Afimoxifene

今天介绍的研究成果发表于 Advanced Science ，题为GeminiMol: 构象空间表征提升了基于人工智能的配体驱动药物发现中的通用分子表示能力”。该工作聚焦于分子表示学习的核心问题——如何让AI不仅理解分子的化学结构，更能捕捉其动态构象特征。现有分子表示模型大多停留在二维结构层面，忽视了分子在生理环境中的三维构象多样性与动态变化，而这些恰是决定药物作用机制、靶点识别及细胞行为的重要因素。 GeminiMol通过引入构象空间相似性（Conformational Space Similarity, CSS）描述符，建立了一种基于对比学习的分子表征框架，能够学习分子结构与构象空间间的复杂映射关系。尽管仅使用约3.9万条分子数据进行预训练，该模型在虚拟筛选、靶点识别、QSAR建模与ADMET预测等多项任务中均取得了优于传统分子指纹和主流模型的性能。GeminiMol展示了构象空间信息在提升模型泛化性与发现新活性分子方面的巨大潜力，为未来基于AI的分子设计和药物发现提供了新的研究方向。 获取详情及资源: • 📄 论文: https://doi.org/10.1002/advs.202403998 • 💻 代码: https://github.com/Wang-Lin-boop/GeminiMol0 摘要 分子表示模型是一种神经网络，用于将分子表示形式（如SMILES或分子图）转化为特征向量，是广泛应用于人工智能驱动药物发现场景中的核心模块。然而，现有的分子表示模型很少考虑分子的三维构象空间，从而忽略了小分子的动态特性，以及构象空间在体现分子性质异质性方面的关键作用，例如多靶点作用机制、对不同生物分子的识别能力、以及在细胞质和膜环境中的动态行为。 该研究提出了一种新的模型——GeminiMol，将构象空间表征融入分子表示学习之中，能够提取反映分子结构与构象空间复杂相互作用的特征。尽管GeminiMol仅在相对小规模的数据集（39290个分子）上进行预训练，但其在67项分子性质预测、73项细胞活性预测以及171项零样本任务（包括虚拟筛选与靶点识别）中均表现出均衡且优异的性能。通过有效捕捉分子的构象空间特征，这一策略为快速探索化学空间提供了新途径，并推动了药物设计范式的革新。1 引言 如果说表示学习是人工智能在面对复杂实体时的“感知受体”，即将文本、图像和声音等人类可读信息转化为智能体可理解的数字表征的调节器，那么分子表示学习便是负责将人类可读的分子表示（如SMILES或分子图）翻译为特征向量的“解释器”，使AI模型能够据此开展药物发现任务。分子表示学习通过预训练任务让模型理解分子表示形式，从而提升其在各类下游任务中的表现，这一思路也被称为元学习（meta-learning）。 近年来，科研界主要形成了三种分子表示学习的训练策略：自监督学习、监督学习与复合策略。自监督学习是一种广泛应用的训练方式，旨在让模型理解不同格式的分子表示，包括SMILES、IUPAC命名、InChI、分子图、三维结构、分子指纹甚至分子图像等。代表性模型有SMILES-Bert、ChemBERTa、KPGT、NYAN、GraphMVP、GEM、UniMol、3DGCL、ImageMol等。通过对多种分子表示的对比学习或自生成任务，自监督预训练模型能够在不依赖结构标签的情况下有效提取分子结构特征。然而，这类方法需要在预训练阶段学习上百万个未标注的分子结构，因此其在远离训练数据的化学空间中的泛化能力仍难以评估。有研究指出，部分自监督策略在下游任务中的表现并不一定优于未经过预训练的方法。 监督预训练策略则通过结构–性质投射或结构–标签语义匹配来捕捉分子的有机化学或药理特征，如ChemBERTa-2、MolT5、CLOOME等。此类方法需要利用不同类型的分子性质构建预训练任务，既可以是分类或回归任务，也可以是与分子描述符或生物医学数据相关的检索与生成任务。其主要缺点在于对标注数据的依赖，同时在预训练中引入分子特征信息也可能影响模型的泛化能力。 为综合两类方法的优缺点，一些研究提出了复合策略，如HelixADMET。这类策略采用分阶段预训练流程：先进行自监督预训练（包括自生成、分子指纹生成、三维几何预测等任务），再执行监督预训练（包括分子性质预测等任务）。这种组合式方法在多数下游任务中展现出更优性能。然而，复合策略也存在局限，如自监督阶段化学空间表征不足、监督阶段依赖高质量大规模数据，以及在泛化性方面的相对欠缺。 针对化学空间表征与泛化能力不足的问题，该研究提出了一种混合对比学习框架，通过分子间相似性作为投影头进行分子间对比学习，从而在不依赖实验性质数据的前提下，训练出可靠的分子表示模型。基于此策略，构建了新的分子表示模型——GeminiMol，该模型在学习药物分子的构象空间相似性（Conformational Space Similarity, CSS）的同时，整合了完整的分子构象空间与药效团特征。研究总体流程如图S1所示：首先定义了构象空间相似性描述符；然后基于39290个分子的较小数据集生成CSS描述符用于训练GeminiMol；最后在四个关键药物发现任务上验证模型性能，包括虚拟筛选、靶点识别、定量构效关系（QSAR）以及吸收、分布、代谢、排泄与毒性（ADMET）性质预测。广泛的实验结果表明，GeminiMol在多种药物发现场景中展现出优异的泛化能力，拓展并深化了分子表示学习领域的研究范式。 图1 | 对比学习框架的构象空间表征与应用任务 a) GeminiMol的预训练与应用框架。在预训练阶段，模型同时考虑了最大公共子结构（MCS）相似性与构象空间相似性（CSS）。其中，CSS描述符通过PhaseShape计算（详见方法部分），MCS相似性则通过最大公共子结构比对获得。分子以图结构的形式输入网络，其中原子被表示为节点，化学键被表示为边。图中直箭头表示不同网络组件之间的信息流向。高亮的二维分子结构展示了分子间的最大拓扑公共子结构（忽略元素差异）。各网络层之间的特征向量维度标注在括号中。b) GeminiMol的零样本应用任务。通过比较表示向量之间的相似性，或通过投影头预测分子间的MCS或CSS相似性，GeminiMol可用于分子相似性预测任务。c) GeminiMol的分子性质建模任务。通过利用表示向量训练解码器或对GeminiMol模型进行微调，可构建基于GeminiMol的预测器，用于分子性质预测等下游任务。2 结果2.1 构象空间相似性描述符 分子间的相似性为对比学习提供了重要契机。然而，以往研究往往通过对分子结构进行修改生成分子对（如MolCLR和iMolCLR），而非依据具有药理或物理意义的分子相似性进行学习。为了进一步增强对比学习在分子表示学习中的作用，有必要将具有药理学或物理学意义的分子相似性评价指标引入分子表示学习体系中，如三维形状相似性与药效团相似性。近期，MolCLaSS模型已将三维形状相似性纳入对比学习框架。然而，药物分子的生物活性构象空间在药物与靶标结合中发挥关键作用，而先前工作（如GEM、Uni-Mol、MolCLaSS）所采用的少量最小构象并不能充分代表与靶标结合相关的生物活性构象空间。 为克服现有方法未能完整表征分子生物活性构象空间的局限，该研究采用系统构象搜索方法，为每个分子枚举其所有可能的三维构象，以全面表征分子的构象空间。随后，通过比较两种分子构象空间中三维形状的相似性来评估它们之间的整体相似度。大多数小分子包含多个可旋转键，不同的旋转组合会产生不同的构象。从理论上讲，通过对每个可旋转键进行小角度分区旋转而生成的系统性构象搜索结果，几乎可以覆盖整个分子的构象空间。小分子在与不同蛋白结合口袋相互作用时，可能采用不同的构象。例如，伊马替尼可与四种不同靶蛋白结合，呈现三种不同的结合构象（如图S2a所示），这一现象说明构象信息对于准确描述药物作用性质至关重要。 随着可旋转键数量的增加，小分子的构象空间变得更加复杂，形成更多低能构象簇（如图S2b所示），这意味着其具有更多可供识别不同靶点的可能性。图S3显示了从蛋白质数据银行（PDB）中获得的4518个分子的6670个实验测定本征构象的应变能分布，结果表明可旋转键的数量是决定分子构象空间复杂度的关键因素。因此，需要开发能够表征构象空间相似性（CSS）的描述符，以便通过对比学习更恰当地刻画分子的性质。 GeminiMol编码器的核心原理是基于二维分子结构提取构象空间特征。为实现这一目标，研究者通过不同的CSS描述符监测构象空间特征的获取过程（具体方法见方法部分）。研究构建了一个包含39290个分子的分子数据集，并对其构象空间进行了全面扫描。随后，为每个分子生成了两个构象集合：一个为近本征构象集合，其应变能低于定义阈值（0.5060 kcal·mol⁻¹·每可旋转键）；另一个为更大范围的构象集合，其应变能阈值为1.4804 kcal·mol⁻¹·每可旋转键。 通过使用PhaseShape软件对分子对进行药效团和几何形状比对，计算并生成了不同能量阈值下的原始CSS描述符（最大与最小相似性得分）。此外，还设计了用于数据增强的高级CSS描述符，通过对原始CSS描述符进行数值变换获得，包括用于表征最大相似性的MaxSim、最大差异性的MaxDistance、构象空间接近程度的MaxAggregation以及构象空间重叠程度的MaxOverlap（具体细节见方法部分）。2.2 GeminiMol框架的训练与解释 作为一种分子间对比学习框架，GeminiMol在训练阶段使用相同的编码器独立地对分子对进行编码（如图1a所示）。原始分子图首先通过Weisfeiler–Lehman网络（WLN）的信息传递机制进行更新。随后，从更新后的分子图中读取分子表示，并将两者连接后输入到多个投影头中，以预测不同的构象空间相似性（CSS）描述符和最大公共子结构（MCS）相似度（如图1a所示）。这些投影头的主要作用是指导编码器学习到具有丰富信息的分子表示（即GeminiMol编码）。 与其他常见对比学习框架中仅含有一到两层隐藏层的投影结构不同，GeminiMol的投影头采用由多层线性层和激活函数构成的整流结构（如图1a所示），以压缩输入特征并提炼高维信息。除以分子间相似性描述符作为对比学习目标来训练独立的分子编码器外，研究还考虑到分子相似性问题与自然语言处理中句子相似性问题具有一定相似性。因此，研究者构建了一个基于化学语言的端到端分子相似性预测框架作为基线模型，命名为CrossEncoder。CrossEncoder允许参考分子与查询分子之间的信息交互，通过在ELECTRA模型中添加化学分词器并借助AutoGluon工具实现。 为评估GeminiMol、CrossEncoder、传统分子指纹方法以及其他第三方基线模型的性能，研究将它们应用于多种下游基准任务（如图1b、1c所示）。这些任务的数据集及对应基线包括：1）用于虚拟筛选的DUD-E与LIT-PCBA；2）用于靶点识别的Target Identification Benchmark Dataset（TIBD）；3）用于定量构效关系（QSAR）分析的靶点级与细胞级化合物活性数据；4）用于ADMET建模的吸收、分布、代谢、排泄与毒性相关化合物性质数据。方法部分提供了更详细的说明。以上四类任务涵盖了配体驱动药物设计的主要应用场景，可全面评估不同分子表示方法在药物设计任务中的整体表现。与以往研究相比，该研究在零样本学习任务中引入了靶点识别（如图1b所示），并将细胞水平的活性预测纳入分子性质建模任务之中。 CrossEncoder与GeminiMol均基于从37336个分子中随机采样所得的800万个分子相似性描述符进行训练，并在交叉集与测试集上进行评估。需要注意的是，交叉集中的分子对中至少含有一个来自训练集的分子，而测试集中的分子对则完全不包含训练集样本。正如图2a所示，两种模型在测试集与交叉集上的Spearman相关系数高度一致，表明模型具有良好的泛化能力。进一步分析了包含60万个样本的子集（见图S4），发现二维结构差异显著但三维结构相似度较高的分子对极为罕见，可视为高质量的分布外（OOD）样本。OOD测试被广泛用于评估机器学习系统在超越训练集偏差时的泛化能力。因此，基于这些数据，研究进行了消融实验，以探讨GeminiMol模型中各组成部分的学习贡献。如图2b所示，减少层数、降低节点特征维度或移除投影头中的整流结构均会导致性能下降；同样，在高级CSS描述符中也观察到类似趋势（如图2c所示）。 图2 | GeminiMol模型在CSS预测与零样本药物发现任务中的测试与解释 a) 交叉集与测试集性能相关性结果显示，模型具有较强的泛化能力。不同形状代表不同的CSS描述符。例如，Global_MAX表示在全局构象空间中的最大相似性；MaxSim表示所有相似性中的最大值；MaxDistance表示最小相似性；MaxOverlap表示MaxSim与MaxDistance之和的一半；MaxAggregation表示在两种应变能阈值下最大相似性的平均值。当相似性名称中的“Max”被替换为“Cross”时，表示A对B与B对A相似性之和的一半。b) 原始CSS标签的消融实验结果。c) 经数值变换后的CSS描述符的消融实验结果。GeminiMol模型在每组实验中进行了四次独立的训练与测试，而其他模型至少进行了两次重复实验。“DropLayerNumber”表示将WLN网络的层数减少至2层；“DropNodeFeatures”表示将WLN网络中节点特征维度降至1024；“ΔRectifier”表示将投影头替换为简化的深度神经网络。d) CrossEncoder与分子指纹方法的性能比较。虚拟筛选性能以LIT-PCBA基准测试中的Boltzmann增强受试者工作特征曲线判别指标（BEDROC）衡量，靶点识别性能以TIBD基准测试中的BEDROC指标衡量。选择LIT-PCBA数据集的原因在于其中的分子来源于真实的高通量筛选实验。红色箭头标示性能最均衡的模型。不同的分子表示方法与指纹类型以不同形状表示，而相似性度量指标以不同颜色区分。e) 不同分子指纹、CrossEncoder与GeminiMol的性能比较。各类CSS描述符以不同形状表示，基线方法计算的相似性以灰色圆点表示。GeminiMol编码向量的皮尔逊或余弦相似性均显示出优越的平均性能。f) GeminiMol模型及CSS描述符的消融实验结果。在零样本药物发现实验中，采用皮尔逊相似性作为度量指标。GeminiMol模型在每组实验中均进行了四次训练与测试，而其他模型至少进行了两次重复实验。“DropLayerNumber”表示将WLN层数减少至2层；“DropNodeFeatures”表示将节点特征维度降至1024；“ΔRectifier”表示将投影头替换为简化的深度神经网络；“RawDescriptors”表示在训练过程中使用原始CSS描述符替代高级CSS描述符进行对比学习。2.3 基于GeminiMol编码的零样本药物发现 在基于配体的药物设计领域中，一个核心假设是“结构相似的分子往往具有相似的生物活性”。这一原则使得研究者能够通过比较配体间的相似性来预测其生物活性的相似程度，即与参考分子在结构上相似的分子可能具有相似的活性或作用靶点。由此，配体相似性分析被广泛应用于虚拟筛选与靶点识别等任务。在机器学习领域，这种方法通常被称为零样本学习（zero-shot learning）。因此，分子相似性搜索成为实现零样本药物发现的主要途径。 在GeminiMol中，可通过两种方式进行分子相似性预测：一种是利用投影头直接预测分子间的构象空间相似性（CSS）描述符；另一种是比较GeminiMol编码向量之间的相似性，例如计算余弦相似度或皮尔逊相关系数。值得注意的是，该研究所用的分子数据集（39290个分子）与DUD-E（1463336个分子）和LIT-PCBA（2808885个分子）重叠极少，因此模型必须在学习二维结构与CSS之间关系的同时，具备较强的泛化能力，才能在下游任务中取得优异表现。 PhaseShape是一种基于三维药效团与形状比对的相似性打分方法，该研究以其作为参考，评估了GeminiMol和CrossEncoder在虚拟筛选任务中的表现，以探究引入构象空间表征是否有助于性能提升。如图S5所示，GeminiMol的多种CSS描述符以及编码向量间的相似性均在DUD-E和LIT-PCBA基准数据集中显著优于PhaseShape。其中，GeminiMol编码向量间的皮尔逊相关与余弦相似度在两个虚拟筛选基准上均表现出最优性能。 为进一步比较不同模型与主流基线方法的差异，研究评估了8种常用分子指纹、CrossEncoder以及GeminiMol在LIT-PCBA和TIBD数据集上的表现。分子指纹作为主流二维结构相似性搜索方法被用作基线（如图2d、2e所示）。CrossEncoder的表现与分子指纹相当，这主要得益于MaxSim与CrossSim预测器的贡献，但整体未能超越分子指纹方法。令人意外的是，GeminiMol编码的余弦相似度与皮尔逊相关在虚拟筛选与靶点识别任务中均取得了平衡且优异的表现。其中，皮尔逊相关系数在两个任务上整体效果最佳。 进一步的消融实验（如图2f所示）表明，去除投影头中的整流结构会显著削弱GeminiMol的性能与稳定性，这与前文的实验结果一致。同时，减少节点特征维度或将高级CSS描述符替换为原始CSS描述符均会导致模型在虚拟筛选与靶点识别中的性能下降。2.4 利用GeminiMol编码识别新的生物活性分子 在药物发现过程中，为满足化合物新颖性的要求，分子表示模型必须能够有效捕捉分子间潜在的相似性，即便它们在二维结构上存在显著差异。这一能力在实践中尤为重要，尤其是在识别具有不同骨架结构的新活性分子时。与多种基线方法相比，GeminiMol在零样本学习任务（如虚拟筛选与靶点识别）中表现出卓越性能（见图2e）。为了深入理解其优异表现背后的原因，研究进一步探讨了GeminiMol对分子结构变化及药物骨架跃迁（scaffold hopping）的敏感性，并以三个不同的靶点为例进行了分析。 首先，为评估常见环闭合操作对先导化合物优化的影响，研究对比了GeminiMol编码、ECFP4指纹与TopologicalTorsion指纹的表现（如图3a所示）。选取了两种非甾体类雌激素受体调节剂——拉索福西芬（lasofoxifene）与阿非莫西芬（afimoxifene）。二者作用于相同的雌激素受体，且在结构上高度相似，具有相近的结合模式（见图3a），其相似性通过视觉比对即可辨识。然而，分子指纹法显示二者在二维结构上存在显著差异。而GeminiMol则能够识别这类微妙的结构变化，将它们判断为具有高度相关性的类似物，预测的MaxSim值为0.942，对应编码相似度超过0.7。 人类免疫缺陷病毒（HIV）蛋白酶是药物研发中的经典靶点之一，相关研究历史悠久。早期研究主要集中于拟对称肽类抑制剂，随后发展出多样的化学骨架。尽管这些新型抑制剂在结构上与原始肽类抑制剂差异明显，但其作用机制相同。研究以经典的拟对称抑制剂A79285为起点，对比了其与四种非对称抑制剂的结构差异（见图3b）。分子指纹显示这些分子的二维结构差异较大，但在GeminiMol编码空间中，它们彼此距离较近，表明GeminiMol能够捕捉不同结构分子在构象空间中的内在相似性。 同样地，研究还分析了三种凝血酶（thrombin）抑制剂的分子结构及其与靶点的相互作用模式（见图3c）。结果显示，即使这些分子的二维结构差异显著，GeminiMol模型仍能识别出它们之间的基础相似性。更为重要的是，研究发现抑制剂的活性与其相似度呈正相关——与最强抑制剂的相似性越低，其活性也相应降低（见图3c）。这些结果表明，GeminiMol不仅能够超越二维结构的局限，更能通过构象空间特征识别不同骨架化合物间的生物学相关性，为新活性分子的发现提供了强有力的工具。 图3 | 基于GeminiMol编码的分子相似性评估 a) 环闭合类化学修饰引起的分子相似性变化。在结构发生变化后，分子指纹的相似性指标显著下降，所有指标均低于0.5；然而，GeminiMol的相似性仍保持在0.7以上，表明其对结构修饰具有较强的鲁棒性。b) 对称与非对称HIV蛋白酶抑制剂的内在相似性。分子指纹无法识别这些具有不同骨架的分子间相似性（得分低于0.4），而GeminiMol编码基于皮尔逊相似性度量，认为这些分子的相似性均高于0.7，能够揭示不同结构分子在构象空间中的共性特征。c) 三种二维结构差异显著但在蛋白结合口袋中表现出相似结合模式的分子。GeminiMol编码的皮尔逊相似性能够准确识别其内在相似性，例如较弱结合分子的相似性得分为0.554，而较强结合分子的得分为0.738。2.5 GeminiMol编码在分子性质建模中的评估 分子性质建模是评估分子表示模型在下游任务中性能的常用方法。以往研究常使用包含ADMET性质信息与靶点层级生物活性数据的数据集，如MoleculeNet、Therapeutics Data Commons（TDC）、LIT-PCBA及PubChem BioAssays，用以评估不同分子表示方法的表征能力。 该研究为全面考察多种分子表示方法的性能，从LIT-PCBA与PubChem BioAssays中收集了21个靶点层级生物活性数据集，从美国国家癌症研究所药物开发项目（NCI/DTP）中收集了73个细胞层级生物活性数据集，并从TDC中获得了46个ADMET性质数据集，此外还包含一个药物成瘾相关数据集（具体见方法部分）。其中，定量构效关系（QSAR）任务分为两类：靶点层级与细胞层级。前者与特定靶点相关，而后者可能涉及多个未知靶点及细胞毒性机制。 研究首先比较了GeminiMol与多种分子指纹方法在两类QSAR任务及ADMET分类与回归任务中的表现（见图S6）。结果显示，在所有分子指纹方法中，由ECFP4、FCFP6、AtomPairs和TopologicalTorsion组合而成的CombineFP表现最佳。由于细胞层级活性建模在基于表型的药物发现中具有重要意义，研究进一步重点评估了GeminiMol、分子指纹及第三方基线模型（包括FP-GNN与Uni-Mol）在73种癌细胞系上的QSAR任务表现（如图4a所示）。在这些分子表示方法中，GeminiMol模型表现最为优异，显著优于CombineFP与其他基线方法（见图4b）。 为揭示GeminiMol在细胞层级QSAR任务中性能优越的原因，研究进一步比较了不同解码器的设计及其对性能的影响（见图4c）。结果显示，模拟GeminiMol框架中投影头结构的PropDecoder表现最佳。结合图S2可见，伊马替尼能够以多种构象结合不同靶点，这说明构象空间特征在建模多靶点相互作用与复杂药物–靶点网络中发挥重要作用，从而解释了GeminiMol在细胞层级QSAR任务中的卓越性能。 此外，GeminiMol在靶点层级QSAR与ADMET任务中也展现出与其他先进方法相当的性能（见图4d–f）。研究进一步测试了仅使用原始GeminiMol编码作为下游任务输入、且固定编码器的模型表现。在此固定编码器配置下，GeminiMol的性能略有下降，但仍优于大多数基线模型，在QSAR任务中优于FP-GNN，并在ADMET任务中超越部分分子指纹方法（见图S7）。值得注意的是，该固定编码器仅基于37336个分子结构进行训练，这表明GeminiMol的训练策略赋予了模型较强的泛化能力。未来若引入更丰富多样的分子结构，预计将进一步提升其表现。 总体而言，GeminiMol不仅在性能上可与传统分子指纹相媲美，还能与专为QSAR任务设计的FP-GNN以及在预训练中使用1900万个分子的Uni-Mol相抗衡。这表明，该研究提出的基于分子构象空间相似性描述符的对比学习框架是一种高效的分子表示模型训练策略。 图4 | 基于GeminiMol编码的分子性质建模应用 a) NCI/DTP中73种癌细胞系的统计分布。b) GeminiMol与其他基线方法在73个细胞层级生物活性建模任务中的性能比较。虚线表示GeminiMol模型的表现。结果显示，GeminiMol在大多数细胞系任务中均优于其他模型，展现出更强的表征与预测能力。c) 不同解码器类型对GeminiMol在细胞层级生物活性建模任务中性能的影响。其中，PropDecoder为用于微调GeminiMol模型的多层感知机（MLP）；CatBoost、LightGBM与AutoGluonNN则是基于固定编码器构建的预测模型。虚线表示经过微调的GeminiMol-PropDecoder模型性能，其优于其他解码结构。d–f) GeminiMol与其他基线方法在靶点层级QSAR任务与ADMET性质建模任务中的性能比较。包含21个靶点层级QSAR任务、35个分类ADMET任务及12个回归ADMET任务。虚线同样表示GeminiMol模型的表现。整体结果表明，GeminiMol在多种任务类型中均保持稳定且优异的性能，验证了其作为通用分子表示模型在药物发现中的广泛适用性。3 结论 数据的数量与质量长期以来都是人工智能科学研究中的关键挑战。该研究提出了一种创新性解决方案，即利用高精度分子模拟技术生成高质量训练数据，以缓解深度学习中高质量数据稀缺的问题。通过这种方式，不仅能够独立训练分子表示模型，还可为其他学习策略提供补充性数据来源。研究发现，将构象空间相似性描述符引入分子表示学习，能够显著提升模型的表征能力与在药物发现任务中的有效性。与以往研究不同，该研究在框架设计中避免引入已存在于其他表示方法（如分子指纹）中的信息，而是探索新的分子表征途径，为未来模型的改进奠定基础。 近年来，靶点导向的药物设计一直是药物研发的主流范式。然而，最新研究表明，大多数药物实际上来源于基于细胞水平表型的发现策略，且部分靶点导向药物的效应也涉及非靶点相互作用。这一发现提示，基于配体的药物设计仍具有重要潜力，特别是在骨架跃迁与配体相似性筛选等方向。该研究揭示了当前分子表示模型的改进空间，并推动药物发现范式的潜在转变。随着以Target 2035为代表的全球药物靶点研究计划的推进，基于配体相似性的靶点识别正变得愈发重要。配合GeminiMol等先进的分子表示技术，未来的药物设计有望通过小分子相似性网络实现生物活性预测与靶向选择性优化，从而推动理性分子设计的新范式形成。该研究的成果也将对药物–靶点相互作用预测及药物副作用预测等领域产生积极影响。 需要指出的是，构象空间表征并非药物发现的“万能钥匙”。对于部分任务，化合物的二维结构信息已足以建立可靠的构效关系，此时引入构象空间信息未必带来显著收益。近年来，借助于PDB-Bind等代表性药物–靶点三维相互作用数据集，基于三维相互作用建模的人工智能方法（如PLANET）已被广泛应用于药物–靶点相互作用预测。此外，药物–靶点结合的性质还与靶点信息密切相关，包括结合亲和力与结合动力学等；同时，药物的吸收、分布与代谢过程也常受到其他生物大分子的影响。因此，单纯依赖小分子构象空间信息并不能有效解决所有问题。GeminiMol的目标是改进现有小分子表示方法，并为其他下游任务（如蛋白–配体亲和力预测与条件分子生成）提供实用工具，从而为人工智能驱动的药物设计提供新的技术支撑。 往期精彩： JMC 2025 | 利用噬菌体展示与冷冻电镜技术高通量鉴定并表征结合LptDE的双环肽 NMI 2025 | ITsFlexible: 预测抗体与T细胞受体互补决定区的构象柔性 Patterns 2025 | LigUnity: 通过学习共享的口袋-配体空间实现分层亲和力景观导航 写作：Z 排版：Barry

“点击蓝字 关注我们山长亮南开大学药学院教授、博士生导师，南开大学百名青年学科带头人，南开大学第九届“良师益友”十佳奖获得者。主持国家自然科学基金面上项目、京津冀基础研究合作专项项目和天津市自然基金重点项目。任中国抗癌协会抗癌药物专业委员会委员、中国细胞生物学学会肿瘤细胞生物学学会委员和中国抗癌协会肿瘤细胞代谢专业委员会委员等。 Signal Transduct Target Ther, Mol Cell, Acta Pharm Sin B, Cell Rep, iScience , EbioMedicine, Cancer Lett, Acta Pharmacol Sin（ 2022 年度优秀审稿人）, Acta Biochim Biophys Sin （ 2022 年度优秀审稿人 ) 和 Biochem Pharmacol 等杂志审稿人。长期从事肿瘤代谢酶表观修饰调控与化学干预研究，在 Nat Cell Biol, Nat Chem, Mol Cell, Cell Res, Acta Pharm Sin B, Acta Pharmacol Sin, J Exp Clin Cancer Res 和 Pharmacol Res 等期刊发表学术论文 50 余篇，总引用 4 000 余次（Google Scholar）， H-index 为 26。 α- 烯醇化酶调控肿瘤的作用机制及靶向干预研究进展 PPS 谢飞，戴昕彤，山长亮 *（南开大学药学院，天津 300350） [摘要] α-烯醇化酶（enolase 1，ENO1）是糖酵解途径中的关键酶，负责催化 2-磷酸甘油酸（2-phosphoglycerate，2-PG）向磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）的转化。ENO1 作为一种多功能蛋白，在细胞表面及细胞质中均有表达，其在糖酵解过程中的作用不仅限于代谢调节，还包括促进肿瘤细胞增殖和抑制细胞凋亡。该酶的表达不受生长抑制因子的调控，从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。ENO1 在多种癌症类型中的过表达，使其成为肿瘤治疗的潜在靶点，同时亦是癌症预后和诊断的重要生物标志物。综述了 ENO1 与癌症关系的最新研究进展，探讨了其作为癌症生物标志物的潜力，并讨论了小分子药物靶向 ENO1 在肿瘤治疗策略中的潜在应用。 癌细胞的代谢重编程是其十四大特征之一。在癌细胞中，葡萄糖代谢的改变尤为显著，是代谢重编程中最具代表性的途径。癌细胞通过代谢重编程驱动肿瘤发展的 3 个阶段。首先，癌细胞通过增加细胞膜上葡萄糖转运蛋白（例如 Glut1 或 Glut3）的表达，提高葡萄糖的转运效率，从而增加对葡萄糖的消耗。接着，葡萄糖代谢产生的代谢中间体促进核苷酸、氨基酸和甘油三酯的生物合成，这些是细胞增殖所必需的物质。在此过程中，许多关键的代谢酶调控失衡，例如，己糖激酶、果糖 1， 6-二磷酸果糖激酶以及 α-烯醇化酶（ enolase 1， ENO1）等在癌细胞中表现出过度表达或过度激活。在第 3 阶段，过量产生的乳酸有助于形成一个更酸性的肿瘤微环境，这对周围的免疫细胞是不利的。在这种情况下，肿瘤糖酵解通路中的酶可能作为靶点，为癌症治疗开辟全新的治疗机会。 ENO1 是糖酵解途径的关键酶之一，是一种具有致癌特性的多功能蛋白。它促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，从而促进各种肿瘤的进展。烯醇化酶家族由4种亚型组成， 其 中 ENO1在人体的多数组织中广泛表达，并在多种癌症类型中表现出过表达现象。 β-烯醇化酶（ enolase 2，ENO2），亦称为神经元特异性烯醇化酶，其表达主要局限于神经元及神经内分泌相关肿瘤。 γ-烯醇化酶（ enolase 3， ENO3）则主要分布在肌肉组织。烯醇化酶 4（ 64306537H0Rik， ENO4）在精子鞭毛部分纤维鞘的正常组装过程中发挥关键作用。这些同工酶在人类中高度保守，它们能够催化 2-磷酸甘油酸（ 2-phosphoglycerate， 2-PG）脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate， PEP），在糖酵解途径中扮演着关键角色。在糖酵解过程中， ENO1占细胞烯醇化酶活性的 90%。此外， ENO1 在多种人类肿瘤中表现出异常表达，并受到多种调控机制的影响。因此， ENO1 被认为是肿瘤治疗的关键分子靶点，并已成为近数十年来研究的焦点。1ENO1 的致癌机制 在癌细胞中， ENO1 作为糖酵解途径的关键代谢酶，不仅能够催化 2-PG 转化为 PEP，而且在细胞表面充当纤溶酶原受体的角色，从而增强癌细胞的侵袭性。 ENO1 的基础功能、蛋白结构以及功能状态下的二聚体形式已被深入研究，并在众多综述文献中得到了系统性的阐述。本文主要综述了近年来关于 ENO1 在肿瘤细胞中作为致癌蛋白的下游信号通路的相关报道。许多研究发现 ENO1 可以通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（ phosphatidylinositol 3 kinase， PI3K） /蛋白激酶 B（ protein kinase B， PKB，又称 AKT）信号通路发挥致癌效应 [1]。以胃癌为例， ENO1 表达水平的升高与胃癌细胞的增殖和转移密切相关，其作用机制涉及 AKT 信号通路的激活。然而，当加入 PI3K抑制剂 Ly294002 后， ENO1 的致癌作用显著减弱 [2]。此外，在乳腺癌、结直肠癌以及胶质瘤细胞中，均观察到类似现象与调控机制 [3-5]。 Xu 等 [6] 研究发现， Snail 可上调 ENO1 的表达，进而增强转化生长因子-β（ transforming growth factor-β， TGF-β） / Smad（ small mothers against decapentaplegic） 信号通路，推动胃癌的上皮-间质转化进程。 Zhan 等 [7]在结直肠癌研究中揭示， ENO1 能够调控腺苷一磷 酸 活 化 的 蛋 白 激 酶（ adenosine monophosphateactivated protein kinase， AMPK） /哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）信号通路，对癌症发展起到促进作用。另有研究表明， ENO1 可通过调节 RAS 癌基因家族成员 Rab1A（ Rasrelated protein Rab-1A）的表达，影响结直肠癌的发展 [8]。然而， ENO1 是否是经由 Rab1A 对 mTOR 信号通路产生调节作用，仍有待深入探究。 Principe 等 [9]研究指出， ENO1 与尿激酶型纤溶酶原激活物受体（ urokinase-type plasminogen activator receptor， u-PAR）的相互作用，会促进胰腺导管腺癌（ pancreatic ductal adenocarcinoma， PDAC）细胞的存活与迁移，并且ENO1 沉默会激活原癌基因酪氨酸蛋白激酶 Src/ 细胞外调节蛋白激酶 1-2（ extracellular regulated protein kinases1-2， ERK1-2） /Ras 相关 C3 肉毒杆菌毒素底物（ Ras-related C3 botulinum toxin substrate， RAC）信号通路，同时使 p38 丝裂原活化蛋白激酶（ p38 mitogen-activated protein kinase， p38MAPK）的磷酸化水平下调。借助基因芯片技术与生物信息学分析手段，研 究 人 员 还 发 现 ENO1 能 够 对 多 种 基 因 的 表 达进行调控。其中，诸多基因与肿瘤的发生发展密切相关，包括原癌基因 c-FOS、施瓦曼-博迪安-戴 蒙德综合征基因（ Shwachman-Bodian-Diamond syndrome gene， SBDS）、丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶 20 基因（ mitogen-activated protein kinase kinase kinase 20， MAP3K20） 以 及 去 黄化1同源物（deetiolated-1 homolog， DET1） [10]。近期研究还揭示， ENO1 可作为一种 RNA 结合蛋白发挥作用，其能够招募 CCR4-NOT 转录复合物亚基 6（ CCR4-NOT transcription complex subunit 6， CNOT6），加速癌细胞中铁调节蛋白 1（ iron regulatory protein 1， IRP1）的 mRNA 衰减过程，并抑制线粒体铁转运蛋白 1 （mitoferrin-1， Mfrn1）的表达，从而阻碍肝癌细胞的铁死亡 [11]。这一系列发现进一步证实， ENO1 可通过行使非传统的 RNA 结合蛋白功能，推动癌症的发展进程（见图 1）。细胞内的信号通路构成了一个极为复杂的网络体系。在目前已知的 ENO1 下游信号通路中，存在着大量交叉与重叠现象。可以预见，还有众多与 ENO1 相关的上游及下游信号通路，亟待深入研究与发掘。与此同时，这些已有的发现也为研究人员带来了全新的问题与研究方向。例如，在对ENO1 的转录调节研究中发现， Src 和 ERK 能够促进 ENO1 的表达，然而， ENO1 表达量的减少却又能够反向激活 Src 和 ERK。这一过程中所存在的反馈调节机制，极具研究价值，值得进一步探究。2ENO1 的调控机制 2.1 ENO1 的转录调节 在癌症发生发展进程中，缺氧是绝大多数肿瘤微环境的关键特征之一。低氧环境能够诱导肿瘤细胞在多种机制层面发生显著改变。糖酵解途径是肿瘤细胞产生能量的主要方式， ENO1 作为糖酵解途径中不可或缺的关键催化酶，其表达水平同样受到低氧条件的严格调控。Semenza 等 [12] 在编码 ENO1 的基因启动子区域，发现了缺氧诱导因子 1（ hypoxia inducible factor-1， HIF-1）的特异性结合位点。在此基础上， Chaika等 [13]进一步发现黏蛋白 1（ mucin 1， MUC1），作为一种Ⅰ型跨膜蛋白，能够对癌细胞的新陈代谢进行调节。MUC1不仅可以直接与HIF-1α和P300相互结合，增强 HIF-1α 的蛋白稳定性，还能够以缺氧依赖的方式促进 HIF-1α 和 P300 在 ENO1 基因启动子上的募集，从而显著促进 ENO1 的表达，增强胰腺癌细胞的糖酵解活性。此外，在子宫内膜癌的研究中发现，前梯度蛋白 2（anterior gradient protein 2， AGR2）可以与MUC1结合，并促进MUC1和HIF-1α的表达。因此， AGR2 能够通过增强 MUC1/HIF-1α 信号通路，促进 ENO1 以及其他多种糖酵解催化酶的表达，进而加速子宫内膜癌细胞中的糖酵解过程 [14]。在 ENO1 的转录调节过程中，除了 HIF-1 作为关键调节因子外， Chen 等 [15] 在胃癌的研究中发现，幽门螺杆菌的细胞毒素相关基因 A 蛋白（cytotoxin-associated gene A protein， CagA） 的 表达和磷酸化同样能够促进 ENO1 的转录。进一步的分析显示， CagA 通过 Src 和丝裂原活化蛋白激酶激酶（ mitogen-activated protein kinase kinase， MEK） / ERK 信号通路上调 ENO1 的表达。在胰腺癌细胞和胃癌细胞的研究中，研究人员分别发现致癌转录因子 MYB[16] 和 Snail[6] 也具有促进 ENO1 转录的作用。在 U87-MG 细胞中，下调 DHX33 蛋白水平会导致包括 ENO1 在内的多种糖酵解途径中的代谢酶的转录水平下降 [17]。在乳腺癌细胞的研究中，核因子 κB（nuclear factor kappa B， NF-κB） 和 雌 激 素受体（ estrogen receptor， ER）可以在转录水平激活ENO1，并且这一机制与 ENO1 介导的肿瘤细胞耐药性存在一定关联 [18]。此外， Chen 等 [5] 还揭示了WW 域结合蛋白 2（ WW domain-binding protein 2， WBP2）在行使转录调节功能时，可通过上调 ENO1的转录，增强神经胶质瘤细胞的糖酵解活性。综上所述，在癌细胞中， ENO1 作为糖酵解途径中的关键催化酶，其基因的转录可受到多种复杂机制的精细调节，这些调节机制共同作用，促进了癌细胞的增殖、转移等生理活动（见图 2）。2.2  ENO1 的转录后调节基因表达的调控不仅发生在转录水平， mRNA水平同样会受到多种因素的影响。可变剪接是生成成熟 mRNA 过程中极为关键的一环， Gu 等 [19] 运用RNA 免疫沉淀技术发现，永离有丝分裂基因 A 相关激酶 2（ never in mitosis gene A related kinase 2， NEK2）能够与丙酮酸激酶 M 型（pyruvate kinase M， PKM）的前体 mRNA（pre-mRNA）上第 9 个外显子两侧的内含子序列相结合。并且， NEK2 通过与核不均一 RNA（heterogeneous nuclear RNA， hnRNA） 1/2 相互作用，调控多发性骨髓瘤细胞中PKM 未成熟 mRNA 的可变剪接过程，进而影响癌细胞中 PKM2 的水平，最终对糖酵解产生作用。研究还显示，敲低 NEK2 不仅会降低 PKM2/PKM1的比值，还会致使包括 ENO1 在内的多种糖酵解催化酶的 mRNA 水平下降。尽管该研究未深入探究NEK2 对 ENO1 的影响机制，但为后续研究 ENO1 mRNA 的可变剪接提供了思路与指导。随着科研水平的不断提升，科研人员发现，在 mRNA 水平的调节机制中，除可变剪接外，非编码 RNA 也参与其中。 Liu 等 [20] 通过生物信息学分析发现， miR-22-3p 能够结合到 ENO1 的 3' 非翻译 区（ 3' untranslated region， 3'UTR） 上。 此 外， ENO1 的 mRNA 在 359A 位 点 发 生 N 6- 甲 基 腺 苷（ N6-methyladenosine， m6A）甲基化修饰，该修饰能够促进 ENO1 的 mRNA 与 YTH 结构域包含的 N6-甲基腺苷 RNA 结合蛋白 1（YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1， YTHDF1）的结合，进而推动 ENO1 的翻译过程 [21]。2.3 ENO1 蛋白水平的调节在 ENO1 的蛋白水平，同样存在着多种调节机制。 F 框和 WD-40 域蛋白 7（ F-box and WD40 domain protein 7， FBXW7）是一种高度保守的 F-box WD40蛋白，它能够作为 SCF（SKP1/CUL1/F-box） E3 泛素连接酶的底物识别关键成分发挥重要功能 [22]。在结肠癌细胞的研究中发现， ENO1 可作为 FBXW7的特异性底物与之紧密结合，进而促使自身发生泛素化降解过程 [23]。随后， Hu 等 [3] 在深入探究分化 抗 原 47（ cluster of differentiation 47， CD47） 在非免疫机制中的作用时发现， CD47 能够显著提高ENO1 的蛋白稳定性，而其作用机制正是有效阻碍了 FBXW7 与 ENO1 之间的结合。对于像 ENO1 这样具有催化功能的蛋白而言，对其酶活性的精准调节是影响该蛋白功能发挥的关键机制之一。存在一种长链非编码 RNA（ long non-coding RNA， lncRNA），即 lncRNA-TCONS_ 00006195 ( 也被称为 lncRNA-6195)，它能够凭借自身的一段特定核酸序列（101-529），与 ENO1 蛋白上的一段氨基酸序列（ 237-405-aa）发生特异性结合。这种结合方式并不会对 ENO1 的蛋白水平以及亚细胞定位产生影响，但却能够在肝癌细胞中有效抑制ENO1的酶活性，从而对癌细胞的增殖过程产生显著影响 [24]。随着蛋白质组学和生物信息学技术的发展， Yan等 [25] 巧妙地联合运用这 2 种先进方法，对胃癌相关蛋白进行了系统性的深入分析，并有力地证明了胃动蛋白 1（ gastrokine-1， GKN1）能够有效抑制胃癌细胞的生长，并诱导细胞周期发生阻滞。生物信息学分析显示， ENO1 是受 GKN1 调控的 74 个蛋白相互作用网络中的关键重要枢纽。进一步的研究发现， ENO1 的过表达会明显阻断 GKN1 的抑癌作用，这表明 GKN1 很可能通过抑制 ENO1 的功能来实现其抑癌效果。ENO1 除了在胞浆中发挥糖酵解过程中催化酶的关键作用外，还能够在细胞表面行使纤溶酶原受体的功能 [26]。研究表明，当肿瘤细胞暴露于脂多糖（ lipopolysaccharide， LPS）环境中时，会显著增强 ENO1 向细胞表面的转运过程，并且由基质相互作用分子 1（ stromal interaction molecule 1， STIM1）和钙释放激活钙调节蛋白 1（ calcium release-activated calcium modulator 1， ORAI1）介导的 Ca2+ 通道会促进 ENO1 的分泌 [27]。此外，在 DNA 发生损伤后， p53 蛋白能够促进包括 ENO1 在内的多种外泌体的分泌过程，并且 TSAP6 作为 p53 的重要调节基因，能够进一步增强这一促进作用 [28]。2.4 ENO1 的翻译后修饰翻译后修饰能够通过对蛋白的结构、亚细胞定位以及与底物的结合特性等方面进行调节，从而对蛋白的功能产生极为显著的影响。大量研究成果表明， ENO1 存在多种不同形式的翻译后修饰。例如，从蜗牛中提取的凝集素 HPA（ Helix pomatia agglutinin）能够特异性识别并富集 O-连接的 N-乙酰葡糖胺（ O-linked N-acetylglucosamine， O-GlcNAc）修饰的蛋白。研究人员利用 HPA 对人乳腺癌中的蛋白进行富集后，通过质谱鉴定发现了 ENO1 的存在，这一结果提示 ENO1 可能存在 O-GlcNAc 修饰 [29]。在肺腺癌细胞的研究中发现， LPS 能够诱导 ENO1上第 50 位精氨酸（ R50）发生单甲基化修饰，进而促进 ENO1 向细胞膜转移，显著增强癌细胞的侵袭能力。研究同时证实，这一修饰反应由蛋白质精氨酸甲基转移酶 5（ protein arginine methyltransferase 5， PRMT5）催化完成 [30]。笔者课题组的研究则表明， PRMT5 和 PRMT6 作为蛋白质精氨酸甲基转移酶，在卵巢癌和肺癌中能够分别催化 ENO1 发生对称和不对称二甲基化修饰，该修饰通过影响 ENO1 同源二聚体的形成，增强其酶活性 [31-32]。Zhou 等 [33] 从 PDAC 和正常胰管细胞中提取ENO1，并通过质谱分析二者的差异。结果发现ENO1 存在多种翻译后修饰，包括磷酸化、甲基化和乙酰化，且这些修饰在癌细胞中的水平显著高于正常细胞。在结直肠癌的研究中发现，当癌细胞处于氨基酸和生长因子缺乏的环境时， unc-51 样激 酶1和2（unc-51-like kinase 1 and 2， ULK1/2）能够催化包括 ENO1（ Ser115 和 Ser282）在内的多种糖酵解催化酶发生磷酸化修饰。通过下调 ENO1的催化活性，促使更多葡萄糖进入磷酸戊糖途径（ pentose phosphate pathway， PPP），以维持细胞内能量和氧化还原状态的动态平衡 [34]。与之相似， ENO1 及其他几种糖酵解酶还会发生一种无需酶催化的修饰。这种修饰通过下调 ENO1 等酶的活性，使积聚的糖酵解中间产物重新定向至其他生物合成途径。该修饰的供体为 1，3-二磷酸甘油酸酯（ 1，3- diphosphoglycerate， 1， 3-BPG），其通过亲电作用富集在 ENO1 的赖氨酸 343（ K343）位点上，生成 3-磷酸甘油基赖氨酸（ 3-phosphoglyceryl-lysine，pgK） [35]。 Huang 等 [36] 发现，作为赖氨酸 2-羟基异丁酰基转移酶的 EP300，其缺失会降低包括 ENO1在内的糖酵解酶上多个赖氨酸 2-羟基异丁酰化（ Khib）特异性位点的 Khib 水平，通过下调 ENO1等的酶活性，抑制结直肠癌细胞的糖酵解过程。此外，在类风湿性关节炎和阿尔茨海默病患者中的 ENO1上，存在由肽基精氨酸脱亚胺酶（ peptidylarginine deiminase， PAD）催化的瓜氨酸化修饰，这种修饰增强了 ENO1 与纤溶酶原的结合亲和力 [37]。而 ENO1 乙酰化水平的增加，能够增强 ENO1 结合 RNA 的能力，但会抑制其作为糖酵解酶的活性 [38]。在蛋白质知识库（Protein Knowledgebase， UniProtKB）中，也列出了许多已知的 ENO1 蛋白上存在的修饰信息。这些翻译后修饰的发现与研究，为探索 ENO1 在肿瘤治疗中的潜在作用提供了重要指导。然而，仍有诸多机制问题亟待深入研究。例如， O-GlcNAc 修饰对 ENO1 具体有怎样的影响？不同修饰究竟如何抑制或促进 ENO1 的酶活性？以及如何借助这些翻译后修饰对 ENO1 的影响，更好地实现癌症抑制等（见图 3）。3ENO1 在癌症诊断和预后中的作用众多针对癌症临床样本的研究显示，在甲状腺癌、头颈癌、非小细胞肺癌等多种癌症患者的血清中，均可检测到 ENO1 以自身抗体的形式存在 [39-42]。此外，与正常人相比，肺癌患者唾液中 ENO1 呈现高表达状态 [43]。这些临床分析结果充分表明， ENO1具备成为癌症诊断生物标志物的潜力。在淋巴瘤、胶质瘤的研究中，通过蛋白质组学及生化分析手段，同样发现了 ENO1 的过度表达现象 [44-46]。基于质谱的单细胞蛋白质组学研究，进一步证实了 ENO1 与癌症之间的关联。相关研究还表明， ENO1 的高表达与乳腺癌 [47]和结直肠癌 [8] 患者的不良预后密切相关。在胃腺癌患者手术后的血清中，成功筛选出包括 ENO1 在内的多种肿瘤相关抗原（ tumor-associated antigen， TAA）。深入分析发现，体内 TAA 阳性种类达 2 种及以上的患者，预后情况较差 [48]。在肺腺癌临床样本研究中，亦观察到预后不良的癌组织中 ENO1 表达上调，且经确认，上调的 ENO1 蛋白源自肿瘤组织，而非间质或炎症成分 [49]。上述研究结果表明， ENO1可作为评估癌症患者预后情况的生物标志物。鉴于 ENO1 可作为癌症诊断与预后生物标志物的特性， Wang 等 [50] 运用 ENO1 抗体构建了靶向膜蛋白ENO1的超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide， SPIO）纳米粒子。借助纳米粒子的超顺磁性，显著提升了磁共振成像（ magnetic resonance imaging， MRI）对胰腺癌的检测效能。此外， Ho 等 [51]研发了一种电化学夹心免疫传感器，通过物理吸附抗 ENO1 单克隆抗体，并以 ENO1 多克隆二抗标记的纳米颗粒为电化学信号探针，最终凭借获取的电化学信号实现对癌症的诊断。尽管已有大量研究证实 ENO1 可作为癌症诊断与预后的生物标志物，且部分研究已尝试开发新型诊断工具，但为了更有效地利用 ENO1 进行癌症诊断，仍需开展更多研究以提升诊断的准确性、特异性及检测的便捷性。4ENO1 抑制剂 鉴于 ENO1 在促进癌症发展以及肿瘤耐药机制中发挥的显著作用，研发 ENO1 抑制剂或许能为癌症治疗开拓全新的思路与方法。在传统的 ENO1化学抑制剂中，氟化钠在实验条件下能够有效抑制 ENO1 的活性 [52]。此外，还有 2 种化学抑制剂，即D-酒石酸半醛磷酸（D-tartronate semialdehyde phosphate， TSP） 和 3-氨 基 烯 醇丙酮酸磷酸（3- aminoenolpyruvate phosphate， AEP），作为底物类似物，它们可以与 ENO1 特异性结合，进而有效抑制其酶活性 [53]。然而遗憾的是，这几种化学抑制剂均难以应用于临床治疗。另外， Jung 等 [54] 采用小分子筛选技术，成功分离出首个非底物类似物的 ENO1 抑制性小分子，并将其命名为“ENOblock”，同时证实了 ENOblock对 HCT116 细胞具有抑制作用。 Zhang 等[55] 在探究天然产物肉桂醛（cinnamaldehyde， CA）对黑色素瘤的抑制作用时发现， CA 能够与 ENO1 发生共价结合，通过改变 ENO1 的蛋白稳定性来抑制其催化活性。进一步研究显示， CA与达卡巴嗪（ dacarbazine， DTIC）联合使用，可显著增强抗癌效果。 Chen 等 [56]发现一种名为颗粒蛋白 A（ granulin-A， GRNA）的多肽，它能够特异性地与 ENO1 结合，抑制癌细胞的生长与迁移。后续研究还表明， GRNA 与顺铂联合应用，可显著提高肝癌细胞对顺铂的敏感性，这进一步证实了靶向 ENO1 是增强顺铂抗肿瘤活性的有效策略 [57]。尽管这些抑制剂的发现为癌症治疗带来了新的契机，但距离实现临床实际应用仍存在较大差距。这是因为 ENO1 作为糖酵解途径中的关键催化酶，不仅在癌细胞中发挥作用，在正常组织中同样具有一定功能。因此，如何实现对癌细胞中ENO1 的特异性靶向，成为癌症治疗过程中亟待解决的关键问题。此外，由于 ENO1 在癌细胞中的含量显著升高，如何在保证药物有效性的同时，平衡有效用药量与药物副作用，也极有可能成为肿瘤治疗中的一大难点。5ENO1 在肿瘤免疫治疗中的作用 随着对机体免疫系统研究的不断深入，研究人员发现免疫系统能够直接抵御肿瘤的发展，这使得针对肿瘤的免疫疗法备受关注 [58]。在探索肿瘤免疫疗法的进程中，大量研究表明， ENO1 可作为肿瘤免疫治疗的一个关键靶点 [59]。 Ray 等 [60] 在多发性 骨 髓 瘤（ multiple myeloma， MM） 的 研 究 中 发现，抑制 ENO1 能够激活骨髓浆细胞样树突状细胞（ plasmacytoid dendritic cell， pDC），进而增强pDC 诱导的 MM 特异性 CD8+ 细胞毒性 T 淋巴细胞（ cytotoxic T lymphocyte， CTL）和自然杀伤细胞（ natural killer cell， NK cell）的活性，为免疫治疗提供了新的策略。此前有研究报道， pDC-MM 相互作用可上调程序性死亡受体配体 1（ programmed death-ligand 1， PD-L1），而程序性死亡受体（ programmed death-1， PD-1） /PD-L1 信号通路会对肿瘤代谢产生影响。基于此，该研究团队进一步深入探究发现， ENO1 与抗 PD-L1 抗体（ anti-PD-L1 Ab）联合使用，能够更有效地激活 MM 患者的免疫系统。前文已提及， ENO1 在细胞膜上作为纤溶源酶受体时会发生瓜氨酸化， Cook 等 [61] 研究发现，瓜氨酸化的 ENO1 可被 CD4 T 细胞识别，成为免疫攻击的靶标。在小鼠实验中，瓜氨酸化的 ENO1 能够诱导机体产生 T 辅助细胞 1（ type 1 T helper cell， Th1）免疫反应，从而抑制肿瘤的生长和发展。此外，还有研究发现，在胰腺癌患者体内，存在具有抗癌功能的 ENO1 特异性 Th17 细胞 [62]。基于 ENO1在免疫治疗中的重要作用， Cappello 等 [63] 开发了ENO1 的 DNA 疫苗，并开展了一系列深入研究。他们发现，向胰腺癌模型小鼠体内注入 ENO1 疫苗后，可诱导小鼠产生抗体并引发免疫应答，小鼠的存活时间也有所延长。进一步实验表明，接种 ENO1 疫苗后，小鼠体内髓系来源的抑制细胞和调节性 T 细胞的数量减少， Th1 和 Th17 细胞的免疫应答增强。后续研究还发现，抗 ENO1 单克隆抗体（ ENO1mAb）不仅能够抑制癌细胞与内皮细胞的黏附及迁移，还会影响一些促炎因子的分泌 [64]。鉴于 ENO1 疫苗无法完全清除肿瘤， Cappello 等 [65] 提出，将 ENO1 的DNA 疫苗与其他治疗手段联合应用，或许更有利于肿瘤的治疗.6ENO1 在肿瘤耐药中的作用机制 在癌症治疗领域，放化疗是当前常用的治疗手段之一。然而，对于众多癌症类型而言，耐药性成为了治疗过程中难以逾越的阻碍。因此，越来越多的研究聚焦于探究癌症的耐药机制，在此过程中发现 ENO1 在其中扮演着重要角色。 Chen 等 [66] 对多重耐药的小细胞肺癌（small cell lung carcinoma， SCLC） 细 胞（ H69AR） 进 行 分 析 时 发 现， 相 较于药物敏感的 H69 细胞，成纤维细胞生长因子受体样蛋白 1（ fibroblast growth factor receptor-like 1， FGFRL1）在 H69AR 中的表达呈现异常增高的状态。进一步深入研究揭示， FGFRL1 能够通过与 ENO1相结合，激活 PI3K/AKT 信号通路，进而抑制药物诱导的细胞凋亡和周期阻滞。在多种癌细胞的研究中还发现， ENO1 在顺铂耐药机制中也发挥着作用。例如在胃癌的研究中，糖酵解作用的增强会提高胃癌细胞对顺铂的耐药性。同时，在顺铂耐药的胃癌细胞中，存在 miRNA-22表达降低以及 ENO1 表达升高的现象 [67]。进一步研究表明，在顺铂耐药的卵巢癌细胞中， ENO1 下调会使细胞内葡萄糖消耗减少，诱导细胞发生衰老，进而促使癌细胞对顺铂产生耐药性。研究人员通过增加5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil， 5-FU）浓度构建了结直肠癌耐药细胞（ HCT116/5-FU 和 SW620/ 5-FU），在这些耐药细胞中发现 ENO1 表达增加。小鼠异种移植实验也证实，敲除 ENO1 能够有效缓解结直肠癌对 5-FU 的耐药性。对耐药性头颈癌细胞进行质谱分析的结果，同样证实了 ENO1 在肿瘤耐药过程中具有重要作用 [68]。此外， Tu 等 [18] 提供的临床数据显示，在术后接受 4-羟基三苯氧胺（ 4-hydroxytamoxifen， 4-OHT）治疗的雌激素受体阳性（ estrogen receptor-positive， ER+）乳腺癌患者中， ENO1 高表达的肿瘤组织复发风险更高。在乳腺癌细胞中敲低 ENO1 后， 4-OHT对耐药细胞的细胞毒性显著增强。综合这些研究结果可见，在不同类型的癌细胞中， ENO1 可通过不同机制促进癌细胞的耐药性，这进一步凸显了 ENO1 在癌症发生、发展以及耐药过程中的关键地位7总结与展望 综上所述， ENO1 在肿瘤进展过程中发挥着多方面的促进作用，能够加速糖酵解进程，推动癌细胞的增殖、迁移、侵袭，增强癌细胞耐药性，并激活致癌信号通路。同时， ENO1 作为癌症预后评估和诊断的生物标志物具有显著优势。尤为重要的是，在多种癌症类型中， ENO1 的过表达与不良临床结局之间存在较强的相关性，这充分表明 ENO1 在激活致癌信号通路中占据关键地位，是极具潜力的治疗靶点。尽管糖酵解通路为肿瘤靶向治疗提供了理想的作用途径，但该通路广泛存在于所有细胞中，这就导致其面临与其他癌症靶向治疗方法类似的难题 [69]，即如何在有效启动抗肿瘤活性的同时，规避因糖酵解关闭给正常细胞生理功能带来的风险。总体而言，将新型 ENO1 靶向抑制剂与传统化疗手段联合应用，有望为癌症患者带来新的治疗希望，为攻克癌症难题开辟新的道路。参考文献：[1]Shi Y, Liu J, Zhang R, et al. 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