Influenza virus vaccine liposomal (Crucell)

摘要癌症是一种慢性疾病，由于治疗的选择性有限，所以很可能是致命的。传统的癌症治疗方案还存在很多问题，比如血液循环慢及抗癌药物的溶解度差。为了提高抗癌药物的效果并将其运送到靶点，治疗性癌症疫苗应运而生。癌症疫苗被认为是大多数实体瘤的可行性治疗方法。疫苗通过包含的肿瘤抗原，核酸，全细胞和多肽刺激抗肿瘤免疫。设计可以诱导长期抗肿瘤记忆，消瘤，清除微小残留病灶；并预防非特异性或不良反应的癌症疫苗，这些疫苗有助于清除身体各种器官或器官系统的癌细胞，把肿瘤复发或转移的风险降到最低。本文综述了用于抗癌治疗的疫苗和抗原，包括目前的疫苗佐剂和不同类型疫苗的作用机制，如基于DNA或mRNA的癌症疫苗。本文还讨论了这些疫苗的应用潜力及该领域的最新研究成果，重点关注它们是否能获得更好的临床疗效。关键词：癌症，免疫治疗，疫苗，核酸，肽，抗原1.前言虽然对癌症的病因、诊断、新的治疗性生物标志物和靶点已经进行了广泛的研究，但癌症仍与高死亡率和高患病率密切相关。在美国，癌症是第二大死因，在未来几年里，预计死亡人数将超过心脏病。2015年世界卫生组织的数据报告显示全球有760万人死于癌症。因此，必须在寻找可以预防和/或治疗这一全球健康问题的新的治疗方法上进行可靠的投资。癌症疫苗是免疫疗法的一种选择，可以“培养”免疫系统识别和消除癌细胞。Edward Jenner博士于1796年研制出第一种预防天花（痘病）的疫苗。从此多种疫苗对控制甚至消除人类和动物中容易流行和大规模流行的传染病作出了贡献。在动物模型和人类志愿者的异种移植物中已经进行了大量的癌症研究，目的是开发通过刺激免疫系统识别和根除肿瘤来治疗癌症的疫苗。寻找和靶向仅由癌细胞表达的合适的表位或抗原是开发癌症疫苗的关键步骤。然而，事实证明，癌症疫苗的开发更具挑战性，因为有希望的临床前研究结果尚未转化到临床。导致失败的因素有很多，可能是对肿瘤生物学及免疫抑制肿瘤微环境（TME）的了解不足，T细胞的反应较弱，不完善的疫苗配方，佐剂以及合适的目标患者的选择。Sipuleucel-T (Provenge®)是一种由患者自身树突状细胞活化构成的疫苗，用于治疗少数基本无症状的转移性去势抵抗性前列腺癌，是迄今为止FDA批准的仅有的三种癌症治疗疫苗中的第一种。另外两种FDA批准的癌症疫苗是治疗早期膀胱癌的活卡介苗(Bacillus calmette - gusamrin)和治疗黑色素瘤的Talimogene laherparepvec®。另外四种配方被批准用作预防性癌症疫苗，用来预防人类乳头瘤病毒和乙型肝炎病毒，因为两种病毒会分别导致宫颈癌、头颈癌和肝癌。然而，免疫疗法的最新进展表明有望研制出更成功的癌症疫苗。尽管如此，我们需要扩展对肿瘤生物学的理解，特别是其独特的靶点或表位，以及有助于早期诊断、预后或对癌症治疗反应的生物标志物。与传统疫苗靶向的外源性病原体抗原不同，肿瘤抗原由于其内源性而具有较弱的免疫原性。基于高通量测序技术的可及性和可负担性，已经发现了几种肿瘤新抗原(由肿瘤DNA中的某些突变产生的独特抗原)。事实上，基因组学或蛋白质组学等先进的医疗技术已经成为最新突破和开发新型诊断和治疗方案的关键。因此，疫苗和癌症疗法正在迅速发展，并随着技术的发展而变得异常复杂、多面化，并受到这种快速变化的影响，这并不奇怪。由于癌细胞更像正常的健康细胞，开发有效的癌症疫苗仍然难以捉摸，极具挑战性。而且现在已经很清楚，由于每一个肿瘤在某种程度上都是独一无二的，有它自己的新抗原和抗原，我们需要采取更复杂、更个性化和更有针对性的方法。根据制备方法，癌症疫苗可分为核酸疫苗、细胞疫苗、病毒疫苗和肽类疫苗四大类(表1)。RNA和DNA疫苗含有病原体的抗原成分和编码基因，是核酸疫苗的实例。基于细胞的癌症疫苗是利用全细胞作为抗原载体的疫苗。为了治疗和预防某些肿瘤，基于病毒的癌症疫苗主要使用病毒作为载体，例如HPV疫苗(Cervarix®，Gardasil®，Gardasil-9®)。多肽疫苗的免疫原性通常较低，因此必须含有佐剂。癌症DNA疫苗是闭环DNA质粒，编码肿瘤相关抗原（TAAs）或引发肿瘤特异性反应的免疫调节复合物。类似地，体外产生的mRNA疫苗可以编码抗原，内化后表达蛋白质以引发免疫反应。治疗性DNA疫苗被认为是最有希望激活免疫系统对抗癌症的策略。然而，更进一步，个性化的新抗原(或DNA)疫苗可以更成功地对抗癌症。与正常但过度表达的蛋白质相反，肿瘤也表达由突变引起的独特靶标或表位，这些突变通常被指定为新抗原(“新抗原”)，仅由肿瘤细胞表达，甚至可能与仅由极少数患有这种类型肿瘤的患者表达的特异性一样。有了个性化的新抗原疫苗，就有可能在不影响健康细胞的情况下，精确地指导针对患者肿瘤细胞的免疫反应，从而防止有害的副作用。目前正在研究几种类型的新抗原疫苗用于几种癌症类型，包括单独使用和与其他治疗方法联合使用。癌症疫苗与不同免疫疗法或常规治疗相结合已被证明是对抗肿瘤耐药和提高临床结果的成功策略。肿瘤生物学、免疫学机制和许多创新医学和纳米技术的不断研究极大地促进了癌症疫苗的研究。在选择疫苗接种平台时，应考虑多种因素，例如，选择合适的肿瘤抗原刺激有效的T细胞，最大化树突状细胞(DCs)上的抗原浓度，细胞形态，肿瘤大小，以及制备个性化疫苗所需的时间和资源。核酸疫苗将是治疗各种转移性疾病最省时的选择。同时，在疫苗开发过程中也可以采用联合治疗，以防止疾病进一步恶化，并创造一个有助于免疫系统更有效反应的环境。本文系统地介绍了用于抗癌治疗的各种类型的疫苗和抗原的最新进展，癌症疫苗的机制，新出现的癌症疫苗佐剂和作为癌症佐剂的纳米载体系统。表1. 癌症疫苗的常见种类2. 目前癌症治疗的疫苗与抗原研制疫苗是为了产生针对特定疾病或感染的特定免疫力。癌症免疫治疗的目的是激活免疫系统，使其能够识别和消除癌细胞。抗癌免疫疗法根据其（重新）激活宿主免疫系统对抗恶性细胞的能力分为“被动”和“主动”两类。肿瘤靶向单克隆抗体（mAbs）和过继性转移T细胞（以及其他方法）被认为是被动形式的免疫治疗，因为它们具有内在的抗癌活性。抗原特异性是免疫治疗抗癌方案的另一种分类。虽然肿瘤靶向单克隆抗体被广泛认为是抗原特异性干预措施，但免疫刺激细胞因子或检查点阻断剂激活的抗癌免疫反应通常情况下没有明确的特异性。常用的疫苗和抗原见表2。表2. 目前的治疗方法使用的癌症疫苗和抗原2.1. 治疗性疫苗的抗肿瘤反应虽然许多原发肿瘤可以手术切除，而且肿瘤在转移部位复发前通常需要很长一段时间，但癌症疫苗已被提议作为一种治疗方法，以引起和/或增强最小残留疾病患者的抗肿瘤免疫，从而预防或延迟复发。很少有疫苗在这种理想的临床环境中进行评估。到目前为止，大多数I期和II期研究都是在标准治疗失败后肿瘤负担相对较大的晚期疾病中进行的。即使在最好的情况下，免疫系统克服肿瘤诱导、治疗诱导或年龄诱导的免疫抑制的能力对治疗性疫苗的成功至关重要。影响治疗性疫苗有效性的另一个因素是肿瘤细胞的生长，肿瘤细胞可用各种方式逃避免疫应答（图1）。黑色素瘤疫苗的开发已经取得了所有治疗性疫苗的努力中最多的临床结果，它开始将同种异体肿瘤细胞系的细胞裂解物与佐剂或与脱落到此类细胞系中的蛋白产物联合应用。这些研究包括数百名晚期III期或IV期黑色素瘤患者，其中许多人患有转移性疾病，化疗失败。以其中一种疫苗Melacine为例，在IV期患者中进行的I期和II期试验显示出了1020%的应答率（清除了一些转移部位）和另外1020%的疾病稳定（肿瘤在不同时期没有进展）。在一项多中心III期研究中，将美拉辛与四药化疗方案进行了比较，两种方案的有效率和生存率相同。与化疗相比，褪黑素的优势在于它无毒，可以提高生活质量。因此，美拉辛现在在加拿大是处方药，也在等待美国批准。一种类似的疫苗制剂canaxin在1000名IV期黑色素瘤患者中进行了测试，并与同等数量的接受手术和化疗但在同一时期未接受疫苗接种的患者进行了比较，在这项单机构研究中，接种疫苗组的总生存率虽小，但在统计学上有显著提高，目前针对该疫苗正在进行一项多中心III期随机试验。图1. 通过治疗性疫苗接种操纵抗肿瘤免疫反应。(a)治疗性疫苗是在肿瘤被诊断出来之后，在肿瘤和免疫系统相互作用的时候进行接种（c）。治疗性疫苗增强免疫力预防微小残留疾病，并防止肿瘤转移（b, c）。一个基于自体肿瘤的疫苗在免疫刺激制剂中施用可以激活朗格汉斯细胞——位于表皮的树突状细胞(DCs)。活化的朗格汉斯细胞加工处理肿瘤抗原并运输到引流淋巴结，将抗原呈递给T细胞。B细胞也被激活，预期结果是克隆肿瘤特异性T细胞的扩增和肿瘤特异性抗体的产生。(b)肿瘤特异性T细胞迁移到肿瘤转移部位，在那里它们试图杀死表达疫苗中包含的抗原的肿瘤细胞。(c)继续生长的转移瘤由肿瘤细胞缺乏T细胞和抗体识别的抗原，或者对其免疫破坏有抵抗力。基于DC的疫苗是癌症疫苗开发的最新进展，自体或异体肿瘤、凋亡小体、肿瘤裂解物、肿瘤RNA和肿瘤DNA都可以装载到DC细胞中。大多数这些制剂已在动物模型中显示出免疫原性和肿瘤排斥的潜力，目前正在进行临床评估。最近发表了一项由载有编码前列腺特异性抗原（PSA）的信使RNA的DC细胞组成的疫苗的I期研究结果，对PSA表达水平升高的前列腺癌患者接种疫苗后，大多数患者可诱导T细胞对PSA产生应答，且PSA的对数斜率暂时降低，可能表明肿瘤生长有所减缓。2.2. 预防性疫苗的抗肿瘤反应许多限制癌症疫苗治疗效果的潜在无法克服的问题不需要在预防癌症的背景下加以解决。经过训练以识别肿瘤抗原的免疫系统被预测在肿瘤临床可见、异质性和能够抑制和逃避免疫反应之前就会破坏肿瘤(图2)。预防性癌症疫苗旨在诱导适应性初次免疫反应，在发生癌变时实现快速而强大的再次免疫反应。这种方法的第一个例子是乙型肝炎病毒（HBV）疫苗，这种病毒可导致肝硬化、肝癌和慢性肝炎。根据对台湾儿童的早期研究，HBV疫苗接种计划使肝癌的风险降低了70%。人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗也紧随其后。HPV是一种致癌的性传播病毒家族，可引起各种肿瘤疾病，从良性病变到转移性癌。此外，预批准试验显示疫苗接种效力非常高（接近100%）。这些预防性疫苗的工作原理是通过一种被称为对改变的自身抗原的特异性免疫的过程，引发对发生恶性转化的细胞的免疫反应。当接种的疫苗中存在微生物和其他外来物质时，它会通过显示损伤相关分子模式（DAMPs）向宿主免疫系统发出警报，从而驱动APC等先天免疫细胞释放激活T细胞所需的细胞因子。预防性疫苗可以刺激记忆性T细胞和B细胞发育，这是防止后续攻击或抗原暴露所必需的。当再次暴露时，由于这些记忆细胞的增殖，反应会更加明显和迅速。然而，许多预防性疫苗需要不必要地暴露于癌症抗原，这些疫苗的设计必须确保抗原不会增加癌症风险。此外，这可能使一般人群难以在医疗环境中成功地接受和使用预防性癌症疫苗。此外，还存在对脱靶效应和任何疫苗接种成分毒性的安全担忧。另外适应性免疫对疫苗的有效性至关重要，所以预防性癌症疫苗面临的另一个挑战是老年人免疫系统的退化问题。因此，这些问题必须得到解决才能开发成功的预防性疫苗。近年来，对人体自发识别和消除癌前细胞和癌细胞的机制和生理过程以及对某些治疗干预的反应有了新的见解。此外，纯的、转基因的或合成标记物已用于基于肽的抗肿瘤疫苗中，仅针对一组特定的肿瘤相关抗原（TAAs）进行免疫，进而触发针对这些标记物的免疫或炎症反应。近年来，多种方法被用于发现有效的抗肿瘤免疫疗法，包括免疫调节单克隆抗体（mAbs），疫苗佐剂及基于仿生配方的精准递送，其中免疫调节单克隆抗体可以攻击CD4+和CD8+ T细胞蛋白受体细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（CTLA-4，也称为CD152）和跨膜配体/受体轴PD-1/PD-L1（程序性细胞死亡蛋白1（或CD279）/程序性细胞死亡配体1）。此外，许多这些免疫制剂还激活免疫效应细胞表面的共刺激受体，并中和TME产生的物质，如转化生长因子β1。在包括免疫疗法如免疫刺激细胞损伤（ICD）致病因子的癌症治疗中，已知免疫刺激细胞因子可以激活癌症患者的免疫系统，这是一种重要的治疗方式。在此背景下，干扰素α （IFNα）被批准用于完全切除的高危黑色素瘤患者和几种难治性恶性肿瘤的辅助治疗，高剂量白细胞介素-2（HDIL-2）被批准用于治疗转移性肾细胞癌和黑色素瘤。表3列出了一些已上市的癌症免疫疗法。与抗体偶联的主要组织相容性复合体（MHC）成分通过APC细胞大量表达，并具有摄取和处理抗原的能力。先天防御细胞像寡树突胶质细胞（DCs），最早由Ralph Steinman于1973年发现并描述，由于其独特的特性和功能，DCs是迄今为止最重要的APC，连接先天免疫和适应性免疫，激活机体免疫反应。不同的DC亚群在发育过程和提呈功能上存在明显差异。图2.预防性疫苗的作用机制预测(a)使用预防性疫苗接种调控抗肿瘤免疫反应。存在高风险的患肿瘤或已确诊有癌前病变的个人需要在肿瘤发生之前接种预防性疫苗。一种基于预期在肿瘤细胞表面表达的抗原制备的疫苗在制备可以激活朗格汉斯细胞-表皮树突状细胞(DCs)的免疫刺激剂(和佐剂)中施用。激活朗格汉斯细胞运输肿瘤抗原到引流淋巴结，在那里它们将抗原呈递给T细胞。B细胞是也被激活，预期结果是肿瘤特异性T细胞和抗体克隆扩增生产。这种效应细胞克隆扩增后会产生一个长期的特异的针对肿瘤抗原的记忆细胞库。(b)如果将来肿瘤生长，肿瘤抗原到达引流淋巴结会重新激活肿瘤特异性记忆细胞并触发快速的再次免疫反应。这种反应包括产生大量的效应T细胞，高滴度的抗体以及肿瘤部位的DCs的持续活化，使肿瘤抗原得以持续加工提呈，进一步扩大免疫反应。(c)因为早期肿瘤还没有长得很大和异质化，所以很容易被已有的免疫反应清除掉。而且，这种肿瘤介导的刺激还会扩大免疫记忆能力。表3. 目前市场上的癌症免疫疗法注：其中一种形式用于癌症患者，由美国食品和药物管理局或同等监管机构批准全球机构。3. 癌症疫苗的作用机制对于治疗性癌症疫苗，其先决条件是引发强烈的免疫反应，准确识别并清除肿瘤细胞（原发性和继发性），具有抗原特异性，全身副作用最小，不产生自身免疫反应。另一个考虑因素是疫苗必须诱导强大的免疫回忆应答来对抗癌细胞，这对于实现疾病的永久解决至关重要。实际上，癌症高死亡率的主要原因是复发，而不是原发肿瘤。基于免疫疗法的癌症疫苗的目的是激活内源性细胞或体液免疫系统来对抗癌症。大多数情况下，癌症疫苗诱导能特异性识别并杀死癌细胞的癌症特异性CD8+ T细胞的产生。肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）通过与它们的T细胞受体（TCR）结合并识别肿瘤抗原表位。此外，CTLs通过多种TCR信号通路，如脱颗粒（穿孔素/丝氨酸蛋白酶的释放），或通过分化配体簇（CD95L）或TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）的上调，诱导癌细胞凋亡。为了有效使用CTLs，它们需要通过肿瘤树突状细胞（DCs）进行驯化。1型常规CD103+迁移DCs是抗原提呈细胞，通过三种不同的机制在癌细胞检测前阐明CTLs：肿瘤抗原粘附于MHC-I、共刺激分子（CD80/86和CD28/152）和促炎细胞因子（IL-12和TNF-α）。CTLs和CD4C Th细胞在激活后会产生某些特性，这些特性极大地影响了随后CTL细胞毒性反应的效率。此外，细胞因子介导的DC许可激活并辅助CD4+ Th细胞。与CD8+ T细胞类似，APCs也能激活CD4+T细胞，不同之处在于肿瘤抗原表位与MHC-II结合而不是MHC-I。CTLs和CD4C Th细胞在激活后会产生某些特性，这些特性极大地影响了随后CTL细胞毒性反应的效率。CTL表型通常由细胞因子混合物定义，细胞因子混合物通过细胞毒性机制释放，促进细胞死亡。许多研究表明，CTL介导的IFN- γ和TNF-α的产生与良好的肿瘤减少潜力和提高患者耐受力相对应。其他研究表明，当CD4C Th细胞分化为Th1表型（以产生IFN- γ、TNF-α和IL-2为特征）时，患者的耐受力得到改善。尽管争议更大，已经证明， Th1效应与Th17偏好（因能产生IL-17而命名）相结合可能更有优势。由于每个T细胞都有一个独特的TCR，只能识别一个抗原表位，因此产生抗肿瘤T细胞水平（许多T细胞克隆）的广泛测量的免疫反应更强。对免疫的最佳免疫反应可能因恶性肿瘤的不同而有差异。癌症疫苗接种也可以通过抗体介导的细胞毒性途径来抑制癌症的发展（图3）。抗体介导的细胞毒性和抗体介导的吞噬作用可用于杀死与抗体结合的癌细胞。基于体液免疫疗法的癌症疫苗，旨在激发患者体内的抗癌抗体，主要用于被动免疫治疗。一旦抗体识别癌细胞表面的表位，负责先天免疫的免疫细胞（自然杀伤巨噬细胞和中性粒细胞）可以识别附着的抗体Fc受体并驱动细胞裂解或吞噬。最后，协同激活其他先天免疫系统（如T细胞）可以帮助增强癌症疫苗要激活的适应性免疫反应。先天淋巴样细胞(ILCs)（如NK细胞或不变NKT细胞(iNKT)），在癌细胞控制方面发挥与CTL互补的作用。为了避免T细胞识别，癌细胞会下调MHC-I或过刺激NK细胞激活受体（如NKG2D, 4-1BB），但可以被具有细胞毒性的NK细胞裂解。iNKT细胞被激活后，会在周围环境中分泌分化Th1或Th2的细胞因子，增强CD40L的表达。iNKT细胞在影响适应性免疫反应中的重要性已被证明，它们具有积极促进DC细胞和B细胞成熟的能力，并间接增强T细胞反应。尽管如此，癌症疫苗因为不携带表位常常难以靶向NK或iNKT细胞。图3. 癌症疫苗的作用机制4. 癌症疫苗佐剂佐剂能增强或改变疫苗的免疫反应。当免疫佐剂与特定疫苗抗原一起使用时，可加速、延长或增强抗原特异性免疫反应。疫苗接种时，单独的抗原是弱免疫原，在没有佐剂的情况下，未成熟DCs提呈的抗原不能引起强烈的免疫反应。佐剂必须诱导免疫细胞到达注射部位，促进细胞介导的抗原运输，并激活APCs。常用的水和油乳液佐剂包括montanide ISA-720和montanide ISA-51等。Montanide ISA-720是一种70:30的油水混合物，包括非矿物植物油和表面活性剂甘露醇单油酸酯。Montanide ISA-51是单油酸表面活性剂和矿物植物油的混合物，水油比例为50:50。这些佐剂通过在注射部位形成一个储存系统来捕获可溶性抗原并限制其快速运送到淋巴结。针对艾滋病、疟疾和其他疾病，已经开展了300多项含有佐剂的癌症疫苗临床试验。现代疫苗中使用的佐剂旨在通过精确靶向免疫系统的特定成分来提高免疫力。更多的现代佐剂，如病原体相关分子模式分子(PAMPs)，呈现出一种威胁信号，模式识别受体(PRRs)可以通过激活免疫系统来破译它们并做出反应。先天免疫细胞表面表达许多受体，如TLRs、核苷酸结合寡聚化结构域受体和甘露糖受体。TLR激动剂启动免疫刺激并提高疫苗接种效果。使用淋巴系统靶向TLR激动剂的研究明确显示，免疫过程中必须提供足够的炎症信号，将CD8+ T细胞反应与TLR激动剂在引流淋巴结中的累积联系起来。目前正在研究大量TLR激动剂作为潜在的癌症疫苗佐剂。最常用的TLR激动剂包括聚肌酸-多胞酸与聚赖氨酸、羧甲基纤维素、单磷酸脂质A、鞭毛蛋白、咪喹莫特和CPG-ODN。5.新出现的疫苗佐剂近年来，许多新型佐剂被发现并用于癌症疫苗。为了应用于临床，新型佐剂必须克服不利的药效学和副作用等困难。其他佐剂（如CD40激动剂，可以将抗原引导到DCs早期内体并促进交叉呈递）也正在研究中，以提高癌症疫苗接种的有效性。虽然CD40激动剂抗体还未作为疫苗辅助物进行测试，但它们已作为单药进行了测试。几例临床前小鼠试验表明，CD40激动剂和TLR激动剂联合使用可以作为一种免疫策略。然而，他们是否能成功地从临床前转化到临床目前还不确定。另一类潜在的癌症疫苗佐剂是干扰素基因蛋白刺激剂(stimulator of interferon genes protein，STING)。STING是一种镶嵌在内质网的跨膜蛋白，在细胞DNA的反应下激活I型IFN。天然和合成的环二磷酸鸟苷和二核苷酸衍生物是主要的STING激动剂，已在小鼠中显示出抗肿瘤活性。STING激活可诱导T细胞凋亡，因为T细胞的STING表达水平最高，而巨噬细胞和DCs并未显示这些结果。为了用于癌症疫苗，STING激动剂需要作为佐剂或与仅针对小鼠模型中的骨髓瘤细胞的递送系统一起补充使用，以防止T细胞死亡。为了避免STING激动剂可能引起的全身毒性，推荐在肿瘤部位给药。此外，STING激动剂与小鼠和人类细胞的结合方式存在差异，这也阻碍了这些化合物的临床前试验。STING激动剂在癌症免疫治疗中的应用可能因其可能的毒性和缺乏精确靶向性而受到限制。许多细胞因子已被证明可作为佐剂。虽然对免疫刺激细胞因子包括IL-2、IL-12、IFN和GM-CSF的研究都有进行，但当前研究主要集中在它们在细胞免疫治疗和疫苗中的应用。许多癌症疫苗接种试验都包括了研究最多的免疫刺激因子GM-CSF。在临床前试验中，GM-CSF似乎是一个非常有吸引力的选择，因为它可以将DCs吸引到注射部位，促进DCs成熟，并促进抗原呈递，所有这些都可以增强癌症特异性免疫反应。GM-CSF在临床研究中的效果不佳，只有少数研究显示出临床效益。大多数试验产生了不同的结果。临床前研究表明GM-CSF能辅助MDSCs增殖，抑制抗肿瘤反应。在临床试验中，低剂量的GM-CSF也能促进CD14+和低HLA-DR-骨髓细胞增殖。在另一项试验中，GM-CSF与不完全弗氏佐剂联合诱导了弱的T细胞反应。尽管如此，一些治疗试验使用了GM-CSF作为佐剂。无机纳米材料作为免疫刺激剂可以激活免疫细胞并促使其发育成熟。纳米材料的组成、大小、形状和电荷会影响佐剂的功效。Wang等人发现带有纳米刺突的TiO2纳米颗粒可以刺激先天免疫。刺突颗粒在被APCs吞噬过程中破坏细胞膜，激活炎性体和先天免疫。刺突TiO2纳米颗粒与卵清蛋白(OVA)偶联可加强癌症免疫治疗的适应性免疫。阿魏木糖醇是美国食品和药物管理局(FDA)批准的一种铁补充剂，可以抑制乳腺癌的生长和肺癌的转移。Jiang和他的同事们还发现锰是潜在的STING通路调节剂。锰是哺乳动物组织中最常见的金属之一，调节多种功能，如抗氧化耐受性、脑功能和免疫活性。Mn2+提高了环GMP-AMP合成酶和STING的敏感性，从而提醒免疫细胞预防感染。基于这些结果，Zhang等人开发了一种基于锰果冻的胶体佐剂(MJ)，它对体液和细胞免疫具有很强的佐剂活性，且无明显的不良反应。在许多抗原模型中的结果表明这种胶体佐剂提高了APCs上的抗原展示并诱导细胞毒性T细胞反应。进一步的研究也证实了MJ佐剂通过激活NLRP3和STING发挥作用。接种了MJ-OVA的小鼠产生了更多的OVA特异性抗体，并激活了CD8+ T细胞，这表明MJ佐剂可以用于癌症免疫治疗。甲羟戊酸途径(MVA)导致高胆固醇血症和骨骼问题，用他汀类药物和双膦酸盐药物阻断MVA通路可引起抗体反应，表明其在免疫治疗中可能具有广泛的药物效能。Xia等人发现在动物模型中，他汀类药物和双膦酸盐化合物的亲脂性药物方案与参与MVA途径的三种主要酶相互作用，这些酶被发现是有效的佐剂。研究人员还研究了各种聚合物的免疫刺激特性，高和同事们制备了用于癌症诊断和定制治疗的纳米复合材料。基于质子海绵方法，他们构建了一系列pH敏感聚合物(4.0-7.4)。ONM-100是一种pH敏感的聚合物纳米颗粒，已获得OncoNano Medicine的许可，目前正作为外科显像剂处于临床试验I期研究阶段。经过修饰的纳米颗粒系统PC7A诱导了强大的CTL反应来消除癌症。PC7A纳米颗粒由于其环7元侧链环而触发STING并增强免疫反应。这种疫苗制剂提高了胞质生物利用度和交叉呈递，提高了CD8+ T细胞的活性。6. 纳米载体系统作为癌症佐剂脂质体是第一个商业可用的用于抗原给药的颗粒药物递送技术。安全性和适应性是脂质体疫苗临床转化和研究成功的关键。脂质体药物(如DoxiI®和AmBisome®)以及疫苗制剂(如Epaxal®和Inflexal®)证明了脂质体的安全性和耐受性脂质体是第一个商业上可用的用于抗原给药的颗粒药物递送技术。安全性和适应性是脂质体疫苗临床转化和研究成功的关键。脂质体药物(如DoxiI®和AmBisome®)以及疫苗制剂(如Epaxal®和Inflexal®)证明了脂质体的安全性和耐受性。Eiji等人制备了表面工程的、pH敏感的卵磷脂/蛋黄卵磷脂脂质体以及线性和超支化聚甘油衍生物。这些表面工程脂质体可以很容易地将荧光标记的抗原转移到DC细胞质中，促进DC成熟，并通过MHC-I进行抗原呈递，减少肿瘤负荷。在神经母细胞瘤动物模型中，通过脂质体给药CpG ODNs可引起显著的抗肿瘤作用，而单独给药CpG无效。当脂质体用于向小鼠递送DNA或RNA复合物时，脂质体增加了APC的吸收和刺激，从而产生抗癌效果。最近，一种新的脂质复合载体通过整合多价阳离子脂质和免疫佐剂α-半乳糖神经酰胺来靶向树突状细胞(DCs)，用于mRNA的递送。病毒体是另一种类型的脂质体，是球形结构，来自病毒包膜的磷脂和病毒刺突蛋白被整合在其中。尽管它们早在1975年就被发现，但首个人类病毒体疫苗——流感疫苗Inflexal V直到2009年才问世。为了预防16型和18型人乳头瘤病毒(CervarixTM和Gardasil®)引起的恶性肿瘤，目前市场上有基于病毒粒子的疫苗接种。病毒体能够将肿瘤抗原靶向运输到APC，并在不增殖或不具有传染性的情况下引发免疫反应，这使它们成为癌症疫苗的普遍选择。结果，就像在转移性乳腺癌患者的I期临床试验中所见的那样，病毒体增强了抗体和T细胞反应。在外部磁场作用下嵌入HA病毒体的电磁物质被认为是脑肿瘤靶向治疗的突破性支架。ISCOMs最早由Morein于1982年发明，主要含有从Quillaia saponaria Molina树树皮中提取的Quil A皂苷佐剂，以及胆固醇和磷脂。在ISCOMs中，胆固醇和皂苷牢固地相互作用，形成40纳米大小的复杂笼状结构，其中蛋白质和佐剂纠缠在一起。这种笼状结构提供了稳定性并降低了皂苷潜在的溶血活性。Pabreja等人制备了一种装载抗原85的ISCOM型结核疫苗。免疫研究结果显示，用ISCOMs免疫的BALB/c小鼠IgG1水平较高，在肺免疫后体液和细胞免疫反应的发生中具有重要意义。Cibulski和他的同事们用皂素制备ISCOMs。他们探索了从巴西龙葵中提取的皂苷与OVA抗原、磷脂和胆固醇配制的ISCOMs的免疫潜力。免疫学研究结果表明，这些制剂在皮下给药后可引起强大的体液反应(IgG1和IgG2)和肿瘤反应(T细胞增殖和Th1细胞因子)。经鼻给药可诱导血清IgG、IgG1和黏膜IgA产生。在疫苗配方中使用ISCOMs的唯一问题是它们的毒性，它会进一步诱导溶血。另一种疫苗佐剂载体系统是具有可生物降解特性的脂质纳米颗粒(LNPs)。Xu等人制备了用于黑色素瘤治疗的Trp2肽疫苗递送系统的磷酸钙LNPs。在肽的N端加入磷酸丝氨酸残基增加了磷酸钙共沉淀。甘露糖修饰LNPs包封CpG ODN。在B16F10皮下和肺转移模型中，接种LNPs诱导了显著的CTL免疫反应，抑制了肿瘤的生长。聚合NP (PNP)佐剂可以保护/稳定疫苗抗原直到它们到达目标位置。PNP可以由多种聚合物制成，包括FDA批准的聚合物如PLGA、PLA、PACA、聚酸酐和壳聚糖，用于持续给药。Liu等人证明了MUC4β和酸酐单体8-二(对羧基苯氧基)-3,6-二氧杂辛烷(CPTEG)和1,3-二(对羧基苯氧基)己烷(CPH)纳米疫苗以20：80的比例的抗原稳定性、免疫原性和释放动力学。体外研究表明MUC4蛋白持续释放，无蛋白降解或表位丢失。MUC4和CTPEG (20):CPH(80)纳米颗粒的协同作用激发了MUC4特异性IgG免疫应答。无机颗粒用于将肿瘤相关抗原靶向实体瘤。金纳米颗粒(GNPs)是安全且惰性的，并且尺寸和形状调节非常方便。由于易于合成和尺寸可调，Kang评估了尺寸为10、22和33 nm的携带OVA的GNPs对引流淋巴结(LNs)和CD8+T细胞免疫反应的影响。结果显示，22 nm和33 nm的OVA-GNPs对LNs的递送和CD8+T细胞反应的诱导更高。Zhang等人使用无溶剂技术用阴离子聚I:C和抗原肽制备了多层聚电解GNPs，通过这种技术，组分自组装形成多层，进一步诱导更多的抗原特异性CD8+T细胞增殖。铝基佐剂被广泛使用，并已被FDA批准用于人体。在水溶液中，传统的氢氧化铝会分解成1-20nm大小的颗粒，对免疫反应的增强作用微弱。Li和他的同事在他们的研究中合成了装载OVA和炭疽芽孢杆菌保护抗原的氢氧化铝NPs (112 nm)。结果表明，与微颗粒相比，这些NPs在注射部位诱导更强的免疫反应和更少的炎症。这是一种有效且更安全的佐剂疫苗递送替代方法。其他类型的无机NPs，如Fe、ZnO、SiO2和TiO2，是很有前途的抗原/佐剂递送载体。与无机NPs相关的根本问题是它们可能沉积在各种组织和器官中并引发长期毒性。7. 基于肽的癌症疫苗使用单一药物或蛋白质、热休克蛋白(HSPs)、抗独特型抗体、融合蛋白、肽和激动剂的组合来刺激特定的抗癌免疫反应已经被广泛研究。此外，利用合成肽疫苗接种技术，可以创建基于特定肿瘤特异性抗原的定制个性化疫苗。通常，这些癌症疫苗由20-30个氨基酸组成，这些氨基酸具有来自抗原的特定表位，预计会引发有效的免疫反应。与灭活的癌细胞疫苗相比，基于肽的疫苗(表4)诱导更特异的免疫反应，靶向重要的中和表位。这种疫苗的免疫优点被称为优势免疫。一般来说，基于肽的癌症疫苗需要CD8+和CD4+ T细胞表位(图4)。CD8+ T细胞表位通过抗原交叉呈递技术激活CTL，而CD4+ T细胞刺激辅助性T细胞维持CTL活性。然而，这些疫苗只能激活部分CD4+和CD8+T亚群。肽链的长度对基于肽的癌症疫苗的有效性有显著影响。化学合成的含有8到12个氨基酸的短肽在体内的半衰期很短，在血液中会迅速分解。这些疫苗通常与有核细胞的人白细胞抗原-1 (HLA-1)相互结合，而不影响APCs。由于它们的小尺寸，这些肽不具有一般人群具有显著水平的HLA多态性所需的多样性，因此已经发现它们仅仅是HLA型特异性的。然而，如果没有CD4+辅助性T细胞的同时激活，这可能导致CD8+ T细胞的耐受或瞬时诱导和CTLs的瞬时激活。肽疫苗中使用较长的肽，通常为20个氨基酸，这些疫苗更可能具有较长的CD4+ T细胞表位和较短的CD8+ T细胞表位，因此往往会触发CD4+和CD8+ T细胞活化。由于这些疫苗在与MHC结合之前被APC摄取并处理，因此它们比短肽具有更强的免疫效果、长效性和稳定性。因此，B淋巴细胞产生的抗体对肿瘤治疗非常有效而且更持久。在临床试验中，基于肽的疫苗通常具有针对各种靶点的多个表位，如NCT02362451和NCT02362464，而体外研究则相反，体外研究通常侧重于单个表位，并已显示出更有效的效果，因为这些表位耐受性良好，并且对各种癌症具有各种临床益处。因此，由几种多肽产生的肽疫苗提供了一种良好的抗癌治疗系统。2015年，Derouazi制备了一类独特的基于重组蛋白的癌症疫苗，将重组蛋白与Z12结合，Z12可以提供多种由MHC I类和II类等位基因表达的CD8+和CD4+T细胞表位。它有助于将蛋白质装载到树突状细胞的抗原处理系统中，并在侵袭性脑癌的原位模型中证明了可以延长寿命。Onodi等人创建并研究了针对存活TAA的长合成肽癌症疫苗(SVX疫苗)。它有三种不同的肽，代表CD4+和CD8+T细胞上结合HLA-1和HLA-2成分的表位。在移植结直肠癌和B淋巴瘤的小鼠中，这种疫苗显示出肿瘤生长减少，这种效果与存活的特异性T细胞反应的出现有关。个性化新抗原疫苗是一种新型的基于肽的癌症疫苗，已被证明是安全、有效的，并且能够诱导强大的T细胞反应。这种疫苗用于APC，目的是通过将T淋巴细胞暴露于肿瘤特异性新抗原，刺激个体免疫系统识别和根除癌细胞。当具有肿瘤抗原特异性的T细胞被纳入肿瘤微环境(TME)时，冷肿瘤可以变成“热”癌症，从而产生更大的抗癌反应。一项针对20例晚期胰腺癌低肿瘤突变负荷(TMB)患者的I期试验表明iNeo-Vac-P01疫苗可提高胰腺癌目前较低的临床疗效。这种定制疫苗已经证明抗原特异性TCR克隆、CD4+或CD8+效应记忆T细胞和更高的外周IFN-γ滴度水平D的显著提高，表明这种定制疫苗有可能激活T细胞并引导它们靶向恶性细胞。基于肽的疫苗有几个好处，但在开发它们时也有很多障碍需要考虑。新抗原的基因组变化，如缺失和突变，可能在多种肿瘤类型中引发内源性T细胞免疫反应，即使某些严重的副作用可能与高亲和力T细胞受体肿瘤的遗传异常有关。理想的TAA还应该在各种肿瘤类型中广泛表达，并在肿瘤发生过程或癌细胞存活中发挥关键作用，以最大限度地减少肿瘤细胞突变或抗原丢失导致的免疫逃逸。因此，存在两种广泛使用的技术来发现新的TAAs：直接免疫学，从患者来源的自体肿瘤特异性CTL克隆开始，挖掘特异的未知的表位；反向免疫学，从预测表位开始。尽管辅助性T细胞识别MHC-II分子的肽可能会增加疗效，但由于MHC-II限制性肽比MHC-I更复杂，因此预测MHC-II限制性肽的免疫原性极具挑战性。目前经常使用生物信息学工具和算法预测程序来定义可以结合MHC-I或MHC-II分子的肽。此外，通过质谱分析可以发现与细胞表面MHC分子结合的肽。通过结合基因表达数据、表位预测算法和质谱分析的信息，可以选择最适合用于疫苗的候选肽。佐剂在提高肽类肿瘤疫苗疗效中的作用单独使用肽疫苗不能充分刺激体内的免疫反应。因此，需要强效免疫刺激剂或强效佐剂来递送基于肽的癌症疫苗。佐剂和抗原必须同时使用，以有效刺激免疫系统，同时防止自身免疫或毒性。佐剂和抗原可以通过之前提到的递送技术递送，或者它们可以组合以改善靶向性。PAMPs和促炎细胞因子目前被用作佐剂来传播危险信号，模式识别受体(PRRs)将识别并通过诱导免疫反应做出反应。TLR激动剂是一种强效佐剂，可以模拟微生物刺激，并已被证明可以增强表位诱导的CTL记忆激活和恶性肿瘤的疫苗接种效果。此外，基于多肽的癌症疫苗已经与作为佐剂的Montanide ISA™51 VG (ISA 51)联合使用。研究表明，Montanide ISA™51在接受癌蛋白E6和E7衍生的长肽疫苗接种的个体中诱导CD4+和CD8+T细胞反应。通过提高APCs通过MHC-I在其表面呈递肿瘤抗原肽供CD8+ T细胞识别的能力，热休克蛋白(HSP)融合到癌症疫苗中可以增强抗肿瘤免疫反应。STING蛋白激动剂是一种跨膜蛋白，可激发有效的I型IFN反应，属于另一类新型佐剂。根据Rossi等人的研究，基于肽的癌症疫苗与STING治疗相结合，增强了免疫的治疗效果，使小鼠B16-OVA和TC-1肿瘤的控制时间延长，生长速度减慢。临床试验表明，包括白细胞介素-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IFN-γ在内的细胞因子有可能作为癌症疫苗的佐剂。GM-CSF已在临床试验（NCT00841399、NCT03579654和NCT00028496）中作为疫苗佐剂用于前列腺癌、腺癌、乳腺癌和肺癌的抗肿瘤免疫治疗。表4. 检查TAAs或多肽治疗癌症患者疗效的研究性试验图4. 通过由先天免疫系统调节的抗原呈递CD4+和CD8+表位，抑制肿瘤组织的增殖的表征 (biorender.com)8. 基于病毒的癌症疫苗溶瘤病毒是一种新的方法，它在特异性杀死肿瘤细胞的同时还能刺激抗肿瘤反应。被溶瘤病毒感染的肿瘤细胞会产生自由基和细胞因子，这些细胞因子也会刺激免疫细胞，这往往会导致肿瘤溶解，并导致TAAs等化合物的释放。载体可以有力地刺激适应性免疫反应，因为免疫系统将其视为入侵颗粒，这可能具有可预见的和持久的免疫效果。除此之外，许多重组病毒也被证明可以感染APCs（包括树突状细胞）并在APCs上表达它们携带的基因。由于感知到的免疫系统检测TAAs的能力增强，细胞毒性T淋巴细胞侵入癌细胞并进一步传递在免疫载体中加密的肿瘤抗原的比例和有效性似乎有所增加。从安全角度考虑，受抑制或复制缺陷的病毒载体是可取的，它们构成了基于病毒的癌症疫苗的主要部分。此外，用于治疗COVID-19或埃博拉的灭活全病毒(腺病毒)疫苗的效力一直很有希望。然而，使用这些病毒疫苗也有不利的一面。由于病毒载体能够引发免疫功能，它们可以激活载体以及后面的免疫。丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、甲病毒、腺病毒和正痘病毒属的病毒，以及牛痘病毒的提取物，甚至鸟痘病毒属的成员，如鸡痘和金丝雀痘，可能是用于癌症疫苗开发和进展的最普遍的病毒，像ALVAC-CEA疫苗。痘病毒载体是属于痘病毒属的大包膜双链DNA (dsDNA)病毒，具有强大的重组和复制效率，可以在多种宿主(脊椎动物和无脊椎动物物种)和肿瘤细胞的细胞质中增殖。肿瘤抗原可由I类和II类MHC通道介导，通过内化转基因表达触发CD4+和CD8+T细胞。腺病毒经常被用作转导某些基因的载体。溶瘤性和非复制性腺病毒疫苗在临床前和临床研究中已明显显示出潜力(NCT00583752, NCT02285816)。腺相关病毒载体是可靠的，可以在实验环境中增殖。这使得生物学家可以进行简单的载体设计，包括重新配置病毒的趋向性，以增强缺乏关键腺受体(Ad受体)的靶细胞和DCsS的转导。腺病毒感染可导致宿主产生中和抗体，从而进一步减少接种疫苗的次数。此外，NCT00108732等实验性临床研究表明，重复加强剂量的鸡痘疫苗可能不会诱导宿主抗媒介免疫功能。与腺病毒同时，癌症疫苗接种基础措施也采用慢病毒和牛痘病毒作为载体。与腺病毒相比，慢病毒和腺相关病毒具有在非分裂细胞中长时间表达转基因的特殊能力。鸟类病毒像禽痘病毒(禽痘病毒属)可在哺乳动物细胞中复制。这两种病毒载体都能有效地感染APCs而不与DNA结合，从而引起强烈的免疫反应。痘苗病毒在鸡胚成纤维细胞中反复传递，产生大量减毒的牛痘毒株，称为改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。感染后，MVA仍然能够在哺乳动物细胞中进行DNA复制，但不能再产生感染性病毒颗粒。8.1 前列腺特异性抗原加三组共刺激分子（PSA-TRICOM）PSA-TRICOM疫苗框架采用重组痘苗病毒(RV)和重组禽痘(rF)进行疫苗接种。每种PSA疫苗都包含称作TRICOM(CD80、ICAM1和LFA-3)的三种免疫共刺激化合物，一种激动剂表位和PSA转基因。在一项II期临床试验中，125名患有转移性去雄抵抗性前列腺癌的男性在接种了规定剂量的痘苗病毒编码的PSA和GM-CSF (PROSTVAC-VF)后，接受了6次鸡痘病毒编码的PSA接种。该II期试验的结果显示，与携带空载体的对照组相比，10个月的总体存活率有所提高。遗憾的是，一项大规模的III期研究没有重现这些结果，导致试验终止。尽管特异性T细胞已被激活，但免疫调节肿瘤微环境可能在调节针对肿瘤的免疫反应中发挥了负面作用。PANVAC-VF是另一种基于痘病毒的疫苗，主要由编码CEA(6D)、TRICOM和MUC1(L93)的引物注射剂组成，并伴随着编码rF中相同转移基因的强化注射剂。MUC1(L93)和CEA(6D)具有特异性氨基酸改变以增强免疫原性，这分别代表癌胚抗原和粘蛋白1糖蛋白。在转移性癌症的试点研究中，25人接受了135个周期的PANVAC。只有7%的PANVAC周期被发现与2级流感样症状有关，在流感样疾病期间发生的3级短暂性晕厥可能归因于PANVAC。8.2 基于病毒的癌症疫苗优化策略TME增强是一种使基于病毒的癌症疫苗的效率最大化的方法。随着我们对TME免疫抑制性质的机制理解的发展，许多结合病毒疫苗接种的策略变得可行。研究发现Treg是一种重要的免疫抑制细胞，由Hippo通路的主要辅激活因子YAP蛋白控制。YAP功能不全会导致Treg功能障碍。因此，干扰treg介导的免疫抑制TME，进一步灭活YAP，可以提高病毒疫苗的抗肿瘤效果。由于已经证明TGF可以通过影响一系列免疫细胞(如T细胞或NK细胞)引起免疫抑制，另一种方法是将TGF与已证实的病毒疫苗结合使用。此外，PD-L1抑制剂和基于病毒的疫苗一起使用并进行了评估。在肿瘤模型中，病毒疫苗和PD-L1抑制的结合可导致长期无肿瘤生存。M7824是一种新型的双功能抗PD -L1和TGF-β药物，据报道可协助基于病毒的癌症疫苗更有效地工作。与这种标准治疗方法相关，正在开发具有免疫调节成分的基于病毒的疫苗，以阻止TME。例如，溶瘤病毒疫苗如BT-001既能表达抗CTLA4抗体，也能表达GM-CSF。9. 核酸疫苗当考虑到治疗用途时，核酸疫苗在与传染病和癌症的斗争中具有良好的潜力。核酸疫苗不同于传统疫苗，因为它们非常有效而且便宜。因此，核酸疫苗可能对疾病的诊断和治疗都有益。然而，核酸疫苗有限的免疫原性和稳定性已阻碍了它们的发展。因此，进行了大量的研究，改进递送系统增强其免疫原性和稳定性，从而促进医疗应用的进展。此外，病原体中的目标抗原是由核酸疫苗触发的免疫反应的唯一部分。由核酸(如DNA和RNA)制成的疫苗(图5)已在医学领域显示出巨大的潜力。图5. 基于基因的癌症疫苗的图示 (biorender.com)9.1 DNA疫苗DNA疫苗是癌症免疫治疗中一种有趣的方法。这些疫苗是在20世纪90年代发现的，是DNA介导的流感疫苗接种的结果。DNA疫苗由具有两个复制起点的双链DNA的细菌质粒组成。它们也有一个聚腺苷化基序和一个类似于人类巨细胞病毒的调节因子。牛生长激素(BGH)基因提供多聚腺苷化序列，CMV启动子导致转基因在哺乳动物宿主细胞中过表达。DNA疫苗被称为第三代疫苗。这些疫苗由植入的DNA基因组成，该DNA通过存在于DNA质粒中的强启动子编码目标细菌或病毒的抗原。编码后的抗原会在宿主体内引发强大的免疫功能。DNA疫苗必须到达细胞核进行转录，然后编码抗原将在细胞质内翻译。然后MHC-I和MHC-II分子进一步处理抗原并将其传递给CD8+ T细胞和CD4+ T细胞以启动免疫原性。美国食品和药物管理局监管用于兽医领域的医学和治疗用途的DNA疫苗。已发现该疫苗可改善免疫调节认知。DNA疫苗的注射方式被认为对疫苗的有效性有重大影响。不同组织内不同的APCs可以辅助疫苗诱导必要的免疫应答。这些疫苗通常是静脉注射和局部注射。静脉注射、皮下注射和肌肉注射等非肠道途径最常用于DNA疫苗的递送。这些途径激活组织特异性APCs，进而刺激细胞和体液免疫反应。由于DNA疫苗能够在作为神经微生物的特征性入口点的身体区域诱导局部免疫，因此通过粘膜通道递送DNA疫苗最近引起了广泛关注。DNA疫苗的作用机制分为三种类型：第一条途径包括DNA进入体细胞，如肌肉细胞，经过翻译，然后MHC-1分子将DNA编码的抗原直接传递给细胞毒性CD8+ T细胞。少数情况下，体细胞中DNA表达的抗原通过释放凋亡小体而被释放，这可能涉及第二条途径。这些肽随后被吞噬细胞内吞，经APCs加工处理，并通过MHC-II分子交叉呈递给CD4+T细胞。DNA转染直接APCs是第三条途径。这种疫苗具有设计方便、成本相对较低、稳定期长、溶出率最好、甚至可以快速改造等显著优势。尽管DNA疫苗在临床研究中的免疫原性较差，但技术的进步，像递送系统和免疫刺激剂(如佐剂)的使用可能有助于取得更好的结果。最近有研究在DNA疫苗中使用异种抗原治疗黑色素瘤和克服全身免疫耐受的策略。在最近的癌症研究中，异种p53抗原被用于生产DNA疫苗来对抗结肠癌。此外，许多新的临床前研究表明，编码前列腺相关抗原前列腺酸磷酸酶(PAP)的DNA疫苗可以引发PAP特异性CD8+T细胞免疫反应，在22名前列腺癌患者中使用编码人类PAP的DNA疫苗进行的I/II期研究中已被证实。有许多方法可以提高DNA疫苗的治疗效果。有效的转录需要一个有效的启动子序列，强大的启动子也被证明可以提高抗原的表达效率。加强肿瘤特异性抗原的布局设计也是增强DNA疫苗的关键。免疫刺激细胞因子也可以帮助增强疫苗对效应T细胞的影响。它们通常由含有抗原的疫苗或其他质粒编码，并与疫苗一起作为蛋白质施用。最新研究中最常用的细胞因子包括IL-12、GM-CSF和IL-2。包括内分泌治疗和放射治疗在内的各种方法与DNA疫苗相结合，以提高治疗效果。9.2 RNA 疫苗RNA疫苗通常由编码预期抗原的DNA模板链和利用噬菌体RNA聚合酶在体外转录产生的信使RNA组成。指定的mRNA转录本在被宿主细胞摄取后被直接翻译到细胞质中，随后产生的抗原随后被递送到APCs以触发免疫反应。作为一种替代方案，树突状细胞可以与肿瘤相关抗原mRNA或整个肿瘤RNA结合提供给宿主，以触发特定的免疫系统反应。这类疫苗受到青睐，因为它们具有DNA疫苗所表现出的几乎相似的优良特征，此外，它们还提供了一些进一步的优势。与DNA不同，RNA可以通过进入细胞质来转染细胞，在那里进行翻译。RNA疫苗通常可以从肿瘤样本中提取并使用PCR等方法进一步扩增，这个过程可以产生大量的患者特异性抗原。通过传递共刺激信号，例如通过toll样受体TLR3、TLR7和TLR8, RNA可以作为佐剂起到辅助作用。这些因素对RNA疫苗的开发和创造具有越来越重要的意义。反式复制、自我复制和非复制RNA构成mRNA疫苗结构的三种主要类型。许多癌症疫苗策略依赖于自我复制或非复制的RNA。非复制的mRNA编码特异性抗原，在进入靶细胞的细胞质后迅速翻译成蛋白质。这显然会产生大量蛋白质的表达，而且随着时间的推移会逐渐下降。通过体外转录或提取整个转录本，非复制mRNA的生产过程相当简单。相比之下，感兴趣的转基因也包括在自我复制的结构中，连同病毒RNA依赖的复制病毒基因组RNA聚合酶(RdRp)。通过反式复制或自复制，RNAs在不同的转录本上运输所需的转基因和病毒RdRp，以尽量减少在制造过程中闭环RNA载体的数量。生产用于癌症治疗的mRNA疫苗的一个关键组成部分是mRNA结构的内在感知与载体生产的最佳相关性。最初的基于mRNA的疗法已经显示出治疗癌症的潜力。在临床上，这些物质有可能改变免疫抑制性TME，并作为刺激T细胞的强兴奋剂。而且，由于癌症的内在变异性，无论是在临床适应症内还是在临床适应症之间，都需要更多的创新技术来创造有效的基于RNA的癌症治疗方法。为了获得治疗优势，正在进行的化学工程项目正在改良mRNA载体，以获得抗原表达和先天免疫检测之间的最佳平衡。为了对抗全身或局部耐受，肿瘤抗原靶型可能需要不同强度的免疫刺激信号。mRNA疫苗最有希望的应用是给癌症患者接种注入加工肿瘤相关抗原(TAAs)的mRNA的自体树突状细胞(DCs)。在分别进行额NCT02808416、NCT01334047和NCT01446731的临床试验中，这些有效的mRNA疫苗中有许多是针对脑癌、卵巢癌和前列腺癌开发的。BioNTech SE的产品BNT111正在进行治疗转移性黑色素瘤的I期临床试验，该疫苗靶向主要存在于黑色素瘤中的肿瘤相关抗原，如MAGEA3、酪氨酸酶、TPTE和NY-ESO-1。基于此，肿瘤细胞应该最终被免疫系统消灭。10. 结果与展望癌症疫苗和免疫治疗依赖于对肿瘤免疫逃避机制的透彻理解。最近的研究已经检查了肿瘤微环境，并得出了在疾病不同阶段影响治疗反应的内外部耐药的结论。先前成功的和临床有效的疫苗接种尝试可能会影响未来治疗平台的设计。抗原预测的发现和新颖的佐剂系统增加了疫苗接种的个性化。抗原可以作为多肽、mRNA或DNA疫苗施用，或显示在DC异种移植上。必须结合不同的疫苗接种平台、免疫调节和潜在的癌症治疗方法(化疗和放疗)来对抗肿瘤耐药性。必须仔细确定每种成分的时间、顺序和剂量，以确保其有效性。临床前和临床研究表明，癌症免疫治疗疫苗可以通过激活T淋巴细胞对抗肿瘤抗原，破坏不同类型肿瘤细胞，副作用小。使用针对多种新抗原的疫苗可以减少免疫逃避和成功根除肿瘤。为了增强抗肿瘤免疫，癌症疫苗与目前使用的免疫治疗方法(如免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒和其他免疫调节剂)相结合是一种很有吸引力的方法。这种组合治疗方法可以弥补单独使用时每种疗法的局限性。为了激活、扩大和促进抗癌免疫反应，理想的与癌症疫苗具有增强和/或协同作用的治疗药物应该抵消有限的免疫抑制导致的免疫逃逸。为了进一步优化和设计治疗性癌症疫苗，在临床前和临床转化工作中应遵循一些重要的考虑因素，例如根据肿瘤环境快速检测最有利的组合方法以获得最佳免疫反应的强大疫苗设计。因此，癌症免疫疗法是消除肿瘤和建立免疫监视的有希望的药物。在癌症疫苗成为一种可行的治疗方法之前，鉴别新抗原、开发联合疗法和优化疫苗接种技术还需要付出更多努力。参考资料：Gupta M, Wahi A, Sharma P, Nagpal R, Raina N, Kaurav M, Bhattacharya J, Rodrigues Oliveira SM, Dolma KG, Paul AK, de Lourdes Pereira M, Wilairatana P, Rahmatullah M, Nissapatorn V. Recent Advances in Cancer Vaccines: Challenges, Achievements, and Futuristic Prospects. Vaccines (Basel). 2022 Nov 25;10(12):2011. doi: 10.3390/vaccines10122011. PMID: 36560420; PMCID: PMC9788126.近期直播推荐识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要接种疫苗是预防传染病最重要的手段之一。随着时间的推移，依据抗原成分，许多不同类型的疫苗已被开发。佐剂是提高疫苗接种效果的基本成分，尤其是其作为免疫反应的载体、储存库和刺激物等时，发挥的作用有所差异。多年来，疫苗中很少使用佐剂，而铝盐是最常用的佐剂。然而，近年来的研究集中在许多不同的新化合物上，其具有有效佐剂特性和高安全性。纳米技术和分子生物学等现代技术强有力地运用于抗原和佐剂成分的生产过程，从而提高了疫苗的功效。目前，在疫苗生产中微粒、乳剂和免疫刺激物因有巨大潜力而备受关注。尽管一些研究报告了疫苗佐剂潜在的一些副作用，例如最近发现的ASIA，但疫苗的巨大价值仍然是毋庸置疑的。事实上，最近的COVID-19大流行凸显了疫苗的重要性，特别是在管理未来潜在大流行病方面。在这一领域，对佐剂的研究在生产愈发有效的疫苗中发挥主导作用。关键词：疫苗接种，佐剂，现代技术，未来展望。1.引言疫苗接种无疑是人类历史上最显著的健康成就之一。在短短的两个多世纪，疫苗使我们能够实现不同寻常的目标，例如彻底消灭天花，在世界大部分地区消灭小儿麻痹症，以及在一些国家大幅度降低许多传染病的死亡率和发病率。在世界上许多地方疫苗接种政策是公共卫生的基石，安全有效的疫苗受到人们极大的关注。疫苗的效力不仅取决于抗原成分，还取决于佐剂，其以一种更有效的方式刺激免疫系统。佐剂被定义为添加到疫苗中的成分，以改善对抗原的免疫反应。此外，佐剂有几个优点，如减少每剂疫苗的抗原量和疫苗接种次数，在某些情况下，它们增加抗原成分的稳定性，延长其半衰期并间接提高其免疫原性。现有许多不同类型的佐剂用于疫苗生产（表1）。表1 根据佐剂的主要作用机制分类佐剂根据不同的标准进行分组，例如它们的物理化学性质、来源和作用机制。最受关注的分类系统之一是基于其作用机制，将其分为两大类:递送系统(颗粒)和免疫增强剂。另一类佐剂是粘膜佐剂，这是一组与前面的佐剂具有某些特征的化合物。在递送系统佐剂中，抗原与佐剂相结合，特别是作为抗原载体。此外，它们能够通过激活先天免疫系统诱导局部促炎反应，导致免疫细胞募集到免疫部位。确切地说，抗原-佐剂复合物通过病原体相关分子模式(PAMPs)激活模式识别受体(PRR)途径。这引起先天免疫细胞的激活，伴随有细胞因子和趋化因子的产生。同样的途径被免疫增强剂直接激活（图1）。图1 佐剂的作用机制添加佐剂对老年人使用的疫苗特别有效，因为这类受试者会出现免疫衰老的生理现象，它在自然感染或人工刺激(接种疫苗)后导致免疫反应减弱。在这种情况下，佐剂的存在可使疫苗克服这一限制。而且，佐剂对亚单位疫苗特别有用，因为亚单位疫苗通常免疫原性弱，无法单独刺激强烈的免疫反应。然而，并非所有疫苗都需要佐剂。例如获得认证的脑膜炎球菌结合疫苗不含佐剂，因为与蛋白质载体的结合本身能够刺激良好的免疫反应。表2列出了目前认证的佐剂疫苗。表2 当前通过FDA和EMA认证的人用佐剂疫苗如表所示，目前绝大多数由EMA和FDA批准的人用疫苗都包括铝盐佐剂。鉴于这些佐剂是疫苗配方中使用最早的佐剂，为了提高疫苗的安全性和有效性，增加新佐剂的数量是绝对必要的，因此，有必要加强对具有佐剂特性的新分子和因子的研究，增加体外和体内研究的数量。与此同时，由于佐剂的使用和研究、新细胞底物的使用或工艺变更或转移申请方面的监管挑战，新产品的批准可能会受到延迟和提高成本。这方面可能成为抑制新奇事物、增加成本和延迟疫苗适用性的障碍，特别是在资源匮乏的国家。此外，2019冠状病毒病大流行凸显了获得有效疫苗以应对新的大流行潜在威胁的重要性。事实上，COVID-19的RNA疫苗具有内在佐剂特性，其与编码RNA载体的脂质体成分相关。然而，最新认证的COVID-19疫苗是基于含有刺突蛋白的经典平台，并添加了一种名为Matrix-M的新佐剂，该佐剂含有皂角提取物的成分A和C。在选择疫苗佐剂时需要考虑很多方面，其中安全性是第一位。一种好的佐剂必须是安全的，耐受性好，易于生产的；具有良好的药学特性(pH值、渗透压、内毒素水平等)以及保质期长；最后，在经济上可行。在不影响佐剂安全性的前提下兼顾所有这些特性是很困难的。因此，目前使用的疫苗中佐剂应用较少。尽管疫苗取得了巨大的成就，但近几十年来，人们对这些产品产生了许多担忧。一种反对疫苗的文化即“疫苗犹豫”已在世界范围内蔓延。2019冠状病毒病(COVID-19)大流行刺激了“疫苗犹豫”，它一方面表明了疫苗接种作为抵抗传染病基本武器的重要性，但另一方面也凸显了一部分人的犹豫行为。许多研究已报道了造成这种态度的几个原因，但许多研究表明，最主要的原因是疫苗副作用的恐惧和疫苗组成的不信任，特别是佐剂是一种比其他成分更能引起公众关注的成分。事实上，疫苗的副作用通常是轻微和短暂的，其通常表现为注射部位的局部疼痛和红斑，轻微的全身不适和流感样症状，这些影响通常在接种疫苗几小时或几天后消失，很少有过敏反应或其他严重副作用的病例报道。这篇综述评价了当前使用的疫苗佐剂，评估正在进行关于佐剂的特性和未来可能使用的研究，强调科学文献中存在的潜在问题和副作用的依据。2.递送系统2.1 矿物盐铝盐20世纪20年代发现了铝盐的佐剂特性，1926年人们开始用这些化合物作为疫苗佐剂。最初考虑在培养基中添加铝盐，以便诱导破伤风和白喉抗原的沉淀，从而帮助其纯化。然而，其结果表明，铝沉淀抗原比可溶性抗原具有更强的免疫原性。因此，铝盐是使用时间最长和最常用的佐剂，目前认证的疫苗中约有三分之一含有铝。因此，铝盐是疫苗佐剂中安全性测试最多的佐剂。人类通过不同的途径接触到铝，尤其是食物和空气。它主要通过消化道和呼吸道被人体吸收，随后进行扩散，然后经过三步排除过程，可是这一过程永远不会完成。低于3%的吸入铝和1%的摄入铝扩散到整个生物体。然而，在人体中发现95%的铝通过受污染的食物摄入的。世界卫生组织(WHO)规定通过食物摄入铝的最高水平应为1mg/kg/d(成人为60至70mg/d)。最后，铝包含在肠外溶液内，因此，通过注射扩散到血液和各种体液区室，在这种情况下，为了避免铝的积累，其在静脉注射溶液中的浓度应<25g/L。铝一旦被生物体吸收，在人体组织中扩散。大部分金属储存在骨骼、肝脏、肺和神经系统中。对于患有慢性肾病的人来说，铝不能被清除，并随着时间的推移而积累，尤其是在骨骼和神经系统中积累。在这类病人中高水平的铝会沉积在大脑中引起脑病。在大鼠体内注射同位素铝-26 (26Al)后其精确地量化了铝对大脑的渗透。在生理条件下，铝的脑渗透被量化为每克脑组织的0.001%～0.005%，这与给药途径和化学形式无关。2010年Goullé等量化了人组织中铝水平，其应用电感耦合等离子体与质谱检测相结合的技术对20例已故患者进行分析，这些患者以前没有接触过金属，也没有接受过任何含铝或其他微量矿物质的治疗，以湿重表示的中位数结果如下:肺=0.47g/g，脑=0.19g/g，肝脏=0.15g/g，心脏=0.10g/g，肌肉=0.08g/g和肾脏=0.06g/g。铝主要通过泌尿系统被生物体缓慢排出。有些铝会永久沉积在人体内，其含量会随着接触程度和年龄的增加而增加。在成年人体内永久沉积铝的量约为30～50mg。在疫苗中铝以结晶氢氧化铝(AlH)复杂聚合物或无定形羟磷酸铝(AlP)的簇状纳米颗粒形式存在。AlH呈针状纳米颗粒(Ø20nm)，而AlP在透射电镜下呈网状。这两种形式通常溶于柠檬酸盐，但AlP比AlH更易溶解。抗原通过静电相互作用和配体交换吸附到佐剂颗粒表面。铝盐抗原结合增强抗原提呈细胞(APCs)对抗原的摄取和提呈。而且，铝盐刺激NLRP3炎症小体的作用，导致IL-1β和IL-18的产生，引起局部炎症和APCs的募集。许多疫苗是抗原吸附在AlH或AlP上(例如，白喉和破伤风疫苗、无细胞百日咳疫苗、乙型肝炎疫苗以及肺炎球菌和脑膜炎球菌疫苗)。因为它们的免疫原性弱，需要增强免疫反应，以便引起有效的疫苗接种。在欧洲，《欧洲药典》规定疫苗中的铝含量最高不超过1.25mg/剂。在美国，《美国联邦法规》规定生物制品(包括疫苗)中的铝含量为0.85mg/剂。铝主要以可溶性柠檬酸盐或氯化物盐的形式存在于食物中，而无机铝化合物的佐剂是难溶的，这是佐剂作用方式的一部分。因此，由于铝在生理pH值下的溶解度较差，肌肉注射或皮下注射后疫苗中铝的吸收率预计会非常慢。为了评估肌肉注射后铝的动力学，Flarend等人进行了一些体内研究，通过肌肉注射26Al标记的AlH和AlP，其总铝剂量为0.85 mg，实验28天内AlH吸收率为17%，AlP吸收率为51%。26Al的最大血清浓度(Cmax)是2µg/L，即家兔铝的正常值(30µg/L)为7%。基于这些结果，肌内注射铝盐疫苗佐剂后铝Cmax的预期增加量为0.04µg/L，即平均血铝水平5 µg/L的0.8%。在本试验中，大脑中的铝水平浓度在10 - 8～10 - 7mg/g之间，即10−5～10−4µg/g，因此<0.0001µg/g，这比人脑中0.2µg/g的平均浓度低2000多倍。此外，一些研究评估了注射柠檬酸26Al后人体内铝的排泄情况。一项相当古老的研究表明，静脉注射26柠檬酸铝后，59%的注射剂量在一天内随尿排出，随后几天排出速度变慢(第5天平均滞留率为27%)，而最近的一项研究表明，在注射铝剂8年后，残留率约为2%。铝的毒性仅次于体液和组织中增加的金属水平。特别是当肾功能受损时，这种增加是排除它的能力而改变的。尤其血液透析的肾功能衰竭患者具有较高的铝水平，伴随可能的神经毒性风险。肾移植能够解决铝的过剩，并可能解决相关的神经毒性。多年来，科学家们一直在争论神经退行性疾病可能是铝致神经毒性，到目前为止，还没有确凿的证据表明，这一作用仍然存在争议。铝的神经毒性已在体外、离体和体内动物模型和人体中进行了研究。在体外对细菌进行了一些研究，显示铝不存在致突变性，此外，使用对氧化诱变剂敏感的菌株后，对铝的氧化作用模式产生了疑问。在体外对细胞系进行了研究，以评估不同形式的铝可能的遗传毒性。研究人员在细胞系进行评估不同形式的铝可能引起的遗传毒性。一些科学家使用多个供体的淋巴细胞在动物模型中进行胚胎毒性研究，最后，在体内进行各种研究。在这些研究中最常用的技术是彗星试验和微核试验。有趣的是，研究结果往往不一致和相互矛盾，这可能存在方法上的缺陷。因此，到目前为止，尽管铝盐能够产生或多或少强烈的氧化应激，但仍不能肯定地说(在推荐剂量下)用作佐剂的铝盐会有毒性作用。2.2 乳剂这一类重要佐剂的前身是完全和不完全的弗氏佐剂。这两种佐剂都是油包水乳剂，其能够提呈抗原并刺激先天免疫系统。在其构造中完全弗氏佐剂(CFA)包括热杀死的分枝杆菌，它增强了刺激免疫反应，目前其诱导小鼠强烈的免疫激活和自身免疫(如葡萄膜炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎)。然而，CFA能够引起强烈的和持久的局部炎症，这可能导致动物明显的疼痛，并可能在注射部位发生溃疡。不完全弗氏佐剂(IFA)不含分枝杆菌，在20世纪50年代被用作人流感疫苗的佐剂，与无佐剂的相同疫苗相比，它可以诱导更强、更持久的抗体反应。IFA的佐剂活性是基于油性抗原沉积的特征，抗原在注射部位持续释放，这同时导致抗原寿命的增加以及强烈的局部先天免疫刺激，伴随吞噬、白细胞募集和浸润以及细胞因子的产生。然而，IFA的强烈副作用，疫苗配方中应用IFA及其人类的常规使用受到阻碍。特别是，毒性是含量高的非生物降解的废油以及它们的品质差引起的。2005年WHO进行的一项调查显示，大约100万名IFA患者进行免疫接种后出现了严重的副作用，例如在4万名接种疫苗的人中出现了无菌脓肿。2.2.1 MF59MF59是一种油包水乳剂，其由角鲨烯、Span 85和Tween 80组成，其溶解于pH 6.5的10 mM柠檬酸钠缓冲液，平均粒径约为165 nm。这是1997年意大利批准的第一种用作人类疫苗的水包油乳剂。它目前用于三价和四价(TIV和QIV)流感疫苗Fluad (Seqirus)，这些疫苗最初仅用于65岁以上的人群，但后来被批准用于其他流感风险群体如幼儿和婴儿，并在H1N1大流行疫苗期间用于孕妇和幼儿。研究表明：MF59的存在可提高2岁以下儿童流感疫苗的有效性。MF59还作为HBV疫苗的佐剂进行了测试，其能够引起强烈的免疫反应，而且比铝诱导的免疫反应更好。MF59的作用机理与铝盐相似。注射部位的储存状况几乎可以忽略不计，因为研究表明其半衰期为42h。相反，MF59具有诱导细胞和体液免疫反应的强大能力，包括产生高滴度的功能性抗体。MF59的存在刺激局部先天免疫细胞分泌趋化因子，如C-C基序趋化因子配体4 (CCL4)，C-C基序趋化因子配体25 (CCL2)， C-C基序趋化因子配体5 (CCL5)和C-X-C Motif配体8 (CXCL8)，它反过来驱动白细胞募集、抗原摄取和迁移到淋巴结，触发适应性免疫反应。另外，研究报道，MF59能够增加调节白细胞跨内皮迁移的基因簇的表达，以及随后招募的MHCII+CD11b+细胞进入注射部位，引发强大的免疫应答。在35个国家数百万剂的应用证明了MF59是安全且耐受性良好。2.2.2 AS03AS03是由表面活性剂聚山梨酸酯80和角鲨烯和DL-α-生育酚两种可生物降解的油脂在磷酸盐缓冲盐水中组成的油包水佐剂乳液。这种佐剂已用于流感疫苗，引起类似MF59的免疫反应，也用于疟疾疫苗。2009年欧盟委员会批准AS03佐剂的疫苗Pandemrix上市，而2013年，美国食品和药物管理局(FDA)获批了一种AS03佐剂甲型流感(H5N1)单价疫苗。然而，α-生育酚的抗氧化和免疫刺激特性似乎比MF59增强了免疫刺激。事实上，在6至35个月的儿童中使用AS03佐剂流感疫苗显示出强烈的免疫反应，甚至在接种疫苗6个月后也是如此。为了阐明DL-α-生育酚在AS03中的作用，我们比较了AS03和缺乏DL-α-生育酚的乳剂的作用。通过测定抗原摄取、免疫细胞募集和分泌的细胞因子水平，我们得出结论是缺乏DL-α-生育酚导致免疫应答和抗体滴度降低。而且，有研究表明AS03能够通过激活NF-κB刺激免疫系统，诱导肌肉和淋巴结分泌细胞因子和趋化因子，促进先天免疫细胞的迁移。另外，AS03可刺激CD4+ T细胞特异性免疫反应，这可以决定持久的中和抗体产生和更高水平的记忆B细胞。AS03的成分进一步添加了两种强免疫刺激剂，即QS-21(一种从黄芪中提取的皂苷)和3- O -去酰基-40 -单磷酰脂质A (MPL)，以增强其免疫原性，从而形成AS02。2.3 微粒2.3.1 病毒样颗粒病毒样颗粒(VLP)是由自组装衣壳蛋白外壳组成的二十面体或棒状纳米颗粒(Ø 20 - 200nm)。长期以来，人们一直在研究并将其用于疫苗开发。它们是非传染性粒子，因为它们不包含任何遗传物质。它们是一种被称为纳米疫苗的最重要代表之一新型疫苗，这种疫苗在疫苗开发中正变得越来越重要。VLP是一种智能纳米颗粒，因为它们是具有重复表位的外部病毒外壳形成，免疫系统将其识别为非自身，从而产生强烈的免疫反应。然而，它与天然病毒共有的这一特性，但并不具有感染的能力。除了这些重复的结构基序外，VLPs的大小与病毒相似(通常在20-800nm之间)，并且经过快速有效的处理，即使在没有佐剂的情况下也能产生快速而持久的免疫反应。根据是否存在包膜，VLPs可分为非包膜VLPs和包膜VLPs (eVLP)，无包膜VLPs又可分为单衣壳蛋白VLPs和多衣壳蛋白VLPs，以及单层、双层和三层VLPs。多衣壳无包膜的VLPs一个经典例子是由乳头瘤病毒L1和L2蛋白形成的，它们能够自组装形成微粒。eVLP从宿主细胞获得脂质膜，在组装和出芽过程中表达，又分为单层、双层和多层。它们可以由不同的病毒类型形成，其表达系统包括大肠杆菌，酵母(酿酒酵母和毕赤酵母)、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞和无细胞系统。在细胞系统中生产VLP采用一种称为“组装-然后纯化”的多步骤方法，首先利用衣壳蛋白的自发组装能力直接出现在表达细胞载体内，其次纯化新形成的颗粒。有时，为了获得较纯的颗粒，在细胞内组装后，新颗粒必须分解，从而使它们第二次重新组合。另一种制造方法使用无细胞体外组装加工系统，其组成与传统细胞方法的相反，特别是，它们在表达和纯化后，体外表达系统被用于生产衣壳蛋白自发组装的平台，而无需拆卸新形成的VLPs。目前，有两种重要的添加佐剂的疫苗使用纳米颗粒平台产生免疫:乙型肝炎和乳头瘤病毒(HPV)疫苗。当前，使用的乙型肝炎疫苗是一种含有乙型肝炎表面抗原的重组疫苗(HBsAg)，以VLPs的形式，用于预防乙肝感染，其利用重组DNA技术，以酿酒酵母为表达载体生产疫苗。每个剂量含有10µg/0.5 mL VLPs(儿童)或20µg/mL(成人)，两者都吸附于氢氧化铝。该疫苗接种于15岁以下的婴儿、儿童和青少年，或感染乙型肝炎的高危人群，在乙肝病毒携带者母亲所生的新生儿中也显示出极好的免疫原性(95% - 99%的有效性)。乙肝疫苗似乎能提供至少10年的免疫力。HPV疫苗也是基于VLP平台的疫苗。HPV病毒粒子是非包膜的，含有双链DNA (dsDNA)。衣壳具有二十面体对称性，由主要结构蛋白和次要结构蛋白组成，即L1蛋白和L2蛋白。目前的九价HPV疫苗可预防九种不同的病毒基因型，这些病毒基因型可导致90%的宫颈癌和80-95%的肛门生殖器癌，建议从9岁开始对男性和女性接种。九价型HPV疫苗含有9种不同HPV基因型(6、11、16、18、31、45、53、58)的L1蛋白形成VLPs，并通过重组DNA技术合成。VLPs的优势在于它是一种不含病毒基因组的蛋白质结构，不具有传染性和致癌性。目前用于表达L1蛋白的载体是酿酒酵母。VLPs与佐剂(AlP)协同使用可产生良好的免疫应答，因此预防宫颈癌达90%。此外，事实证明，疫苗诱导的抗体能够穿过胎盘，保护新生儿免受HPV 6和11的感染。2.3.2 病毒颗粒病毒体是一种与天然病毒结构非常相似的疫苗平台。在结构上，它们是重组流感病毒包膜形成的VLPs，由血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和磷脂(磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱)组成，缺乏病毒遗传物质。1975年首次提出使用病毒颗粒生产流感疫苗。自此，出现了这类疫苗有效性的科学证据，并用于预防甲型肝炎(Epaxal)和流感(Inflexal)的两种疫苗。Inflexal Ⅴ是一种适用于所有年龄组的佐剂流感疫苗，对健康和免疫功能低下的儿童、成人和老年人都有良好的疗效。它能诱导B细胞应答并产生特异性抗体。病毒颗粒保留了血凝素的受体结合能力和膜融合活性，但缺乏病毒性RNA，它们结合后不能诱导细胞感染。而且与亚基和分裂病毒粒子流感疫苗相比，这种结合能力增加了它们的免疫原性。病毒颗粒作为一个完美的递送系统，能够将抗原转移到抗原呈递细胞(APCs)的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。然而，由于它们较弱的佐剂特性，病毒颗粒不能有效的激活APC和促进交叉呈递。这种内在的限制可以通过添加更强的佐剂来去除。例如基于TLR4配体单磷酰脂质A (MPLA)和金属离子螯合脂质DOGS-NTA-Ni吸附到膜上的病毒颗粒，研制了一种新型流感疫苗。在体外，与未添加佐剂的病毒颗粒相比，吸附了MPLA的病毒颗粒能够诱导更强的APCs活化。此外，具有MPLA佐剂的病毒颗粒免疫小鼠诱导特异性CTLs的产生。生产的流感病毒颗粒使用洗涤剂(乙二醇)-正十二烷基单醚(C12E8)溶解病毒包膜，随后进行超离心并去除病毒核衣壳，然后，使用疏水珠从上清液中去除洗涤剂，随后病毒膜脂和包膜糖蛋白重新组装，形成约100-200 nm的颗粒。研究表明，这一过程形成的流感病毒颗粒表现出与野生型病毒非常相似的融合特性。流感病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞，然后与核内体膜融合。由于膜融合活性，不同的大分子可以被包裹在病毒颗粒腔内到达靶细胞的细胞质。例如，包裹在病毒颗粒内的DTA(白喉毒素的A亚基)可以成功地转运到靶细胞的细胞质中，导致蛋白质合成的完全抑制，甚至质粒DNA也可被包裹在阳离子脂质形成的病毒颗粒内。这种病毒颗粒DNA可以有效地转染靶细胞。病毒颗粒传递系统和佐剂的显著优势是能够通过疏水脂质相互作用将抗原吸附到它们的表面和管腔上。而且，在疫苗生产中病毒颗粒比VLPs更受欢迎，因为后者由于其蛋白质结构运动受到限制。此外，将抗原吸附到病毒颗粒的液体磷脂双分子层表面会刺激与宿主细胞受体的相互作用。FDA已批准病毒颗粒作为人类使用的纳米载体，因为它们具有很高的耐受性和安全性。与亚单位疫苗引起较弱的免疫反应相比，病毒颗粒能够诱导强大的体液和细胞免疫，这与自然感染和其他强效佐剂具有非常相似的方式。目前为止，除了上述两种流感和甲型肝炎的基于病毒颗粒的疫苗外，这几种基于病毒颗粒的HIV、HPV、RSV和疟疾疫苗也在研究。艾滋病毒颗粒疫苗在临床I期显示出符合期望的结果，有可能很快会上市。尽管疫苗可以通过肌肉注射或皮下注射，但粘膜途径可能引起更强的免疫反应，因为艾滋病毒传播的主要途径是粘膜组织，因此，强大的粘膜抗体产生是抵抗HIV感染的重要防御机制。研究人员已经从流感病毒中制备了基于HIV病毒颗粒的疫苗，其主要通过吸附一些HIV-1毒力抗原，如gp41和p1肽，并加入3M -052和一种增加病毒颗粒膜硬度的耐热佐剂。另一项研究，一种热稳定性的HIV-1病毒颗粒疫苗由流感包膜的病毒颗粒组成，其含有HA、NA、卵磷脂、脑磷脂和其他磷脂，外加3M-052、toll样受体(TLR7/8)和海藻糖。关于HPV，一些研究侧重于含有E6和E7蛋白的基于病毒颗粒的疫苗，其通过受体介导的内吞作用与宿主细胞膜融合。研究表明，重组HPV16 E7流感病毒颗粒诱导了强烈的CTL反应，并阻止了HPV16+向癌症转化。此外，用E7病毒颗粒免疫诱导了抗E7的IgG抗体反应。3.免疫增强剂3.1 TLR1/2激动剂在TLR1/2激动剂中，L-pampo是一种由Pam3Csk4(Pam3)和多肌苷:多胞苷酸(polyI:C)组成的强效佐剂体系，其分别为强效TLR1/2和TLR3激动剂。Lee等人研究表明L-pampo诱导的抗HBV抗体的产生比明矾更强，并且还参与细胞介导的免疫反应，如增加多功能CD4+ T细胞。此外，还研究了抗SARS-CoV-2的有效佐剂。具体而言，与广泛使用的佐剂相比，SARS-CoV-2抗原如受体结合域(RBD)和S1抗原，或RBD- Fc接合L-pampo可对SARS-CoV-2产生强烈的体液和细胞免疫应答。此外，细菌脂蛋白是TLR2识别的最有效的配体。研究表明，从细菌脂蛋白中提取的合成脂肽是B细胞和巨噬细胞的强激活剂，可以用作疫苗佐剂。来自发酵支原体的2 kDa巨噬细胞激活脂肽-2 (MALP-2)通过TLR2-和myd88依赖的信号通路激活免疫细胞。除MALP-2外，Pam2CSK4和Pam3CSK4也是公认的TLR2激动剂，它们已被评估为治疗利什曼原虫、疟疾和流感等传染病的药物。TLR3受体激动剂在发现TLRs之前，一种合成的dsRNA，即[poly(I:C)]被发现具有高度诱导IFN产生的能力。TLR3是一种检测病毒dsRNA的细胞核内体的受体，它识别poly(I:C)，因为它在结构上模拟病毒RNA，从而诱导I型IFN和III型IFN的产生，并引起Th1细胞因子反应。在TLR3- poly(I:C)相互作用后产生的I型IFN对于常规树突状细胞(cDCs)有效激活CD8 T细胞反应尤为重要。另外，poly(I:C)产生的I型IFN刺激T细胞的克隆扩增，增加效应T细胞的比例和抗原特异性B细胞的数量。由于这些原因，poly(I:C)作为一种潜在的佐剂已被广泛研究，然而，poly(I:C)对人体有毒性作用。因此，科学家们的关注点已集中在poly(I:C)的衍生物，如poly(ICLC)和poly(IC12U)，以及其他合成的TLR3激动剂，如ARNAX, IPH3102和RGC100。Poly(ICLC)是羧甲基纤维素中的poly-L-赖氨酸，与poly(I:C)类似，其能够刺激IFN的产生。然而，它对血清核酸酶具有较高的抗性，同时具有较高的免疫刺激作用。poly(ICLC)的一个有趣的方面是能够诱导天然免疫途径中其他几个基因序列的表达，包括炎性体和补体系统AS，类似于活病毒疫苗。迄今为止，一些研究已经使用聚(ICLC)作为传染病的候选疫苗，如恶性疟原虫和HIV以及癌症。研究表明，与其他TLR激动剂(如LPS和CpG)相比，poly(ICLC)能够引发更强的Th1免疫应答，这是疫苗接种的一个积极方面。Poly(IC12U)通过尿嘧啶和鸟苷残基之间的错配降低Poly(I:C)的毒性。然而，尽管这种变化降低了毒性，但它导致I型IFN的产量低于poly(I:C)。与poly(I:C)和poly(ICLC)不同，poly(IC12U)与TLR3结合，但不与MDA5结合。与poly(ICLC)类似，一些研究将ploy(IC12U)作为HIV、流感和癌症疫苗的佐剂。ARNAX是一种具有佐剂潜力的TLR3激动剂，它是一种TLR3特异性配体，其毒性低于poly(I:C)。poly(I:C)的毒性与其激活MAVS通路(RIG-I和/或MDA5的激活)的能力有关。因此，Matsumoto等人开发了一种包括GpC磷酸化寡脱氧核苷酸和dsRNA的配体，该配体被TLR3识别并内化到核内体中。由于RNA链的长度相对较短，该配体能够激活TLR3，同时避免MDA5的检测。在小鼠模型中，佐剂不能诱导血清炎症细胞因子水平的显著增加，但有利于DC交叉呈递抗原并引发Th1谱。研究ARNAX最重要的两个领域是癌症免疫治疗和流感疫苗接种。3.2 TLR4激动剂TLR4激动剂作为疫苗佐剂有AS01、AS02和AS04，它们都含有TLR4内体的配体MPLA。具体来说，AS01已被用于开发疟疾、艾滋病毒和结核病的疫苗。AS01是一种包裹在脂质体结构中复合佐剂，其由两种不同的免疫刺激分子MPLA和QS-21组成。QS-21是一种天然的三萜苷类皂苷类物质，提取自枇杷膏的树皮。这两种化合物利用脂质体作为载体通过胆固醇依赖性内吞作用到达细胞。在细胞内，QS-21导致溶酶体不稳定并促进蛋白激酶SYK的激活。MPLA连接内体TLR4，诱导TRIF依赖的信号通路。单独使用QS-21具有重要而不利的溶血作用，可诱导细胞死亡。然而，溶血活性的QS-21和随后的细胞死亡通过脂质体包封终止。AS01激活细胞凋亡蛋白酶-1，从而促进NLRP3炎性体的激活和从APCs中释放IL-1β和IL-18。IL-18的释放导致IFN-γ的快速产生，尤其是淋巴结中的自然杀伤细胞，从而促进DC的成熟并诱导Th1型免疫反应。3.3 TLR5激动剂TLR5是一种识别细菌鞭毛蛋白的受体，它由几种免疫细胞表达。TLR5与配体的结合导致炎症途径的激活和许多炎症介质的释放，如TNF-α， IL-1β， IL-6和NO。此外，鞭毛蛋白能够引起Th1和Th2反应，而不像其他TLR配体只能够引起Th1反应。另外，鞭毛蛋白通过激活NLRC4炎性体诱导IL-1β的产生和释放。鞭毛蛋白不依赖TLR5或NLRC4的模型能够发挥佐剂活性，但效率低于野生型。事实上，在小鼠模型中这两种受体都不存在时，佐剂的能力大大降低，这表明至少需要一种受体存在才能驱动免疫反应；而两者的存在提供了最好的免疫结果。研究表明，鞭毛蛋白在免疫功能低下的人群中仍能维持其佐剂作用，例如HIV阳性的病人。Cui等评论了使用鞭毛蛋白作为佐剂的研究。最简单的方法是抗原给药，该方法成功地诱导了黏膜免疫反应，对防止呼吸道和胃肠道感染至关重要。研究人员已经开展了许多研究，特别是关于鞭毛蛋白作为流感疫苗佐剂的作用。鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白与不同的流感抗原联合使用，如灭活的PR8流感病毒(IPR8)、HA(H5N1)和禽流感病毒(AIV)H5N1都获得了强大的免疫反应(特别是产生IgA的粘膜)。在活减毒细菌中修饰的鞭毛蛋白获得了嵌合鞭毛蛋白或鞭毛蛋白抗原复合物，例如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)。此外，重组鞭毛蛋白-抗原融合蛋白的生产已在动物模型中用于传染病和癌症的佐剂疫苗。迄今为止，至少有三种用鞭毛作为佐剂的疫苗处于临床试验阶段:两种是流感病毒，另一种是鼠疫耶尔森氏菌。3.4 TLR7/8激动剂一些研究表明TLR7/8激动剂能够强烈诱导Th1免疫应答。与TLR7/8结合的配体产生高水平的I型IFN，IL-12, TNF-α和IL-1β。另外，TLR7/8和TLR9激动剂是唯一能够激活和促进cDCs和浆细胞样树突状细胞(pDCs)克隆扩增的激动剂分子，也能调动CD14+CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。TLR7/8激动剂最重要的代表是一些合成的小分子，命名为咪喹莫特(R837)和瑞喹莫特(R848)，其属于咪唑喹啉类。当今咪喹莫特被批准用于治疗生殖器疣、浅表基底细胞癌和光化性角化病，而雷西喹莫特已被研究用于抗病毒和抗癌治疗。然而，这些小分子已被证明有一些内在的限制。特别是，它们可以扩散到远离给药部位的地方，从而远离抗原，从而降低疗效并诱发全身副作用。因此，研究已证明这些分子与铝佐剂的直接结合能够提高疫苗的效力。先前的一些研究将咪唑喹啉类药物与HIV-1 Gag蛋白或整个灭活流感病毒直接偶联，增加了Th1应答和抗原特异性的T细胞数量。此外，它与合成聚合物支架、脂质-聚合物两亲体、聚乙二醇(PEG)、纳米凝胶、明铝和各种其他合成聚合物的偶联显著增加了咪唑喹啉类药物的递送，并促进了DC和抗原特异性T细胞的成熟。而且，咪唑喹啉与一种或多种其他TLR激动剂(如MPLA (TLR4)和MPLA + CpG ODN (TLR4和TLR9)混合研究表明，这种组合增加了先天免疫反应，产生了显著抗原特异性中和抗体和改善Th1反应。所有这些创新方面都突出了TLR7/8激动剂作为佐剂候选药物的卓越潜力。3.5. TLR9激动剂TLR9自然识别以未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸为代表的细菌DNA基序，通过myd88依赖途径驱动先天免疫系统的激活。这些分子基序用于具有特定修饰的合成佐剂，以防止被核酸酶降解。在自然杀伤细胞、B细胞和pDCs中，CpG-ODNs产生强大的趋化因子、细胞因子和抗体，驱动强烈的Th1型免疫反应。迄今为止，研究人员已开发了三种不同类型的CpG-ODN配体，其分为三类(A - C)，但只有B类分子作为佐剂用于临床试验。CpG-B ODN定位于核内体并引起pDCs成熟。此外，CpG-B ODN可以直接与B细胞相互作用，增强抗体的产生。在小鼠模型中显示，CpG-B ODN作为佐剂可产生可观且持久的抗体，优于铝佐剂或非佐剂疫苗。最近许可的CpG 1018是一种具有较高的化学稳定性和佐剂能力的寡核苷酸，可引发Th1型免疫反应，被用作乙肝疫苗Heplisav-B的佐剂。Heplisav-B中的CpG 1018提高了疫苗效力，与需要三剂才能产生最佳保护的传统乙型肝炎疫苗相比，只需接种两剂即可。目前为止，CpG 1018正在用于开发几种疫苗，包括针对黑色素瘤和COVID-19的疫苗，另一种CpG ODN CpG 7909在HBV和疟疾疫苗临床评估中显示出令人鼓舞的效果，其他下一代TLR9激动剂已开发。一个有效的代表是MGN1703，其包括CG基序的小DNA分子，但它在结构上不同于CPG ODN。MGN1703是一段中间为双链的反向互补DNA组成，两个单链环包围，它包括三个非甲基化的CG基序并形成哑铃状结构，与线性分子CpG ODNs形成对比。MGN1703作为癌症疫苗的佐剂进行了测试，发现它能够激活先天和适应性免疫反应，只有轻微或暂时的副作用。4.佐剂的潜在副作用:亚洲综合症尽管疫苗具有良好的安全性，但近年来，人们对疫苗可能产生的负面影响产生了新的关注，除了众所周知的副作用外，还描述了一种新的疾病分类学实体。最早由Shoenfeld等人提出实体是佐剂诱导的自身免疫/炎症综合征(ASIA)。这种综合征包括一些免疫介导的疾病，这些疾病可能发生在暴露于佐剂后的易感遗传个体中。其特征主要是自身抗体的产生，一旦触发因子被移除，情况会好转。该综合征发病时，一些外部因素如感染性因子或佐剂(即粉尘、硅胶、铝盐等)作用于易感遗传背景，其通过自身免疫性疾病(ADI)发展相关的特定HLA抗原介导。尤其是这些患者中HLA-DRB1和PTPN22基因同时存在已证明是最常见的自身免疫背景。根据最近的科学证据，一些病理情况，如结节病、Sjögren综合征(SS)、未分化结缔组织病(UCTD)、硅胶植入物不相容综合征(SIIS)和免疫相关不良事件(irAEs)是ASIA背景的典型例子。除了疫苗中含有的常见佐剂外，许多其他物质如硅酮、石蜡、透明质酸、丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯也具有佐剂的特性。Watad等人将ASIA标准分为主要标准和次要标准。在临床表现之前，主要标准包括暴露于各种外源性刺激(感染、接触佐剂)以及出现典型的临床表现，如肌痛、肌炎、关节痛、关节炎、慢性疲劳、睡眠障碍、脱髓鞘、记忆丧失、发热和口干。次要标准包括自身抗体或针对佐剂的抗体的出现，特定HLA模式(即HLA DRB1, HLA DQB1)的存在，以及自身免疫性疾病的发展，即多发性硬化症或系统性硬化症。以前的一些研究表明含有铝盐的疫苗能引起ASIA。一个典型的例子是HPV四价疫苗(含铝盐)，据报道，接种疫苗后几周内易感受试者的自我免疫风险会增加，它或者是HBV疫苗。然而，Linneberg研究铝盐潜在副作用结果表明，与接受常规过敏治疗的对照组相比，经皮下多次过敏原联合氢氧化铝免疫治疗以及随后接受比三剂疫苗中含铝量高100倍人死亡率更低，自身免疫性疾病更少。科学家们的努力已转向研究生物标志物诊断ASIA或预测它的易感性(除了之前已经提到的)。例如，在患有ASIA受试者中ACE 1和IL-2受体增加50%，维生素D的缺乏增加了ASIA的发病率(缺乏免疫调节作用)。通过对500例ASIA的分析，Watad等人强调了易感性似乎与ASIA非常相关。这项研究表明，女性个体、吸烟者、以往患有自身免疫性疾病或家庭成员患有后者的人患ASIA的比例较高。其中多基因自身免疫性疾病最为常见，UCTD和Sjögren综合征患病率最高，分别为38.8%和16.8%。在54.4%自身抗体检测阳性的患者中48.2%为ANA阳性。很明显，考虑到自身免疫/自身炎症状态的发展背后，其有环境和遗传因素。接种疫苗与出现症状之间的中位时间为一周(2天至5年)；48.2%的人群在接触至少一种疫苗后出现临床症状。然而，除了这一科学证据外，一些研究表明接种佐剂疫苗与ASIA之间没有关系。在这些研究中，已表明疫苗接种和自身免疫之间的联系可能是虚假的，因为存在混淆因素和随机事件的结果，而不是真正的因果关系。疫苗接种或接触外来物质与自身免疫/炎症和免疫介导事件的潜在发生之间可能存在的联系不应成为降低疫苗接种覆盖率的“虚假神话”。实际上，疫苗不良事件很少发生。由于缺乏信息和可靠的数据，亚洲是一个恰当的总括性术语，可以把各种事件和显然不相关的反应集合在一起，这些反应的共同根源是暴露于疫苗、硅胶或其他外来物质。需要强调的是，即使未来的研究表明佐剂和自身免疫之间存在真正的相关性，然而，这不会削弱疫苗免疫实践所发挥的巨大和毋庸置疑的保护作用，疫苗免疫实践提供了许多临床益处；事实上，疫苗有助于根除和控制许多传染病，提高人类生活质量。5.结论疫苗接种一直是人类与传染病作斗争的最有力武器之一。由于这些有效和安全的预防手段，人类已能消灭人类历史上最可怕的敌人（病原微生物）。最近的COVID-19大流行充分强调了疫苗接种的重要性，疫苗研究必须取得进一步进展并为未来的大流行做准备。疫苗的效力取决于佐剂的基本特性和作用。关于疫苗接种的未来，必须更加重视这些分子，以便生产出越来越安全有效的疫苗。目前该领域的相关产品等研究正在进行，以便实现这一目标，造福人类。参考资料：Facciolà A, Visalli G, Laganà A, Di Pietro A. An Overview of Vaccine Adjuvants: Current Evidence and Future Perspectives. Vaccines (Basel). 2022 May 22;10(5):819. doi: 10.3390/vaccines10050819. PMID: 35632575; PMCID: PMC9147349.