RGT-100

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是肝硬化(cirrhosis)和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的主要病因。目前，全球约有超20亿人感染过HBV，其中2.96亿人（约占总人口3.7%）患有慢性HBV感染，每年可导致全球约82万人死于肝硬化和HCC并发症。 即使有预防性的疫苗，每年仍有约150万例新发感染。世界卫生组织设定了到2030年消除HBV的目标，即与2015年相比，HBV相关死亡率降低65%，发病率降低90%。 当前，临床治疗中关于HBV的疗法已取得显著进展，为实现慢性乙肝（Chronic hepatitis B，CHB）的功能性治愈（乙肝表面抗原（HBsAg）消失）和完全治愈（清除共价闭合环状DNA（cccDNA）和整合HBVDNA）提供了希望。 劲帆医药结合现有及自主研发的肝脏特异性启动子，成功开发了rAAV-HBV1.3-mer WT replicon和rAAV-1.2×HDV系列造模病毒产品，另外还与武汉大学合作开发了一系列AAV-HBV-1.04乙肝造模病毒产品，通过ATR介导DNA损伤（DDR）形成HBV cccDNA，使乙肝表面抗原HBsAg和HBV子代产生，实现更好地模拟病毒复制过程。以上产品具备成模率高、稳定性好、适用范围广等优势，加速推进了乙肝/丁肝病毒复制机制的研究及抗乙肝/丁肝药物的研发进程。 此外，劲帆医药还拥有专业的体内外药效评价团队，可提供肝脏疾病药物筛选、药效学评价、药代动力学研究、Non-GLP非临床安全性评价等服务项目，全面覆盖药物临床前研究的完整流程。 近期，来自美国国立卫生研究院（NIH）国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所的Marc G. Ghany研究团队在期刊《Gastroenterology》上发表了题为“Current Best Practice in Hepatitis B Management and Understanding Long-term Prospects for Cure”的综述，该综述涵盖了当前慢性HBV感染的最佳管理实践和HBV感染的新兴疗法及其治愈前景。 1 HBV介绍 01 HBV生命周期 HBV颗粒（也称Dane particle）由一个外层脂质包膜和一个内部核衣壳组成，核衣壳内含有病毒遗传物质（DNA）和复制所需的酶（聚合酶）。病毒基因组是部分双链DNA，具有四个重叠的开放阅读框，它们编码以下7种病毒蛋白：聚合酶，核心蛋白，乙肝e抗原（HBeAg），大、中、小三种HBsAg以及X蛋白。病毒生命周期如图1所示。复制过程中，会产生双链线性DNA（约占5%～10%），这些DNA可能随机整合到宿主基因组中,进而引发肝细胞癌（HCC）。相当比例的HBsAg可能来源于整合的HBV DNA。 图1 HBV生命周期和药物开发靶点 （图片来源：Yardeni D et al, Gastroenterology, 2023） 02 HBV感染后的免疫机制 免疫反应在HBV清除中起着重要作用。HBV不易激活包括Ⅰ型干扰素（IFN）途径在内的细胞内先天防御机制，但可以通过Ⅰ/Ⅲ型IFN和细胞内抗病毒传感器（如Toll样受体（TLRs）、视黄酸诱导基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）样受体）的药理学激活和外源性IFN治疗来抑制其复制。HBV还可以通过HBV前基因组RNA（pgRNA）与RIG-Ⅰ之间的相互作用以及体外肝细胞中的IFN刺激来诱导产生Ⅲ型IFN。 此外，在急性HBV感染患者中，自然杀伤（NK）细胞和NKT细胞可在早期被激活。因此，一旦HBV在肝细胞中复制，Ⅲ型IFN以及NK细胞和Kupffer细胞（也称枯否细胞）的激活可能有助于在感染早期调节病毒复制和病毒传播。 在动物模型中，T细胞已被证实是HBV清除和肝病发病机制中的关键因素。CD8 T细胞能识别和杀死病毒感染肝细胞，而CD4 T细胞则提供关键的T细胞和协调免疫反应。在急性HBV感染的患者中，广泛的抗病毒T细胞反应和HBsAg特异性中和抗体反应能有效清除病毒，HBV特异性记忆T细胞还能在急性HBV感染临床缓解后持续数十年，这些记忆T细胞由体内微量病毒维持，并可能介导病毒控制；B细胞也参与HBV控制，慢性HBV感染涉及特异性及全身性T细胞和B细胞功能障碍，由于长期暴露于病毒抗原和炎症介质，这将导致免疫衰竭和免疫失调。 另外，先天性和适应性免疫细胞的非特异性炎症浸润在HBV感染的肝脏中积聚，并促进肝细胞损伤和纤维化，而无法抑制病毒。因此，免疫介导的HBV治疗需要在病毒免疫控制和肝细胞损伤之间取得平衡以避免不良临床后果。 2 治疗策略 01 HBV感染治疗目标 慢性乙肝（CHB）治疗的主要目标是预防肝硬化、HCC发展和降低肝脏相关死亡率。然而，从感染HBV到发生这些终点事件，病情发展通常需要经过几十年。因此，评估慢性HBV感染治疗方法的研究依赖于替代终点，包括HBV DNA水平低于可检测下限、谷丙转氨酶（ALT）正常化、HBeAg清除、HBsAg清除和组织学改善，其中HBsAg清除被认为是最佳的终点，但自发性和治疗相关的HBsAg清除率较低，每年大约只有1%。 02 CHB治疗指征 CHB是一种动态疾病。HBeAg状态、HBV DNA和ALT水平是评估CHB疾病活动的主要指标。美国肝病研究学会（AASLD）、欧洲肝病研究学会（EASL）和亚太肝病研究学会（APASL）这三大肝脏学会已就治疗指征提供了指导（表1）。此外，世界卫生组织针对可能无法进行病毒载量检测的低收入和中等收入国家开发了一种更为简化的治疗方法。所有指南均强烈建议对失代偿性肝病、肝硬化，以及具有活动性疾病指征的患者（HBV DNA和ALT水平升高的患者）进行治疗。其它治疗或预防指征见表2。 另有一些专家提出了一种可替代且更简化的“全面治疗”法，即无论患者ALT水平如何，对所有HBsAg阳性且可检出病毒血症的个体进行治疗。但该方法在部分患者中存在争议，研究人员建议“逐例分析”，来考虑疾病进展和肝癌的风险因素以及患者接受治疗的意愿，从而处理指南治疗标准之外的情况。 表1 关于CHB肝病学会指南和世界卫生组织的治疗指征 （图片来源：Yardeni D et al, Gastroenterology, 2023） 表2 关于HBV感染的其他治疗及预防指征 （图片来源：Yardeni D et al, Gastroenterology, 2023） 03 CHB治疗药物 美国已获批7种用于治疗慢性HBV感染的药物，包括标准干扰素α-2b（美国和欧洲已不再使用）、聚乙二醇干扰素α-2a、拉米夫定（lamivudine）、阿德福韦（adefovir）、替比夫定（telbivudine）、恩替卡韦（entecavir, ETV）、富马酸替诺福韦二吡呋酯（tenofovir disoproxil fumarate, TDF）和替诺福韦艾拉酚胺（tenofovir alafenamide, TAF）。由于聚乙二醇干扰素具有更优越的药代动力学和给药方案（每周一次与每周三次相比），因此它优于标准干扰素。 在核苷（酸）类似物中，由于恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺具有更强的药效和更低的抗病毒耐药性，因此它们被推荐用于替代拉米夫定、阿德福韦和替比夫定。肝病学会指南推荐了两种治疗策略（表3）。一种是使用聚乙二醇干扰素α-2a进行为期48周疗程治疗，另一种是使用推荐的核苷（酸）类似物之一进行长期治疗。 表3 目前获批上市的治疗CHB药物及其疗效 （图片来源：Yardeni D et al, Gastroenterology, 2023） ▎聚乙二醇干扰素α-2a 作用机制：尚不完全清楚，但具有抗病毒和免疫调节两种特性。 推荐剂量和治疗周期：对于HBeAg阳性和HBeAg阴性的患者，推荐剂量均为180mg，每周一次皮下注射，持续48周。 优点：HBeAg阳性患者的HBeAg清除率较高（30%），并能在较短时间内清除HBsAg（HBeAg阳性患者为2%-7%，HBeAg阴性患者为4%），特别是在HBV基因型为A、B的患者中。此外，HBeAg和HBsAg能保持持续阴性。 缺点：需要皮下注射给药，存在许多严重的不良事件。 禁忌症：禁用于失代偿性肝硬化患者、伴有临床上显著门静脉高压的代偿性肝硬化患者和妊娠期女性。 ▎核苷（酸）类似物 作用机制：通过被HBV逆转录酶整合到新合成的DNA中，作为DNA链终止剂抑制病毒复制。 优点：核苷（酸）类似物的疗效因药物而异（表3），普遍具有良好的安全性和耐受性。 缺点：对cccDNA无活性，停药后易复发；存在引起肾病和骨量丢失的风险，尤其是TDF。 适用人群：可用于失代偿期肝硬化患者和孕妇，用以治疗或预防母婴传播。 04 治疗终点 在HBeAg阳性患者中，聚乙二醇化干扰素相关的HBeAg血清学转换是主要治疗终点之一。大约25%的患者在短期（停药后的6-12个月）内可以持续抑制HBV DNA至2000 IU/mL以下。相比，在HBeAg阴性患者中，只有19%的患者可以在停药后维持HBV DNA ＜400 copies/mL。 使用核苷（酸）类似物治疗时的最佳终点是至少2次检测中确认HBsAg已清除，无论是否出现Anti-HBs。对于非肝硬化、HBeAg阳性的患者，如果实现HBeAg血清学转换、HBV DNA检测不出，并接受至少12个月的巩固治疗，则可以停用核苷（酸）类似物。 建议进行至少1年的治疗后监测（每3个月一次），以检测疾病是否重新活跃。对于HBeAg阴性患者，AASLD建议进行无限期治疗，直至HBsAg消失。对于无肝硬化的患者，如果实现HBV DNA检测不出且ALT水平正常持续2-3年，APASL和EASL则建议可以停止治疗。 实际上，病毒学复发几乎普遍存在，停药后的前3个月内，10-30%的患者观察到病情恶化，近一半的患者可能需要重新开始治疗。因此，停用治疗的决定需要与患者仔细商议，并且患者必须同意在停药后接受密切监测。由于存在肝功能失代偿的风险，肝硬化患者不应停用抗病毒治疗。 05 未治疗患者的监测和筛查 由于慢性HBV感染的动态特性，未治疗患者应每3～6个月检测一次HBV DNA和ALT水平，直至出现自发性HBsAg丢失。对于HBeAg阳性患者，应每6～12个月检测一次HBeAg状态。对于HBeAg阴性、HBV DNA水平较低（<2000 IU/mL）且ALT水平正常（非活跃性携带者/HBeAg阴性慢性感染）的患者，应在1年内每3个月检测一次HBV DNA和ALT水平，以确认疾病处于非活跃状态，之后可每6～12个月监测一次，还应每年检测一次HBsAg丢失情况，以及每2～3年进行一次无创性肝纤维化评估。 针对肝硬化患者，应每6个月进行一次超声筛查，可结合甲胎蛋白（AFP）检测。HBsAg阳性且无肝硬化的成年人，但如果属于HCC高风险人群（40岁以上的亚洲或黑人男性以及50岁以上的亚洲女性、一级亲属有HCC病史者、或丁型肝炎病毒感染者）也应每6个月进行一次筛查。HBsAg清除后，对于肝硬化患者、一级亲属患HCC或有长期感染史（男性>40岁，女性>50岁）的患者，应继续进行HCC监测。 3 创新疗法 由于上述疗法对cccDNA和整合HBV DNA的影响有限，且无法恢复慢性HBV感染的免疫功能紊乱。因此，迫切需要能够实现高HBsAg清除率的治疗方案。目前在研的创新疗法包括阻断病毒产生（表4，图1）和恢复耗竭的免疫反应（表4，图2）。 表4 目前在研的抗病毒药物 （图片来源：Yardeni D et al, Gastroenterology, 2023） 图2 HBV发病机理中的免疫亚群及免疫调节治疗策略 （图片来源：Yardeni D et al, Gastroenterology, 2023） 01 直接抗病毒药物 靶向病毒入侵的前提是阻断新一轮的肝细胞感染，从而防止cccDNA的形成并减少cccDNA库。 Bulevirtide：能不可逆地阻断牛磺胆酸钠共转运蛋白受体，从而阻止病毒入侵，现已被欧洲药品管理局（EMA）批准用于治疗慢性丁型肝炎病毒感染。研究结果显示，在HBeAg阴性的CHB患者中，以不同剂量给予Bulevirtide 12周后，少数患者的HBsAg水平下降了≥0.5log IU/mL，但无人实现HBsAg清除，还观察到无症状的胆汁酸升高。 Hepalatide：另一种牛磺胆酸钠共转运蛋白受体阻断剂，目前正在进行一项双盲、安慰剂对照的Ⅱ期临床研究，用以评估其联合pegylated IFN与单独使用pegylated IFN治疗CHB的效果。 单/多克隆抗体制剂：除阻断病毒入侵外，单克隆抗体还可以降低病毒血症和亚病毒颗粒水平，并通过呈递病毒抗原刺激T细胞，使得HBsAg清除。GC1102是一项正处于Ⅱ期临床试验中的重组乙型肝炎免疫球蛋白。VIR-3434是一种新型单克隆抗体，正在病毒抑制患者中进行Ⅰ期临床研究（NCT04423393），初步结果表明，HBsAg水平呈剂量依赖性快速下降，且未发生显著不良事件。 ▎靶向HBV转录物的药物 抑制病毒产生的另一种方法是通过RNA干扰（RNAi）和反义寡核苷酸（ASOs）靶向编码信使RNA（mRNAs）的蛋白质。这种方法的治疗优势是单个小干扰RNA（siRNA）/ASO可以沉默多个病毒转录物。 siRNA：能与病毒mRNA结合，并引起细胞内RNA诱导的沉默复合体（RISC）降解病毒RNA。然而，由于该种疗法存在递送载体毒性和长期作用效果差，因此研究人员建议可以作为诱导疗法在短期疗程内给药以降低HBsAg水平。在部分患者中，研究人员发现AB-729可抑制HBsAg水平，从而增强HBV特异性免疫反应，这可能是该药物的另一个益处。 ASOs：能与病毒mRNA结合，并通过RNAseH1或空间位阻效应诱导其降解，从而阻止翻译。目前有两种反义分子，bepirovirsen和IONIS-HBVLRx，正在接受核苷（酸）类似物治疗的患者中进行Ⅱa期临床试验，最近的研究进展显示其均有积极的治疗效果。 ▎靶向HBV核心蛋白的药物 HBV核心蛋白作为病毒核衣壳的结构蛋白，是基因组进行逆转录和复制的场所。核心蛋白还调节HBV基因组的亚细胞转运和释放、RNA代谢、cccDNA转录，并抑制宿主先天性免疫反应。因此，HBV核心蛋白是乙肝药物开发的一个重要靶点。 核心蛋白变构调节剂（CpAMs）通过形成异常组装的核衣壳或缺乏pgRNA的形态正常但空的核衣壳（或两者兼有），来抑制HBV复制。目前至少有12种CpAMs处于药物开发的不同阶段（表4）。CpAMs在抑制所有HBV基因型的HBV复制方面非常有效，不过该类药物必须与一种或多种不同类型的抗病毒药物联合应用。CpAMs与核苷（酸）类似物联合应用时，会带来更快和更显著的病毒抑制作用。 ▎靶向HBV聚合酶的药物 靶向HBV聚合酶逆转录酶功能的药物是治疗慢性HBV感染广泛使用的药物。ATI-2173是一种乙肝病毒聚合酶抑制剂。在Ⅰ期临床研究中，28天给药后导致HBV DNA平均减少2.8 log10 IU/mL，且无任何严重不良事件。预计在短暂的给药间隔内，HBsAg水平没有变化，该药的Ⅱ期临床研究正在进行中。其他靶向HBV聚合酶如pradefovir、HS-10234，分别源自阿德福韦和替诺福韦，旨在提高抗病毒效力并降低代谢物毒性。初步数据表明，其有效性与TDF相似。靶向HBV聚合酶RNase H功能的药物也正在临床前开发中。 ▎靶向HBsAg释放的药物 由于HBsAg的清除被定义为功能性治愈，因此开发能够降低HBsAg水平和限制病毒产生的药物引起了研究人员的极大兴趣。此外，HBsAg在慢性HBV感染中以亚病毒颗粒的形式大量循环，因此有望通过降低HBsAg来恢复免疫反应。核酸聚合物（NAP）是一种短的合成寡核苷酸，能够与HBV亚病毒颗粒相互作用并阻断其分泌。一项只有40例病患的临床研究中，研究人员评估了REP2139或REP2165这两种NAPs与替诺福韦和pegylated IFN联用，并与替诺福韦和pegylated IFN单用进行了为期48周的比较。 结果显示，在治疗方案中加入NAPs的情况下，44%的患者HBsAg持续降低至检测水平以下，且全部产生了Anti-HBs，大多数接受NAPs治疗的患者（90%）观察到3-4级ALT升高，而在未接受NAP治疗的患者中为20%。未来还需要更大数量患者组的对照研究来进一步评估NAP的有效性和安全性。 另一种类似方法是使用S-抗原转运抑制寡核苷酸聚合物（STOPS）。STOPS也是一种单链寡核苷酸，可以隔离HBsAg产生所需的细胞蛋白。体外研究表明，STOPS比NAP具有更大的效力。然而，该药物的Ⅰ期临床研究结果显示，HBsAg未显著降低，因此试验已被终止。 ▎靶向HBV cccDNA的药物 消除肝细胞核内的cccDNA是治愈慢性HBV感染的关键。目前，有几种消除或沉默cccDNA的方法正在临床前开发阶段。然而，脱靶效应的潜在风险可能会限制这一方法的应用。基因编辑技术如锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶和CRISPR/Cas-9蛋白，通过在DNA中引入靶向双链断裂，然后通过同源修复在裂解位点产生突变使cccDNA失活。一项使用来自嗜热链球菌的CRISPR/Cas9系统对HBV感染细胞系的研究中，成功清除了90%的HBV cccDNA。 但在靶标特异性、安全高效以及提高编辑效率以消除所有cccDNA等方面还需进一步的研究。此外，靶向HBV X蛋白（HBX）可能是沉默cccDNA的可行方法。Pevonedistat和dicoumarol显示可降低HBX表达，恢复Smc5/6水平，并在培养的肝细胞和人源化小鼠模型中抑制病毒转录。另外，通过上调APOBEC3A/B表达也可导致cccDNA降解。 02 间接抗病毒药物 当前与治疗相关的一个问题是，是否可以通过纯抗病毒方法实现治愈，或者是否有必要添加免疫调节剂。目前的免疫学方法均针对先天性和适应性免疫系统，以广泛增强细胞防御并促进HBV适应性免疫应答（图2）。 ▎靶向先天性免疫系统 先天性免疫系统对HBV的识别能力很差，因此HBV被视为一种隐匿性病毒。然而，观察到肝非实质细胞产生的某些细胞因子（如IFN-α、IFN-γ、肿瘤坏死因子-β和白细胞介素[IL]-1α）以及LTbR介导的APOBEC（载脂蛋白BmRNA编辑酶，催化多肽样）激活或RIG-I激活，可以通过非细胞溶解机制抑制甚至清除HBV，这为开发先天性免疫反应的外源性激活剂提供了理论依据。几种病原体识别传感器的激动剂，例如TLRs、RIG-I和干扰素基因刺激物（STING），已被证明能诱导产生IFN刺激基因和促炎细胞因子，从而清除病毒。 先天免疫激动剂 TLRs在许多细胞亚群（包括免疫细胞）中表达，作为病毒和细菌病原体相关分子模式的传感器，在宿主防御中发挥着重要作用。在土拨鼠模型中，CpG寡脱氧核苷酸与ETV联合治疗被证明可以抑制土拨鼠肝炎病毒的病毒载量。几种口服TLR-7/8激动剂正在进行临床试验，包括GS-9620、RO7020531（RG7854）、RG7795（ANA773）、JNJ-4964（AL-034/TQ-A3334）和GS-9688。 刺激和恢复适应性免疫因子 目前临床上已经探索了几种策略来重新激活对HBV的弱适应性免疫应答，其中一个关键考虑因素是安全诱导治疗应答，而不会引起严重的肝细胞损伤和临床失代偿。 免疫检查点抑制剂：在一项小型试验研究中，评估了在核苷（酸）类似物治疗的患者中使用PD-1抑制剂（nivolumab）的效果，观察到HBsAg有轻微下降。一名患者在3级ALT升高之前实现了HBsAg血清学转换，且未观察到严重不良事件。最近的一项Ⅱ期临床研究评估了在有核苷（酸）类似物治疗经验的患者中使用PD-1单克隆抗体恩沃利单抗（envafolimab, ASC22）的效果。 观察到HBsAg最大降低1.2log10 IU/mL，且未出现显著的ALT升高，患者对治疗耐受性良好。另一种靶向PD-1途径的方法是通过核糖核酸酶H（RNAseH）途径降解PD-1配体mRNA。尽管免疫检查点抑制具有潜在作用，但对其安全性和不可预测反应还需进行更大规模的研究。 基因编辑T细胞：免疫疗法在癌症治疗中的成功，为乙肝治疗提供了新思路，如使用CAR-T细胞、TCR-T细胞激活T细胞受体，从而更新替代体内耗竭的T细胞并产生新的功能性T细胞。动物模型的初步证据表明，这种方法可以降低HBsAg和HBV DNA的水平，而不会引起显著的肝脏损伤。未来还需要在非肝细胞癌患者中进行进一步的临床研究以验证其安全性和有效性。 新型治疗性疫苗：目前的疫苗方法采用独特的策略来提高疫苗效力，包括纳入多种抗原以扩大T细胞应答（GS-4774，一种包含HBsAg、HB核心抗原和HBX的酵母载体）；改进递送系统（电穿孔，例如编码HBsAg和HB核心抗原的INO-1800疫苗，编码HBV核心和聚合酶蛋白的JNJ-64300535疫苗）；采用新型佐剂（INO-1800疫苗加INO-9112）；与检查点抑制剂联合使用；使用病毒载体（非复制型人腺病毒、黑猩猩腺病毒、改良后的安卡拉痘苗病毒和沙粒病毒）等。 — 总结 — 慢性HBV感染会导致慢性肝炎，患者一生都有发展为肝硬化和肝细胞癌的风险。因此，有必要进行终身监测以检测疾病进展。尽管当前治疗能改善临床结局，但由于药物对共价闭合环状DNA（cccDNA）和整合HBV DNA效果甚微，因此无法完全实现长期治愈。 鉴于全球疾病负担，迫切需要更有效的治疗方法，对HBV生命周期和持续性感染的免疫发病机制有更深入的了解，以及开发创新药物和给药方式。要实现功能性治愈可能需要多种药物联合治疗，包括抗病毒药物、降低病毒抗原负荷的药物以及增强免疫反应的免疫调节剂。 另外，还需要进一步完善基因编辑疗法。疾病负担在低收入和中等收入国家最为严重，因此，就需要开发出更安全、有效、疗程有限且负担得起的治疗方法。 扫码获取全文 劲帆医药已开发rAAV-HBV1.3-mer WT replicon、AAV-HBV-1.04（与武汉大学合作开发）和rAAV-1.2×HDV系列造模病毒产品，具备成模率高、稳定性好、适用范围广等优势，加速推进了乙肝/丁肝病毒复制机制的研究及抗乙肝/丁肝药物的研发进程。 01 乙肝造模AAV病毒产品 ▎产品信息 可根据客户不同需求定制HBV基因组点突变株。 应用场景：慢性乙肝模型、HBV持续复制模型，可用于研究乙肝病毒复制机制及抗乙肝药物的开发。 可提供的现货产品见下表，另相关AAV-HBV-1.04系列造模病毒产品可致电客服17720514121详询。 ▎产品列表 02 丁肝造模AAV病毒产品 ▎产品信息 可根据客户不同需求定制不同肝脏特异性启动子启动的HDV基因组及其点突变株。 应用场景：慢性乙肝/丁肝合并感染模型，可用于研究丁肝病毒复制机制及抗丁肝药物的开发。 可提供的现货产品见下表。 ▎产品列表 END 劲帆医药自主研发的昆虫杆状病毒One-Bac 4.0系统，能克服传统Bac/Sf9系统感染效率低、空壳率高、种毒传代不稳定等问题，在大规模量产定制化AAV过程中，可实现高产率、高感染活性、高实心率，单批次产能可达1E+18vg，为您的基因治疗药物研发保驾护航！业务合作欢迎致电17720514121详询！ 关于劲帆医药 劲帆生物医药科技（武汉）有限公司简称“劲帆医药”，创立于2022年，提供一站式基因治疗药物CRO/CDMO服务。拥有全球领先的AAV规模化制备专利技术平台及cGMP级病毒载体生产车间，致力于推进基因治疗更有效，更安全，更经济，更可及，赋能客户，造福患者。 联系我们 电话：17720522078 官网：www.genevoyager.com 邮箱：marketing@genevoyager.com 地址：中国武汉东湖高新区光谷七路128号 微信：Genevoyager2022 关于同写意  同写意论坛是中国新药研发行业权威的多元化交流平台，二十年来共举办会议论坛百余期。“同写意新药英才俱乐部”基于同写意论坛而成立，早已成为众多新药英才的精神家园和中国新药思想的重要发源地之一。同写意在北京、苏州、深圳、成都设立多个管理中心负责同写意活动的运营。 尊享多重企业/机构会员特权  ● 分享庞大新药生态圈资源库； ● 同写意活动优享折扣； ● 会员专属坐席及专家交流机会； ● 同写意活动优先赞助权； ● 机构品牌活动策划与全方位推广； ● 秘书处一对一贴心服务。 入会请联系同写意秘书处  同写意创新链盟机构  （上下滑动查看更多） 国通新药 | 通瑞生物 | 科济药业丨立迪生物 | 森西赛智 | 汇芯生物 | 申科生物 | 方拓生物 | 东抗生物 | 科盛达 | 依利特 | 翊曼生物丨锐拓生物丨复百澳生物丨圆因生物丨普洛斯丨华润三九丨皓阳生物丨人福医药丨广生堂药业丨澳宗生物丨妙顺生物 | 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导读：基于十多年的技术积累和革新，体外转录（IVT） RNA技术的关注度因新冠mRNA疫苗的成功提升到了空前的高度。RNA在理论上可以生产出任何一种人类所需的蛋白质，用于传染病预防、肿瘤治疗、蛋白替代治疗、细胞治疗、再生医学等领域，mRNA的科研价值和商业价值无可比拟。与mRNA相比，环状RNA(circRNA)具有更高的稳定性，并且未修饰转录本的免疫原性也较低。circRNA的这两个关键优势，可以充分发挥RNA疗法的全部潜力。 2023年，中国食品药品检定研究院（简称中检院）研究团队在Frontiers in Immunology（IF:5.7）上发表综述《Research progress on circular RNA vaccines》，总结了circRNA的发现、体内代谢和生物学功能，以及circRNA疫苗的研究进展、生产过程、质量控制中的主要挑战及解决策略等，以期为circRNA疫苗相关研究提供参考。 01 背景介绍 COVID-19 mRNA疫苗是首个获批的mRNA疫苗，其可诱导高水平的体液免疫和细胞免疫反应，全球已接种超40亿剂mRNA疫苗，约占免疫接种总数的1/3。目前，约40种mRNA疫苗处于临床试验阶段，其中多种已批准上市或获得紧急使用授权。 COVID-19 mRNA疫苗为线性结构，稳定性差。circRNA因具有由共价键形成的单链闭环结构，在体内具有较高稳定性，且可进行蛋白质编码和翻译，为疫苗开发提供潜力。开发的COVID-19 circRNA疫苗，不仅具有线性mRNA疫苗的优势（快速和可编辑性等），且在一定温度范围内比线性mRNA疫苗具更高的稳定性和更长的蛋白表达时间，低剂量即可引发强烈的免疫反应。因此，一些研究人员认为circRNA疫苗可成为应对未来新型重大传染病或其他常见病毒性疾病（如HBV、HHV、EBV、IAV和HPV）的有力工具，并可能开发用于细胞疗法或治疗性肿瘤疫苗。 02 circRNA的发现 1971年，在马铃薯纺锤体块茎病研究中发现可入侵植物并致植物死亡的缺少蛋白外壳的病毒样分子，称为“类病毒”。1976年Sanger等人首次将类病毒描述为单链共价闭合的circRNA分子。1979年，Hsu和Coca-Prados使用电子显微镜发现HeLa细胞中存在无自由侧翼末端的circRNA分子，首次报道在真核细胞中观察到circRNA分子。1990年代初，鉴定并表征由内源性RNA产生的circRNA。 后续研究提出了产生这类分子的机制，如假设反向重复序列是Sry环化所必需的。2010年起，随着RNA测序和生物信息学技术的发展，揭示了不同生物体（如人类、小鼠、植物、隐球菌、斑马鱼和原生生物）中存在多种高度保守的circRNA，使circRNA研究爆炸式增长。2015年，首次报道能编码和翻译蛋白的circRNA。2017年开始，现代分子生物学实验技术的应用使先前研究发现的各种circRNA得以验证。2018年研究人员成功合成能表达蛋白质的circRNA，用于疫苗开发。2022年，开始研究COVID-19 circRNA疫苗和治疗性肿瘤或遗传疾病疫苗。 图1 circRNA研究的重大发现 03 天然circRNA的体内代谢和功能 3.1 circRNA合成 RNA经反向剪接和外显子跳跃在体内循环。反向剪接的RNA环化是RNA出现断点后，下游5'剪接供体位点与上游3'剪接受体位点的反向连接，后内含子序列经选择性剪切产生circRNA。外显子跳跃实现的RNA环化是外显子与内含子剪接后发生环化的过程。不同的断点位置有助于circRNA的多样性，不同类型的circRNA由外显子、内含子、基因间区域或非转录区域通过反向剪接随机组合产生。 根据序列组合差异，circRNA分为4类：（1）外显子circRNA：仅含外显子，占总circRNA的80%以上，通过套索驱动的环化或直接反向剪接环化产生。两个侧翼内含子间的碱基配对使下游5'ss和上游3'ss结合，促进反向剪接反应以产生circRNA；（2）外显子-内含子circRNA：又称eiciRNA，由外显子跳跃环化产生，隐藏在核心外显子的侧翼内含子序列通常需剪接；（3）内含子circRNA：由从套索衍生机制的分枝中逃脱的内含子产生，依赖于前体mRNA 5'剪接位点附近共有鸟嘌呤（G）和尿嘧啶（U）富集结构域和断点附近富含胞嘧啶（C）结构域。富含GU的结构域可保护富含C结构域不发生分支或降解，产生稳定circRNA；（4）tRNA内含子circRNA：由前体tRNA被tRNA剪接核酸内切酶（TSEN）复合物切割裂解产生的外显子和内含子连接形成。 图2 4种类型circRNA 3.2 circRNA生物学功能 （1）基因转录调节：circRNA可与宿主DNA结合形成R-loop，影响DNA复制、转录和损伤后修复。如circSEP3通过与cSMARCA5形成R-loop导致转录终止；circRHOT1将Tat互作蛋白60kDa（TIP60）募集到NR2F6启动子上，诱导原癌基因表达促进肝细胞癌中的细胞增殖、迁移和侵袭。 （2）“海绵”效应：天然circRNA对microRNA（miRNA）或蛋白表现出“海绵”效应。如circHIPK3与miR-124结合并抑制其活性；circHIPK2通过靶向miR124-2HG调节星形胶质细胞活化；circNfix与Ybx1（过表达导致不良预后及各种肿瘤复发）和Nedd4l结合，促进其相互作用并诱导Ybx1降解。 （3）通过形成复合物激活蛋白：EBV感染宿主后产生circBART2.2，被细胞RIG-I受体识别，RIG-I受体被激活后通过下游干扰素信号通路实现抗病毒作用。但m6A甲基化修饰后的circRNA未被RIG-I受体识别。 （4）蛋白翻译：2015年在果蝇中首次发现circRNA编码和翻译蛋白的能力。circRNA由IRES或MIRES介导翻译起始：IRES将核糖体募集到mRNA内部区域以启动翻译，可通过募集不同反式作用因子促进核糖体组装和启动翻译，如circMbl和circFGFR1；MIRES介导的翻译起始涉及RNA中一或多个位点发生m6A甲基化，使eIF4G2的募集用于翻译起始。 3.3 circRNA降解 circRNA的稳定闭环结构可使其免受核糖核酸外切酶（如RNaseR）裂解。研究发现dsRNA或poly（I：C）可在体内激活内切酶RNase L降解circRNA；ATP依赖性RNA解旋酶、UPF1和核酸内切酶G3BP1可识别具复杂二级结构的circRNA并诱导其降解；HRSP12可识别circRNA的m6A修饰，其与RNase P/MRP内切酶复合体相互作用诱导circRNA降解；circRNA可通过特异性引物和探针靶向被内切酶RNase H降解；miR-671与circRNA CDR1as序列的互补结合也诱导AGO2介导的circRNA降解。 04 circRNA疫苗研究进展 人工制备circRNA的方法：（1）化学合成：BrCN或EDC诱导线性RNA的5'-端磷酸和3'端羟基间形成共价键，产生circRNA，但该过程易产生2'-5'磷酸二酯键；（2）T4 RNA连接酶连接：线性RNA分子5'-端单磷酸基团与3'-端羟基经T4 RNA连接酶作用形成共价键而环化，因此使用T7 RNA聚合酶体外合成的RNA在环化前须去除两个磷酸基团，其中RppH用于去除β和γ磷酸；（3）内含子自剪接：I/II类内含子可执行RNase功能，使线性RNA分子形成circRNA。 图3 体内外（人工）circRNA的环化方法 2015年，通过构建含分裂GFP的单外显子小基因，发现前体mRNA可在人和果蝇细胞中高效反向剪接产生可翻译circRNA。2018年，使用IRES介导翻译起始的I类内含子剪接法合成编码EGFP的circRNA，在293T细胞持续表达168h，而线性mRNA仅表达48h。目前人工合成表达蛋白的circRNA主要通过内含子剪接（图4A）或T4 RNA连接酶连接（图4B）产生。 图4 制备circRNA疫苗的方法 Wei等人采用IRES介导翻译起始的I类内含子剪接法开发一种针对原始COVID-19毒株的LNP-circRNA疫苗。分别以10μg、50μg/只剂量免疫小鼠，均引起较强的Th1免疫反应。猴子接受两剂100μg/只的疫苗后进行原始病毒株攻击实验，免疫组肺部病毒载量、肺损伤程度和肺部浸润性炎症细胞数量显著降低。随后针对COVID-19 Delta变体、Omicron BA1变体的circRNA疫苗实验证明疫苗的广谱活性及高稳定性。 Wang等人使用II类内含子剪接法制备COVID-19 circRNA疫苗用于小鼠免疫，引发强烈的RBD特异性记忆B细胞反应和平衡的Th1/Th2细胞免疫反应，血清IgG滴度为线性mRNA疫苗的10倍。 使用T4 dt内含子剪接法进行RNA环化会产生“剪接疤痕”序列，不同的序列长度导致不同的拓扑结构。circRNA组成元件及组成差异（载体拓扑结构、非翻译区（UTR）和IRES等）影响翻译效率。通过不同剪接疤痕、5'UTR、3'UTR和IRES序列的实验对比，发现使用50nt长剪接疤痕序列和Apt-eIF4G序列作为5'UTR、全长HBA1序列作为3'UTR及野生型iCVB3序列作为IRES构建的circRNA翻译效率显著提高，在293T细胞中持续表达7天，而线性mRNA疫苗仅表达3天。综上，当以低剂量给药时，circRNA疫苗不仅具有强免疫原性，且持续表达蛋白时间更长。 circRNA和线性mRNA疫苗间的差异：（1）体内降解方法不同；（2）circRNA疫苗主要使用IRES介导的翻译途径，线性mRNA疫苗使用5'帽（m7GpppN）结构介导的翻译途径，二者通过涉及不同起始因子的转录起始复合体翻译成蛋白；（3）circRNA疫苗因环形结构不易被降解而无需修饰，线性mRNA疫苗需假尿苷、5'帽和3'poly（A）等修饰。 05 circRNA疫苗生产过程 目前circRNA疫苗工业化生产步骤如下： （1）质粒作模板，经体外转录合成线性RNA分子； （2）RNA环化，其中内含子剪接法因无需添加酶而具较好应用前景，T4 RNA连接酶连接也可用于circRNA工业化生产，但对序列长度>2000nt的RNA分子环化效率较低； （3）使用递送系统（如LNP）进行疫苗包封。环化反应会产生如线性RNA前体、剪接的RNA序列等杂质，常采用色谱法去除。由于提高RNA环化效率导致杂质含量降低，因此提高环化效率可能是简化纯化过程的可行方法。有研究表明，在pH=7.5且终浓度为50mM Tris-HCl、10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲溶液中进行环化，有效提高RNA环化效率。 图5 circRNA疫苗生产工艺流程图 06 circRNA疫苗质量控制 WHO发布关于评估mRNA疫苗预防传染病的质量、安全性和有效性的监管考虑指导文件。USP制定了mRNA疫苗质量分析程序，NMPA药物评价中心（CDE）发布了预防性COVID-19 mRNA疫苗药物研究技术的指导原则（试行），上述指导文件可作为制定circRNA疫苗质量控制过程的参考。 环化率、纯度是circRNA疫苗的关键质量属性(CQA)，常利用毛细管电泳（CE）和HPLC测定。T4 RNA连接酶、RNase R及dsRNA的残留量使用ELISA进行质量控制，其中测定疫苗中dsRNA残留量常使用抗dsRNA J2抗体，但circRNA是否可直接结合抗dsRNA J2抗体或干扰抗dsRNA J2抗体与dsRNA结合的研究尚未报道，故使用该法前需进行样品适用性分析。 07 总结 由于研发、生产、质量控制和安全等方面的问题，circRNA的研究仍处于临床前阶段，后续通过优化条件或开发新型方法解决上述问题对于使circRNA疫苗成为应对未来新型重大传染病、常见病毒性疾病工具或治疗性肿瘤疫苗至关重要。