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—共价的道路上，没有终点，只有里程碑 经典的共价弹头如以丙烯酰胺为代表的α,β-不饱和羰基通过迈克尔加成反应与半胱氨酸的巯基硫形成共价键，以芳基磺酰氟为代表的硫（VI）弹头通过亲核取代反应与赖氨酸形成共价键。在药物设计中，将这类共价弹头与配体相连，实现配体在口袋中的长时间占据。 然而，共价反应的活跃性常常导致脱靶结合、代谢稳定性差等问题。因此，作为反应中心的共价弹头的设计以及进一步的整体药物分子设计尤为重要。本文将介绍一些新型共价弹头以及它们在药物设计中的巧妙应用。  N-酰基-N-烷基磺酰胺类共价弹头 配体导向（Ligand-directed）化学是一种基于亲和力驱动的化学反应策略，由Itaru Hamachi教授提出，最初作为生物正交蛋白质标记技术的替代方案，用于配体脱离的化学生物学探针设计，由于其高效的反应动力学和独特的反应机制，在共价药物设计中得到应用。从2009年至今已发现了五种基于该策略的共价弹头，最新一代为2018年报道的N-酰基-N-烷基磺酰胺（NASA）和2023年改良的N-酰基-N-芳基磺酰胺（ArNASA）。NASA为赖氨酸靶向共价弹头，当赖氨酸ε-氨基亲核进攻缺电子的羰基碳后，发生电子转移，原有的酰胺键断裂，赖氨酸氨基与NASA的羰基形成新的酰胺键，这使得NASA氨基端的基团脱离，而羰基端的基团共价连接到蛋白质上（Fig.1）。以该弹头亲核取代反应的特性，可以进行如下分子设计：利用非共价配体进行定位，随后对氨基酸残基进行共价修饰，最后配体脱离。这种定位-共价-脱离的药物分子设计策略可以实现特定氨基酸残基的长时间标记，同时减少配体本身对靶标功能的影响。 Figure 1 Evolution of ligand-directed (LD) chemistry. DOI: 10.1021/jacs.8b11747 二价降解剂设计 2024年，Yu Chen等报道了一种基于NASA的多特异性分子，他们将90kDa热休克蛋白（HSP90）配体连接在NASA的氨基端（脱离端），目标蛋白（POI）配体连接在NASA的羰基端（共价结合端），从而实现HSP90蛋白的特异性标记，即共价反应使HSP90变为一个稳定的、能特异性识别并结合POI的降解子，而配体的脱离又减少了对HSP90功能的影响。理论上，靶标蛋白被降解后又会重新释放出其配体和降解子，进入下一轮结合与降解。通过该分子标记血小板中的HSP90，构建工程化的降解血小板（DePLTs），这些降解血小板会主动靶向伤口区域并激活。根据预标记HSP90的POI配体类型及其转运机制，激活后的DePLTs可通过泛素-蛋白酶体系统或溶酶体途径，在靶细胞内介导目标蛋白降解。其中，被包裹在血小板微粒中的HSP90利用泛素-蛋白酶体系统降解细胞内POI，而释放的游离HSP90则将细胞外POI导向溶酶体降解。在乳腺癌术后小鼠模型中，携带对应POI配体的DePLTs成功降解了细胞内溴结构域蛋白4（BRD4）和细胞外程序性细胞死亡配体1（PD-L1），从而有效抑制了癌症复发或转移（Fig. 2）。 Figure 2 Schematic illustration of platelet-based protein degraders with covalently labeled HSP90 realizing TPD for intracellular or extracellular targets in vivo. DOI: 10.1038/s41587-024-02494-8 2025年的另一项研究中，Rentang Huang等利用NASA的高选择性、快速反应性和生物相容性，将Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）适配体和VHL配体通过NASA相连，NASA与ZBP1表面的亲核氨基酸残基发生亲核取代反应，将其打上“降解标签”，在缺乏ZBP1高亲和力小分子配体的情况下实现了其共价识别和高效降解，克服了传统PROTAC技术中非共价稳定性带来的挑战。通过共价PROTACs直接降解ZBP1为体内炎症性病毒感染提供了有效治疗手段（Fig. 3）。 Figure 3 Schematic of C-PROTAC design and its impact on ZBP1 signaling during viral infection. DOI: 10.1002/anie.202423524 翻译后修饰仿生调控剂设计NASA除了可以被用作二价降解剂的设计，也可以用来设计单价分子，实现翻译后修饰的仿生调控。赖氨酸酰化是广泛存在且结构多样的翻译后修饰，极大地扩展了人类蛋白质组的功能多样性。因此，靶向赖氨酸残基的酰化已成为调控蛋白质功能的仿生策略。传统的细胞内靶向赖氨酸酰化的策略往往依赖基因干预、内源性酰化机制的激活或非特异性酰化试剂。Elizabeth M. Ryan等开发了一种靶向赖氨酸酰化探针/调控剂：在POI配体的赖氨酸朝向区引入NASA弹头，NASA的羰基端为乙酰基、丁酰基等酰化基团。在分子动力学尺度，配体首先结合POI口袋，NASA从而接近待修饰的赖氨酸残基，与其发生亲核取代反应，最终，赖氨酸被特异性修饰预设的酰化基团，配体脱离口袋。这种方式避免了传统酰化方式对细胞内其他分子机器的调动，将酰化过程对环境的干扰大大降低，同时，精准酰化特定氨基酸残基，减少脱靶修饰。作者鉴定出选择性作用于旁系同源物的化学探针，可对干扰素刺激的抗病毒RNA结合蛋白中保守的赖氨酸进行乙酰化，从而生成具有阻断RNA相互作用的全新蛋白质构型，并进一步证实，通过靶向调控视黄醇代谢关键酶的乙酰化修饰，可诱导蛋白质形成具有构象变化的异构体，从而引发功能获得性表型（Fig. 4）。 Figure 4 Strategies for targeted protein acylation and versatile chemical tools for post-translational lysine modifications in live cells. DOI: 10.1021/jacs.4c09073 可触发迈克尔受体共价弹头 除了亲核取代，通过迈克尔加成反应也可以实现“触发-释放”的化学反应。Jiaming Zhuang等提出了一种能同时响应硫醇和胺类等化学/生物活性强信号的化学开关。该硫醇/胺触发型化学开关基于带有β位优良离去基团的可触发迈克尔受体（TMAc）。受体通过“触发-释放”过程实现动态调节：硫醇/胺的加入会触发离去基团的级联释放，形成活性较低的受体。新生成的TMAc可通过二次亲核触发的“触发-逆向”过程，逆转释放原始硫醇/胺（Fig. 5）。 Figure 5 Chemical switch for bonding and debonding using Triggerable Michael Acceptors (TMAc). DOI: 10.1039/c9sc05841a 磷酸化靶向嵌合体设计 在基于事件驱动的多特异性分子研发浪潮中，由于蛋白质磷酸化是动态细胞过程（如信号传递、相变）中快速传递信息的核心机制，磷酸化靶向嵌合体（PHICS）和去磷酸化靶向嵌合体（PhosTAC）备受瞩目，其原理是利用小分子物理拉近激酶/磷酸酶和POI，实现POI的磷酸化/去磷酸化。大多数PHICS/ PhosTAC的效应器配体（激酶配体）采用非抑制性变构结合剂，防止配体结合的同时抑制效应器的激酶活性，然而相较于抑制剂，激动剂、别构分子开发更加困难，一些激酶缺乏合适的配体用来设计嵌合体。在一些研究中，使用基因编辑技术，给效应器连上FKBP-Tag，利用Tag配体，间接拉近效应器和POI，这种设计可以有效探索POI磷酸化/去磷酸化表型，却难以继续进行药物设计与优化。那么，能否利用效应器抑制剂开发事件驱动的多特异性分子呢？Rajaiah Pergu等给出了答案，他们将布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂通过甲基丙烯酰胺（一种可触发的迈克尔受体）与BRD4配体相连，当BTK抑制剂将分子定位到BTK口袋附近后，口袋附近的半胱氨酸巯基与迈克尔受体发生加成-消除反应，BTK抑制剂脱离而BRD4配体共价连接到BTK蛋白上，随后，ATP结合并催化BTK的激酶功能，使被募集的BRD4磷酸化。这种PHICS被验证在伊布替尼耐药细胞系中展现出积极活性（Fig. 6）。 Figure 6 Schematic representation of BTK tagging via inhibitor-directed addition−elimination,  ternary complex formation, and phosphorylation of BRD4. DOI: 10.1021/acscentsci.3c00200 思考与展望 随着药物研发的不断深入与学科交融的持续推进，新型化学技术在药物设计中的应用将可预见地持续增多，如何利用这些有机化学、化学生物学中的新技术进行分子设计是一个值得长期探讨的问题。新型共价技术在药物设计中的应用是一个很好的例子，我们讨论了这些机制独特的共价弹头如何在二价降解剂、翻译后修饰仿生调控剂以及事件驱动的多特异性分子中发挥作用，包括但不限于对1. 怎样对缺乏高亲和力小分子配体靶标进行高效降解；2. 怎样在不干扰靶标活性情况下实现特定氨基酸的精准修饰；3. 怎样在缺少效应器非抑制性配体的情况下设计事件驱动的多特异性分子这些问题的回答。未来，随着化学空间的拓展和有机合成技术的提升，将会有更多精妙的药物分子设计，解决长期困扰我们的临床问题。 参考资料： 1. Tsukiji S, Miyagawa M, Takaoka Y, Tamura T, Hamachi I. Ligand-directed tosyl chemistry for protein labeling in vivo. Nat Chem Biol. 2009;5(5):341-343. 2. Fujishima SH, Yasui R, Miki T, Ojida A, Hamachi I. Ligand-directed acyl imidazole chemistry for labeling of membrane-bound proteins on live cells. J Am Chem Soc. 2012;134(9):3961-3964.. 3. Takaoka Y, Nishikawa Y, Hashimoto Y, Sasaki K, Hamachi I. Ligand-directed dibromophenyl benzoate chemistry for rapid and selective acylation of intracellular natural proteins. Chem Sci. 2015;6(5):3217-3224..  4. Tamura T, Ueda T, Goto T, et al. Rapid labelling and covalent inhibition of intracellular native proteins using ligand-directed N-acyl-N-alkyl sulfonamide. Nat Commun. 2018;9(1):1870. 5. Kawano M, Murakawa S, Higashiguchi K, Matsuda K, Tamura T, Hamachi I. Lysine-Reactive N-Acyl-N-aryl Sulfonamide Warheads: Improved Reaction Properties and Application in the Covalent Inhibition of an Ibrutinib-Resistant BTK Mutant. J Am Chem Soc. 2023;145(48):26202-26212. 6. Tamura T, Hamachi I. Chemistry for Covalent Modification of Endogenous/Native Proteins: From Test Tubes to Complex Biological Systems. J Am Chem Soc. 2019;141(7):2782-2799. 7. Chen Y, Pal S, Li W, Liu F, Yuan S, Hu Q. Engineered platelets as targeted protein degraders and application to breast cancer models. Nat Biotechnol. 2025;43(11):1800-1812.  往期回顾： 衰老与癌症：硬币的两面? Linker 优化：PROTAC 的关键？ 非阿片镇痛：从VX-150到VX-548 老药新用：药物发现的捷径？ 靶向磷酸酶：药物设计路在何方？ 排版/整理：舒黄亮