mRNA的癌症疫苗的可行性。从那时起，mRNA疫苗在癌症治疗中的应用已在多项临床前和临床研究中进行了探讨。到目前为止，只进行了少数几项mRNA癌症疫苗的临床研究。大多数试验集中在急性髓系白血病（AML）、多发性骨髓瘤、间皮瘤、胶质母细胞瘤、恶性胶质瘤和肾细胞癌，以及胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌（BCa）、非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌和结直肠癌的mRNA疫苗，并且仍处于早期阶段（I和II）（图5）。Moderna和默克夏普多美公司宣布，2023年7月，首个mRNA个性化癌症疫苗（mRNA-4157）和抗程序性细胞死亡1（PD-1）单克隆抗体（Keytruda）的组合疗法进入了III期临床试验。这是首个进入III期临床试验的mRNA癌症疫苗。表I总结了mRNA疫苗治疗癌症的临床试验。 胰腺癌。越来越多的数据表明，胰腺癌的肿瘤内和肿瘤间异质性，特别是与免疫微环境和基因改变有关，与治疗抵抗性相关。传统的癌症治疗方法通常会导致获得性抵抗，强调了需要针对性、个性化的护理。在患有胰腺导管腺癌的患者中，最近使用辅助定制的mRNA新抗原疫苗autogene cevumeran的I期临床研究表明，疫苗刺激了T细胞活性，这可能与疾病的复发延迟有关。在临床试验中，19名患者中有16名在接受了Atezolizumab治疗后接受了cevumeran治疗；接受mRNA疫苗的16名患者中有8名产生了持续产生IFNγ的T细胞易位，证明了mRNA疫苗的免疫持久性。对疫苗有反应的受试者的中位无复发生存期（RFS）在中位随访时间为18个月时尚未达到。反应者的RFS明显高于非反应者。因此，可以得出结论，Atezolizumab（一种抗PD-L1单克隆抗体）与mRNA疫苗结合，诱导了广泛的T细胞活性，并延迟了胰腺癌的复发。Kang等人表明，在进行手术切除并有延迟复发风险的胰腺导管腺癌（PDAC）患者中，个性化的mRNA新抗原疫苗autogene cevumeran（BNT122）与Atezolizumab和mFOLFIRINOX（PDAC手术后的标准辅助化疗方案）结合使用，诱导了显著的T细胞活性。 结直肠癌。针对结直肠腺癌的mRNA疫苗有限。一个重大困难是从几种疫苗候选中筛选出可能适合特定类型癌症的mRNA疫苗。Liu等人确定的潜在mRNA疫苗候选物包括靶向抗原血栓蛋白2、卵泡抑素样3、肌钙蛋白T1、大囊泡、胶原蛋白三螺旋重复含1和NADPH氧化酶4。该研究还描述了CRC的异常基因表达模式和突变景观。结果可能有助于确定适合免疫治疗的CRC患者，并为创建mRNA癌症疫苗提供理论基础。 黑色素瘤。为了开发mRNA疫苗并确定合适的疫苗接种人群，Ping等人分析了黑色素瘤中的潜在肿瘤抗原。他们的分析揭示了蛋白酪氨酸磷酸酶受体类型C、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素11（SIGLEC11）、环状寡腺苷酸激活的单链核糖核酸酶和单链脱氧核糖核酸酶1、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1和ADAM样解刀蛋白1可能是黑色素瘤mRNA疫苗的抗原靶标，为黑色素瘤mRNA疫苗的开发奠定了基础。根据Sittplangkoon等人的研究结果，在黑色素瘤模型中，未修饰的mRNA疫苗可能导致产生IFN-I或触发下游信号级联反应，这两者对于引发强效的抗肿瘤T细胞反应至关重要，这些反应调节肿瘤的发展和转移。最近的一项临床研究结果显示，实验性疫苗mRNA-4157/V940结合pembrolizumab可能作为高危黑色素瘤治疗的辅助治疗。与单独使用PD-1抑制剂治疗的患者相比，接受这种组合治疗的个体在手术后复发风险显著降低。 乳腺癌（BCa）。Li等人确定了可能适合mRNA疫苗接种的BCa患者群体以及用于创建抗BCa mRNA疫苗的潜在BCa相关抗原。总共鉴定出三种肿瘤相关抗原：CD74、干扰素调节因子1和蛋白酶体激活亚单位2。这些抗原经常出现突变、扩增或上调，并且与免疫细胞浸润和预后相关。具有B类免疫亚群的患者的肿瘤微环境（TME）可能对mRNA疫苗反应良好。在前列腺腺癌（PRAD）免疫亚型2和3组的患者更有可能从免疫接种中受益，PRAD mRNA疫苗的潜在抗原，包括Kelch样家族成员17、肉碱棕榈酰转移酶1B、IQ基序含有GTP酶激活蛋白3、Lck相互作用跨膜适配器1、YjeF N-末端结构域含有3、卷曲螺旋结构域含有180、MutS同源物5和钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G-型受体3。 肝细胞癌（HCC）。北京协和医学院医院正在进行针对肿瘤抗原mRNA治疗疫苗ABOR2014（IPM511）的首次人体临床试验。该疫苗编码了在HCC患者中经常上调的近20种HCC抗原。该研究旨在评估IPM511单独使用以及与PD-1抑制剂治疗结合使用在经过一线标准治疗后病情进展的晚期HCC患者的安全性、耐受性和初步疗效。该研究目前正在进行中，尚未公布结果，主要研究者表示，IPM511在使用这种方法治疗的第一位患者中已经显示出安全性和临床可行性。 食管癌。最近报道了一项针对晚期食管鳞状细胞癌的个性化mRNA癌症疫苗结合PD-1抑制剂治疗的研究。参与研究的患者首先使用来自病变组织的全转录组测序进行新抗原筛选。开发了一种针对这些新抗原的个性化mRNA癌症疫苗。随后，患者接受了mRNA癌症疫苗与PD-1抑制剂的组合治疗，患者获得了部分缓解；治疗方案的安全性在可控范围内。因此，mRNA疫苗可能是晚期食管癌患者有效的治疗策略。 6.mRNA疫苗在肿瘤治疗中的功能性实现  mRNA疫苗的免疫治疗  癌症现在可以通过免疫治疗有效治疗，鉴于早期临床结果积极，FDA已经授权越来越多的免疫疗法。癌症免疫治疗的基础是免疫系统识别和消除癌细胞的能力。随着近年来针对增强对恶性肿瘤的免疫反应的多类药物的出现，这一研究领域迅速扩大。这些包括各种疫苗接种方法、采用T细胞治疗、免疫检查点抑制剂和细胞因子。 肿瘤抗原。肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs）是两类由mRNA编码的抗原，传统上一直是免疫治疗的靶标。鉴于免疫记忆，专门针对TAAs或TSAs的疫苗可能会针对并杀死表达抗原上调的癌细胞，并提供持久的治疗反应。 TAAs。TAA对肿瘤细胞并不独特。虽然它们也可能存在于健康组织和细胞中，特别是在胚胎组织中，这些抗原在肿瘤中的表达显著升高。Conry等人开发了第一种mRNA癌症疫苗；这种疫苗表明，用编码癌胚抗原（CEA）的mRNA免疫的小鼠在受到CEA表达肿瘤细胞挑战时显示出抗CEA抗体反应。自从这一初步发现以来，TAA研究受到了显著关注，并取得了积极的临床研究结果。Huang等人在胆管癌中鉴定了三种肿瘤抗原，包括CD247、Fcγ受体Ia和转录域相关蛋白，这些抗原与改善的预后和抗原呈递细胞的浸润有关。这些抗原可能作为针对胆管癌的mRNA疫苗的潜在候选物。然而，TAA免疫方法确实存在一些缺点。TAA通常不在恶性细胞中发现。此外，由于并非所有发现的TAA都能诱导抗肿瘤免疫反应，选择TAA可能具有挑战性，疫苗开发成本高昂。肿瘤本身可能会下调TAA，允许在专注于特定抗原时逃脱。最后，TAA也可能存在于正常组织中，针对它们的疫苗可能会引起外周和中枢耐受反应，这可能导致疫苗效力差或针对正常组织的自身免疫。 肿瘤特异性抗原（TSAs），也称为新抗原，是肿瘤细胞因体细胞随机变化而独有的抗原，因此不存在于正常组织和细胞中。肿瘤特异性突变是癌症免疫治疗的诱人靶点，这些突变可能导致新抗原的产生，从而允许开发定制疫苗，因为这些突变的抗原在健康组织中不表达，因此可以被T细胞识别。基于新抗原的疫苗接种相对于基于TAA的疫苗具有以下特点，突显了它们的优势。由于新抗原仅由肿瘤细胞产生，它们只能触发特定于肿瘤的T细胞反应，限制了对非恶性组织的伤害。新抗原提供了通过逃避T细胞对自身表位的中央耐受来引发针对肿瘤的免疫反应的潜力。此外，由于这些疫苗增强的新抗原特异性T细胞反应的持久性，可能提供长期防止疾病复发的保护，并提供超出治疗的免疫记忆。为了使患者对转移性胃癌产生免疫，Cafri等人最近将经过验证和表征的新抗原和预测的新表位以及驱动基因突变结合到一个单一的mRNA构建中。开发的疫苗证明是安全的，并且产生了针对预期新表位的T细胞反应，这些新表位在免疫之前尚未被发现。尽管取得了进展，使用新抗原仍然面临几个挑战；这些障碍源于生物学和技术因素，包括潜在抗原和HLA分子的多态性，对我们对不常见HLA等位基因的HLA结合基序的理解存在差距，以及肿瘤的异质性。 mRNA疫苗的肿瘤抗原递送方法 mRNA转染的DC疫苗。DC可以转染表达肿瘤抗原的mRNA和总肿瘤mRNA，然后可以将其传递给宿主并启动免疫反应。将转染TAA mRNA或总mRNA的DC皮下应用于带瘤小鼠已被证明可以诱导T细胞免疫并抑制已建立肿瘤的生长，这也支持了这两种不同转染方法的可行性。接受顺铂治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的患者，当Kongsted等人转染表达多种TAA的DC时，没有出现不良反应；约50%的研究参与者表现出免疫反应。现在正在进行一项针对肺癌患者的1期临床试验，评估MIDRIXNEO，这是一种针对肿瘤新抗原的定制mRNA加载的树突状细胞疫苗。 直接注射。有几种方法可以直接将编码肿瘤抗原的mRNA注入宿主体内。局部细胞，如APC，吸收mRNA并将其转移到细胞质中进行翻译。通过淋巴结内注射是传递肿瘤抗原的最常见方法之一。2012年对29名晚期黑色素瘤患者的1期研究开始了；这项试验的未发布数据显示，淋巴结内mRNA注射是安全和可行的（NCT01684241）。编码酪氨酸酶、前黑素体蛋白、MAGE家族成员A3（MAGE-A3）、MAGE-C2和肿瘤中优先表达的黑色素瘤抗原以及TriMix mRNA在静脉内注射时耐受性良好。在另一项1期临床研究中，研究了针对III期和IV期黑色素瘤患者的新抗原特异性mRNA疫苗的淋巴结内递送，该疫苗由针对患者的20种突变组成（NCT02035956），这表明可以利用个体突变。 通过皮肤给药。通过皮肤可能实现由mRNA表达的肿瘤抗原的给药。小鼠通过基因枪将编码增强型绿色荧光蛋白和黑素细胞自身抗原TRP2的IVT mRNA注射到皮肤上。这成功地引发了针对抗原的细胞免疫，对B16肺转移和诱导类似白癜风的毛发脱色起到了保护作用。在一项涉及21名转移性黑色素瘤患者的1/2期临床试验中，将编码六种与黑色素瘤相关抗原的mRNA通过皮内注射，使用精蛋白凝聚的裸mRNA，安全且成功地注射到4名可评估患者中的2名。此外，在7名可测量疾病的患者中，有1名对疫苗表现出完全反应。 通过鼻内给药。通过mRNA编码肿瘤抗原的粘膜途径可以有效地引发全身免疫反应和局部粘膜免疫。通过鼻内递送可以达到鼻相关淋巴组织，这是一个有利的位置，可以促进抗原内化，以促进对癌细胞的保护反应。在侵袭性刘易斯肺癌模型中，Mai等人通过腹腔内免疫小鼠，使用阳离子脂质/精蛋白复合物携带编码角蛋白19的mRNA，这减缓了肿瘤的发展并引发了强大的细胞免疫反应。 通过静脉内给药。Sahin等人研究了编码四种非突变肿瘤相关抗原的黑色素瘤fixvac（bnt111）静脉内脂质体RNA（rna-lpx）疫苗。rna-lpx疫苗是一种成功的免疫治疗方法；针对疫苗抗原实现了强大的CD4+和CD8+ T细胞免疫，伴随着有利的临床反应。在某些反应者中，抗原特异性细胞毒性T细胞反应是持久的，并且常常记录采用T细胞治疗。 mRNA编码的免疫调节剂。肿瘤免疫疗法，也称为主动非特异性免疫疗法，是最早使用免疫系统调节剂的医学领域之一。体外靶细胞转染，或静脉内或肿瘤内递送，是体内通过mRNA产生免疫调节剂的主要方法。由于细胞因子，免疫系统的细胞可以在短距离内进行通信，细胞因子是先天和适应性免疫的重要调节剂。为了刺激癌症患者的免疫系统，细胞因子疗法已成为一种重要的治疗手段，并且是当前临床癌症研究的主要课题。mRNA编码细胞因子基免疫疗法的目标是以最少的毒性和系统暴露从递送重组蛋白中增加TME中的细胞因子数量。 鉴于其强烈的促炎特性，IL-12是癌症免疫疗法的一个有希望的选择。IL-12信号诱导1型T辅助细胞（Th1）分化、CD8+细胞获得细胞毒性活性以及激活IFN-γ的产生，所有这些都改善了吞噬功能和局部炎症。T细胞转染mRNA产生由p35和p40亚基组成的单链IL-12（scIL-12）是研究的主题之一。在同源和异种移植小鼠模型中，scIL-12表达T细胞的肿瘤内注射导致注射和远处肿瘤病变的完全排斥。通过与4-1BB配体（4-1BBL）mRNA共电穿孔，进一步增强了T细胞的抗肿瘤效果。已经显示，新型肿瘤内IL-12 mRNA治疗可以刺激Th1 TME转化和强大的抗肿瘤免疫。此外，在对检查点抑制剂有抵抗力的小鼠肿瘤模型中，将免疫检查点抑制剂与IL-12 mRNA结合使用，增加了抗癌反应，增强了总生存期（OS）和肿瘤退缩。 已经验证了多种mRNA编码不同细胞因子的免疫治疗效果。Hotz等人在肿瘤内给药后检查了编码四种细胞因子的mRNA，IL-12、IFN-α、IL-15 sushi和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。这些细胞因子可能促进免疫记忆的发展，并具有强大的抗癌作用。Hewitt等人表明，在各种TME中，直接肿瘤内给药编码这些细胞因子的mRNA产生了强烈的抗癌反应。 肿瘤免疫疗法除了细胞因子外，还涉及mRNA编码的刺激配体和受体。免疫系统从刺激配体和受体接收炎症信号，这些信号可用于癌症免疫治疗。通过暂时为细胞提供刺激受体，mRNA可用于暂时激活强大的炎症信号。虽然这些免疫刺激剂不被视为癌症疫苗，但它们通常与其他免疫治疗方法（如检查点阻断调节剂）联合使用，以增强体液和细胞反应。一些研究表明，使用编码共刺激分子的mRNA电穿孔后，DC的免疫刺激活性显著增加，包括CD83、肿瘤坏死因子受体超家族成员4（也称为OX40）和4-1BBL。Trimix mRNA是一种由三个mRNA分子组成的mRNA基佐剂，编码CATLR4、激活刺激因子CD40L和共刺激分子CD70，该佐剂于2016年创建。Loomis等人表明，通过肌肉注射连接的体外转录mRNA-TLR7激动剂，可以在体内增强抗原特异性的细胞介导和体液反应。TriMix mRNA单独使用（TriMix mRNA加TAA mRNA，或自体单核细胞衍生的mRNA共电穿孔的树突状细胞与编码CD40配体、CD70和组成性激活的TLR4的mRNA，称为TriMixDC-MEL）以及与ipilimumab检查点抑制剂（一种阻断CTLA的单克隆抗体）联合使用，都能引发强大的免疫反应，从而带来有希望的临床反应和延长无病生存率（NCT01676779和NCT01302496）。这些II期研究是针对III/IV期黑色素瘤患者进行的治疗。 mRNA编码的抗体。自从首个抗体被批准用于癌症治疗以来，肿瘤学领域以越来越快的速度开发了基于抗体的治疗方法。因此，现在有几种获批的抗体和正在进行临床审查的其他候选物。Thran等人展示了mRNA在体外产生各种抗体和抗体类型的能力。此外，编码肿瘤抗体的mRNA可能引发强大的抗肿瘤免疫。 抗体在肿瘤治疗中的参与可以通过以下方法分类：i) 抗体在结合目标受体后，可能通过诱导凋亡信号或去除关键的生长信号，促进肿瘤细胞的直接死亡。ii) 通过附着于癌细胞特异性抗原，激活免疫介导的细胞死亡，诱导补体依赖性细胞毒性（CDC）或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。iii) 阻断免疫检查点，涉及阻止PD1或CTLA4抗体，重新激活针对癌细胞抗原的T细胞反应，并触发免疫介导的细胞死亡。iv) 直接与癌细胞结合的T细胞，启动免疫介导的细胞死亡。 单克隆抗体（mAb）、mAb片段和工程变体（如二价抗体、三价抗体、小抗体和单域抗体）是参与肿瘤免疫治疗的抗体类别。单克隆抗体和双特异性抗体都经过了广泛的研究和使用。 首个获得癌症治疗许可的mAb，利妥昔单抗，靶向CD20并诱导CDC，以及较小程度的ADCC。它用于治疗慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤。在体外前B细胞淋巴瘤模型中，编码这种mAb的mRNA是有益的。由于曲妥珠单抗抑制激酶活性、下游信号和人表皮生长因子受体2（HER2）/Erb-B2受体酪氨酸激酶2受体二聚体化，癌细胞饿死并最终死亡。通过与癌细胞上的诱导凋亡受体结合的拮抗性抗体，如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体和抗体-药物偶联物，尤其是向癌细胞传递有毒有效载荷，也可能诱导直接肿瘤细胞死亡。当使用靶向肝脏的LNP配方鞘内给药时，从血清中检索到编码mRNA的曲妥珠单抗，并表现出ADCC。在HER2/neu阳性乳腺癌异种移植模型中，这种方法增加了存活率。通过将抗程序性细胞死亡配体1（PD-L1）mAb表达的自放大RNA注入小鼠肿瘤，可以促进转染细胞中PD-L1 mAb的翻译和CD8+ T细胞向肿瘤的浸润。尽管mAbs在癌症方面有多个积极的例子，但较差的组织穿透限制了完整抗体在肿瘤质量上均匀分布的能力。因此，已经努力修改抗体的结构，产生了具有改善的组织穿透性的新型抗体片段。抗体片段的发现在双特异性抗体（BsAbs）的研究中极大地帮助了，并被用作创建这些抗体的构建块。世界上第一个同时结合两种抗原的抗体是在1960年代由Nisonoff等人通过使用适度的再氧化方法将两个兔多克隆抗体血清的抗原结合片段结合起来创建的。 BsAbs相对于常规mAbs的一个可能好处是它们能够同时靶向两个不同的位点，并在一定程度上绕过肿瘤药物抗性。然而，由于BsAbs的血清半衰期很短（仅几个小时），它们必须不断使用输液泵给患者施用。克服这个限制的一个可能方法是使用mRNA直接在患者中产生治疗性抗体。 最近的一项研究强调了一种成功的双特异性靶向方法；一种临床上批准的LNP封装mRNA表达C-C基序趋化因子配体2（CCL2）和CCL5（bisccl2/5I），可以双特异性结合和中和。这显著促进了TAM向抗肿瘤M1表型的极化，并降低了TME中的免疫抑制。BisCCL2/5i与PD-1L抑制剂联合使用已被证明在小鼠模型中，原发性肝癌的胰腺、结直肠和肝脏转移中实现长期存活。Wu等人描述了使用mRNA编码具有消融Fc免疫学效应功能的BsAb。该抗体，也称为XA-1，靶向人PD-L1和PD-1。与直接用于癌症的抗体治疗不同，这项工作表明，使用XA-1 mRNA LNPs治疗可以有效地通过肝细胞产生内源性治疗性BsAbs。 mRNA编码的抗原受体。通过产生转基因T细胞受体（TCRs）或CARs，由于mRNAs的短暂性质，已经有可能为naïve T细胞提供肿瘤选择性。编码CARs或TCRs的mRNA已被证明具有价值；生成CARs或TCRs的短暂表达可以防止细胞因子释放综合征的发展，这是慢性T细胞激活的负面后果。CAR-T细胞作为最有前途的癌症过继免疫治疗方法引起了相当大的兴趣。 CAR-T治疗中，从患者体内提取免疫T细胞，通过体外基因改造，赋予其识别癌细胞表面的“嵌合抗原受体”（CAR）。这些改造后的细胞在实验室中扩增后，再输回患者体内。通常，细胞外的TAA特异性抗体结合域与细胞内的T细胞信号区域融合，形成嵌合受体。几乎每种肿瘤相关抗原都可能成为CAR-T细胞的靶标。然而，CAR-T治疗中也存在一些风险，包括针对非肿瘤组织的毒性。体外转录的mRNA CAR-T细胞作为一种安全的治疗方案正在兴起，因为它们可以避免针对性的抗肿瘤毒性。大多数研究使用mRNA电穿孔的CARs，这是一种实用且可扩展的方法，能够在不损害细胞产品活性的情况下实现淋巴细胞转染率超过90%。CAR表达在T细胞表面大约持续7天，并且在遇到目标细胞后内化的CARs不会恢复。然而，体外转录mRNA方法也有其缺点。包括较差的肿瘤浸润、当T细胞数量有限时制造困难、重复注射CAR-T细胞时副作用的风险，以及mRNA重定向T细胞的短寿命，导致编码蛋白的表达持续数天。最重要的是，电穿孔有各种缺点，可能严重影响生成的CAR-T细胞的质量。实际上，脉冲电场的应用可能会不可逆转地破坏细胞质膜的完整性。在存活的转染细胞中，可能会观察到转基因表达减少、异常的基因表达谱和较差的活性。实际上，研究表明，与未修饰和未纯化的mRNA相比，使用化学修饰的1mΨ mRNA和/或进一步纯化以去除dsRNA的mRNA，小鼠T细胞电穿孔的CAR编码mRNA显示出显著降低的检查点分子（PD-1和淋巴细胞激活基因3）上调。这赋予了免疫沉默的mRNA转染T细胞更大的杀伤力，即使在细胞的CAR表达消失后也能持续。当前结果必须在mRNA CAR-T细胞的生产中考虑，以满足临床试验的目标，目前正在进行mRNA CAR研究，针对血液和实体肿瘤恶性肿瘤。 目前，mRNA CAR-T细胞受到极大关注，并在肿瘤治疗研究中显示出有希望的结果。使用mRNA CAR-T细胞治疗血液恶性肿瘤已经看到了有利的临床前和临床结果。主要靶标包括CD19、CD37、CD33和CD123。已经进行了针对淋巴瘤和白血病的mRNA CAR-T细胞治疗的临床前研究。针对霍奇金淋巴瘤的CD19方法和针对复发/难治性急性髓系白血病的CD123方法都在临床研究中进行了测试。这两项研究表明mRNA CAR-T治疗是安全的。Jetani等人最近提出了一种新的mRNA CAR-T细胞治疗方法，他们确定了siglec-6作为AML中CAR-T细胞的新靶标。Lin等人创建了一种新的CD8+ CAR-T细胞产品Descartes-08，用于治疗多发性骨髓瘤；该产品初步显示出持续的反应和强大的治疗指数。间皮瘤、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤是已经研究了mRNA CAR-T治疗的实体恶性肿瘤。 组合疗法-免疫疗法和mRNA疫苗。mRNA治疗与另一种治疗方式的结合可能在肿瘤治疗中显示出巨大潜力。肿瘤抗原与免疫调节剂之间的相互作用是当前研究的主要焦点。 早期研究表明，将TAA和IL-12 mRNA转染到成熟的DC中可以增强TAA特异性CTLs，这可能被用来触发由NK效应细胞和CTLs介导的针对肿瘤的免疫反应。通过测试编码HLA-II类靶向信号（DC-LAMP）、黑色素瘤相关抗原、CD40配体、CATLR4和CD70融合蛋白的mRNA，证明了使用trimixdc Mel的细胞免疫疗法的安全性和免疫原性。在研究的IV剂量水平下，看到了具有持久疾病控制的抗肿瘤效果。 最近，在转移性肾细胞癌的3期研究中使用了Sunitinib和rocapuldencel-T。通过电穿孔自体免疫，使用成熟的单核细胞衍生的DCs制备的放大肿瘤RNA和CD40L RNA，并没有提高接受组合治疗的患者的总生存期。然而，与总生存期相关的免疫反应得到了增强。 mRNA疫苗的蛋白质疗法 诱导癌细胞死亡的方法。通过使用mRNA疗法，可以使得癌细胞产生一种致命的细胞内蛋白，导致细胞自我毁灭。Van Hoecke等人通过宫内传递编码混合谱系激酶结构域样蛋白的mRNA，导致肿瘤生长停滞和诱导坏死性肿瘤细胞死亡。 蛋白质替代疗法。IVT mRNA在蛋白质替代疗法中的使用是基于产生可以激活或抑制细胞途径的外来蛋白，以及补充缺失或表达不足的蛋白质。自1992年首次用于蛋白质替代的临床前评估以来，IVT mRNA注射已被用于针对几种蛋白质。 鉴于它们的可及性，肝脏、肺和心脏是IVT mRNA基于蛋白质替代治疗的主要靶标。然而，其他组织和器官，如皮肤、眼睛的背面或鼻腔，也被视为潜在的靶标。罕见和遗传性疾病是这种治疗方式的主要目标。疾病引起的下调蛋白与遗传异常有关，并由治疗性IVT mRNA编码。 IVT mRNA作为蛋白质替代疗法正在作为癌症治疗的一种方式进行研究。然而，这是非常困难的，因为它需要反复给药，有时甚至是全身分布，以及靶向mRNA表达。据我们所知，目前在蛋白质替代领域还没有开始使用IVT mRNA的临床试验。 在96%的高级别浆液性卵巢癌患者中存在肿瘤蛋白（TP53）的突变。由TP53基因表达的p53蛋白识别并修复细胞中的DNA损伤，并在损伤无法修复时诱导细胞死亡，从而避免异常细胞的增殖，防止癌症的发生。当TP53基因突变时，表达的突变p53蛋白失去了其致癌效应。在最近的一项研究中，一个团队合成了编码正确p53蛋白的mRNA，并将其装载到脂质体中进行传递，从而允许mRNA在癌细胞中表达功能性p53蛋白。经过上述mRNA治疗后，来自患者的卵巢类器官开始萎缩和死亡，小鼠模型中的原发性肿瘤和转移瘤几乎完全消失。这些发现表明，基于IVT-mRNA的蛋白质替代疗法可能重新激活癌细胞中的致癌蛋白，因此可能成为癌症治疗的宝贵治疗选择。 基因编辑的mRNA疫苗。mRNA技术表达可编程核酸酶，如锌指核酸酶、转录激活因子效应物核酸酶和成簇的规则间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关内切酶（Cas）9系统，允许基因编辑作为一种潜在的治疗手段。通过向细胞基因组提供特定部位的变异，例如纠正有害突变或引入保护性变化，这些基因组工程技术允许替换或修改基因表达。CRISPR-Cas9由Cas9核酸内切酶和单导向RNA（sgRNA）组成，是一种广泛使用的基因编辑工具。CRISPR-Cas9治疗可用于永久性地消除癌细胞存活基因，避免了重复给药的需要，从而提高治疗效果。癌细胞或T细胞被转染了封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中的Cas9 mRNA和sgRNA。mRNA在细胞质中翻译以产生Cas9蛋白，然后与sgRNA复合形成对特定DNA序列有亲和力的核糖核蛋白。接下来，核糖体复合物转移到细胞核以破坏肿瘤存活基因。当这种情况发生在T细胞中时，PD-1和内源性TCR基因被敲除以在肿瘤细胞中诱导凋亡。Ling等人使用针对E6或E7致癌基因的Cas9 mRNA和gRNA治疗宫颈癌。结果表明，这种方法不仅有效地敲除了致癌基因，还逆转了免疫抑制微环境以实现抗肿瘤效果。 再生医学 再生医学的目标是通过重新建立或恢复其正常功能来替代、再生或恢复受损或被破坏的组织、器官或细胞。调节细胞生物活性的蛋白质，如细胞分裂、迁移和分化以及生长因子、细胞因子和转录因子，对再生过程至关重要。将体外转录mRNA转染到体细胞中表达转录因子，是传统的体细胞重编程和转分化的有吸引力的替代方法。在再生医学中使用体外转录mRNA的主要目标是增加1型糖尿病患者分泌胰岛素的能力。使用细胞和间充质干细胞工程进行肿瘤治疗尚未得到广泛关注。已经证明，使用前列腺素E2受体拮抗剂从干细胞中诱导出具有转移干细胞特性的干细胞外泌体，并用于癌症治疗和再生医学。干细胞外泌体可以降低肿瘤抗性。是否可以使用mRNA疫苗表达具有转移干细胞特性的干细胞外泌体用于癌症治疗，这是一个考虑点。 7.结论和未来展望  由于新型抗肿瘤药物和疗法的不断发展，癌症患者的生存几率有所提高；然而，包括肿瘤药物抗性、剂量毒性等问题在内的一些问题，不断带来新的困难。与标准治疗方法相比，大多数恶性肿瘤的生物治疗旨在通过刺激自身免疫和阻断关键信号转导来预防肿瘤生长和发生。人们对于mRNA基技术的长期效果缺乏一些担忧；研究人员正试图使用mRNA治疗挑战目前的疾病治疗方法。 自从Wolff等人证明体外转录的mRNA可以在活细胞中产生蛋白质以来，mRNA疫苗在几个应用中已显示出成功。作为一种有前途的新型平台，基于mRNA的疫苗需要克服冷链保存的限制，并提供更好的适应性、有效性、简便性和可扩展性，以及降低成本。mRNA疫苗在传染病方面已显示出益处，癌症是mRNA技术的预定目标。在未来2-4年内，使用定制癌症疫苗的几项积极的临床研究应该完成。 在肿瘤治疗中使用组合mRNA治疗似乎有着有希望的前景。包括手术、放疗和化疗在内的目前肿瘤治疗方法效果很好。作为一种新型生物治疗，mRNA治疗需要额外的临床试验，以提供一个更好的整合计划，然后才能有效地纳入当前程序。此外，mRNA技术可以与免疫疗法结合使用；目前，大多数研究集中在免疫调节剂上。由于其独特的优势，mRNA也预计将取代ILs、IFNs和细胞集落因子等重组蛋白药物。由于体外转录mRNA在基因编辑技术中减少误差的能力，肿瘤基因治疗可能会取得进展。假设通过将目标基因引入载体来完成肿瘤基因治疗，mRNA治疗最终可能会降低遗传家族性肿瘤的流行率。因此，更广泛的癌症患者可能会从这些新解决方案中受益。 未来对癌症mRNA疫苗的研究应该集中在治疗性和预防性疫苗的开发上。个性化mRNA疫苗为对当前治疗无反应的肿瘤，如胰腺癌，提供了新的治疗策略。此外，mRNA技术可以用来开发针对癌症重要原因的病毒的疫苗，如HPV和HBV。研究表明，在动物研究中，HPV mRNA疫苗比HPV重组蛋白疫苗和HPV DNA疫苗对肿瘤更有效，支持使用mRNA技术开发预防肿瘤的预防性疫苗的未来，这将在临床试验中进一步评估。 此外，mRNA疫苗的灵活性、适应性和快速生产能力将为未来预防和治疗传染病和癌症提供激动人心的可能性，这将有助于减少全球疾病负担。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要患者对信使核糖核酸(mRNA)疫苗表现出良好的耐受性，编码分子的选择是灵活多样的。这些疫苗可以被设计成表达包含多个表位的全长抗原，而不受主要组织相容性复合体(MHC)的限制，相对容易控制，并且可以快速批量生产。美国食品药品监督管理局(FDA)于2021年批准了辉瑞和BioNTech生产的首个基于mRNA的新型冠状病毒病(COVID-19)疫苗，引发了mRNA疫苗研发热潮。基于上述特点和mRNA疫苗的发展，尤其是近五年来，mRNA肿瘤疫苗已成为研究热点，发展迅速。本文从抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用、不同给药途径和临床前评价等方面对mRNA肿瘤疫苗的研究进展进行了分析，以反映mRNA肿瘤疫苗的发展趋势和面临的挑战。关键词：mRNA，癌症疫苗，肿瘤相关抗原，新抗原，mRNA递送载体，佐剂，给药途径。1.mRNA疫苗和mRNA癌症疫苗1961年，Brenner等人首次发现mRNA，它是基因作为蛋白质表达所必需的关键中间分子，含有与氨基酸(蛋白质的基本单位)相对应的密码子信息。1990年，Wolff等人首次证明，通过肌肉注射编码相应蛋白的纯RNA，可以在小鼠体内有效表达特定蛋白[如氯霉素乙酰转移酶和荧光素酶(Luc)]；具体来说，βgLucβgAn RNA的蛋白表达以剂量依赖性和时间依赖性的方式发生；这项工作还提出了mRNA疫苗的概念。2020年，美国食品和药物管理局(FDA)紧急批准了Pfizer--BioNTech/BNT162b2和Moderna/mRNA-1273生产的两种基于mRNA的疫苗，用于预防2019年冠状病毒病(COVID - 19)。2021年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了Pfizer-BioNTech(上市名称为Comirnaty)生产的首个COVID-19疫苗，激发了mRNA疫苗的研发热情，并对mRNA癌症疫苗的突破产生了期待。迄今为止，研究人员已将mRNA用作疫苗平台[例如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、冠状病毒、病毒抗原(狂犬病病毒糖蛋白、寨卡病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的蛋白质)，细菌病原体(结核分枝杆菌)和癌症]和蛋白质替代平台(例如factor IX、卵泡抑素、鸟氨酸经甲氨基甲酰基酶和促红细胞生成素)，用于疾病的预防和治疗。mRNA疫苗具有许多共同特征。与质粒脱氧核糖核酸(DNA)和病毒载体存在因基因插入和/或感染而导致突变的风险不同，mRNA进入细胞质后可直接翻译成蛋白质；因此，mRNA疫苗是非整合的、非传染性的、耐受性良好的。mRNA也在细胞中短暂表达，允许重复接种。mRNA转录物中编码单位的选择是灵活多样的，允许编码抗原和免疫调节分子来诱导和调节适应性和先天免疫应答，并且含有多个表位的编码全长抗原可以由MHC Ⅰ类(MHC-Ⅰ)和Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子呈现，而不受MHC限制。体外转录(IVT) mRNA的生产不需要细胞，防止了蛋白质或病毒的污染，并允许快速、经济和容易的大规模生产。mRNA癌症疫苗利用编码肿瘤抗原或免疫调节分子的mRNA递送相应的蛋白，结合相关的递送载体和佐剂，诱导抗肿瘤应答。图1显示了mRNA癌症疫苗的发展时间表。抗肿瘤T细胞是介导这些疫苗治疗效果的主要预期效应细胞，图2总结了抗肿瘤T细胞产生和作用的机制。RNA在疫苗位点被DCs摄取，翻译并加工成抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物并呈递到细胞表面。活化的DCs到达引流淋巴结，呈递的抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物与淋巴结内分化簇8 (CD8)+/CD4+ T细胞(第一信号)表面的T细胞受体(TCR)结合，导致T细胞活化和增殖，共刺激信号分子[如CD80/CD86, OX40配体(OX40L)]与受体(如CD28, OX40)在T细胞(第二信号)和细胞因子[如干扰素(IFN) I，白细胞介素12 (IL-12)， IL-1]与T细胞上的细胞因子受体结合(第三信号)。此外，CD4+ T细胞分泌的IL-2可促进CD8+ T细胞扩增。活化的T细胞在趋化因子[如CC -趋化因子受体7，CC -趋化因子配体(CCL) 5，CXC -趋化因子配体9/10]的作用下向肿瘤组织迁移并浸润，最大限度地发挥其分泌的效应器[如IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、穿孔素、颗粒酶]的抗肿瘤作用。内源性抗原主要通过MHC-Ⅰ分子呈递激活细胞毒性CD8+ T细胞，外源性抗原主要通过MHC-Ⅱ分子呈递激活辅助CD4+ T细胞。细胞毒CD8+ T细胞通常对靶细胞具有很强的直接杀伤作用，这些细胞是癌症疫苗预期诱导的主要效应细胞。2.mRNA癌症疫苗在临床前和临床研究中的进展疫苗的核心作用是提供能被人体免疫细胞识别的抗原，从而引发免疫反应。抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用以及给药途径是疫苗设计中需要考虑的关键因素。表1总结了这些因素的进展在临床前和临床设置。表2总结了2016年至2021年期间使用基于mRNA的癌症疫苗的临床试验。2.1.选定抗原或靶标2.1.1.肿瘤相关抗原研制肿瘤疫苗的第一步是抗原的选择，抗原应具有较高的肿瘤特异性，并能诱导强而可控的抗肿瘤T细胞反应。肿瘤抗原根据其组织分布、表达水平和中枢耐受状态可分为TAAs和TSAs。TAAs在肿瘤中普遍过表达，在正常组织中也有表达，肿瘤特异性弱，中枢耐受性强，免疫原性弱，主要包括组织分化抗原和癌胚抗原。TAAs的中枢免疫耐受是利用这些抗原开发癌症疫苗的主要挑战。使用多个(如2-6个)共享TAAs的组合已成为临床开发靶向mRNA癌症疫苗的趋势。所选择的TAAs通常在相关肿瘤中广泛表达，当与不同的载体或佐剂结合时，可以诱导抗肿瘤免疫反应。2009年，Weide等人对鱼精蛋白(RNActive®)保护mRNA癌症疫苗进行了1/2期临床研究，采用GM-CSF作为佐剂，编码6种TAAs (Melan-A、酪氨酸酶、gp100、MAGE-A1、MAGE-A3和生存素)。这种疫苗是皮内注射。该疫苗显著降低了免疫抑制细胞(如外周血中的Foxp3+/CD4+调节性T细胞(Tregs)和骨髓抑制细胞)，并增加了一部分患者的特异性T细胞。1例接受治疗的患者完全缓解，未发生大于Ⅱ级的不良反应(NCTO0204607)。2011年，Fotin-Mleczek等人对编码卵白蛋白(OVA)/PSMA/STEAP和PSMA的蛋白蛋白复合物mRNA癌症疫苗进行了临床前研究。结果表明，双组分mRNA肿瘤疫苗可通过TLR7诱导自佐剂作用，平衡适应性免疫反应，并具有持续的抗肿瘤作用(NCT00831467,NCT00923312)。2014年，Fotin-Mleczek 等人研究表明，蛋白复合OVA -编码mRNA的癌症疫苗与临床前放疗联合使用具有较强的协同抗肿瘤作用。编码4-5种前列腺特异性抗原[如CV9103 (NCT00831467)和CV9104 (NCT01817738)]或5-6种黑色素瘤和非小细胞肺癌TAAs[如CV9201 (NCT00923312)和CV9202 (NCT03164772)]的蛋白复合物肿瘤疫苗正在临床试验中。BN111是一种mRNA癌症候选疫苗，编码4种TAAs (NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE)的固定组合，这些TAAs在黑色素瘤中普遍存在，并作为RNA -脂质复合物制剂(Lipo - MERIT)递送。BNT111单独或联合免疫检查点PD-1抑制剂可诱导不可切除黑色素瘤患者持续和强抗原特异性CD4+ / CD8+ T细胞反应和客观反应。超过5%的患者发生了相关不良事件，大多数不良反应为1-2级(NCT02410733)。基于这些结果，BNT111已获得FDA快速通道指定用于临床转化治疗晚期黑色素瘤(NCT04526899)。Lipo-MERIT mRNA癌症疫苗编码3个针对OC的TAAs (NCT04163094)， 5个针对PC的TAAs[如BNT112 (NCT04382898)]，或针对HNSCC和HNC的共享癌症抗原的固定组合[BNT113 (NCT04534205)]，目前正在临床试验中。AML和骨髓瘤mRNA肿瘤疫苗的临床翻译也呈现出从单一TAA的应用[如WT1 (NCTO0834002、NCT00965224、NCTO1291420)]到多个TAA的联合应用[如WT1、PRAME、CMV pp65、癌睾丸抗原7、MAGE-A3 (NCTO1734304、NCT02405338、NCT01995708)]的趋势。研究发现，在43%的化疗后缓解的AML患者中，经WT1 mRNA电穿孔的DCs可预防或延迟复发(NCT00965224)，改善的总生存率(OS)率或临床反应与诱导WT1特异性CD8+ T细胞反应(NCTO0965224, NCTO1291420)相关。TLR7 /8成熟DCs转染编码WT1、PRAME和CMV pp65的RNA可防止在完全缓解的AML患者亚群中复发(NCTO1734304)。mRNA肿瘤疫苗也在朝着个体化和精确化方向发展，初步趋势是从应用自体肿瘤[如AML (NCT00514189-已终止)、前列腺癌(NCT01197625)、NCT01278940、NCT008464562、NCT00961844-已终止]或肿瘤干细胞[如OC (NCT01334047-已终止)]衍生mRNA向采用个体化TAA 面板 (NCT01334047、NCT02709616、NCT02808364、NCT02808416)发展。负载完整肿瘤mRNA的DCs可以诱导针对肿瘤内广泛抗原的T细胞反应，甚至是患者独有的抗原(NCT01278940)。研究发现，用癌症干细胞衍生mRNA转染的树突状细胞可诱导患者产生免疫应答，并显示出有希望的初步安全性结果(NCT00846456)。含有3-13种不同TAA mRNA的个性化TAA面板脉冲DCs与良好的OS相关，并且治疗的患者没有出现Ⅲ/Ⅳ级不良事件(NCT02709616, NCT02808364, NCT02808416)。来源于自体肿瘤细胞或肿瘤干细胞的mRNA包含肿瘤细胞中的所有蛋白。这个策略简单可行，但其靶向性和有效性有待提高，同时也要考虑安全性。图1 mRNA癌症疫苗发展的时间轴。缩写：CART，电荷改变可释放转运体；CLAN，阳离子脂质辅助纳米颗粒；DCs,树突状细胞；DOTAP/DP7-C，1,2-二醇-3-三甲基丙烷氯/胆固醇改性阳离子肽DP7；LCP NPs，脂质/钙/磷酸（LCP）纳米颗粒；LPC，阳离子脂质体/鱼精蛋白复合物；LNPs，脂质纳米颗粒；Mann,甘露聚糖；PGCP NPs，聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA）/G0-C14/神经酰胺聚（乙二醇）（PEG）(PGCP) NPs；PSA，前列腺特异性抗原；ssPAlmE-PALA，脂质纳米颗粒和a-螺旋阳离子肽“KALA”；triMN-LPR，阳离子脂质体(L)-一种阳离子聚合物(P)-mRNA (R)，称为脂多聚体（LPR），通过A-D-甘露聚糖苷（triMN）的三天线功能化。2.1.2.肿瘤特异性抗原TSAs通常是由肿瘤细胞基因组中的非同义突变形成的肿瘤新抗原；这些抗原在正常细胞中不表达，具有很强的肿瘤特异性和免疫原性，中枢耐受性较弱。TSAs与抗肿瘤免疫反应之间的相关性已在多项研究中得到证实。对来自癌症基因组图谱的18个实体肿瘤数据中的数千个RNA序列的分析显示，每个肿瘤中新抗原的数量与T细胞细胞毒性活性相关基因的表达呈正相关。对来自癌症基因组图谱的515例患者的6个位点的RNA-seq数据分析表明，高水平的免疫原性突变表位与患者生存率的提高有关。具有高水平免疫原性突变的肿瘤具有更高水平的CD8A、PD-1和CTLA4。对619例结-直肠癌样本的全外显子序列分析表明，肿瘤中高水平的新抗原与肿瘤浸润淋巴细胞的增加和生存率的提高相关。在子宫内膜癌中也证实了新抗原水平与肿瘤浸润淋巴细胞数量之间的关系。此外，发现具有高水平新抗原的肿瘤比具有低水平新抗原的肿瘤具有明显的同质性。突变负荷大于每百万碱基10个体细胞突变的肿瘤(相当于表达基因中150个非同义突变)更容易形成免疫原性新抗原，而突变负荷小于每百万碱基1个体细胞突变的肿瘤不太可能形成免疫原性新抗原。大多数肿瘤的突变负荷为每百万碱基1-10个体细胞突变，通常可以形成T细胞识别的新抗原。Rajasagi等人利用全外显子测序和HLA -肽预测结合算法(即NetMHCpan)分析了13种不同肿瘤(2488个样本)的预测突变HLA-结合肽，结果表明每个肿瘤都可以产生数万到数千个新抗原，这表明新抗原在大多数肿瘤中是常见的。图2 mRNA癌症疫苗的作用机制图mRNA癌症疫苗的流行趋势是向个体化和精密度发展，旨在开发使用多种(20种)新抗原的mRNA癌症疫苗[如，IVAC MUTANOME (NCTO2035956)、IVAC_W_brel_uID和IVAC_W_brel_uID/IVAC_M_uID (NCT02316457)、RO7198457(NCT03289962、NCT04161755、NCT03815058、NCT04486378)、mRNA-4157 (NCT03313778、NCT03897881)、NCI4650/mRNA4650 (NCT03480152)、NCT03468244、NCT03908671]。2015年，Kreiter等人通过外显子组测序和MHC-Ⅱ表位预测结合算法分析了小鼠肿瘤细胞(如黑色素瘤细胞系B16F10、结肠癌细胞系CT26和乳腺癌细胞系4T1)中的突变肽，并制备了编码这些突变肽的RNA疫苗，在临床前评估它们的抗肿瘤作用。多新表位RNA在体内有效诱导T细胞应答，抑制小鼠肿瘤的生长和转移，大部分免疫原性突变体被CD4+ T细胞识别；即使RNA只编码一个新表位(如B16-M30)，也能诱导更强的T细胞反应，并控制小鼠B16F10黑色素瘤的生长。Zhang等人对DOTAP/DP7-C脂质体进行了临床前研究，DOTAP/DP7-C脂质体作为载体和佐剂，装载了编码小鼠LLC细胞系LL2 (DOTAP/DP7-C/LL2)五种肿瘤新抗原的mRNA。DOTAP/DP7-C/LL2显著抑制原位和皮下LL2肿瘤的生长，刺激抗原特异性淋巴细胞反应。2017年，Sahin 等人发现基于RNA的多重新表位疫苗可诱导黑色素瘤患者的抗原特异性多克隆T细胞免疫反应；选择的新表位中有60%具有免疫原性，这些新表位诱导的主要T细胞反应是CD4+ T细胞反应，肿瘤转移明显减少，约75%的患者无进展生存期为27个月(NCT02035956)。2020年，Cafri等人发现编码20种新抗原的NCI4650/mRNA-4650可在胃肠道肿瘤患者中诱导新抗原特异性T细胞反应；选择的新抗原中有21%是免疫原性的，来自患者的新抗原特异性T细胞中有59%是CD4+ T细胞(NCT03480152)。虽然mRNA的制备是快速和经济的(良好生产规范级RNA可在3周内制备)，但肿瘤新抗原的筛选和鉴定可能需要很长时间和昂贵，并且在疫苗制备过程中患者的病情可能发生变化，导致研究人员错过了患者的最佳治疗机会。基于高通量和生物信息学技术对基因深度测序和大数据集蛋白质组学分析的参数，治疗性肿瘤新抗原肽疫苗、RNA疫苗和融合DC -肿瘤细胞疫苗的制备时间分别约为160天、114天、103(89-160)天和10天。新抗原的筛选和鉴定速度直接影响mRNA新抗原疫苗的临床疗效，是mRNA新抗原疫苗面临的一大挑战。同时，肿瘤新抗原预测的准确性有待提高。表1 mRNA癌症疫苗在临床前和临床设置的概述2.1.3.免疫调节分子与肿瘤抑制基因编码CD70、CD40配体和组成活性TLR4的mRNA(命名为TriMix, NCT03788083)；编码人OX40L、IL-23和IL-36γ的mRNA(命名为mRNA-2752, NCT02872025，NCTO3739931)；和编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA(命名为SAR441000/BNT131、NCT03871348)是编码免疫调节分子的三种具有代表性的mRNA癌症疫苗，这类疫苗还包括编码TLR7/8激动剂和RIG-1激动剂的mRNA疫苗(CV8102/ RNA佐剂®、NCT03291002、NCT03203005)；mRNA编码OX40L [mRNA-2416 (NCT03323398)]；mRNA编码IL-12[MEDI1191 (NCT03946800)， BNT151 (NCT04455620)]；mRNA编码IL-12和IL-7 (BNT152, BNT153，NCT04710043)；和编码BisCCL2/5i的mRNA。一些研究表明，编码免疫调节分子(如TriMix，mRNA-2752，BNT131和mRNA编码BisCCL2/5i)和肿瘤抑制基因(如PTEN或p53编码mRNA)的mRNA癌症疫苗作为单一疗法也具有抗肿瘤作用，通常与多种肿瘤抗原(如MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶、gp100、生存素、hTERT和新抗原)和免疫检查点抑制剂(如抗PD-1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合用作辅助治疗。2012年，Van Lint等人发现，结节内注射TriMix和TAA(如TRP2/WT1/P1A) mRNA可诱导DCs成熟并原位启动抗原特异性T细胞。与不加佐剂的荧光素酶(FLuc) mRNA脉冲DCs相比，TriMix显著降低了DCs中FLuc的表达，且LPS、单磷酰脂质A、聚(I:C)诱导的降低作用更强；而TriMix可以产生免疫刺激环境来改善T细胞反应，优于LPS。2016年Bialkowski等人发现HPV16-E7-TriMix mRNA可诱导CD8+ T淋巴细胞向肿瘤粘膜迁移，控制肿瘤生长。当与顺铂联合使用时，HPV16-E7-TriMix mRNA通过下调髓源性抑制细胞(MDSCs)和Tregs的数量来抵抗免疫抑制微环境，导致生殖道肿瘤完全消退。在多种小鼠肿瘤模型中，瘤内注射TriMix已被肿瘤浸润的树突状细胞吸收，然后呈交给肿瘤引流淋巴结的T细胞，诱导抗肿瘤T细胞反应和抗肿瘤作用。2013年和2016年，Wilgenhof等人发现，与TriMix共电孔的DCs和编码四种与HLA Ⅱ靶向信号(DCLAMP)(命名为TriMixDC-MEL)相关的黑色素瘤相关抗原(MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶或gp100)之一的mRNA，在预处理的晚期黑色素瘤患者中具有良好的耐受性，并在两名患者(NCT01066390)中引起完全缓解和部分缓解。TriMixDC-MEL联合免疫检查点抑制剂(ipilimumab)在预先治疗的晚期黑色素瘤患者(NCTO1302496)中耐受并诱导高度持久的肿瘤反应。2020年，De Keersmaecker等人研究表明，在相当一部分晚期黑色素瘤患者中，TriMixDC-MEL和ipilimumab联合使用可诱导有效的CD8+ T细胞反应，并与患者的临床反应相关(NCTO1302496)。2019年Hewitt发现，在瘤内注射包裹在LNPs中的编码IL- 23、IL-36γ和OX40L的三联体mRNA，可以激活并招募多种免疫细胞(例如DCs和T细胞)进入肿瘤，从而诱导依赖于Batf3的交叉呈递DCs和细胞毒性CD8+ T细胞的持久抗肿瘤免疫。该疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用，在体内抗免疫检查点抑制剂模型中具有强大的抗肿瘤作用。2021年，Hotz等人发现BNT131联合抗PD -1抗体可显著提高荷瘤小鼠(如B16和MC38荷瘤小鼠)的生存率。2021年，Wang等人发现编码BisCCL2/5i LNPs的mRNA与编码PD-1配体抑制剂LNPs的mRNA联合可显著延长荷瘤(如原发性肝癌、结直肠癌和胰腺癌的肝转移)小鼠的生存期，且BisCCL2/5i可促进这些肿瘤对PD-1配体抑制剂的敏感性。表2 2016-2021年期间关于mRNA癌症疫苗的临床试验一些临床前研究表明，使用编码肿瘤抑制基因(如PTEN和p53)的mRNA治疗肿瘤是可行的。2018年，Islam等人研究发现，负载抑癌基因PTEN编码mRNA的聚脂包被多聚脂杂交NPs(如mRNA- pgcp NPs)可在体外和体内有效转染PTEN基因缺失的前列腺癌细胞，并通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶Akt通路促进癌细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长。2021年，Lin等人发现肿瘤抑制基因PTEN编码mRNA NPs可诱导PTEN突变的黑色素瘤细胞和PTEN缺失的前列腺癌细胞自噬和死亡。PTEN-mRNA NPs上调免疫抑制TME中的CD8+ T细胞和促炎细胞因子(如IL-12、TNF-α和IFN-γ)，下调Tregs和MDSCs，并与抗PD -1抗体联合对这些肿瘤产生有效的抗肿瘤作用。2019年，Kong 等人研究发现肿瘤抑制基因p53-编码mRNA NPs可促进p53缺失型肝细胞和NSCLC细胞对哺乳动物雷帕霉素抑制剂靶点(依维莫司)的敏感性，且p53-mRNA NPs与依维莫司联用在体外和体内肝癌和NSCLC模型中具有显著的协同抗肿瘤作用。编码p53和肿瘤抗原(如生存素、hTERT、新抗原)的mRNA癌症疫苗目前正处于临床试验阶段(NCTO0978913、NCT02316457)。2.1.4. mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂的联合研究肿瘤发展过程中对TAAs的中枢免疫耐受和外周免疫耐受(如免疫检查点通路，TME)是癌症疫苗面临的两大挑战。两者都会影响癌症疫苗的效力和持续时间。为了靶向中枢免疫耐受，多个TAAs或多个TSAs的组合是mRNA癌症疫苗发展的主要趋势。为了靶向外周免疫耐受，将mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用是mRNA癌症疫苗应用的另一个主要趋势。2018年，Liu等人对负载MUCI mRNA的LCP NPs联合抗-CTLA-4抗体治疗TNBC进行了临床前评估，结果表明LCP-mRNA NPs作为单一疗法或联合治疗的一部分(LCP-mRNA NPs + 抗-CTLA-4)可显著抑制肿瘤生长，且联合治疗的抑制效果明显强于LCP-mRNA NP单疗法。Wang等人研究表明，同时装载编码黑色素瘤相关抗原TRP2的mRNA和靶向PD-L1的小干扰RNA的LCP NPs可以在体外和体内有效地将mRNA传递到DCs中，并促进DCs的成熟。靶向PD-L1的小干扰RNA下调DCs中PD-L1的表达，增强抗肿瘤免疫和抗肿瘤作用，疫苗有效抑制肿瘤生长。2019年，Verbeke等人研究表明，单独使用Galsomes mRNA的体内抗肿瘤作用不明显，这种治疗可以增加免疫微环境中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、不变性NKT (iNKT)、NK和M1肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的数量；这些作者还发现，治疗对PD-1/PD-L1通路的负调控可能会限制其抗肿瘤作用。与单独接种疫苗相比，结合OVA mRNA Galsomes和抗PD-L1抗体显著增加脾脏iNKT细胞数量，降低脾脏DC细胞上PD-L1水平和脾脏增生iNKT细胞上PD-1水平，显著提高抗肿瘤效果。此外，Oberli等人表明，含有编码单一肿瘤抗原(例如gp100或TRP2)的mRNA的lnp和使用这两种抗原的序贯治疗在体内均具有显著的抗肿瘤作用；但两种方法的抗肿瘤作用无显著性差异。2.2.抗原或目标的表达2.2.1. mRNA分子的药效学用于制备疫苗的mRNA主要包括常规的非复制mRNA和病毒衍生的自扩增mRNA。mRNA的IVT是制备分子的主要技术，利用噬菌体RNA聚合酶(如T3、T7或SP6 RNA聚合酶)和含有目标抗原序列的线性化DNA模板。非复制性IVT mRNA的基本结构包括一个编码目标蛋白的开放阅读框(ORF)、一个位于5'和3'非翻译区(UTRs)两侧的7-methylgaunosine 5'帽和一个3' poly(A) 尾。5'帽和3'poly(A)可以在IVT过程中添加，也可以在初始IVT后酶促添加。自我扩增的mRNA包含两个ORFs，一个编码目标抗原序列，另一个编码病毒复制机制，从而实现持久的细胞内RNA扩增。一种由编码CEA的甲病毒复制子组成的mRNA疫苗(称为AVX701)正在临床试验中(NCTO0529984, NCTO1890213)。与蛋白质或肽疫苗不同，mRNA癌症疫苗产生效果的第一步是编码蛋白的序列信息可以翻译成功能蛋白。影响翻译过程的因素包括正调节因素、负调节因素和双向调节因素。正调控因子总结如下:①5′帽及其修饰物[如抗反向帽类似物CleanCap]可招募真核翻译起始因子4E，促进核糖体识别和翻译起始，消除mRNA序列中的游离磷酸基团，显著增强mRNA的稳定性。②poly(A)序列及其修饰(如长度’)可以减缓RNA外切酶的降解过程，从而增加稳定性，延长体内半衰期，提高mRNA的翻译效率。③UTR优化[例如，由a-珠蛋白和β-珠蛋白衍生的3' UTR序列，AU和GU-富集序列；3' UTR中的稳定元素；5' UTR中的GCC-(A/G)- CCAUGG，短而松散的5' UTR135]和ORF的密码子优化(如尿苷的缺失，G:C含量的富集，同义频繁密码子，具有较高转移RNA丰度的密码子)可以提高mRNA的稳定性和蛋白质翻译。表达载体中的表位通过不同的序列和信号肽(例如，内核/溶酶体信号分选片段和跨膜-细胞质结构域)连接，以增加IVT，提高抗原在细胞内加工和呈递的靶向性。④核苷修饰[如假尿嘧啶(Ψ)、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基胞苷(5meC)和n -乙酰胞苷修饰转录后RNA]和纯化IVT-mRNA(如Mg2+31、温度、高压液相色谱和快速蛋白液相色谱)以减少双链RNA的污染，可以降低分子的先天免疫激活，增加蛋白质翻译。与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA (5meC, Ψ)可显著促进小鼠FLuc的表达。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用明显强于LCP(未修饰mRNA)。负调控因素包括:①细胞外RNases酶能快速降解裸mRNA。②IVT产生的双链RNA杂质可以结合细胞质中的模式识别受体(PRRs)[如RIG - Ⅰ，黑色素瘤分化相关蛋白5 (一种RIG -Ⅰ受体)，蛋白激酶RNA激活(也称为真核翻译起始因子2 alpha激酶2)，2'-5'-寡腺苷酸合成酶]和内体(如TLR3)来激活特定途径[如RIG -Ⅰ /MAD5→线粒体抗病毒信号蛋白→IFN Ⅰ，(IFN Ⅰ→)蛋白激酶RNA激活→真核翻译起始因子2alpha， (IFN Ⅰ→)2′5′-寡聚腺苷酸合成酶→核糖核酸酶L, TLR3→含有Toll/IL-1受体结构域的适配器诱导IFN-β→IFN Ⅰ]，可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解。双向调节因子包括未修饰的单链RNA作为病原体相关分子模式(PAMP)，它可以结合内体中的PRRs[如TLR7, TLR8]来激活特定途径(TLR8→髓样分化因子88→促炎细胞因子；TLR7→骨髓分化因子88→干扰素调节因子7→IFN Ⅰ)。一方面，mRNA可以激活先天免疫反应(DC成熟和激活)，进而激活适应性免疫反应(T和B细胞免疫反应);另一方面，过早和过度激活IFN Ⅰ可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解，促进DC和T细胞凋亡。过度强烈的炎症反应也会引起毒副作用。在T细胞中，Ⅰ型IFN受体信号的激活先于TCR信号的激活，可作为促进免疫应答的真正第三信号。Udhayakumar等人表明，与含有未修饰mRNA的RALA mRNA纳米复合物相比，含有Ψ-和 5meC-修饰mRNA的mRNA纳米复合物诱导了有效的抗原特异性细胞毒性T细胞反应，并且具有优越的疗效，修饰的(5meC，Ψ) mRNA纳米复合物通过抑制IFN-β活化显著降低了Ⅰ型IFNs对CTLs的抑制作用，并有效诱导了CTLs。相比之下，Oberli等人表明，未修饰mRNA LNP疫苗在外周血中诱导的CD8 T细胞应答(7.8%)比核苷修饰mRNA (5meC，Ψ) LNP疫苗(1.0%)强得多，并表明Ⅰ型干扰素是保护性CD8 T细胞应答所必需的。这些相互矛盾的结果可能与双向调节因素有关。2.2.2.疫苗抗原表达方法根据抗原的表达，疫苗可分为多肽或蛋白质疫苗、细胞疫苗(如肿瘤细胞疫苗、DC疫苗和工程细胞疫苗)、核酸疫苗(如DNA和RNA疫苗)和病毒载体疫苗。肽或蛋白疫苗是广泛使用的疫苗类型。抗原肽的序列定义明确，易于控制。肽疫苗包括短肽疫苗和长肽疫苗。短肽疫苗有一些缺点，包括蛋白质水解导致抗原降解和免疫反应持续时间较短，短肽可以结合许多核细胞表面的MHC Ⅰ分子，这些核细胞作为非专业抗原呈递细胞APCs)，通常不含共刺激信号，导致抗原耐受和T细胞功能障碍。长肽疫苗通常含有20-30个氨基酸，可激活CD4+和CD8+ T细胞。蛋白质疫苗也能诱导T细胞反应；然而，长肽通常比蛋白质更有效地被APCs内化和加工。长肽疫苗的缺点包括对酶降解的敏感性、快速清除和注射部位吸收不足。细胞疫苗主要包括癌细胞疫苗和DC疫苗。癌细胞疫苗是用自体或异体灭活的全细胞及其衍生物(如细胞裂解物、DC融合衍生物、表达TSAs或免疫增强因子的修饰全细胞和肿瘤衍生mRNAs)，它们通常包含细胞的所有抗原，在疫苗设计和生产之前不需要费力地鉴定，从而导致相对快速的制备和某些个性化特征。然而，使用癌细胞的方法不能准确地测定和控制相应的肿瘤抗原，质量控制困难，而且癌细胞往往含有较少的特异性抗原，导致免疫原性较弱和潜在的致癌性。DCs是最有效的APCs，在连接先天和适应性免疫反应中起着核心作用。DC疫苗一般使用自体DC作为载体来表达和呈递抗原。1996年，Boczkowski等人证明了使用肿瘤来源的mRNA癌细胞脉冲DCs的可行性。2017年之前，在大约24项临床试验中，mRNA癌症疫苗使用DCs作为载体。然而，DC疫苗的制备工艺复杂，生产昂贵，质量控制困难。此外，患者必须具有相对正常的免疫功能，没有化疗或其他治疗引起的骨髓抑制，并提供大量功能性DCs，导致可用疫苗数量有限。核酸疫苗是用编码抗原的核酸(如DNA、RNA)制备的。mRNA疫苗的特点已在本文第1部分进行了描述。与mRNA相比，DNA必须进入细胞核才能翻译成相应的抗原，这有插入突变引起的潜在风险，可能比mRNA更不安全。总的来说，核酸对降解敏感，不稳定，半衰期短，导致裸核酸被APCs吸收的效率较低。新的载体和给药途径。用于提高核酸的吸收和呈递效率(下文讨论)。有限的研究表明mRNA癌症疫苗与肽或蛋白癌症疫苗相比具有抗肿瘤优势。用体外合成的鸡OVA RNA脉冲的DCs比用OVA肽脉冲的DCs在体外刺激OVA特异性的初级CTL反应更有效。在原位治疗性肿瘤模型中，DOTAP/DP-C/mRNA编码5种新抗原在诱导脾脏产生活化T细胞(CD3+ CD8+ IFN-γ+)方面明显强于DOTAP/DP-C/突变肽。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用显著强于LCP (TRP2肽/CpG)。编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs提高MC38-S荷瘤小鼠存活率的能力明显强于相应的蛋白处理。肽抗原通常只含有一个表位，而mRNAs编码的全长抗原含有多个表位，可以诱导T细胞靶向这些表位，产生更强的抗肿瘤作用。病毒载体疫苗是利用病毒作为表达或呈递抗原的载体制备的。目前，被广泛研究的病毒载体包括痘病毒、腺病毒和疱疹病毒。出于安全考虑，采用复制缺陷病毒或减毒病毒。痘病毒可包含多个基因，复制和转录仅限于细胞质，插入突变的风险较低，表达产物可呈现MHC Ⅰ和Ⅱ。非禽类痘病毒可以诱导宿主产生免疫反应，从而使其只能使用一种或最多两种疫苗。重组鸟痘病毒可以多次接种，其病毒外壳蛋白不能在哺乳动物细胞中产生，并且病毒不能诱导宿主产生免疫反应来中和病毒。重组腺病毒载体易于设计，作为疫苗和基因治疗药物的载体已显示出实用性；然而，它们的免疫原性会影响疫苗的效果。疱疹病毒有广泛的宿主范围；可感染神经细胞、外周血单核细胞和DCs；并且具有复制周期短、容量大、安全性相对较好的特点。此外，其他载体，如细菌和酵母，在临床前研究中显示出作为疫苗载体的潜力。总的来说，免疫原性、致癌性、传染性、包装能力有限和病毒载体生产困难是广泛应用的挑战。2.3.mRNA癌症疫苗的载体开发具有良好的安全性、靶向性、稳定性、自佐剂效应、负载能力和通用性的mRNA递送载体，能够高效、持续地递送和呈递抗原，激活APCs，是mRNA肿瘤疫苗领域的一个基本方向。mRNA肿瘤疫苗在临床前采用的载体如表3所示。mRNA癌症疫苗中使用的主要载体之一是脂质体及其衍生物。1995年，Conry等人显示了编码人CEA复合物的脂质体mRNA的体液免疫原性，首次在临床前研究中证实了mRNA癌症疫苗的概念验证。甘露糖可以与DCs表面表达的甘露糖受体结合，利用靶向DCs的载体促进mRNA的高效传递和转染。2011年，Perche等人研究表明，携带mRNA的Man11-LPR100转染DCs的效率是无糖LPR100的4倍，并且在体内具有更好的抗肿瘤作用。由于甘露糖与其受体之间的结合力较弱，增加载体表面甘露糖的密度可能是提高甘露糖修饰LPR递送效率的有效途径。2018年，Le Moignic 等人研究表明，与单甘油三酯- LPR相比，三甘油三酯- LPR可以更有效地诱导抗原转染，通过在注射部位诱导局部炎症反应，将更多的DCs招募到引流淋巴结，并更有效地诱导抗原特异性免疫反应。2018年，Wang 等人利用甘糖醇偶联物(MPn-CHs)制备了DCs靶向脂质体(MPn-LPs)作为mRNA载体，结果表明MP1000-LPs负载mRNA (MP1000-LPX)具有良好的转染效率，MP1000-LPX主要通过增强DCs上甘糖受体(如CD206)的表达来增强mRNA的表达。2020年，Son等人研究表明，采用多糖包被二氧化硅纳米颗粒制备的Mann -capsules可以通过Dectin-2或TLR-4激活骨髓源性树突状细胞(BMDC)，且Mann -capsules促进BMDC分化和成熟的能力明显强于PEI或脂质体；此外，PEI和脂质体具有高毒性。LNPs似乎是一种很有前途的mRNA癌症疫苗载体。LNPs的成分主要包括可电离脂质，促进mRNA的自组装和内体释放；磷脂，支持脂质双层结构；胆固醇，一种稳定剂；脂质锚定聚乙二醇，延长配方的半衰期。还考虑了筛选和鉴定这些媒介的高通量技术。2017年，Oberli 等人构建并优化了LNP库，发现含有编码肿瘤抗原的mRNAs(如gp100和TRP2)与LNPs作为佐剂结合，可有效诱导抗原特异性CD8+ T细胞，抑制肿瘤生长，延长小鼠OS。2018年，McKinlay等人对基于两亲性CARTs的mRNA载体库进行了高通量筛选研究，结果表明，与单一CART或脂质体 2000相比，双CART可将体外淋巴细胞mRNA转染效率提高9倍；体外mRNA转染效率为80%，小鼠淋巴细胞mRNA转染效率为1.5%。2019年，Miao等人建立了一种高通量的可电离类脂质构建技术，可在一天内合成数千种脂质制剂，并使用DCs(如HeLa细胞、BMDCs或骨髓源性巨噬细胞)高通量评估LNPs的转染效率。结果表明，mRNA LNPs通过干扰素基因通路的胞内刺激物诱导APC成熟，增强抗肿瘤作用。2021年，Meng等人发现含有CpG核心的VLVPs可以促进DC成熟和抗原呈递、抗原特异性CD8+ T细胞在淋巴器官中的增殖和肿瘤中的T细胞浸润，并减少免疫抑制细胞(如肿瘤相关骨髓源性抑制细胞和表达精氨酸酶1的抑制性DCs)。以LNPs为载体的mRNA癌症疫苗[如编码新抗原的mRNA-4157 (NCTO3313778、NCTO3897881)和编码突变蛋白的V941 (NCT03948763)]目前正处于临床试验阶段。多阳离子肽鱼精蛋白和DCs是mRNA癌症疫苗中采用的另外两种主要载体。鱼精蛋白和DCs的特点及其作为mRNA癌症疫苗载体的研究进展分别见第2.1.1节和2.2.2节。鱼精蛋白可以保护mRNA不被血清RNA酶降解，促进mRNA的传递。此外，鱼精蛋白可与脂质体联合使用(例如，阳离子脂质体-鱼精蛋白，LPC和VLVP)。2000年，Hoerr等人发现脂质体包裹的浓缩RNA-肽复合物可诱导抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应，裸RNA和蛋白蛋白保护的RNA在体内均可诱导特异性免疫反应，而受保护的RNA在体外稳定时间较长。Mai等人的研究表明，携带细胞角蛋白19编码mRNA的LPC经鼻递送可诱导小鼠APC成熟和强烈的细胞免疫反应，并降低肿瘤的生长。载体对疫苗的效力有关键影响。Phua等人表明，在没有NP载体的情况下，鼻内接种裸mRNA不能诱导抗肿瘤免疫反应。然而，临床前和临床研究都在综合考虑所选靶点、佐剂和递送方法的基础上证明了裸mRNA的可行性和有效性。发现FLT3可增强结内裸RNA的抗肿瘤作用。结内HPV16-E7-TriMix裸mRNA和瘤内TriMix裸mRNA均可诱导有效的抗肿瘤T细胞反应。结节内裸mRNA多重新表位疫苗诱导有效的抗原特异性T细胞免疫应答(NCT02035956)。2.4.佐剂在mRNA癌症疫苗的临床前研究中开发的一类主要佐剂[如LPS73, poly(I:C), Td, CpG]是PAMPs，它通过PAMP-PRR途径激活DCs，然后调节先天和适应性免疫反应。作为一种强效的回忆抗原，Td可通过CCL3106促进DC迁移，提高抗肿瘤作用。LPS辅助处理进一步提高了CD8+ T细胞水平和LNP mRNA诱导细胞的抗肿瘤活性。mRNA- CART联合CpG的体内抗肿瘤作用明显强于mRNA-CART和裸mRNA与CpG的联合，也强于mRNA-CART与TLR7配体或CD80 /86 mRNA的联合。大多数新型载体(如脂质样材料C1、DOTAP/ DP7-C、Mann-capsule、LNPs)兼具载体和佐剂的特性，其中一些载体具有佐剂的功能，类似于PAMPs。Mann -capsule通过Dectin-2或TLR-4激活BMDCs，葡聚糖-capsule通过CD206、CD209或巨噬细胞诱导的C型凝集素激活BMDCs。DP7-C、DOTAP和mRNA分别通过TLR2、TLR4和TLR7激活DCs。DOTAP/DP7C诱导DC成熟和抗原呈递的能力明显强于DOTAP、poly(I:C)和CpG。Cl或C1 mRNA可通过TLR4依赖的核因子κB信号通路促进BMDC活化，C1- OVA mRNA的体内抗肿瘤作用是TLR4依赖的CpG，因为VLVP中含有的佐剂，可以提高疫苗的效果，阻止PD-1在T细胞中的表达。然而，这些类PAMP佐剂可能影响mRNAs的翻译效率和降解，并具有潜在的毒性，如2.2.1节所述。开发既不影响mRNA翻译效率，又能积极调节多种先天和适应性免疫反应，促炎作用相对温和，毒性较低的新型佐剂已成为重要方向。TAA mRNA的免疫原性可以通过GM-CSF mRNA的共递送而增强。FLT3配体可促进浆细胞样DCs、经典DCs和NK细胞的扩增；诱导T辅助1型微环境；增强肿瘤内T细胞浸润及裸RNA的抗肿瘤作用。mRNA LNPs可通过刺激干扰素基因依赖性激活Ⅰ型IFN，诱导APC成熟，限制全身细胞因子表达，增强抗肿瘤作用。用于mRNA Galsomes的佐剂α-GC可通过DCs呈递激活iNKT细胞。活化的iNKT细胞可与DCs发生双向正调节作用，可正向调节NK细胞和免疫抑制细胞(如MDSCs和M1 TAMs)，不影响mRNA翻译效率，促进直接和间接的抗肿瘤作用。编码免疫共刺激分子的mRNA可用作佐剂(见2.1.3节)。TriMix (NCT01066390, NCTO1302496)；mRNA-2752 (NCT02872025)；mRNA编码人OX40L (mRNA-2416, NCT03323398)；编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA (BNT131，NCTO3871348)；编码IL-12的mRNA (MEDI1191，NCT03946800)；和mRNA编码的TLR7 /8激动剂和RIG-1-兴奋剂(RNA佐剂®)，NCT03291002，NCT03203005]正在临床试验中作为辅助治疗与免疫检查点抑制剂联合使用。表3 在临床前环境中用于mRNA癌症疫苗的递送系统概述2.5.给药途径给药途径直接影响疫苗的效力，mRNA癌症疫苗通常采用的给药途径包括静脉注射、皮内、皮下、肌肉注射、结内和肿瘤内给药。静脉注射允许更大的疫苗量和直接将疫苗输送到淋巴器官，但也有更大的系统性毒性风险。皮下注射疫苗的真皮含有APCs(如，DCs和巨噬细胞)以及血管和淋巴血管，但主要由致密结缔组织组成，导致通过皮内途径给药时疫苗量很小。皮内给药也可导致注射部位的不良反应(例如，肿胀、疼痛、红斑和瘙痒)。皮下注射疫苗的皮下区域含有比真皮更少的APCs；然而，它主要由脂肪组织的松散网络组成，允许通过皮下途径注射更大的注射量，从而引起更少的局部副作用(如疼痛)。肌肉注射疫苗的肌肉含有致密的血液网络，可以帮助招募和再循环不同类型的免疫细胞(如，浸润性APCs)到注射部位。肌内给药比皮内给药的注射量大，局部副作用也比皮内和皮下给药轻。结内注射疫苗的淋巴结含有多个APCs，结内给药具有较高的递送效率，允许小剂量的疫苗，但涉及复杂的程瘤内给药主要用于编码免疫共刺激分子的mRNA疫苗(例如TriMix, CV8102, mRNA-2752, mRNA-2416, BNT131和MEDI1191)作为免疫辅助治疗，也允许小剂量的疫苗，涉及复杂的程序。准确预测特定疫苗的最佳给药途径是困难的，建议通过直接比较研究来选择疫苗的最佳给药途径。结内注射的Luc-RNA在体内的转染效率优于皮内或皮下注射。经静脉注射OVA RNA复合DOTAP-DOPE诱导的CTLs杀伤作用优于皮内或皮下注射(静脉注射＞皮内注射＞皮下注射)。结内递送OVA mRNA联合TriMix诱导的抗原特异性T细胞的体内细胞毒性明显强于皮内递送疫苗。皮内接种E7 mRNA单糖化-LPR诱导的抗原特异性T细胞应答明显强于皮下接种。通过CART有效地将mRNA传递到APCs中(次要淋巴细胞APCs优先通过静脉注射靶向，而局部APCs通过皮下注射靶向)。肿瘤内三次给药的编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs的抗肿瘤作用显著优于同种药物的皮内或皮下给药；然而，在同一剂量下，通过这些途径的抗肿瘤效果没有显著差异，这表明对肿瘤疫苗的给药效果也与给药频率有关。鼻黏膜富含APCs和免疫细胞，临床前研究表明经鼻内注射的mRNA癌疫苗初步有效。鼻内接种mRNA纳米颗粒和鼻内递送LPC mRNA均可诱导抗肿瘤免疫应答。3.mRNA癌症疫苗的挑战和趋势迄今为止，已有数百种癌症疫苗进行了临床评估，美国食品和药物管理局(FDA)批准了三种治疗性癌症疫苗[卡介苗 (TheraCys®)，一种牛分支杆菌减毒活株，用于治疗非肌肉浸润性膀胱癌；Sipuleucel-T (Provenge®)，一种用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的DC疫苗；以及用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤性疱疹病毒疫苗(talimogene laherparepvec, T-VEC) (Imlygic®)和两种预防性癌症疫苗(HPV疫苗和乙型肝炎病毒疫苗)。影响mRNA肿瘤疫苗研制的因素主要包括分子本身的内在因素和外部因素[如对肿瘤抗原的中枢耐受性(见第2.1.1节)、肿瘤和HLA的异质性以及肿瘤免疫微环境]。这些因素深刻地影响了mRNA癌症疫苗的发展。从内在因素来看，研究人员通过改进mRNA的结构和序列，改进mRNA的制备和纯化技术(见第2.2.1节)，开发新的传递载体(见第2.3节)，在一定程度上提高了mRNA癌症疫苗的有效性。肿瘤异质性的本质是肿瘤细胞的基因组异质性，导致抗原异质性，这是影响抗肿瘤T细胞反应产生的关键因素，也是开发个性化癌症疫苗的主要原因。HLA异质性主要是指个体间HLA分子类型的不同，导致个体间这些分子对肿瘤抗原的结合区域或结合亲和力存在差异，从而影响抗肿瘤T细胞反应的产生和强度。HLA异质性是由HLA等位基因在不同民族和地区人群中的多态性引起的。HLA Ⅰ等位基因包括9-11个常见超型，其覆盖率为90%。HLA-A loci (HLA-A等位基因：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101和A*2402)占HLA-Ⅰ等位基因的60%，HLA-B loci (HLA-B等位基因：B*0702、B*0801、B*2705、B*3501和B*5701)占这些等位基因的35%以上。TME由免疫细胞、间充质细胞以及多种细胞因子和组织因子组成，在肿瘤发生和免疫逃逸中起重要作用。大质量内的间质压力可减少大分子(如抗体)和效应细胞(如T细胞)的扩散。大多数实体瘤也缺乏T细胞共刺激分子。TME通常含有免疫抑制细胞，包括CD4+Tregs, MDSCs，抑制性CD8+T细胞，M2 TAMs和调节性NK/NKT细胞。这些免疫抑制细胞和TME中的肿瘤细胞可以释放大量可溶性的免疫抑制因子，包括转化生长因子β、IL-10、PD-L1、吲哚胺2,3-双加氧酶和血管内皮生长因子等，进入微环境。考虑到肿瘤和HLA的异质性，肿瘤新抗原疫苗的开发在理论上比TAA定向疫苗具有更强的特异性抗肿瘤作用和更弱的毒副作用，一直是癌症疫苗研究的主要热点(见2.1.2节)。鉴于肿瘤免疫微环境，开发基于免疫的联合疗法(例如，与佐剂或免疫检查点抑制剂联合)已成为癌症疫苗应用的一个关键趋势(见第2.1.4和2.4节)。4.讨论产品的临床前评价是进入临床转化的前提，合理的评价可以提高预测临床结果的可靠性。临床前评价所采用的参数、技术和方法是疫苗质量标准的重要组成部分。疫苗的临床前评价应充分阐明疫苗的作用和机制，而mRNA肿瘤疫苗临床前评价的重点是确定抗原特异性T细胞反应的产生(如T细胞的数量和活化)和效果(如T细胞的杀伤作用和抗原亲和力)。一般来说，在临床前评估中，定量的体外和体内试验用于评估mRNA癌症疫苗的效果和机制。根据目前对抗原特异性T细胞免疫应答的认识，评价参数主要包括①鉴定疫苗的理化特性；②mRNA转染APC的效率(如结合与摄取、内化与转运、表达与分布)；③APCs的分化、成熟和抗原提呈；④疫苗免疫刺激；⑤细胞免疫原性(如CTL的产生、增殖和靶细胞杀伤)；⑥体液免疫原性；⑦抗肿瘤作用及相关机制；⑧初步毒性（如细胞毒性、内脏毒性和溶血）。诸如颗粒大小、电荷、对mRNA的结合能力和负载率、稳定性(如时间、温度和血清稳定性)、聚乙二醇化和硬度等因素可影响抗原递送(如淋巴引流)。Son等人研究表明，尺寸为~220 nm的Mann-capsules具有良好的变形能力，通过50 nm孔膜后的回复率约为30%。与基于蛋白质或肽的疫苗不同，mRNA疫苗开发的第一步是确保mRNA序列中编码的信息能够有效地翻译成相应的蛋白质或肽。mRNA的体外和体内转染效率是mRNA疫苗临床前评价的重要参数，提高mRNA的转染效率是提高mRNA疫苗药效学的关键途径。然而，APCs的体外转染效率可能存在差异，DOTAP/ DP7 - 增加了绿色荧光蛋白mRNA在APCs(包括293T、JAWSII、DC2.4和BMDCs)中的体外转染效率分别为84.87±3.21%、12.23±1.35%、28.49±2.46%和14.51±2.35%。为了验证mRNA在体外和体内的转染效率，我们以多种APCs作为体外转染模型，在体内检测不同器官的多种APCs的mRNA转染效率。增强绿色荧光蛋白(FLuc)是实验中常用的转染蛋白。染料标记的mRNA或疫苗载体已广泛用于转染研究。共聚焦显微镜和流式细胞术常用于评估细胞内微转染(如递送、摄取和翻译)，共聚焦显微镜可更直观、准确地评估mRNA的翻译效率，交互式视频信息系统可用于评估全身或局部大转染(如分布、淋巴引流)。用于体内抗肿瘤活性评价的肿瘤模型主要包括治疗性或预防性皮下、原位和肺转移肿瘤模型，所建立的体内肿瘤模型应准确模拟人体病理。Bialkowski等人的研究表明TC-1肿瘤的TME可因肿瘤接种部位(即皮下、肺部和生殖道)的不同而有显著差异，这直接影响了E7-TriMix mRNA疫苗的抗肿瘤效果。在选择用于临床前评估的细胞或动物模型时，物种特异性是需要考虑的重要因素。为了获得更准确的评价信息，可以建立人源化动物模型。通过静脉注射人外周血单个核细胞(HLA-A2型)的CD34+造血干细胞建立的人源化小鼠，进入免疫缺陷NOD/ shi-scid IL-2Rγnull小鼠或C57BL/6小鼠，建立体内肿瘤模型(如结果表明，转染修饰的人CD133 mRNA的DCs处理人源化小鼠模型的中位生存期大于60天，转染修饰的小鼠CD133 mRNA的DCs处理同源小鼠肿瘤模型的中位生存期为38天。肿瘤疫苗理论上具有抗肿瘤复发和转移的作用，可以建立多种体内肿瘤模型进行评价，阐明这些疫苗在预防或治疗肿瘤转移或复发方面的优势。有效的抗肿瘤反应需要多个免疫细胞的协同作用，而不是单个细胞的作用。目前，大多数肿瘤疫苗的重点是诱导CD8+T细胞，但CD4+T细胞等免疫细胞在诱导和维持免疫记忆、增强CTLs的肿瘤杀伤作用中也发挥着重要作用。采用NKT配体(如α-GC)作为佐剂的mRNA Galsomes通过iNKT细胞诱导抗肿瘤作用。在含有CD4+和CD8+T细胞的培养系统中转染CD133 mRNA的DCs比仅含有CD4+或CD8+T细胞的培养系统中的DCs更有效地激活T细胞并杀死肿瘤靶细胞。也有人担心mRNA癌症疫苗的安全性和副作用。修饰后的mRNA可与血清蛋白结合形成血管闭塞，具有潜在的毒性。DOTAP/DP7-C mRNA具有良好的血清稳定性和较低的细胞毒性；然而，Lipo2000和PEI25K具有很强的细胞毒性。最后，我们期待mRNA癌症疫苗的成功临床转化。参考资料：He Q, Gao H, Tan D, Zhang H, Wang JZ. mRNA cancer vaccines: Advances, trends and challenges. Acta Pharm Sin B. 2022 Jul;12(7):2969-2989. doi: 10.1016/j.apsb.2022.03.011. Epub 2022 Mar 23. PMID: 35345451; PMCID: PMC8942458.