Vancomycin Hydrochloride

摘要 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）通常栖息在生物膜和宿主细胞内，表现出对常规抗生素和免疫清除的高度耐药性，导致持续性和复发性感染。鉴于DNA在细菌增殖和致病性中的核心作用，它成为开发下一代抗菌剂的理想靶点。本研究报告了一种DNA靶向光敏剂（PS）TPE-CN的开发，旨在有效治疗MRSA相关感染。TPE-CN对细菌DNA具有高度特异性，且具有优异的膜通透性，能够破坏细菌的DNA和膜结构，从而有效消除漂浮型MRSA。此外，TPE-CN还能选择性地与巨噬细胞的溶酶体共定位，在不损害宿主细胞完整性的情况下，有效清除细胞内的细菌。进一步的体内研究验证了TPE-CN强大的抗菌效果，在严重MRSA感染模型中加速了伤口愈合。总的来说，本研究提出了一种精确靶向细菌DNA的分子设计策略，为应对耐药病原体提供了一个有前景的治疗途径，并推进了下一代抗菌疗法的发展。 1 引言 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）依然是全球范围内细菌感染的主要致病菌，在医院和社区环境中均构成了重大的医疗挑战。更为复杂的是，该细菌能够在宿主细胞内生存并形成生物膜，形成一种保护性屏障，使其免受抗生素的攻击，并促进其不受控制的增殖。当这些细菌定植于组织时，可以侵入各种细胞类型，引发严重的炎症反应，如骨髓炎、败血症和心内膜炎。当前MRSA治疗面临的主要挑战来自其机制的复杂性和透过性问题，这使得常规抗生素难以穿透哺乳动物细胞膜和生物膜，有效靶向持久的细菌菌株。尽管面临这些困难，但仍然过度依赖高剂量抗生素，这加剧了细菌对常规抗微生物药物的耐药性问题。 当前，迫切需要探索替代常规抗生素的方法，以实现有效的MRSA控制。尽管出现了一些新策略，如抗体-抗生素偶联物、肽-抗生素杂交物、基于纳米材料的抗生素以及噬菌体疗法，但由于技术复杂性以及在直接接触时细菌外膜的不一致性，导致细菌裂解，因此这些策略的临床转化仍然有限。有些策略也作为光敏剂（PSs）使用，在光激活下生成活性氧种（ROS），从而实现空间和时间受控的抗菌治疗。由于其独特的机制，这些光敏剂表现出低侵袭性、较低的耐药性发展潜力和良好的生物相容性，使其成为替代抗菌治疗的有吸引力的候选药物。然而，许多现有的光敏剂缺乏对细菌靶标的特异性，导致对宿主细胞和关键生物分子的非特意性损伤。这一局限性突显了迫切需要开发具有精确细菌识别和选择性清除能力的靶向光敏剂，以提高治疗效果和生物安全性。  细菌DNA在病原体的毒力、存活和传播中发挥着核心作用，使其成为下一代抗菌策略的一个有吸引力的靶点。值得注意的是，某些抗生素，如BPH-1358和MBX-1066，已展示了直接与细菌DNA结合的能力，从而抑制DNA的合成和复制，最终导致广谱的细菌清除。这些药物不仅对广泛的病原体，包括多重耐药菌株，表现出强大的活性，而且与常规抗生素相比，其诱导耐药的可能性较低，并且具有更快的杀菌动力学。基于这一机制，DNA靶向光敏剂（PSs）作为一种有前景的治疗替代方案正在兴起。通过定位于细菌DNA附近，这些光敏剂可以同时破坏细胞膜的完整性，并在接近遗传物质的地方生成细胞毒性ROS，从而实现高效的细菌杀灭。然而，选择性地靶向细菌DNA仍然是一个相当大的挑战，因为非特异性DNA结合物可能也会与宿主的基因组DNA发生相互作用，从而可能损害周围的健康组织。因此，合理设计具有高特异性和亲和力的光敏剂来靶向细菌DNA，是开发更安全、更有效的抗菌疗法的重要一步。 在此，我们开发了一种D–π–A型光敏剂，配备了喹啉基-吡啶单元，命名为TPE-CN，具有D–π–A结构（方案1A）。该光敏剂不仅在光激活下表现出强大的ROS生成能力，而且由于其喹啉基-吡啶基团的正电荷，具备了通过静电作用与DNA结合的能力。分子中还引入了四苯乙烯单元，作为分子的疏水性片段。由于分子结构设计使其在酸性环境中具有荧光响应，因此该光敏剂能够在溶酶体中富集，并呈现出显著的荧光开启效应。这个精心设计的结构，具有较大的空间位阻和亲水/疏水末端，也预计能选择性地跨越细菌膜，同时避免核膜的干扰（方案1B）。在简便的合成过程中，详细的光谱实验验证了TPE-CN在ROS生成效率和DNA结合亲和力方面的优异性能。TPE-CN通过破坏细菌膜、干扰DNA并阻碍能量代谢和蛋白质合成来发挥作用。进一步的抗菌实验表明，TPE-CN在抑制生物膜和宿主细胞内耐药细菌活性方面具有良好的效果。此外，TPE-CN还诱导了巨噬细胞向M2型表型的极化，有效减轻了治疗后的炎症反应（方案1C）。本研究揭示了DNA靶向光敏剂在体内抗菌治疗中的巨大潜力，尤其是在对抗耐药菌株方面，标志着创新治疗模式的重大进展。 2 结果          2.1 化合物的合成与表征 化合物TPE-CN采用经典的三步合成路线合成（见图S1）。首先，采用文献方法合成了喹啉铵衍生物。通过将喹啉铵衍生物（1当量）与1-(吡啶-4-基)piperazine（1.05当量）在1-丁醇中回流反应12小时，得到中间产物。接着，加入4-(1,2,2-三苯乙烯基)苯甲醛（1.05当量）并继续回流反应12小时。冷却后，将反应混合物过滤，沉淀用乙醇洗涤，最终得到TPE-CN，收率为54%。通过1H NMR、13C NMR和EMI-MS对TPE-CN进行了全面表征（见图S2–S4），结果表明其结构正确且纯度高。 TPE-CN的宽吸收带覆盖了400–700 nm的范围，恰好与白光照射的范围相匹配（见图1A），从而提高了材料的光敏感效率。这一宽吸收带归因于TPE-CN发射中心的电子供给–接受相互作用所导致的最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占据分子轨道（LUMO）之间的能隙。密度泛函理论（DFT）计算进一步证实，电子密度在TPE-CN的四苯乙烯段的HOMO中广泛分布，而喹啉盐则主导LUMO（见图1B）。在甲醇和四氢呋喃（THF）的混合溶剂模型中研究了AIE特性，结果显示，加入甲醇这一劣溶剂后，荧光强度增强了14倍（见图1C和图S5），这一现象与小分子有机物的AIE特性一致。此外，TPE-CN在甲醇/THF混合溶液中经过48小时监测后，其荧光强度保持稳定（见图S6），验证了其聚集体的稳定性。由于其结构中包含容易质子化的吡啶和吡喹啉基团，进一步评估了其在不同pH缓冲液中的荧光光谱特性。图1D显示，随着pH值的逐渐降低，荧光强度逐步增加，在pH = 4.0时达到最强的荧光信号，这正适合在溶酶体的酸性环境中进行成像。凭借其具有弯曲形状的结构特征和包含喹啉盐的亲水/疏水分子设计，TPE-CN预计能够对核酸表现出优异的荧光响应。因此，详细研究了TPE-CN对核酸的荧光响应。如预期所示，在将210 µg/mL DNA加入含有TPE-CN的Tris–HCl缓冲液后，约610 nm处出现了一个新的荧光发射峰，并且荧光强度增强了4.25倍（见图1E、F）。 SCHEME 1光敏剂设计示意图，展示了其在杀菌和抗炎机制中的应用。(A) TPE-CN的结构示意图及其在抗菌过程中的优势。(B) TPE-CN精确靶向由巨噬细胞吞噬并进入溶酶体的MRSA的DNA，而不与核DNA发生作用，这是由于核膜的屏障作用。(C) TPE-CN介导的光动力治疗（PDT）在抗菌感染中的提议机制。MRSA指的是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。  结果表明，TPE-CN能够通过比率荧光变化响应DNA。采用来自MRSA的DNA旋转酶二聚体的2.6 Å蛋白晶体结构（PDB编号：7MVS）进行了TPE-CN的半柔性分子对接模拟，结果显示TPE-CN能够优先与DNA结合，并避开蛋白质（见图1G）。进一步分析表明，TPE-CN可以通过强烈的静电相互作用插入到DNA双螺旋的沟槽中（见图S7和表S1）。 利用TPE-CN对核酸的强结合能力，我们探讨了其在细菌中的成像能力。经过30分钟的孵育后，分别在绿色（480 ± 30 nm）和红色（650 ± 30 nm）通道下收集的共聚焦荧光图像显示了明亮的荧光，这与核酸滴定实验的结果一致。值得注意的是，在405 nm激发下，连续扫描TPE-CN染色的MRSA显著增强了细菌的荧光，这可能归因于TPE-CN的增加吸收以及其与核酸的结合，导致TPE-CN在细菌内部的局部聚集。 TPE-CN的D–π–A结构旨在促进内系统跨越（ISC）过程，从而增强光敏化作用。TPE-CN的HOMO与LUMO的分离降低了电子–电子交换能量，导致小的单重态–三重态能隙（ΔEST）。通过在体外测量ROS的生成量，评估了TPE-CN的光敏化水平，并与Ce6和玫瑰苯胶（RB）进行了对比。使用DCFH-DA、DHR123、HPF和ABDA分别检测了总ROS、超氧阴离子（O2−⋅）、羟基自由基（⋅OH）和单线态氧（1O2）的水平。正如图1K–N和图S8所示，在光照射下，DCFH的荧光强度增加速度比商业化的Ce6和RB更快，这表明TPE-CN能够更有效地产生总ROS。具体而言，TPE-CN不仅能够产生比Ce6和RB更高的1O2，还能生成与RB相当的O2−⋅和⋅OH水平，这些水平远强于Ce6。这些结果突显了TPE-CN在PBS中的优越光动力效率，能够生成大量的I型和II型ROS。 2.2 TPE-CN的抗菌性能 为了研究TPE-CN的抗菌活性，我们选择了MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌），作为多药耐药革兰氏阳性细菌的代表菌株进行模型研究。TPE-CN由于其优异的DNA结合能力，能够高效地标记MRSA（见图S9），并且能够有效抑制MRSA的活性（见图2A和图S10）。其IC50为1.26 µM，表明其具有适度的抗菌效果。在白光照射下，IC50降至0.44 µM，较未照光的TPE-CN降低了2.9倍，这突显了光毒性增强的细菌杀伤效果。此外，进行了SYTO9-PI染色实验， 图1TPE-CN的光物理特性和光动力效率(A) TPE-CN在PBS中的标准化吸收和荧光光谱。(B) 通过DFT计算得到的TPE-CN的HOMO和LUMO轨道分布。(C) 相对发射强度（I/I0）与甲醇浓度的关系图。I0和I分别为TPE-CN（10 µM）在甲醇和THF-甲醇混合溶液中的荧光强度峰值。(D) TPE-CN在不同pH缓冲液中的荧光响应（pH范围：4.0–10.0）。(E) 在Tris–HCl缓冲液（pH = 7.4，10 mM，100 mM K+）中，TPE-CN（10 µM）对ctDNA滴定的荧光发射光谱，激发波长为405 nm。(F) 相对发射强度（I/I0）与ctDNA浓度的关系图。I0和I分别为TPE-CN（10 µM）在无ctDNA和不同浓度ctDNA溶液中的荧光强度峰值。(G) 基于优化结构的TPE-CN与DNA结构的分子对接模型。(H) 在405 nm共聚焦激发下，TPE-CN染色的MRSA的双通道荧光成像。(I) 在405 nm共聚焦激发下，TPE-CN染色的细菌被持续扫描后，细菌场景被放大，再次收集共聚焦图像（每次扫描15 J/cm²，扫描10次）。重叠图像为绿色通道和红色通道的合成图。(J) TPE-CN单重态与三重态能级图。(K–N) TPE-CN、玫瑰苯胶（RB）和Ce6在2 µM浓度下，在不同时间间隔下（总照射时间分别为50秒、10分钟、300秒和300秒）白光照射下，DCFH-DA（用于总ROS）、HPF（用于⋅OH）、DHR-123（用于O2−⋅）和ABDA（用于1O2）的荧光强度相对变化。HOMO：最高占据分子轨道；LUMO：最低未占据分子轨道。  并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行观察。如图2B所示，与PBS组相比，TPE-CN（5 µM）处理后的损伤MRSA的PI红色荧光信号更加明显。此外，TPE-CN + 光照组显示出最强的红色荧光，表明TPE-CN在光照射下能够有效地破坏MRSA，这与平板计数结果一致。总之，所有结果都证实了TPE-CN能够有效抑制MRSA的生长。 图2 TPE-CN在体外的杀菌能力及其机制(A) TPE-CN处理后的MRSA细菌活性，随后进行光照射（100 mW/cm²，10分钟）。(B) 不同处理后的SYTO 9/PI染色的MRSA共聚焦图像。尺度条表示40 µm。(C) 在不同浓度的TPE-CN处理下，光照射（100 mW/cm²，10分钟）后MRSA培养上清液中的相对DNA含量。(D) MRSA经不同处理后的琼脂糖凝胶电泳DNA条带： (1) DNA标记； (2) 未处理MRSA的基因组DNA； (3) TPE-CN处理后的MRSA基因组DNA； (4) TPE-CN光照射（100 mW/cm²，10分钟）处理后的MRSA基因组DNA。(E) 不同处理后MRSA转录基因的聚类分析热图。红色和蓝色分别表示上调和下调的基因表达，n = 3。(F 和 G) TPE-CN与PBS组转录基因的火山图（F），TPE-CN + 光照组与PBS组转录基因的火山图（G）。(H) 各组差异表达基因的统计直方图。(I 和 J) TPE-CN与PBS组下调基因的基因本体（GO）富集分析图（I），TPE-CN + 光照组与PBS组下调基因的GO富集分析图（J）。MRSA，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。  2.3 TPE-CN的抗菌机制 接着，我们详细探讨了TPE-CN的抗菌机制。如图2C所示，随着TPE-CN浓度的增加，MRSA培养上清液中的OD260相对比率逐渐增大。值得注意的是，白光照射（100 mW/cm²）进一步促进了核酸向上清液的泄漏和积累。这些结果表明，TPE-CN能够有效地破坏MRSA的细胞膜。同时，TPE-CN的膜损伤能力可以通过白光照射得到协同增强，导致膜结构和核酸、蛋白质的更严重损伤和泄漏。为了进一步研究TPE-CN对膜的损伤能力，我们在不同条件下进行了DNA琼脂糖凝胶电泳和上清液中蛋白质的分析。与对照组相比，TPE-CN组的DNA条带变弱，而在TPE-CN + 光照组中，DNA条带几乎消失（见图2D），这表明TPE-CN加光照显著诱导了MRSA的DNA损伤。此外，进行了一种探究DNA损伤的TUNEL染色实验。TPE-CN组显示出来自断裂DNA的暴露3’-OH位点的微弱红色荧光，而TPE-CN + 光照组则显示出更强的红色荧光（见图S11），与琼脂糖凝胶电泳结果一致。进一步分析发现，TPE-CN + 光照组上清液中的蛋白质浓度显著增加（见图S12），这一结果与核酸泄漏的趋势一致。这些发现证实了TPE-CN有效地与MRSA DNA结合并造成损伤，展示了其优异的抗MRSA潜力。 为了全面研究TPE-CN的杀菌机制，我们采用了原核转录组测序技术来评估不同处理后MRSA的基因表达水平。热图分析显示，TPE-CN组与PBS组之间的差异表达基因（DEGs）表达差异较小。然而，TPE-CN + 光照组与PBS组和TPE-CN组相比，差异更为显著（见图2E）。随后，DESeq2分析识别出187个受TPE-CN处理影响的基因，其中154个基因上调，33个基因下调，相较于PBS组（见图2F–H）。相反，TPE-CN加光照射处理显著改变了基因表达，621个基因上调，588个基因下调，与热图分析结果一致。这些结果表明，光照处理显著增强了TPE-CN对细菌基因表达的影响。此外，与DNA复制和修复相关的基因，如recJ、ssb、pcrA、ruvA和ruvB，在TPE-CN + 光照组中表现出显著下调（见表S3）。相较之下，TPE-CN组中这些基因的下调较少，表明TPE-CN在光照射下对DNA功能的影响更加显著，这一效应归因于TPE-CN强大的DNA损伤能力。随后，我们对差异表达基因（DEGs）进行了富集分析。如图2I所示，基因本体（GO）富集气泡图揭示了TPE-CN组下调基因的重要功能注释，特别强调了离子和化学应激反应。值得注意的是，离子反应，尤其是金属离子反应，在膜稳定性和酶活性中发挥着关键作用。 这些发现表明，TPE-CN损伤了MRSA的细胞膜，导致渗透压失衡并使细菌失活。经过TPE-CN加光照处理后，更为多样的生物过程和细胞组分，包括核糖体结构、翻译、大分子或蛋白质代谢和生物合成过程，以及质子泵合成ATP酶的活性，均出现下调。这表明TPE-CN进一步破坏了细菌内细胞器和蛋白质合成的完整性，直接影响了细菌生长、增殖和致病因子合成所必需的合成过程。 此外，信号通路分析在基因研究中发挥了重要作用。如图S13所示，京都基因和基因组百科全书（KEGG）气泡图显示，磷酸转移酶系统（PTS）、氨基酰-tRNA生物合成和氧化磷酸化是主要富集的通路，表明TPE-CN加光照射能够影响能量代谢和氨基酰-tRNA的生物合成。此外，氨基酰-tRNA作为翻译过程中蛋白质生物合成的底物，进一步确认TPE-CN还直接破坏蛋白质合成，从而抑制MRSA的增殖和功能。 为了进一步揭示各组在能量代谢通路中差异表达基因（DEGs）的变化，对能量代谢相关基因进行了层次聚类分析。如图S14所示，大多数能量代谢通路基因均显著下调，从而影响MRSA的生长与增殖。这些结果表明，TPE-CN能够抑制能量代谢，导致细胞膜受损，并诱导MRSA发生氧化损伤。基于上述结果，TPE-CN可通过四种不同机制清除MRSA：(1) TPE-CN与MRSA的DNA结合，通过抑制DNA复制产生严重损伤；(2) TPE-CN破坏细胞膜，造成细菌渗透压显著失衡；(3) TPE-CN下调PTS和氧化磷酸化通路，从而抑制能量代谢；(4) TPE-CN直接阻断蛋白质生物合成过程。整体来看，TPE-CN通过多重协同机制深度破坏MRSA的生存结构与代谢功能，展现出卓越的抗菌潜力。  2.4 体外抑制MRSA生物膜 生物膜通过产生细胞外高分子物质，可以保护细菌免受宿主免疫系统和抗菌药物的攻击，这使得感染治疗变得更加具有挑战性。因此，我们研究了TPE-CN在清除MRSA生物膜中的效果。MRSA生物膜通过将MRSA（1 × 10^8菌落形成单位[CFU]/mL）在37°C下培养48小时，在TSB培养基中形成。如图3A–C所示，TPE-CN与MRSA生物膜共孵育后，红色荧光逐渐在生物膜内以时间依赖的方式增强。在20分钟时，红色荧光出现在生物膜的底部，并与DNA探针Hoechst 33342的蓝色荧光很好地重合（见图3B），表明TPE-CN能够迅速渗透并与MRSA生物膜中的DNA结合。随后，研究了TPE-CN的抗生物膜性能。将MRSA生物膜处理不同浓度的TPE-CN，并随后暴露于白光下。如图3D、E所示，细菌的存活率表现出浓度依赖性下降， 图3 TPE-CN对MRSA生物膜的渗透与清除(A) 不同时间间隔（0、5、10和20分钟）下，Hoechst 33342和TPE-CN染色的MRSA生物膜的三维共聚焦图像。(B) MRSA生物膜与TPE-CN共孵育20分钟后的二维共聚焦图像放大图。(C) TPE-CN与MRSA生物膜共孵育后，在不同深度和时间间隔下的相对荧光强度（%）。相对荧光强度通过计算红色荧光像素数与该深度总像素数的比值得出。(D 和 E) 处理不同的MRSA生物膜后，琼脂平板上的MRSA照片（D）和生物膜中MRSA的细菌存活率（E）。误差条表示独立实验的标准差（n = 3）。(F) 不同处理后的SYTO 9/PI染色的MRSA生物膜三维重建共聚焦图像。 在TPE-CN浓度为16 µM时，存活率降至5%以下，而在黑暗组中，存活率为37%。这表明TPE-CN具有有效的抗生物膜能力，这归因于其强大的生物膜渗透能力和ROS生成能力。此外，SYTO9/PI共染色实验显示，TPE-CN + 光照组的PI红色荧光信号显著高于黑暗组，表明TPE-CN能够有效杀灭MRSA。相比之下，PBS组中的生物膜保持完整结构，MRSA仍然高度活跃（见图3F）。这些结果揭示了TPE-CN能够在光照射下渗透并破坏MRSA生物膜。 2.5 TPE-CN对细胞内MRSA的精确靶向与清除 受到TPE-CN在体外抗MRSA效果的启发，我们进一步研究了TPE-CN对细胞内MRSA的抗菌作用。最初，将TPE-CN与RAW 264.7细胞共孵育30分钟，并使用商业化的溶酶体探针Lysotracker Deep Red（LTDR）来研究TPE-CN的精确定位。共聚焦图像显示，TPE-CN与LTDR的重叠效果非常好，Pearson共定位系数为0.84（见图4A、B）。 图4TPE-CN对细胞内MRSA的杀菌与免疫调节作用(A) TPE-CN（5 µM）与Lysotracker Deep Red（LTDR，绿色）共同孵育的RAW 264.7细胞的共聚焦图像。(B) TPE-CN与溶酶体的共定位系数分析。部分（A）中的代表性细胞由白线标出，系数类型为Pearson相关系数，n = 3。(C) MRSA感染的RAW 264.7细胞，首先与Hoechst 33342孵育40分钟，随后与TPE-CN（5 µM）孵育。代表性TPE-CN标记的细胞内MRSA由白色箭头指示。(D) 使用流式细胞术检测不同处理后RAW 264.7细胞中ROS的生成。(E 和 F) 不同处理下RAW 264.7细胞上MRSA的琼脂平板照片（E）和细菌存活率分析（F）。(G) 使用流式细胞术检测MRSA感染的RAW 264.7细胞在TPE-CN和TPE-CN加光照射处理后的CD86和CD206表达。数据以均值±标准差（SD）表示，进行了单因素方差分析（ANOVA）。*p < 0.05, **p < 0.01, 和 ***p < 0.001。(H) 使用Western blot检测TPE-CN诱导的MRSA感染的RAW 264.7细胞中巨噬细胞极化。(I) 使用流式细胞术检测RAW 264.7细胞在与TPE-CN和TPE-CN加光照射。（L）处理的MRSA上清液培养后的CD86和CD206表达。 “M”代表MRSA。 结果结合共定位分析表明，TPE-CN可以有效地被细胞内化，并随后由于溶酶体内的pH环境升高，自动聚集成纳米粒子，并有效地与巨噬细胞溶酶体结合。增强对细胞内细菌的靶向能力对于清除细胞内的多药耐药细菌至关重要。在已证明的杀菌效能基础上，我们进一步评估了其对细胞内细菌的有效性。将TPE-CN添加到MRSA感染的RAW 264.7细胞中，并使用Hoechst 33342染色宿主细胞和MRSA的DNA。共聚焦图像显示，TPE-CN发出的红色荧光与MRSA的蓝色荧光精确重叠，表明TPE-CN对MRSA具有优异的细胞内靶向能力（见图4C）。使用二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）检测TPE-CN处理的RAW 264.7细胞中的细胞内ROS。图4D显示，在PBS、PBS + 光照或单独TPE-CN处理的RAW 264.7细胞中，ROS水平没有显著变化，正向荧光细胞分别为1.45%、3.15%和4.43%。相反，TPE-CN + 光照组的ROS水平显著增加至99.7%，表明溶酶体内的TPE-CN能够产生强烈的ROS条件，有助于清除细胞内的细菌。接下来，我们检查了TPE-CN对细胞内细菌的抗菌效率。如图4E、F所示，TPE-CN处理的RAW 264.7细胞中MRSA负荷呈浓度依赖性下降，在黑暗条件下，10 µM浓度时减少了85.7%。在光照条件下，细胞内MRSA几乎完全抑制，只有3%的存活率，表明TPE-CN对细胞内MRSA具有强效的抗菌作用。 巨噬细胞的极化方向在抗炎过程和组织再生中具有关键作用。我们探讨了TPE-CN对MRSA感染的巨噬细胞极化的影响。如图4G所示，TPE-CN显著下调了CD86的表达，并且与未经处理的MRSA感染RAW 264.7细胞相比，CD206的表达没有变化。经过光照射后，CD86的表达进一步下降，而CD206的表达在MRSA感染的RAW 264.7细胞中增加了12.3%，这是在与TPE-CN共同孵育后观察到的。同时，通过Western blot实验，我们确认TPE-CN和TPE-CN + 光照显著增加了M2型巨噬细胞分子标志物（CD206和VEGF）的表达，并减少了M1型巨噬细胞分子标志物（CD86和CCR7）的表达（见图4H）。此外，我们发现，当使用TPE-CN和TPE-CN加光照处理的MRSA上清液处理正常RAW 264.7细胞时，这些细胞倾向于极化为M2表型（CD206），表明这种极化可能与细菌相关的生物分子释放有关（见图4I）。这些结果表明，TPE-CN抑制巨噬细胞向M1表型的极化，且TPE-CN不仅进一步减少了M1表型巨噬细胞的比例，还促进了M2表型巨噬细胞的生成。TPE-CN的这种免疫调节效应非常引人注目，为抑制细菌感染治疗中的过度炎症提供了一种新策略。 2.6 TPE-CN在体内对金黄色葡萄球菌的靶向作用 受到上述体外研究结果的启发，我们进一步研究了TPE-CN是否能够在体内清除侵入的MRSA。我们通过将MRSA接种到小鼠烧伤皮肤上，建立了烧伤创面感染模型，随后分别对小鼠进行PBS、TPE-CN、TPE-CN加光照和万古霉素的皮下注射。在相应的时间点进行创面大小测量、菌落形成单位（CFU）计数和组织学分析（见图5A）。在注射TPE-CN后，感染的皮肤被切片并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行成像。如图5B所示，在感染的皮肤组织中观察到大量的红色荧光点。重要的是，发出绿色荧光信号的GFP标记金黄色葡萄球菌与红色荧光信号很好地重叠，呈现出明亮的黄色荧光，表明TPE-CN在体内对金黄色葡萄球菌具有出色的靶向能力。 2.7 TPE-CN在烧伤创面感染中的MRSA清除效果 如图5C–E所示，无论是否光照，TPE-CN组和万古霉素组的创面大小均显著小于PBS组和PBS + 光照组。TPE-CN组和万古霉素组的创面有所缩小，而在TPE-CN + 光照组中，创面甚至完全消失。第14天时，TPE-CN + 光照组的创面愈合率为96.8%，而TPE-CN组和万古霉素组分别为69.3%和74.7%，这表明TPE-CN在光照射下加速了创面愈合。此外，所有组别在抗菌治疗过程中体重没有显著变化，表明TPE-CN对小鼠生长的影响最小（见图5D）。第14天，所有小鼠均被处死，并收集了皮肤组织进行CFU计数和组织学分析。与PBS组相比，TPE-CN组和万古霉素组的细菌负荷显著降低，而TPE-CN + 光照组几乎完全消除了细菌（见图5F）。这些结果表明，TPE-CN由于其优异的体内杀菌性能，能够促进感染创面的愈合。 此外，在治疗期间，通过检测两种典型的促炎因子IL-6和TNF-α来评估炎症水平。如图5G所示，TPE-CN + 光照组的IL-6水平降至9.9 pg/mL，并在感染后第10天恢复至正常水平，与PBS组相比，后者的IL-6水平维持在20.7 pg/mL。PBS + 光照、TPE-CN和万古霉素组的IL-6水平分别为22.4、14.7和12.8 pg/mL。类似地，TNF-α水平的变化与IL-6在创面愈合过程中的变化一致（见图S18）。这些结果表明，TPE-CN不仅能够在体内直接杀灭感染的细菌，还能下调炎症细胞因子的释放，从而促进创面的快速愈合。 此外，感染的皮肤组织被切除用于组织学分析。在TPE-CN + 光照组的苏木精-伊红（H&E）染色图像中，明显观察到上皮化、毛囊形成和表皮增厚，且创面部位几乎没有炎症细胞，显示出全层皮肤结构的恢复（见图5H）。相比之下，在TPE-CN组和万古霉素组，部分上皮化、肉芽组织和少量毛囊形成，表明创面正在愈合，而PBS组和PBS + 光照组的创面中存在大量炎症细胞浸润和痂皮，表明TPE-CN能够抑制MRSA感染并有效促进疤痕去除。此外，使用马松染色法评估了胶原纤维的生成，以促进组织再生。如图5I所示， 图5 TPE-CN在体内的创面愈合与抗菌评估(A) MRSA感染的烧伤创面模型示意图，处理方式为TPE-CN和光照10分钟或万古霉素，在第0天进行治疗。(B) GFP标记金黄色葡萄球菌感染的小鼠创面皮肤切片的共聚焦图像。左侧图像中的白框放大部分显示在右侧图像中。(C) 不同处理后小鼠MRSA感染烧伤创面的照片。(D 和 E) 不同治疗后小鼠的体重变化（D）和创面大小变化（E）。(F) 不同处理下感染部位MRSA的细菌存活率。(G) MRSA携带小鼠血清中IL-6水平的ELISA分析。(H 和 I) 不同处理后MRSA感染皮肤切片的苏木精-伊红（H&E）染色图像（H）和马松染色图像（I）。数据以均值±标准差（SD）表示，进行了单因素方差分析（ANOVA）。p < 0.05，p < 0.01，和p < 0.001。MRSA，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。 TPE-CN组和万古霉素组的胶原纤维数量均显著高于PBS组和PBS + 光照组。TPE-CN + 光照组显示出显著更多的胶原纤维，并且呈现出更加有序的排列模式，表明创面愈合进入了更为先进的阶段。这些结果表明，TPE-CN通过快速清除感染细菌和调节体内炎症过程，促进创面愈合。 为了评估生物相容性，TPE-CN被静脉注射到健康小鼠体内，持续14天。随后，采集了不同处理组的小鼠血样和主要器官，用于血液生化和组织学分析。如图S19所示，H&E染色图像显示，TPE-CN对包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏在内的主要器官未引起明显的不良反应。血液生化检测也表明，与PBS组相比，血液指标仍保持在正常范围内（见图S20）。这些结果表明，TPE-CN在体内具有最小的暗毒性和优异的生物相容性。 3. 结论 在本研究中，我们展示了TPE-CN相较于传统抗生素的四大优势：（1）TPE-CN能够同时靶向并破坏细菌的DNA和细胞膜，从而实现快速高效的细菌清除；（2）TPE-CN能够有效穿透MRSA生物膜，这些生物膜通常对常规抗生素具有抗性，并消除其中嵌入的细菌；（3）TPE-CN能够在溶酶体内自组装成纳米颗粒，并在酸性条件下表现出增强的荧光，从而实现荧光“亮起”成像，选择性清除细胞内的细菌，而不损害宿主的基因组DNA；（4）TPE-CN在抗MRSA治疗后还能够调节巨噬细胞的极化，从而抑制过度的炎症反应。这些综合性质使TPE-CN成为治疗耐药性细菌感染的一个极具前景的光疗诊疗剂。 据我们所知，TPE-CN的设计具有多个独特优势，使其在传统抗菌策略中脱颖而出：（1）虽然许多已报道的抗微生物剂缺乏对细菌DNA的特异性，且可能损伤宿主细胞，TPE-CN却是一个罕见的DNA靶向抗菌剂，它通过静电相互作用选择性地结合细菌DNA。其空间位阻效应和膜选择性有效防止了其进入核膜，从而最大限度地减少宿主DNA的干扰，并在降低细胞毒性的同时增强了抗菌效果；（2）与传统抗生素和基于纳米材料的抗微生物剂在穿透生物膜或到达细胞内细菌方面存在困难不同，TPE-CN具备合理设计的亲水/疏水平衡和pH响应性荧光。这使其能够高效穿透MRSA生物膜，选择性地积累在巨噬细胞的酸性溶酶体中，并实现精准的亚细胞定位，进而有效消除细胞内的病原菌，解决了当前治疗中的一大难题；（3）与大多数抗菌剂主要集中在微生物清除不同，TPE-CN独特地将光动力杀菌作用与免疫调节效应结合起来，通过促进巨噬细胞从促炎的M1型极化到抗炎的M2型。通过这种双重作用，不仅消除感染，还能够减轻炎症，这在现有的抗微生物设计中是少见的，因为免疫调节作用通常被忽视；（4）虽然许多抗菌策略依赖于单一机制，TPE-CN却采用了一种全面的多模式方法：它同时破坏细菌DNA、损伤细胞膜、抑制能量代谢并抑制蛋白质合成。这种协同机制使其能够高效清除浮游MRSA、生物膜以及细胞内细菌。在烧伤感染模型中，TPE-CN展示了优于万古霉素的治疗效果和伤口愈合结果。总体而言，本研究提出了一种创新的分子设计范式，专注于DNA靶向抗菌治疗，为应对抗微生物耐药性提供了有前景的解决方案，并推动了下一代精确抗生素的发展。