Adenine

引言 CRISPR/Cas9系统自发现以来，得到快速发展已被广泛应用生命科学基础研究、基因治疗、动植物育种改良等领域【1】。基于Cas9切口酶（nCas9）与脱氨酶结构域/糖基化酶（MPG或UNG）的融合成的碱基编辑器（ABE，CBE，gGBE，gTBE），可高效实现A-to-G，C-to-T，C-to-G，G-to-C/T，以及T-to-G/C的碱基替换，为纠正突变的疾病位点提供了精准高效基因编辑工具【2-6】。然而由于Cas9的体积过大（1368个氨基酸），基于nCas9的碱基编辑器难以实现单个AAV（4.7kb) 的包装递送，极大限制了在体基因编辑的发展应用。近年来一系列紧凑型的Cas9蛋白【7-9】、Cas12f系列同源物【10-14】、以及其祖先蛋白TnpB【15,16】被报道，由于编辑活性有限，或缺乏HNH结构域而难以改造为缺口酶，都限制用于碱基编辑器的开发。 2021年，张锋团队发现由IS200/IS605转座子超家族编码的IscB核酸酶，被认为Cas9的祖先蛋白，具有与Cas9相似的HNH和RuvC结构域，且仅有约500个氨基酸（约SpCas9的1/3大小）【17,18】，具有开发成微型碱基编辑器的潜力。2023年，杨辉团队通过对OgeuIscB/ωRNA系统的工程化改造，开发出了高效的OgeuIscB变体（enOgeuIscB），并通过融合脱氨酶结构域，开发出高效迷你型碱基编辑器（miBE），推动了DNA单碱基编辑领域进入迷你型的“新时代”，具有极大的临床应用潜力【19】。然而，IscB/ωRNA系统需要严格的6位碱基靶序列邻近基序（TAM）来识别目标DNA，识别位点有限。因此，开发靶标识别范围更广的高效小型IscB碱基编辑器是十分必要。 2024年8月15日，辉大（上海）生物科技有限公司研发团队、复旦大学附属眼耳鼻喉科医院黄锦海团队和中科院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉团队合作在Nature Chemical Biology上发表题为Engineered IscB–ωRNA system with expanded target range for base editing的研究论文。该研究通过宏基因组数据挖掘，鉴定出19种具有不同TAM范围的新型IscB-ωRNA系统；综合RNA结构优化、蛋白质工程化改造、流式细胞术、脱靶检测等技术手段，成功获得在人类细胞内具有靶标识别范围广、更高效编辑活性的IscB系统（IscB.m16*）；通过融合脱氨酶结构域，进一步开发出基于新型IscB的迷你型腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器，并在哺乳动物细胞和小鼠疾病模型中包括SpCas9-BE无活性的疾病位点上均验证了其强大的碱基编辑效率和广泛的靶标识别能力，为未来精准基因治疗临床应用提供了强有力支持。 研究人员首先从200GB的宏基因组数据库中挖掘出19个未被表征的新型IscB系统，采用细菌耗竭实验鉴定相应的TAM序列；进一步利用荧光报告系统，筛选出10个具有真核细胞活性的IscB系统，其中IscB.m16表现出最高的编辑活性。为提高IscB.m16系统的活性并拓宽TAM范围，研究人员对IscB.m16核酸酶进行RuvC结构域的精氨酸扫描突变和TAM识别相关位点的饱和突变，以及对其ωRNA进行茎环截短和碱基替换的优化改造。通过多轮迭代的高通量荧光报告系统筛选，最终获得了编辑活性高和TAM范围宽的IscB.m16变体(IscB.m16*,即IscB.m16RESH-ωRNA)。通过细菌耗竭TAM序列识别实验发现，相较于野生型IscB.m16的TAM位点MRNRAA扩展到NNNGNA。 （Credit: Nature Chemical Biology） 在此基础上，研究人员构建了迷你型腺嘌呤碱基编辑器（IscB.m16*-ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（IscB.m16*-CBE）。在哺乳动物细胞中，IscB.m16*-ABE的碱基编辑效率与SpG-ABE效率相当，显著高于已报道的enOgeuIscB-ABE且有更广的TAM兼容性。在人源化人源化杜氏肌营养不良症（DMD）小鼠疾病模型中，单AAV包装的IscB.m16*-CBE经注射至肌肉组织后，成功并高效的将小鼠肌纤维中dystrophin蛋白水平恢复至野生型小鼠的40%，为DMD患者提供了一种有希望的基因治疗策略。 总的来说，该研究通过对新型IscB的挖掘和优化改造，开发出靶向范围更广的高活性、高特异性的迷你型碱基编辑工具IscB.m16*-BE，在基于AAV的基因治疗应用中显示出独特的优势和巨大的潜力。 参考文献 1. Porto, E.M., Komor, A.C., Slaymaker, I.M., and Yeo, G.W. (2020). Base editing: advances and therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery 19, 839–859. https://doi.org/10.1038/s41573-020-0084-6. 2. Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A., and Liu, D.R. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424. https://doi.org/10.1038/nature17946. 3. Gaudelli, N.M., Komor, A.C., Rees, H.A., Packer, M.S., Badran, A.H., Bryson, D.I., and Liu, D.R. (2017). Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464–471. https://doi.org/10.1038/nature24644. 4. Kurt, I.C., Zhou, R., Iyer, S., Garcia, S.P., Miller, B.R., Langner, L.M., Grünewald, J., and Joung, J.K. (2021). CRISPR C-to-G base editors for inducing targeted DNA transversions in human cells. Nat Biotechnol 39, 41–46. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0609-x. 5. Tong, H., Liu, N., Wei, Y., Zhou, Y., Li, Y., Wu, D., Jin, M., Cui, S., Li, H., Li, G., et al. (2023). Programmable deaminase-free base editors for G-to-Y conversion by engineered glycosylase. National Science Review, nwad143. https://doi.org/10.1093/nsr/nwad143. 6. Tong, H., Wang, H., Wang, X., Liu, N., Li, G., Wu, D., Li, Y., Jin, M., Li, H., Wei, Y., et al. (2024). Development of deaminase-free T-to-S base editor and C-to-G base editor by engineered human uracil DNA glycosylase. Nat Commun 15, 4897. https://doi.org/10.1038/s41467-024-49343-5. 7. Chen, S., Liu, Z., Xie, W., Yu, H., Lai, L., and Li, Z. (2022). Compact Cje3Cas9 for Efficient In Vivo Genome Editing and Adenine Base Editing. The CRISPR Journal 5, 472–486. https://doi.org/10.1089/crispr.2021.0143. 8. Davis, J.R., Wang, X., Witte, I.P., Huang, T.P., Levy, J.M., Raguram, A., Banskota, S., Seidah, N.G., Musunuru, K., and Liu, D.R. (2022). Efficient in vivo base editing via single adeno-associated viruses with size-optimized genomes encoding compact adenine base editors. Nat. Biomed. Eng 6, 1272–1283. https://doi.org/10.1038/s41551-022-00911-4. 9. Zhang, H., Bamidele, N., Liu, P., Ojelabi, O., Gao, X.D., Rodriguez, T., Cheng, H., Kelly, K., Watts, J.K., Xie, J., et al. (2022). Adenine Base Editing In Vivo with a Single Adeno-Associated Virus Vector. GEN Biotechnology 1, 285–299. https://doi.org/10.1089/genbio.2022.0015. 10. Hino, T., Omura, S.N., Nakagawa, R., Togashi, T., Takeda, S.N., Hiramoto, T., Tasaka, S., Hirano, H., Tokuyama, T., Uosaki, H., et al. (2023). An AsCas12f-based compact genome-editing tool derived by deep mutational scanning and structural analysis. Cell 186, 4920-4935.e23. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.08.031. 11. Kim, D.Y., Lee, J.M., Moon, S.B., Chin, H.J., Park, S., Lim, Y., Kim, D., Koo, T., Ko, J.-H., and Kim, Y.-S. (2022). Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus. Nat Biotechnol 40, 94–102. https://doi.org/10.1038/s41587-021-01009-z. 12. Kong, X., Zhang, H., Li, G., Wang, Z., Kong, X., Wang, L., Xue, M., Zhang, W., Wang, Y., Lin, J., et al. (2023). Engineered CRISPR-OsCas12f1 and RhCas12f1 with robust activities and expanded target range for genome editing. Nat Commun 14, 2046. https://doi.org/10.1038/s41467-023-37829-7. 13. Xu, X., Chemparathy, A., Zeng, L., Kempton, H.R., Shang, S., Nakamura, M., and Qi, L.S. (2021). Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. Molecular Cell 81, 4333-4345.e4. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.008. 14. Wu, Z., Zhang, Y., Yu, H., Pan, D., Wang, Y., Wang, Y., Li, F., Liu, C., Nan, H., Chen, W., et al. (2021). Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Cas12f nuclease. Nat Chem Biol 17, 1132–1138. https://doi.org/10.1038/s41589-021-00868-6. 15. Karvelis, T., Druteika, G., Bigelyte, G., Budre, K., Zedaveinyte, R., Silanskas, A., Kazlauskas, D., Venclovas, Č., and Siksnys, V. (2021). Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature 599, 692–696. https://doi.org/10.1038/s41586-021-04058-1. 16. Kim, D.Y., Chung, Y., Lee, Y., Jeong, D., Park, K.-H., Chin, H.J., Lee, J.M., Park, S., Ko, S., Ko, J.-H., et al. (2022). Hypercompact adenine base editors based on transposase B guided by engineered RNA. Nat Chem Biol 18, 1005–1013. https://doi.org/10.1038/s41589-022-01077-5. 17. Altae-Tran, H., Kannan, S., Demircioglu, F.E., Oshiro, R., Nety, S.P., McKay, L.J., Dlakić, M., Inskeep, W.P., Makarova, K.S., Macrae, R.K., et al. (2021). The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science 374, 57–65. https://doi.org/10.1126/science.abj6856. 18. Schuler, G., Hu, C., and Ke, A. (2022). Structural basis for RNA-guided DNA cleavage by IscB-ωRNA and mechanistic comparison with Cas9. Science 376, 1476–1481. https://doi.org/10.1126/science.abq7220. 19. Han, D., Xiao, Q., Wang, Y., Zhang, H., Dong, X., Li, G., Kong, X., Wang, S., Song, J., Zhang, W., et al. (2023). Development of miniature base editors using engineered IscB nickase. Nat Methods. https://doi.org/10.1038/s41592-023-01898-9. https://www.nature.com/articles/s41589-024-01706-1 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

DNA碱基编辑工具的进步为疾病治疗带来了巨大的希望，可修复由单核苷酸多态性(SNPs)【1】引起的单基因遗传疾病。目前，胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器主要依靠脱氨酶将胞嘧啶 (C) 或腺嘌呤 (A) 转化为尿嘧啶 (U) 或肌苷 (I)，脱氨后的U和I会分别被识别为胸腺嘧啶 (T) 和鸟嘌呤 (G)，从而促进C-to-T和A-to-G碱基变化【2-4】。 在此基础上，进一步引入DNA糖基化酶切割中间产物U或I，产生无尿嘧啶/无嘧啶位点(AP位点)，可以实现碱基的颠换，包括C-to-G转换的CGBE【5、6】和A-to-T/C转换的AYBE【7、8】。但以上碱基编辑工具均依赖脱氨酶，限制了它们编辑T和G的能力，并且由于脱氨酶的过表达会引起一定的脱靶效应。 2024年7月30日，北京大学魏文胜课题组在Nature Communications杂志在线发表题为 “Programmable DNA pyrimidine base editing via engineered uracil-DNA glycosylase”的研究论文，报道了一种名为TBE (Thymine base editor) 的不依赖脱氨酶的DNA碱基编辑工具。与现存的其他胸腺嘧啶编辑工具相比，TBE表现出更高的编辑效率、更小的细胞毒性和更低的脱靶现象。 图1: 不依赖于脱氨酶的碱基编辑器 研究人员关注到人源化尿嘧啶DNA-糖基化酶 (hUNG) 的两个突变体可以在体外实现对胞嘧啶和胸腺嘧啶的直接切割【10】。因此，通过将hUNG突变体与Cas9蛋白结合，sgRNA靶向编辑位点可以在体内实现对DNA序列中的C和T的直接编辑 (图1)，其中在报告系统上编辑C的效率可达到30%，与现存的CGBE编辑效率类似，但针对T的hUNG突变体编辑效率较低。 为了进一步提高胸腺嘧啶的编辑效率，研究人员通过对UNG结构理性设计、同源蛋白检索、定向进化筛选的策略找到了来自耐辐射奇球菌 (Deinococcus radiodurans) 的尿嘧啶DNA-糖基化酶 (DrUNG) 突变体可以在多个人类基因组位点上实现高效的胸腺嘧啶编辑 (图2)，编辑结果显示平均T-to-C, T-to-G及T-to-A的比例为52%, 30%和18%。 通过优化连接氨基酸、引入具有合成倾向性的DNA聚合酶，还可以进一步提高编辑效率与编辑纯度。全面评估显示，TBE在基因组或转录组水平上都不会导致严重的脱靶编辑，这表明其具有高度的编辑特异性。 图2: TBEs在人类基因组多个内源位点实现高效的编辑 近期，多个团队也报道了基于人源化糖基化酶的胸腺嘧啶碱基编辑器【11-12】。通过比较32个内源位点编辑结果，研究人员发现与基于人源的胸腺嘧啶碱基编辑器相比，TBE展现出更高的编辑效率。此外，细胞毒性实验也表明TBE具有更小的细胞毒性。 最后，通过将DrUNG突变体的mRNA与nickase SpCas9融合蛋白和sgRNA共转染到原代成纤维细胞中的α-L-艾杜糖醛酸酶缺陷细胞中，可以观察到该酶活性的恢复，证明了TBEs在相关疾病治疗方面的潜在应用前景。 北京大学/昌平实验室魏文胜课题组博士后伊宗裔、博士后张小雪、博士研究生魏晓旭、本科生李佳怡（2024级研究生新生）为论文的共同第一作者。本研究获得了国家自然科学基金，昌平实验室，北大-清华生命科学中心及中国博士后科学基金资助。 文章链接： https://www.nature.com/articles/s41467-024-50012-w 原文链接： https://www.bio.pku.edu.cn/homes/Index/news_cont/22/17278.html 参考文献： 【1】Porto, E.M., Komor, A.C., Slaymaker, I.M. & Yeo, G.W. Base editing: advances and therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov 19, 839-859 (2020). 【2】Anzalone, A.V., Koblan, L.W. & Liu, D.R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat Biotechnol 38, 824-844 (2020). 【3】Gaudelli, N.M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017). 【4】Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016). 【5】Zhao, D. et al. Glycosylase base editors enable C-to-A and C-to-G base changes. Nat Biotechnol 39, 35-40 (2021). 【6】Kurt, I.C. et al. CRISPR C-to-G base editors for inducing targeted DNA transversions in human cells. Nat Biotechnol 39, 41-46 (2021). 【7】Tong, H. et al. Programmable A-to-Y base editing by fusing an adenine base editor with an N-methylpurine DNA glycosylase. Nat Biotechnol 41, 1080-1084 (2023). 【8】Chen, L. et al. Adenine transversion editors enable precise, efficient A*T-to-C*G base editing in mammalian cells and embryos. Nat Biotechnol (2023). 【9】Tong, H. et al. Programmable deaminase-free base editors for G-to-Y conversion by engineered glycosylase. Natl Sci Rev 10, nwad143 (2023). 【10】Parikh, S.S., Mol, C.D., Slupphaug, G., Bharati, S., Krokan, H.E. & Tainer, J.A. Base excision repair initiation revealed by crystal structures and binding kinetics of human uracil-DNA glycosylase with DNA. EMBO J 17, 5214-5226 (1998). 【11】Ye, L. et al. Glycosylase-based base editors for efficient T-to-G and C-to-G editing in mammalian cells. Nat Biotechnol (2024). 【12】He, Y. et al. Protein language models-assisted optimization of a uracil-N-glycosylase variant enables programmable T-to-G and T-to-C base editing. Mol Cell (2024). 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！