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肠球菌对最后手段抗生素的耐药性 摘要  肠球菌属（Enterococcus）包括一类多样的物种，其中许多是人类和动物肠道微生物群的共生成员。与人类相关的两种最主要的物种，粪肠球菌（Enterococcus faecalis）和屎肠球菌（Enterococcus faecium），也已成为重要的机会性病原体，可引起住院患者的一系列感染，包括尿路感染、血流感染和心内膜炎。肠球菌抗生素耐药性的上升削弱了感染治疗的效果，从而构成了重大的公共卫生风险。肠球菌能够通过染色体突变和抗生素耐药基因的水平转移迅速获得抗药性。本综述全面探讨了肠球菌的抗生素耐药机制，重点关注对最后一线抗生素的耐药，包括对万古霉素和替考拉宁等糖肽类抗生素、恶唑烷酮类（主要是利奈唑胺）和达托霉素的耐药性。此外，我们评估了当前抗生素研发管线中的相关候选药物，并讨论了治疗和预防多重耐药肠球菌感染的替代策略（噬菌体疗法和免疫治疗）。由于肠球菌能够迅速适应新环境，包括对新药物和疗法产生耐药性，因此需要持续的研究努力，以确保为这些重要的机会性病原体不断开发出有效的治疗方案。简介    肠球菌是人类和动物胃肠道中常见的共生菌。肠球菌属（Enterococcus）中已描述了60多种，其中一部分被认为是重要的机会性病原体，能够引发多种感染，特别是在免疫力低下和住院患者中。这些革兰氏阳性兼性厌氧菌能够在恶劣环境中生存，包括高盐浓度和广泛的温度范围。最常引起人类感染的两个物种是屎肠球菌（Enterococcus faecium）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）。虽然两种菌都能够通过突变和水平基因转移获得抗生素耐药性，但抗生素耐药性在粪肠球菌中扩散的速度似乎比在屎肠球菌中更快。    除了这两种主要物种外，肠球菌属中的其他物种也日益被认为是机会性人类病原体。其中最显著的是鸡肠球菌（E. gallinarum）和黄屎肠球菌（E. casseliflavus），它们对抗生素万古霉素表现出低水平的天然耐药性。此外，还报道了一些偶发的临床病例，涉及非屎肠球菌、非粪肠球菌物种，如犬肠球菌（E. hirae）、屎肠球菌（E. durans）、鸟肠球菌（E. avium）和瑞夫肠球菌（E. raffinosus），这些感染来自血流、泌尿道和心内膜炎等情况。由非粪肠球菌、非屎肠球菌引起的感染通常为多菌种感染，其中与革兰氏阴性杆菌的共存尤其常见。尽管这些物种的流行率较低，但它们可以通过可移动遗传元件（MGEs）获得高水平抗生素耐药性，提示它们可能在医疗环境中作为可转移多药耐药性的储库。    粪肠球菌的强大生存能力使其能够在现代医疗环境中存活，从而使其能够定植并感染患者。2019年，包括粪肠球菌（E. faecalis）和屎肠球菌（E. faecium）在内的肠球菌导致全球约439,000人死亡，凸显出它们作为临床感染主要致病菌的重要影响。肠球菌对β-内酰胺类、林可酰胺类和氨基糖苷类抗生素表现出固有耐药性，且可以通过获取质粒、转座子和整合元件等移动遗传元素（MGE）进入基因组，以及通过抗生素靶点的突变，轻易获得几乎所有临床使用抗生素的耐药性。在革兰阳性细菌中，对糖肽类抗生素的耐药性是一个主要问题，因为这些药物常用于治疗多耐药菌株感染。肠球菌是首个获得万古霉素高水平耐药的革兰阳性病原体，首批耐万古霉素肠球菌（VRE）于1986年在欧洲被分离。此后，VRE作为主要医院获得性感染病原体在全球范围内传播。在VRE出现后，开发了新的抗生素，最显著的是利奈唑胺和达托霉素，用于治疗VRE株感染。然而，也有报告显示肠球菌株已经获得对这些新型抗生素的耐药性。    在本综述中,在本次综述中，我们描述了肠球菌获取对最后防线抗生素耐药性的机制。这些不同的策略总结在图1中，该图概述了迄今在肠球菌中描述的主要耐药机制。 图1. 肠球菌抗生素耐药机制概述。肠球菌通过内在耐药机制或获得耐药性后（通过突变或水平基因转移）产生抗生素耐药。具体而言，肠球菌对氨苄西林的耐药性是通过青霉素结合蛋白突变实现的，这些蛋白对 β -内酰胺类抗生素的亲和力较低；而内在耐药性则通过存在替代肽聚糖交联途径实现；对氨基糖苷类的低水平耐药源于这些分子的摄取障碍，粪肠球菌则因染色体上存在编码6-N-氨基糖苷乙酰转移酶的基因；高水平耐药则由获得修饰氨基糖苷类的额外酶或核糖体突变引起。对万古霉素的耐药涉及肽聚糖合成途径的改变，表现为药物结合亲和力降低。达托霉素耐药通常涉及包膜应激和磷脂代谢途径的突变（如LiaFSR、WalKR/YycFG、GdpD和Cls）。此外，LiaFSR和WalKR汇聚于介导磷壁酸d-丙氨酰化的dltABCD（Dlt）途径，该途径通过增加表面正电荷从而改变与脂肽（达托霉素）及某些情况下糖肽的相互作用。利奈唑胺耐药性通过以下两种途径产生：一是获得可保护23S rRNA基因免受抗生素作用的耐药基因，二是发生影响核糖体中利奈唑胺结合位点的突变。肠球菌的抗生素耐药性    肠球菌对广谱抗生素的耐药性β-内酰胺类抗生素通过抑制青霉素结合蛋白（PBPs）的活性发挥作用，这些酶对于肽聚糖的合成至关重要，而肽聚糖是细菌细胞壁的重要结构成分。这种抑制会导致细胞壁完整性受损，最终导致细菌裂解和死亡。肠球菌已经进化出多种对 β-内酰胺类抗生素的内在耐药机制，最显著的是通过产生对这些药物亲和力显著降低的 PBPs。这种内在耐药性是肠球菌生物学的一个关键特征，在主要研究的屎肠球菌和粪肠球菌中体现明显，两者分别表达低亲和力的 PBP（PBP4 和 PBP5）。这些低亲和力 PBPs 显著降低了 β-内酰胺类抗生素的杀菌效果，使得用这些抗生素治疗肠球菌感染的效果减弱。此外，这些 PBPs 可以进一步进化，获得额外突变，从而导致高水平的 β-内酰胺耐药性。此外，抑制 PBP 表达的抑制子功能丧失的突变可能导致低亲和力 PBPs 的过度产生。虽然 β-内酰胺酶的产生是革兰氏阴性细菌中 β-内酰胺耐药的主要机制，但这一机制在肠球菌中似乎重要性有限。虽然已有获得了葡萄球菌 blaZ 基因的粪肠球菌菌株的报道，但这些菌株似乎很少见，并且没有证据表明 blaZ 的存在会导致粪肠球菌的表型β-内酰胺耐药性。除了低亲和力的PBP5，适应医院环境的屎肠球菌（E. faecium）还可以通过由L,D-转肽酶（LDT）Ldt_fm催化的L,D-转肽化途径抵抗β-内酰胺类抗生素，该途径作为PBP介导的D,D-转肽化的旁路。大多数β-内酰胺类药物无法抑制该途径，但碳青霉烯类可以使Ldt_fm失活。然而，由于在临床粪肠球菌株中几乎普遍存在pbp5的突变等位基因，从而赋予对β-内酰胺类的耐药性，碳青霉烯抑制L,D-转肽化途径在临床上并无实际意义。在粪肠球菌（E. faecalis）中，这种LDT介导的旁路并不对β-内酰胺耐药性产生贡献，β-内酰胺耐药性通常涉及pbp4的过表达和/或突变。与粪肠球菌和屎肠球菌相比，其他肠球菌对β-内酰胺类药物的耐药性似乎较为罕见。     氨基糖苷类抗生素作用于细菌30S核糖体亚单位中16S rRNA片段的A位点，干扰翻译起始，抑制肽链延长，并破坏蛋白质合成。这些杀菌剂在指数生长期最为有效。典型的氨基糖苷类药物包括庆大霉素、链霉素和妥布霉素。屎肠球菌对氨基糖苷类抗生素表现出固有耐药性，这在很大程度上是由于染色体上的efmM基因，该基因编码一种16S rRNA甲基转移酶，作用于C1404位点。药物结合口袋中的一个关键核苷酸，从而降低氨基糖苷类药物的活性。高水平氨基糖苷类耐药性定义为庆大霉素最小抑菌浓度（MIC）≥ 500 μg/ml 和链霉素 MIC ≥ 2000 μg/ml，这是一种水平获得性特征，主要由氨基糖苷类修饰酶介导，这些酶通过酶促作用改变氨基糖苷，使其失效。     氨基糖苷修饰酶根据催化机制分为三大类：O-磷酸转移酶（APH）、N-乙酰转移酶（AAC）和O-核苷转移酶（ANT）。在肠球菌中，由aph（2“）-Ib和aph（2”）-Id基因编码的APH酶，以及由aac（6'）-aph（2“）基因编码的双功能酶AAC（6'）-APH（2”），共同介导高水平的庆大霉素耐药性。AAC(6’)-Ie-APH(2”)-Ia 是肠球菌中最常见的氨基糖苷类修饰酶，而 aph(2”)-Ib 和 aph(2”)-Id 在临床分离株中报道较少。高水平链霉素耐药主要与ANT基因的活性相关，特别是由ant（6'）-Ia和ant（3）-Ia基因编码的基因。许多氨基糖苷类耐药基因，包括aac（6'）-Ie-aph（2“）-Ia，均由MGE携带，使其能够在肠球菌及其他细菌物种间传播。     除了上文讨论的耐药基因外，肠球菌还获得了对其他类别抗生素的耐药性，包括四环素和大环内酯类抗生素。这些耐药性在很大程度上归因于耐药基因的水平转移，特别是 tetL 和 tetM，它们使细菌对四环素产生耐药性，以及 ermB，它使细菌对大环内酯类抗生素产生耐药性。此外，屎肠球菌（E. faecium）携带染色体上的 msrC 基因，这有助于其本身对大环内酯类抗生素的耐药性。粪肠球菌（Enterococcus faecalis）缺乏 msrC 基因，依赖获得性的大环内酯耐药决定因素，如 erm(B) 或 mef(A/E)。 图2. 青霉素对肽聚糖生物合成的影响。糖肽类抗生素靶向肽聚糖前体的末端结构（d-丙氨酰-d-丙氨酸，d-Ala-d-Ala），从而阻碍肽聚糖层的交联并抑制细胞壁合成。肠球菌对最后一线抗生素的耐药性     上述对广谱抗生素的多样耐药机制显著增加了肠球菌感染治疗的复杂性。因此，在1970年代和1980年代，糖肽类抗生素万古霉素在治疗多重耐药肠球菌感染中的使用变得更加广泛。万古霉素临床使用量的增加，再加上糖肽类抗生素阿伏霉素在畜牧业中作为生长促进剂的使用，形成了强烈的选择压力，从而促进了耐药性的选择。万古霉素耐药菌株首次在1980年代中期被发现，并自此在全球范围内传播。万古霉素及其他糖肽类抗生素     肠球菌的万古霉素耐药性是通过获取若干编码酶促途径的基因簇介导的，这些途径导致肽聚糖肽链末端残基的替换。这些基因簇被命名为 vanA、vanB、vanC 等，直到 vanP。不同的基因簇是根据其酶的组成差异命名的。获取 vanA 和 vanB 基因簇是屎肠球菌和粪肠球菌 E. faecalis 中万古霉素耐药的最常见原因，在卡赛黄链球菌和鸡链球菌物种中，由于存在vanC型基因簇，万古霉素耐药性是固有的。偶尔，这些有运动性的物种通过携带在接合质粒上的Tn1546型元件获得了vanA，导致高水平的糖肽类耐药性。更少见的是，在E. gallinarum中已报道与Tn1549类整合和接合元件相关的vanB。其他基因簇的分布不那么广泛，尽管据报道vanM基因簇在中国相对常见，但在其他地方并不常见。     vanA、vanB、vanD 和 vanM 基因簇将肽聚糖肽链末端的 d-Ala 残基转化为 d-Lac，生成 d-Ala-d-Lac。万古霉素对 d-Ala-d-Lac 的亲和力仅为对 d-Ala-d-Ala 的千分之一，因此拥有这些基因簇的菌株通常表现出高水平的万古霉素耐药性。VanP 耐药尚未经过生化特性鉴定，但很可能也涉及用 d-Lac 取代 d-Ala。另一方面，vanC、vanE、vanG、vanL 和 vanN 基因簇将 d-Ala 残基转化为 d-Ser，生成 d-Ala-d-Ser，从而使万古霉素的亲和力降低约七倍，导致对万古霉素的耐药水平相对较低。这种细菌细胞壁结构的改变是万古霉素疗效降低的关键（图 2）。值得注意的是，由 vanB 赋予的耐药性通常不会扩展到与万古霉素结构相似的另一种糖肽类抗生素替考拉宁。机制上，尽管万古霉素和替考拉宁都靶向 d-Ala-d-Ala 末端，但替考拉宁不会激活由 vanB 基因簇编码的 VanB 双组分系统（VanSB/VanRB）；因此，vanB 操纵子不会被诱导，VanB 型菌株通常仍对替考拉宁敏感。相比之下，替考拉宁能有效激活 VanA（VanSA/VanRA）系统，诱导 vanA 操纵子表达并产生 d-Ala-d-Lac 末端，从而赋予对万古霉素和替考拉宁的交叉耐药性。这一区别突显了在由 vanB 阳性肠球菌引起的感染中使用替考拉宁的潜在临床价值，因为此时万古霉素治疗可能无效。     万古霉素耐药基因在肠球菌中的传播主要由各种移动遗传元素（MGEs）驱动，包括转座子、质粒、整合性接合元件和插入序列元件。最新研究显示，vanA/Tn1546 通常存在于 Inc18 型质粒上，但也可以由 pRUM 类（RepA_N）和线状质粒携带，凸显了可促成 vanA 在肠球菌中传播的质粒的多样性。值得注意的是，质粒在万古霉素耐药传播中起着关键作用，使基因能够在不同细菌物种之间转移。例如，pIP816 以及高拷贝数多重耐药质粒不仅携带 vanA 基因簇，还可能携带其他耐药决定因素，促进肠球菌多药耐药表型的出现。插入序列（IS）元件，如IS 1216和IS 1251，被认为通过破坏或改变van操纵子内的调控区，尤其是在vanS–vanH和vanX–vanY之间，从而增加vanA基因的表达，这可能增强启动子活性或改变转录终止，从而促进高水平的万古霉素耐药性。     万古霉素耐药在屎肠球菌（E. faecium）中的发生率高于粪肠球菌（E. faecalis）。在欧洲，临床屎肠球菌株的万古霉素耐药发生率从2012年的8.1%上升到2018年的19.0%，而粪肠球菌的万古霉素耐药发生率保持在1.1%稳定水平。在亚洲，万古霉素耐药更为普遍，但屎肠球菌的耐药率仍高于粪肠球菌（22.4% vs 3.7%）。在美国，万古霉素耐药尤为普遍，82%的临床屎肠球菌分离株已获得耐药性，而粪肠球菌的耐药发生率显著较低，仅为7.2%。屎肠球菌相比粪肠球菌万古霉素耐药率更高，可能是多种遗传和环境因素共同作用的结果。它们在获得和保持移动遗传元件（MGE）方面的能力差异起了重要作用，屎肠球菌携带更广泛、更具多样性的IS元件，如IS 256、IS 3和IS 982，这有助于耐药基因的获取和传播。     此外，IS 16的存在，这一标志物与医院适应型屎肠球菌相关，被假设有助于其在院内环境中的适应性和持久性。IS Efa5 已在多个屎肠球菌基因组中发现，它会发生频繁的切除和插入事件，也有助于基因组的可塑性。近年来，IS L3家族与医疗环境中的屎肠球菌的快速进化和生态位适应有关。因此，屎肠球菌显著的基因组可塑性使其能够迅速适应抗生素选择压力，尤其是在水平基因转移起关键作用的医院环境中。目前对能够解释粪肠球菌中万古霉素耐药率较低的基本机制研究较少，但可能是由于携带万古霉素耐药基因的移动遗传元素在该物种中具有相对较高的适应性代价。     近年来，已发现一组表型上对万古霉素敏感的粪便菌株携带vanA或vanB基因簇，这种表型被称为万古霉素变异屎肠球菌（VVE）。从机制上讲，这种变异通常是由于万古霉素操作子调控元件的破坏造成的——例如在 vanR 基因或其启动子中插入 IS 元件——从而削弱了万古霉素抗性基因的可诱导表达。VVE 分离株因其在万古霉素暴露下可能恢复为高水平耐药表型而受到临床关注。VVE也带来了诊断挑战，并凸显了基因组监测在检测可能规避常规感受能力检测的无声抵抗决定因素中的重要性。     除了屎肠球菌E. faecium和粪肠球菌E. faecalis在获得和稳定维持可移动遗传元件（MGEs）能力上的差异外，生态位特化、细胞包膜结构以及肠道微生物群内的相互作用等因素，也可能促成抗性基因在屎肠球菌E. faecium和粪肠球菌E. faecalis之间差异性持续存在。需要进一步研究以全面阐明这些因素的相对贡献及其对VRE流行病学的影响。新型糖肽类抗生素     除了万古霉素和替考拉宁外，糖肽类衍生物现在也正在进入临床应用，其中包括达巴万星、奥利万星和特拉万星（图3）。这些都是脂糖肽类抗生素，其特征是在分子中增加亲脂性侧链，从而增强膜附着和二聚化，进而提高抗菌活性和延长半衰期。这些新型抗生素已获得美国食品药品监督管理局批准，用于治疗急性细菌性皮肤及皮肤结构感染。达巴万星在结构和药代学方面比传统糖肽类具有明显优势。达巴万星的长疏水性烷基侧链增强了膜相互作用并促进二聚化，显著提高其杀菌效力。这一结构改造将达巴万星在人体内的半衰期延长至约149-250小时，使其可以每周一次给药，从而提供了比万古霉素更为方便的替代方案。达巴万星对含有vanA基因簇的VRE无效，但对携带vanB基因簇的VRE菌株有效。这一差异可能是因为达尔巴凡星无法激活vanB基因簇编码的VanRB/VanSB双组分调控系统。与万古霉素不同，万古霉素可以被VanSB易于感知并触发VanRB的磷酸化，从而诱导耐药基因表达，而达巴万星被认为很难被VanS识别。因此，VanRB 未被激活，vanB 操纵子保持沉默，使细菌在表型上对达巴万星（dalbavancin）仍然敏感。尽管临床耐药性仍相对罕见，但已有报道显示，在其他革兰阳性细菌中，在选择性压力下会出现对达巴万星敏感性的降低。在表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中，达巴万星敏感性降低与编码 WalKR 两组分调控系统基因的突变相关，该系统是细胞壁稳态的关键调控因子。在肠球菌中，WalKR（又称 YycFG/VicRK）两组分系统（TCS）高度保守，被认为是唯一必需的两组分系统，作为细胞外膜稳态的中央协调器。在粪肠球菌（E. faecalis）中，通过内源性反义 RNA 抑制 walR 的转录和翻译可减少生物膜形成并减弱体内毒力，并且在 β-内酰胺抗生素压力下的实验进化反复选择 walKR 突变，这与其在细胞外膜应激适应中的作用一致。类比于厚壁菌门中的其他物种，尤其是金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），预计 WalKR 能稳态调控肽聚糖水解酶，但目前仍缺乏直接证明 WalKR 在肠球菌中具有这种调控作用的机制证据。因此，目前关于 walKR 突变与达巴万星及其他糖肽类药物敏感性之间因果关系的证据有限。然而，这些研究结果表明 WalKR 可能在肠球菌中调节糖肽类药物敏感性，并且 WalKR 已被提出作为革兰阳性细菌抗生素开发的潜在靶点，因此有必要进一步研究肠球菌中的这一两组分系统。      与达尔巴万星相比，奥利万星对VRE显示出更广谱的活性。与达巴万星一样，奥利万星通过二聚化来增强其与革兰阳性菌肽聚糖的结合亲和力。然而，奥利万星具有额外的疏水性修饰，包括4-氯联苯甲基基团，这进一步增强了其膜锚定能力，并使其能够破坏细菌膜的完整性，从而增加了其对VRE的广谱活性，包括携带vanA和vanB基因簇的菌株。奥利万星不仅通过抑制糖苷转移和肽转移步骤破坏肽聚糖合成，还能有效结合d-Ala-d-Lac，从而在对VRE保留活性。值得注意的是，最近的临床研究为奥利万星治疗肠球菌感染（包括由VRE引起的感染）提供了有希望的证据。一项回顾性多中心研究表明，奥利万星在治疗由革兰阳性病原体（包括VRE）引起的血流感染、心内膜炎和骨髓炎方面取得了成功。此外，来自欧洲医疗中心和美国血流感染队列的监测数据显示，其对肠球菌（包括表现出vanA介导耐药的菌株）具有强大的体外活性。其脂溶性侧链进一步促使其锚定在细胞膜上，从而增强对VRE的疗效，即使在存在vanA基因簇的情况下，其最低抑菌浓度（MIC90）仍低至0.06 μg/ml。这些特性使奥利万星成为治疗耐万古霉素肠球菌感染的有前景的药物。需要进一步的临床评估，以明确其在肠球菌疾病中的全部治疗潜力。      泰拉万星进一步丰富了脂糖肽类抗生素的种类。与奥里万星和达巴万星类似，泰拉万星通过结合肽聚糖前体来抑制细菌细胞壁的合成。然而，它表现出独特的双重作用机制，从而增强了其杀菌活性。除了通过靶向脂质II阻断转糖基化和转肽化步骤外，泰拉万星还破坏细菌膜的完整性。这一作用得益于其疏水性的癸氨基乙基侧链，该侧链与脂质双层相互作用，导致膜去极化、离子泄漏，并最终导致细胞死亡。除了达巴万星、奥里万星和泰拉万星，下一代万古霉素衍生物，如可变形的布尔瓦仑连接万古霉素二聚体（SVDs），也已被开发出来以应对抗生素耐药性的挑战。不同于通过引入亲脂性侧链进行膜锚定的脂糖肽类，SVDs 利用动态布尔瓦仑支架来增强二聚化和适应性，从而提高其对 vanA 型耐万古霉素肠球菌（VRE）的疗效。通过化学修饰合成的其他新型糖肽也正在研究中，以评估其克服治疗耐药菌株局限性的潜力。 图3. 糖肽类抗生素的结构比较。万古霉素和替考拉宁属于第一代糖肽类抗生素，具有保守的七肽核心结构，但替考拉宁的亲脂性侧链更长，能增强与细胞膜的相互作用。替拉万星的独特之处在于其癸基氨基乙基侧链和膦酰甲基基团，这些结构特征有助于膜去极化和离子外渗。达巴万星源自替考拉宁类似物A40926，其C11位的烷基侧链延伸，可改善药代动力学特性并增强膜亲和力。奥利万星含有4,4‘-氯联苯甲基基团，既能强化膜锚定作用，又能破坏细菌细胞膜。这些结构差异直接影响了它们的抗菌机制和耐药性特征。氧唑烷酮类抗生素及其耐药性     利奈唑胺和泰地唑胺分别于2000年和2014年被美国食品药品监督管理局批准，旨在对抗多重耐药革兰氏阳性菌引起的感染。这些抗生素通过靶向细菌核糖体中的50S亚基，破坏蛋白质合成过程，抑制起始复合物的形成，类似于氯霉素类和林可霉素的机制。     对利奈唑胺的抗性既由染色体突变也由可转移耐药基因的获得赋予。23S rRNA基因的结构域V内的突变，特别是G2576U突变，显著降低了利奈唑胺的结合亲和力，导致耐药性。其他突变通常涉及氨基酸取代、缺失或插入，这些变化改变了核糖体中的药物结合位点，降低了利奈唑胺亲和力并赋予耐药性。除了这些染色体突变外，肠球菌还获得了可转移的恶唑烷酮耐药基因（cfr、optrA 和 poxtA），这显著增加了对利奈唑胺的耐药性。      cfr 基因最初是在来源于动物的葡萄球菌属中发现的，但现在已在临床肠球菌分离株中发现，这突显了抗生素耐药性的动物源性特征。cfr基因家族包括多个同源基因，如cfr（B）、cfr（C）、cfr（D）和cfr（E），它们在功能相似性上存在联系，但在序列和分布上不同。这些基因共同编码一种RNA甲基转移酶，靶向23S rRNA中的腺嘌呤2503，从而对多种抗生素类别产生耐药性。A2503残基的甲基化阻碍了氯霉素类、林可酰胺类、恶唑烷酮类、Pleuromutilins和链霉素A的有效结合，最终导致PhLOPSA多药耐药表型。在葡萄球菌和肠球菌中，CFR已在多种质粒、转座子和整合共轭元件上被鉴定，尽管所涉及的具体元素在不同属之间有所不同。在金黄色葡萄球菌中，cfr常见于p12-00322、pSCFS3和pSCFS7等质粒上，并与促进物种间转移的转座子如Tn 558结合。在肠球菌中，该基因也主要与质粒相关，而不是与染色体元件相关，并且在屎肠球菌（E. faecium）和粪链球菌（E. faecalis）之间存在差异。虽然pE35048-oc质粒已在屎肠球菌中报道，但粪链球菌往往在不同的质粒骨架上携带cfr，其中一些还与额外的耐药基因相关，包括optrA和poxtA。     对表现出利奈唑胺耐药性的肠球菌分离株的研究强调了第二个耐药决定因素 OptrA 的作用，它影响对利奈唑胺和泰地唑胺的耐药性。最初在一种临床分离的粪肠球菌 E. faecalis 菌株中被检测到，后续研究报道 OptrA 出现在屎肠球菌、E. avium、E. hirae 和 E. gallinarum 中。OptrA 基因似乎具有特别的传染性，还被报道存在于其他革兰氏阳性菌中，包括金黄色葡萄球菌、猪链球菌和猪链球菌属。中国最近的监测显示，OptrA 主要在来源于食用动物的肠球菌分离株中被检测到，而在人类分离株中的出现频率似乎较低。OptrA 基因编码一种 ATP 结合盒（ABC）-F 蛋白，通过保护抗生素作用靶点免受药物结合，从而促进耐药性。OptrA 的广泛分布及其与家畜抗生素使用的关联，引发了关于该耐药基因在动物相关和环境细菌间持续传播潜力的担忧。第三种利奈唑胺耐药基因，称为 poxtA，最初在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中被描述，其基因产物也被发现是 ABC-F 蛋白，类似于 OptrA。PoxtA 与 OptrA 的氨基酸同一性仅为 32%，强烈表明这些基因是独立进化的。对不同欧洲国家的临床肠球菌菌株培养收藏分析发现，poxtA 和 optrA 比 cfr 基因在利奈唑胺耐药肠球菌株中更常见。值得注意的是，optrA 基因在粪肠球菌 E. faecalis 中似乎比在屎肠球菌中更常见，而 poxtA 基因在屎肠球菌中比在粪肠球菌 E. faecalis 中更普遍。     在肠球菌中，恶唑烷酮耐药基因的传播受到它们与移动遗传元件（MGE）相关性的强烈促进。poxtA 基因常被 IS 1216E 元件所包围，这有助于其转移和稳定整合。。此外，携带 poxtA 的质粒经常共携带其他耐药决定因子，例如苯甲酰氯类外排基因 fexB 以及四环素耐药基因 tetM 和 tetL，这表明选择压力可能推动其共选择和持续存在。值得注意的是，实验证据表明，一些携带 poxtA 的质粒具有接合转移能力，使肠球菌之间能够进行水平基因转移，进一步加速耐药性的传播。中国的多项研究显示，cfr、optrA 和 poxtA 在动物肠道以及医院废水中广泛存在，且肠球菌是这些耐药基因最重要的宿主。在中国，肠球菌中这些耐药基因的高流行率，尤其是在从牲畜分离的菌株中，表明农业用药对 optrA 和 poxtA 的出现和传播施加了强烈的选择压力。     质粒介导的恶唑烷酮耐药基因的出现和传播对公共健康构成了重大关注。这些基因与来源于动物和环境库的肠球菌相关，强烈提示其与农业中抗生素的使用有关。值得注意的是，恶唑烷酮类抗生素并未用于畜牧业，但 cfr、optrA 和 poxtA 也可提供对苯基氯霉素类抗生素的耐药性，而该类抗生素在农业中被广泛使用，并且在人体医学中被认为重要性有限。携带恶唑烷酮耐药基因的移动遗传元件（MGE）的令人担忧的出现和传播，只有通过跨部门的举措来限制抗生素的使用，并提高对提供多类抗生素耐药性的耐药基因风险的认识，这一现象被称为跨类耐药，才能加以解决。达托霉素      达托霉素于1987年被发现，并于2003年获批用于临床，是一种环状脂肽类抗生素，已成为治疗由革兰阳性病原体引起的难治性感染的重要选择药物。与大多数历史上仅限于局部应用的膜靶向抗生素不同，达托霉素可以全身使用。这一特性具有显著优势，因为这类膜活性抗生素相比传统针对单个蛋白靶点的抗生药，其抗药性诱导速度更慢。     达托霉素具有独特的作用机制，它以1:1的摩尔比与Ca2+离子结合，这些复合物插入细胞质膜，导致细胞内离子和三磷酸腺苷（ATP）泄漏，从而杀死细菌。最近已经证明了一种替代的杀菌机制，其中达托霉素通过在膜中聚集脂质 II 来抑制细胞壁合成，从而阻止膜结合酶，如 MurG，接触其底物，停止肽聚糖的组装（见图4）。两种因素对达托霉素的抗菌效果至关重要。首先，定义复合物的形成，例如二聚体 Dap2 Ca3 PG2 复合物，使其能够稳定且有针对性地结合到富含磷脂酰甘油 (PG) 的细菌膜区域。其次，这些复合物可以进一步组装成小型的嵌入膜的寡聚体，作为瞬时离子载体，允许离子穿过膜而不形成永久性孔洞。这种局部调节的离子泄漏导致膜去极化，这是导致细菌细胞死亡的关键事件之一。这一提出的机制将达托霉素与经典的孔形成肽如蜜蜂毒素或革兰霉素区分开来，并突出了其更微妙但高度特异的作用方式。达托霉素耐药机制      随着达托霉素的临床应用，已经观察到肠球菌的耐药性上升。这种耐药性主要源自细胞膜脂质组成的改变，特别是磷脂酰甘油（PG）水平的变化，这会削弱药物与膜结合的能力。此外，肠球菌中达托霉素耐药性的出现似乎涉及多种突变，尤其是那些负责细胞膜应激反应和磷脂代谢的基因。与达托霉素耐药性特别常相关的突变基因包括 LiaFSR 系统和 yycFGHIJ（WalKR）操纵子中的基因，以及对磷脂稳态至关重要的酶，如甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（GdpD）和心磷脂合酶（Cls）。尽管粪肠球菌（E. faecalis）和屎肠球菌（E. faecium）在基因上有相似之处，但在暴露于达托霉素后，它们表现出不同的耐药进化轨迹，这些将在下文中进一步讨论。在非屎肠球菌和非粪链球菌中，达托霉素耐药似乎很少见，唯一的例外是Hirae菌株，在家畜和环境中常能分离出达托霉素耐药菌株。E. hirae 对达托霉素的耐药机制目前尚不清楚。下面，我们还将描述最近关于革兰阳性菌中出现可移动达托霉素耐药性的证据，包括肠球菌属中的情况。 图4. 达托霉素的双重作用机制示意图。达托霉素是一种钙依赖性脂肽类抗生素，专门针对革兰氏阳性菌。当钙离子结合时，达托霉素会插入细菌细胞膜。左图：达托霉素促使膜内脂质II聚集，形成空间位阻，阻碍肽聚糖生物合成关键酶（主要是脂质II合成酶MurG）与膜结合。这种空间干扰抑制了肽聚糖合成，导致细胞壁生长受阻。右图：达托霉素破坏膜微结构域，引发膜去极化但不形成大孔。由此产生的膜电位（Δψ）缺失会损害膜功能，最终导致细菌死亡。粪肠球菌的达托霉素耐药性     体外进化实验揭示了肠球菌获得达托霉素抗药性的常见遗传途径。在逐步增加达托霉素暴露的条件下，实验室菌株通常会在一组核心的细胞包膜调控和生物合成基因中产生突变，特别是编码LiaFSR三组分应激反应系统的基因。值得注意的是，这些相同的突变也已在临床分离株中发现，强调了体外和体内抗药性机制的趋同进化。累积的证据表明抗药性具有有序的两步进程：首先在LiaFSR调控基因中发生突变（如liaF的截断或liaR的点突变），激活细胞包膜应激反应，其次通过cls、gdpD或相关基因改变膜磷脂代谢，重塑细胞膜并降低达托霉素的结合效力。除了这些经典的抗药性突变外，还记录了其他遗传贡献者。例如，一项体外研究在逐步适应达托霉素过程中发现了七个位点的突变，包括一个全局转录调控因子（rpoN），提示在主要途径受阻时存在通向抗药性的替代途径。同样，转座子测序（Tn-seq）方法也强化了LiaFSR回路和膜稳态基因的核心作用：扰动与LiaFSR相关的因子liaX或细胞包膜重构途径（如负责糖醇酸d-丙氨酸化的dlt操作子）会使肠球菌对达托霉素敏感，确认这些元件在抗生素应激下的存活中至关重要。     独特地，粪肠球菌（E. faecalis）在细胞膜中表现出磷脂小域的重组，这种模式有别于金黄色葡萄球菌（S. aureus）或屎肠球菌（E. faecium）中观察到的模式。在非耐药菌株中，阴离子磷脂如心磷脂在分裂隔膜和极区高度密集。尽管磷脂酰甘油（PG）是达托霉素的主要结合靶点，心磷脂在组织膜曲率和小域定位中起着关键作用，特别是在细胞分裂部位。在耐药菌株中，这些结构被破坏，导致这些脂质重新分布，从而阻止达托霉素进入其靶位点，有效降低其杀菌活性。这种磷脂的重排被认为是一种诱饵机制，将抗生素从重要膜区域引开。观察到的脂质重新分布可能是由 LiaFSR 系统介导的调控重编程的下游效应。特别是，LiaR 中的 D191N 突变模拟磷酸化并诱导二聚体向四聚体的构象转变，大大增强了 DNA 结合亲和力并上调应激反应。另一方面，删除 liaR 会导致高度易感表型，最小抑菌浓度（MIC）降至低至 0.094 μg/ml，凸显该系统在介导达托霉素耐药性中的关键作用。LiaFSR 通路中的突变通常伴随其他遗传改变，这些改变共同促进粪肠球菌中更强的达托霉素耐药表型。例如，编码心磷脂合酶的 cls 基因的改变——如 R218Q 取代或 N77–Q79 缺失——可增强实验室菌株如 OG1RF 的耐药性。同样，gdpD 基因的突变已显示可与 liaF 突变协同作用，产生完全耐药表型。此外，在由 LiaR 转录调控的 liaXYZ 操纵子中也发现了其他突变。这些基因被认为在应对包膜应激时调节膜的重塑。值得注意的是，LiaY 与 Cls 共定位，有助于形成非隔膜的心磷脂富集小域，这是达托霉素耐药的关键特征。此外，在耐药菌株中还发现了 yybT 和 gshF 的突变，分别与环二核苷酸信号传导和谷胱甘肽代谢相关。尽管它们的精确作用仍在研究中，这些基因参与了更广泛的应激反应网络，这些网络可能在抗生素作用下加强细胞包膜的韧性。屎肠球菌的达托霉素耐药性     与粪肠球菌（E. faecalis）一样，耐达托霉素在粪肠球菌（E. faecium）中也是通过细胞包膜的多方面遗传和生化适应产生的。虽然在粪肠球菌中有与达托霉素抗性功能类似的情况，屎肠球菌（E. faecium）也通过独特途径进化出达托霉素抗性。主要的抗性突变途径包括LiaFSR三组分调控系统和必要的WalKR两组分系统，后者是革兰氏阳性菌细胞包膜应激反应的保守调控因子。在耐达托霉素分离株中观察到的LiaFSR的构成性激活，会触发广泛的转录重编程，从而增强细胞包膜的防御——例如，通过增加dltABCD操纵子的表达，该操纵子负责脂磷壁酸的D-丙氨酰化及其他膜应激防御，这可能降低抗生素到达、结合和破坏细胞质膜的能力。值得注意的是，在临床分离株中已经报道了诸如LiaR 的 W73C 和 LiaS 的 T120A 等反复出现的突变，并且这些突变似乎共同进化以增强耐药性。在达托霉素耐药的肠球菌中，WalKR 双组分系统的改变已被证明导致肽聚糖合成和分隔分裂的重塑，     产生更厚的细胞壁，从而降低达托霉素的溶解效能。walKR突变对粪肠球菌的影响尚待阐明。另一种常见的适应是cls基因的突变，这会导致膜磷脂组合的扰动。CLS突变会重新分布阴离子心磷脂，减少细胞表面的净负电荷，阻碍达托霉素依赖钙的结合。与这些基因变化一致，耐达托霉素的屎肠球菌表现出改变的膜生理特性，包括细胞包膜带电更多以及膜流动性降低，这通过磷脂重构实现，例如赖氨酰卵磷脂（lysyl-PG）和环丙烷修饰脂肪酸的增加。虽然这些改动在达托霉素压力下能够增强生存能力，但它们往往会带来适应性权衡：耐药突变体通常生长较慢，毒力减弱，并且在缺乏药物时竞争力较差。在某些情况下，包膜的变化甚至会带来附带的敏感性——例如，某些耐达托霉素的屎肠球菌由于细胞包膜调控的相关改变而重新对糖肽类抗生素敏感。有趣的是，在抗生素压力缺失的情况下，IS元件插入li-aFSR位点，逆转耐药性并恢复易感性。     值得注意的是，最近的研究发现出现了优势的医院适应性屎肠球菌系，它们结合了达托霉素耐药性和细菌素产生能力，使其能够在肠道中优于其他肠球菌株并繁殖生长，尽管抗性带来了适应性成本。通过观察利福昔明预防可以促使抗达托霉素耐药性在粪链球菌中出现，进一步揭示了粪链球菌达托霉素耐药性演化的新见解。从机制上讲，利福昔明会选择 rpoB 基因（编码 RNA 聚合酶的 β 亚基）中的突变，这会导致 prdRAB 操纵子和细胞膜重塑的表达增加，从而使细菌对达托霉素产生耐药性。综合来看，现有证据表明，屎肠球菌的达托霉素耐药性并非由单一突变引起，而是一系列协调的调控和膜适应性变化，主要涉及 LiaFSR/WalKR 信号通路和膜脂重塑，这些变化增强了细胞包膜对抗生素的防御能力，但通常以整体适应度的降低为代价。移动性达托霉素耐药机制的出现     直到最近，人们认为肠球菌中多粘菌素耐药的所有已知机制都是通过染色体突变产生的。然而，最近的一项研究在一种与牲畜相关的Mammaliicoccus sciuri分离株中发现了一种新型水平获得的耐药决定因子——drc基因簇。该移动基因座编码一个类似BceAB的ABC转运蛋白及其调控系统，它们共同通过化学失活抗生素来介导高水平的达托霉素耐药。与walKR或liaFSR等基因的典型染色体突变不同，这一机制代表了一种不同的耐药策略，扩展了已知革兰氏阳性细菌达托霉素耐药的谱系。     尤为值得关注的是，drc基因座还在三株动物来源的粪肠球菌E. faecalis分离株中被鉴定出，其中一株表现出表型达托霉素耐药。在这些菌株中，drc基因被IS元件或类似Tn3的重组酶所夹持，并且至少在一例中似乎位于质粒上，这强烈暗示其在肠球菌群体中具有移动性。虽然其流行率仍然较低且主要局限于兽医环境，但其向人源肠球菌传播的潜在可能性引发了重要的临床关注。     持续的基因组监测和严格的抗菌药物管理将对限制这一可转移耐药元件的出现和传播至关重要。未来展望与总结评论     肠球菌尤其是屎肠球菌中多重耐药性的问题日益严重，因为这种病原体能够通过水平基因转移巧妙地积累抗生素耐药基因。为了应对肠球菌中抗生素耐药性不断上升的趋势，迫切需要超越传统抗生素的创新疗法。抗耐万古霉素肠球菌（VRE）的治疗格局正在超越传统抗生素，融合了下一代合成药物和创新生物制剂。德帕唑胺Delpazolid这是一种通过作用于50S核糖体亚单位抑制蛋白质合成的下一代恶唑烷酮类药物，在二期临床试验中显示出血液学毒性降低。艾拉普林Iclaprim一种靶向细菌二氢叶酸还原酶的二氨基嘧啶类药物，已完成三期研究，并在临床前模型中显示出强效的抗VRE活性。     在生物制剂策略中，一种口服噬菌体混合制剂（VRELysin）正在进行一期/二期试验，以选择性地清除肠道VRE。与此同时，工程化噬菌体衍生的溶菌酶——细胞壁降解酶——在临床前模型中对难治性屎肠球菌和粪肠球菌分离株显示出强大的杀菌活性。针对肠球菌表面抗原的单克隆抗体，如荚膜多糖和分泌的毒力因子，在体外显示出增强的调理吞噬杀伤作用，并正在进入晚期临床前开发阶段。     虽然这些策略大多仍处于研究阶段，但它们共同扩展了未来的治疗武器库，并强调了专注于多重耐药肠球菌的转化研究的紧迫性。除了这些研究策略外，抗生素开发流程中还出现了多种具有有前景抗肠球菌活性的药物。这些包括具有新机制或改进药理特性的化合物。拉德唑胺是一种第二代氧沙唑烷酮，具有二元基间隔和异链侧链，能在生理pH下改善电离和亲水性，在体外效力更优，对肠球菌的活性比利奈唑胺高约4–16倍。康泰唑胺（MRX-I）是一种具有未证实安全性的下一代氧唑烷酮，在体外对VRE表现出强效活性，且与利奈唑胺相比，耐受性较佳。其静脉前药康替唑胺acefosamil（MRX-4）目前处于临床开发阶段，可用于口服和静脉给药治疗多重耐药革兰氏阳性感染。泰斯巴汀Teixobactin是一种首创抗生素，靶向保守的细胞壁前体脂质II和III，也已证明对VRE具有强效的体外活性。为提高合成可及性和药代动力学特性，已开发出多种类似物——如d -Arg4 - Leu10 - Teixobactin，在临床前研究中保持了强的抗肠球菌疗效和最小的细胞毒性。然而，由于粪肠球菌对Teixobactin具有较高的内在耐受性（Darnell等，2019），该抗生素在治疗肠球菌感染方面可能效用有限。此外，MGB-BP-3是一种新型小沟DNA结合剂，通过选择性靶向革兰氏阳性菌DNA中富含AT的再基因元来发挥杀菌活性。该药物已证明对万古霉素敏感和耐药肠球菌具有强效体外活性，并因其独特的绕过经典耐药途径机制。虽然大多数候选药物仍处于早期研究阶段，但它们代表了从现有药物结构异体向真正新颖药共体转变的趋势。它们与耐药决定因子基因组监测结合的持续进展，或许为解决多药耐药肠球菌这一持续挑战提供了可持续的途径。     尽管新型抗生素候选药物的开发已取得显著进展，但粪肠球菌，尤其是屎肠球菌的多重耐药问题仍然是一个紧迫的挑战。这种病原体不仅能逃避新型治疗，还能迅速积累耐药基因，因此需要超越传统抗生素的替代方法。针对这一日益严重的威胁，噬菌体疗法已成为一种有前景的解决方案。通过利用噬菌体靶向特定的细菌株，噬菌体疗法代表了一种量身定制且高度可适应的传统抗菌疗法补充或替代方案。例如，一项临床病例研究描述了在一例一岁肝移植受者中，联合抗生素疗法成功使用静脉注射噬菌体疗法治疗由耐万古霉素肠球菌引起的危及生命的腹部感染。采用个性化双噬菌体组合治疗后临床迅速改善，序列测序显示感染转变为万古霉素易感株，凸显噬菌体疗法控制感染和调节耐药动态的潜力。另一例研究中，噬菌体与抗生素联合治疗粪便菌血症，但疗效较差，噬菌体治疗后菌血症复发。     除了噬菌体治疗外，非单克隆治疗策略，尤其是单克隆抗体，正作为针对多重耐药性肠球菌的靶向干预手段受到关注。临床前研究表明，针对粪肠球菌表面抗原（如聚集物质和荚膜多糖）的单克隆抗体，可以增强动物感染模型中的噬细胞杀伤能力并赋予保护作用。值得注意的是，实验研究强调了表面相关毒力因子，如心内膜炎和生物膜相关的菌毛（Ebp）和明胶酶（GelE），在屎肠球菌心内炎发病机制中起着关键作用。在动物模型中破坏这些因子显著减弱了细菌的毒力，减少了心脏定植，并改变了免疫反应，从而消除了它们作为未来免疫治疗靶点的潜力。     目前尚无针对肠球菌的获批疫苗，粪肠球菌也无候选疫苗处于临床开发阶段;尽管如此，临床前研究的流程已经扩大。包括菌毛（Ebp/EbpA）、表面粘附素（SagA）和金属结合脂蛋白（EfaA/AdcA/AdcAII），以及来自膜囊泡的抗原等多种抗原都可以作为疫苗靶点。小鼠模型研究显示，这些抗原中的几种具有保护作用，支持其作为疫苗候选者的可能性。值得注意的是，粪肠球菌AdcA免疫能保护其他革兰氏阳性病原体感染。这一观察促进了一种高温稳定、多呈导抗原Sc（EH）3的开发，该抗原有望用于肠球菌、金黄色葡萄球菌和链球菌感染的疫苗。这些免疫疗法可能作为传统抗菌药的有前景的辅助或替代方案，尤其适用于免疫功能低下患者或快速清除病原体至关重要时。随着耐药机制持续削弱小分子抗生素的疗效，免疫治疗可能在肠球菌感染管理中发挥越来越重要的作用，促使进一步的临床开发和转化投资。     尽管肠球菌中抗生素耐药机制的快速积累令人极为担忧，但仍有大量机会开发未来的治疗方式和创新疗法，以成功治疗由多重耐药菌株引起的感染。此类策略的开发和应用需要严格的抗菌药物管理以及对耐药模式的持续监测，以有效管理和减轻与多重耐药肠球菌相关的风险。 Resistance to last-resort antibiotics in enterococci. FEMS MICROBIOL REV. 2025; 49 doi: 10.1093/femsre/fuaf057