BNT-141

摘要在过去的十年中，用于预防和治疗应用的信使RNA（mRNA）疫苗的开发已经迅速发展。mRNA疫苗在各种应用中已证明具有治疗功效，包括传染病、免疫疗法、遗传性疾病、再生医学和癌症。许多mRNA疫苗已进入临床试验，少数几种已获得FDA上市批准。与传统方法相比，这种新兴的治疗方法在以下几个方面具有优势：安全性，有效性，适应性，批量生产以及成本效益。然而，值得一提的是，向目标部位的递送和体内降解以及热稳定性是能够改变其疗效和结果的限制因素。在本文中，我们介绍了不同类型的mRNA疫苗，其作用方式以及优化其开发和克服其限制的过程。我们还重点探讨了各种纳米颗粒介导的mRNA疫苗的递送系统。一般来说，递送系统在提高mRNA疫苗稳定性，生物相容性和对目标细胞和组织的靶向能力方面起着至关重要的作用。除了作为运载工具的功能外，它们还能保护mRNA分子免受可能改变其效率的物理、化学和生物活性的伤害。最后，我们重点讨论了关于未来应聚焦更安全和更有效的mRNA应用，并强调了当前mRNA疫苗的优点和缺点。1.背景疫苗接种在抗击传染病方面发挥了关键作用，并在全球公共卫生方面做出了重大贡献。传统的疫苗平台在疾病预防中发挥了重要作用，主要使用灭活或减毒病原体、蛋白质亚基或病毒载体。然而，这些传统的疫苗平台通常需要复杂的制造过程，并且在可扩展性、开发速度和适应新出现病原体方面可能存在限制。近年来，mRNA（即信使RNA）疫苗已成为一种突破性的技术，为针对包括病毒爆发和新兴病原体在内的传染病进行快速和有针对性的疫苗开发提供了一个多功能平台。mRNA疫苗是新一代的疫苗，利用体内细胞生产特定的抗原，进而引发针对产生的抗原的免疫反应。这种创新方法比传统疫苗平台具有许多优势。它已经引起了人们的极大关注，特别是在最近针对SARS-CoV-2病毒的mRNA疫苗成功开发和使用情况下。mRNA疫苗的一个主要优势是它们的快速开发和生产能力。与传统疫苗需要耗时且昂贵的制造过程不同，mRNA疫苗可以在几周内设计和合成，为应对新兴传染病或不断变化的病原体提供前所未有的灵活性和速度。此外，mRNA疫苗的遗传信息模板特性使得通过简单地改变编码所需抗原的mRNA序列来轻松适应不同的病原体。然而，有效地将mRNA分子传递到目标细胞是一个重大的挑战，因为它们容易受到降解、稳定性有限并且难以到达所需的作用部位。纳米颗粒已成为有潜力的工具，为mRNA疫苗递送提供了许多优点，克服了裸露的mRNA分子的固有局限性。这些纳米级载体提供保护和输送能力，促进有效的细胞摄取、保护免受酶降解以及mRNA有效载荷的控释。此外，纳米颗粒可以经过改造来提高稳定性、延长循环时间，并促进其靶向递送到免疫细胞或特定组织，最终增强了mRNA疫苗的免疫原性和疗效。脂质纳米颗粒（LNPs）已成为目前mRNA疫苗传递的主要纳米颗粒。LNP可以在其疏水核心中封装和保护mRNA，从而实现高效的细胞摄取和胞内释放。这种方法已成功应用于开发针对各种传染病（包括COVID-19）的mRNA疫苗。LNP表现出优秀的安全性、高转染效率和诱导强大免疫反应的能力，使其成为有效疫苗接种策略的潜力工具。除了LNP之外，还探索了其他类型的纳米颗粒，如聚合物纳米颗粒、肽和基于鱼精蛋白的递送系统，用于mRNA疫苗的递送。每种纳米颗粒类别都有着不同的优势，例如可调的尺寸、表面修饰和靶向传递能力。包括合成聚合物和天然聚合物在内的聚合物纳米粒子在设计上具有多样性，可以保护裸露的mRNA免受降解。与此同时，自组装肽和鱼精蛋白纳米复合物在细胞穿透方面具有独特的性质。纳米颗粒mRNA疫苗的重要性和相关性超越了它们在预防传染病方面的应用。mRNA技术在解决其他疾病治疗方面也具有潜力，包括癌症免疫治疗、个性化医疗和遗传疾病的干预治疗。使用纳米颗粒快速设计和生产mRNA疫苗的能力证明了它具有应对新发传染病的灵活性，在疫情应对中是一笔宝贵的财富。本综述我们将全面概述纳米颗粒作为mRNA疫苗递送载体的功能。我们将介绍mRNA疫苗的定义、作用机制、传递系统、生产工艺和临床应用。通过阐明纳米颗粒mRNA疫苗的重要性和相关性，本综述还将致力于揭示疫苗开发的进步以及mRNA疫苗在传染病预防和其他治疗干预中的潜力。2.mRNA疫苗的发展这一部分将讨论不同类型的mRNA疫苗，阐述其作用机制以及提高mRNA疫苗安全性和有效性的不同方法。2.1.mRNA疫苗的分类基因疫苗的接种后免疫效果优于传统疫苗，例如重组蛋白和活病毒或灭活病毒疫苗。例如，DNA疫苗可以刺激体液免疫和细胞免疫。此外，与传统的疫苗相比，基因疫苗更容易实现大规模生产。mRNA疫苗有三种类型：传统mRNA疫苗、自扩增mRNA疫苗和跨扩增mRNA疫苗。传统mRNA含有非翻译区（5UTR、3UTR）和免疫抗原的编码区；因此，它被称为非扩增或非复制型mRNA。免疫反应与转录的mRNA数量成正比，由于其未扩增的行为可能导致需要反复施用mRNA，因此可能需要高剂量的mRNA。自我扩增mRNA疫苗是通过添加来自我复制RNA病毒的复制子而进行基因修饰的mRNA。自我扩增mRNA和跨扩增mRNA都具有5’端和3’端保守序列元件（CSE）。据推测，CSE除了能与病毒或细胞蛋白结合外，还可以调节病毒RNA合成。自我扩增mRNA和跨扩增mRNA之间的主要区别在于自我扩增mRNA具有非结构蛋白1-4（nsP 1-4）序列，而跨扩增mRNA需要同时递送两个RNA基因，即没有nsP 1-4编码序列的mRNA和有nsP1-4编码序列的mRNA。2.2.mRNA疫苗的作用机制的确，细胞中的mRNA是从细胞核中的基因组DNA转录而来，并且可以在细胞质中的核糖体上进行翻译以形成所需的蛋白质。最初，mRNA在RNA聚合酶的帮助下从基因组DNA转录为初级mRNA。初级mRNA包含外显子和内含子。此后，初级mRNA经过进一步的修饰转化为成熟mRNA，这些修饰包括剪接初级mRNA以去除非编码内含子、封闭5'UTR，并在3'端添加聚腺苷酸序列。在mRNA疫苗技术中，mRNA在体外合成，并经过注射和穿过细胞膜以在细胞质中进行翻译。在mRNA从细胞核（天然合成的mRNA）或从细胞膜（mRNA疫苗）转移到细胞质后，mRNA通过核糖体翻译成所需的蛋白质。在翻译过程中，poly-A尾与poly-A结合蛋白（PABP）结合，真核起始因子eIFs与5'UTR帽结合以启动翻译。核糖体然后翻译mRNA中翻译区（由三个核苷酸组成）的每个密码子，将其转化为氨基酸。从mRNA翻译的作用机制中可以知道，合成的mRNA疫苗中的5'帽、5'UTR、翻译区、3'UTR和poly-A尾等成分需要被核糖体识别，才能成功地将mRNA翻译成所需的抗原。与质粒DNA（pDNA）疫苗相比，使用mRNA疫苗的主要优势在于不需要像pDNA在翻译成所需蛋白质之前进入细胞核内并成功转录为所需的mRNA。体外合成RNA的递送存在几个生理障碍。阻碍RNA传递的主要障碍之一是穿越细胞膜并从内体中逃逸。因此，mRNA需要一种递送载体，这将在下一节（第3节）中详细解释。在传统mRNA中，开放读框（ORFs）编码抗原，可以翻译成感兴趣的抗原，例如病毒表位，从而诱发免疫反应，引起接种者被感染时对病原体的识别。图1说明了mRNA给药后免疫系统激活的机制。图1 mRNA脂质纳米颗粒疫苗的免疫激活机制。自扩增mRNA包含能在蛋白翻译之前RNA扩增所需的病毒复制序列如CSE和nsP 1-4，nsP1负责5’端帽状结构化病毒RNA，nsP2除了具有解旋酶和蛋白酶活性之外，还可以在复制过程中解开RNA双链。此外，nsP2可以裂解nsP 1-4多肽蛋白为其亚基（nsP1、nsP2、nsP3和nsP4） 。nsP3促进病毒和宿主蛋白之间的相互作用，而nsP4是一种RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp），催化RNA复制。自我复制后，自我扩增mRNA可以产生数个拷贝，这些拷贝将翻译成抗原，因而比传统mRNA引起的免疫反应更强。2.3.mRNA疫苗优化能够增强mRNA疫苗的稳定性、安全性和有效性的方法各有不同。修饰mRNA的非翻译区(UTR)对于增加其稳定性及其有效性起着至关重要的作用。尽管5'和3'UTR在mRNA翻译过程中没有翻译序列，但它们在改善mRNA的稳定性和从mRNA中表达蛋白质方面起着至关重要的作用。mRNA的5'帽和3'UTR中的poly(A)尾可以调节mRNA的翻译效率。例如，据报道，在5'UTR中修饰反义帽类似物可以增强mRNA翻译。这种翻译增强可能是由于修饰帽与核糖体中的真核翻译起始因子(eIFs)的结合力增加。此外，当在未成熟树突状细胞中转染时，将mRNA的帽转换为磷酸硫代酯基团可能改善mRNA疫苗的稳定性和表达。向mRNA中添加核苷酸可以改变疫苗的稳定性和翻译能力。据报道，在哺乳动物细胞中向mRNA中插入假尿苷与未修饰的mRNA相比，增加了翻译蛋白的产量，并减少了不希望的免疫原性反应。因此可以通过减少免疫原性反应和增加蛋白质表达来分别增强安全性和有效性。此外，将修饰的核苷酸整合到mRNA序列中可以减少或消除Toll样受体(TLRs)的激活，最终增强mRNA疫苗的安全性。3.mRNA疫苗递送系统本部分将介绍四种不同类型的材料，即聚合物、肽、鱼精蛋白和脂质，以及它们为了提高给药后的mRNA疫苗稳定性、有效性和安全性，作为裸mRNA的载体所各自拥有的递送系统。3.1.聚合物纳米颗粒聚合物通常起初是与聚乙烯亚胺（PEI）聚合物一起用于核酸的递送。然而，由于PEI存在高表面电荷密度和毒性，其应用受到了限制。因此，研究人员一直在探索替代递送方法，例如将低分子量PEI与聚乙烯基乙二醇（PEG）结合并把它与环糊精结合，这是一种有效且更安全的途径，并且可以通过不同的途径给药导致产生不同的抗体。新型的可生物降解的聚合物如聚(氨基酯)，有希望未来用于肺部mRNA递送。科学家已经开发出用于结构-功能研究的聚(氨基酯)库，这些库可以通过Michael反应制备。这些可生物降解聚合物可以容易地修饰主链和外围基团，而具有高胺密度的超支化树枝状球形树状大分子可以有效地形成mRNA复合物。然而，这些复合物存在电荷密度过大可能会伤害细胞并引起血清聚集的问题，但通过向其核心添加PEG或二硫键可以解决这些问题。使用pH响应性聚合物是另一种mRNA递送方法。这些聚合物能够在到达细胞质时由于细胞质内的pH不同而发生自我降解，进而释放出mRNA进入细胞。含有阳离子或两亲性胺基团的亲水性聚合物也可以通过静电结合mRNA，形成纳米复合物，将mRNA携带进入细胞。通常，像壳聚糖和PEI这样的高分子量聚合物需要经过修饰以改善其转染有效性和持久性。同时，mRNA的亲和力受到聚合物长度、电荷密度和混合物浓度的影响。3.2.肽纳米颗粒和蛋白纳米颗粒由于基于肽/蛋白质的生物纳米材料具有良好的生物相容性和相对易获得性，因此已被广泛应用于药物递送、疾病诊断和疫苗开发等领域。这种纳米材料一般具有20-200纳米的尺寸，是进行有效淋巴结定位的理想选择。在疫苗递送系统中使用自组装蛋白质载体是一种可靠且安全的方法，例如Wang等人报道称，通过将Pre-S1 HBV表面抗原与自组装的铁蛋白纳米粒子（NP-PreS1）结合，实现了具有治疗和预防双重属性的HBV疫苗接种。由于阳离子或两亲性胺基团（如精氨酸）的存在，两亲性肽可以与mRNA静电结合形成纳米复合物，进而帮助将mRNA递送到细胞中。内体的pH值可以改变具有重复精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（RALA）基序的细胞穿透肽（CPP）的结构，从而促进膜和内体之间形成孔道，使mRNA进入细胞。此外，RALA可以激活T细胞介导的免疫应答并将mRNA转运到树突状细胞。最近一项关于两亲性CPP/mRNA复合物的研究表明，这些直径小于200纳米的复合物在小鼠结肠癌细胞中显示出显着的细胞摄取和蛋白表达。3.3.鱼精蛋白纳米颗粒鱼精蛋白是一种主要由带正电的氨基酸组成的阳离子蛋白。这种正电荷使其能够与核酸如RNA，形成复合物，从而保护生物系统免受核酸酶的降解，并增强其向目标组织的递送。由于鱼精蛋白复合物具有多种特性和临床安全性，因此在生物医学研究中作为药物递送纳米载体具有多种应用。鱼精蛋白递送系统的最重要特性是阳离子性质，这是由于精氨酸富含序列的存在增强了鱼精蛋白与任何负电荷分子（如mRNA）的复合物，因此，鱼精蛋白递送系统可以用于基于mRNA疫苗的设计。将利用半乳糖苷酶的鱼精蛋白-mRNA复合物注射到胶质母细胞瘤组织中，以评估mRNA 鱼精蛋白复合物的可行性。研究表明，鱼精蛋白保护的mRNA会导致肿瘤生长显着减少并最终消失，并且在肿瘤内注射稳定mRNA后产生记忆抗肿瘤免疫应答。此外，鱼精蛋白与CureVac的自我佐剂RNActive®递送技术结合使用，以形成mRNA复合物，从而开发出狂犬病和流感A疫苗。应当注意的是，与其他常用的转染试剂（例如聚乙烯亚胺（PEI）聚合物）相比，鱼精蛋白一直被用于改善复合核酸的转染效率，并且未检测到浓度高达10mM时的细胞毒性，而其他转染试剂在剂量超过5mM时会引发体内毒性作用。最近，为了制备稳定良好的疫苗，鱼精蛋白在mRNA递送方面的应用已经增加并且预计将开展更多的研究。3.4.脂质纳米颗粒(LNPs）LNPs是一种智能的、纳米级的脂质载体，用于将mRNA转运到细胞质中。这些颗粒纳米载体可以通过与早期内体脂质双层融合有效地将mRNA递送到细胞内，并保护mRNA在系统循环中免于被RNA酶降解。LNPs已被用于开发已获得临床批准的SARS-CoV-2 mRNA疫苗。对于mRNA给药，LNPs提供了许多优势，如配方简单、可定制、具有生物相容性以及高mRNA负载能力。LNPs通常由三种主要成分组成：可电离的脂质（40-50%）、胆固醇（38-45%）和辅助磷脂（10-12%）。在某些情况下，会添加第四种成分，例如聚乙二醇化脂质即PEG脂质（1-2%），如图2所示。这些成分共同作用，包装和保护裸露的mRNA。第一批携带RNA的脂质是阳离子DOTMA [1,2-二油基-3-三甲基氨基丙烷]及其合成等效物DOTAP [1,2-二油酰-3-三甲基氨基丙烷]，这两者在1989年被发现。从那时起，许多其他的阳离子脂质，如被广泛使用的Lipofectamine，也被用于RNA递送。图2 核酸递送系统LNPs的主要成分。阳离子脂质两亲物已被创造并评估为核酸的载体。阳离子脂质与天然脂质具有相似的分子结构，只是包含阳离子头部基团而不是天然脂质的两性离子或阴离子头部基团，阳离子头部基团由一个连接基团将极性基团和疏水基团相连而形成，并且带正电荷。相比之下，疏水基团包含两个烷烃链或胆固醇基团。由于阳离子脂质具有正电荷表面，可以与负电荷细胞表面结合，促进LNPs渗透进入细胞，因此更适合用于药物递送应用。LNPs被用于递送针对COVID-19、流感和结核病的mRNA疫苗和药物。当可离子化的脂质在生理pH水平下引入血流时，它们呈中性电荷，这提高了它们的安全性，并且与其他脂质相比延长了血液循环时间。这些可离子化的脂质在酸性溶液中与mRNA结合，形成纳米颗粒，其中带正电的脂质吸引RNA。此外，由于内体的酸性环境，它们容易与内体膜融合，将mRNA释放到细胞质中。第一批用于RNA运输的可电离脂质是DODAP（1,2-二油基-3-二甲基氨基丙烷）和DODMA（1,2-二油氧基-3-二甲基氨基丙烷）。用于mRNA递送的另一种可电离脂质是DLin-MC3-DMA，用于包封siRNA时具有高效性和安全性。由于微流体学这项革命性技术的出现，mRNA递送科学可能会发生转变。微流体设备预计将用于制造用于药物和疫苗的LNPs，使用频率随着技术的进步增加。通过微流体学实现mRNA装载到LNPs中，这包括精确控制mRNA和LNP成分的混合，并使mRNA很好包封在LNP内。此外，微流体学能够制造具有均匀粒径分布的LNPs，这对于有效地将mRNA递送到细胞中至关重要。制备装载mRNA的LNPs的典型程序包括将mRNA溶解在低pH水性缓冲液（pH~4.0）中，并通过微流体学将它们与疏水性脂质的乙醇溶液混合形成稳定的LNPs，具有低的多分散指数。这些LNPs最初含有25-50%乙醇和低pH；因此，它们需要进一步通过膜过滤进行透析和缓冲液交换以获得最终的大批量产品。该产品可以通过0.2um无菌级过滤器过滤灭菌，然后填充到无菌容器中。成品药物产品可以是冻干或直接填充的形式。4.mRNA疫苗应用针对包括传染病和个体差异性癌症疫苗的不同疾病，mRNA疫苗已被广泛研究和开发。随着mRNA修饰和递送技术的不断发展，mRNA疫苗的潜在应用预计将进一步增加。4.1.针对传染病的mRNA疫苗mRNA疫苗的开发工作原本长期以来一直处于初级阶段，但COVID-19大流行已经加速了研究工作，促使人们对预防传染病mRNA疫苗的可能性产生了重大兴趣。最突出、最广泛使用的例子是辉瑞-生物技术公司(Pfizer-BioNTech)和莫德纳(Moderna)公司的COVID-19疫苗，它们编码SARS-CoV-2的刺突蛋白来刺激机体针对病毒的免疫反应。mRNA疫苗编码刺突蛋白的抗原或其受体结合域，从而保护感染者免受这种危及生命的感染。2020年末，美国食品和药物管理局(FDA)批准了第一批针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗，即辉瑞-BioNTech疫苗(BNT162b2)和Moderna疫苗(mRNA-1273)。这两种疫苗都是使用含有可电离脂质的LNPs包封mRNA而成。两剂量的BNT162b2证明在预防住院方面的有效性为87%，预防有症状COVID-19的有效性为94%，总体上预防COVID-19的有效性为95%。研究表明BNT162b2和mRNA-1273的一次和加强免疫对SARS-CoV-2止的有效性为90%。需要注意的是，Moderna疫苗在4-8℃下储存一个月后仍显示出良好的安全性和有效性，而辉瑞-BioNTech疫苗需要-60℃的储存条件。目前正在开发几种针对传染病（如流感、寨卡病毒、巨细胞病毒和狂犬病）的mRNA疫苗。最近的一项研究开发了一种基于LNP的疫苗，由编码流感A和B病毒血凝素抗原的20个谱系组成，以保护机体免受同源和异源易变异病毒感染。4.2.针对癌症的mRNA疫苗mRNA癌症疫苗的作用靶点取决于肿瘤抗原，以刺激细胞免疫。肿瘤抗原分为肿瘤特异性抗原（TSA）和肿瘤相关抗原（TAA），其中TSA仅表达于肿瘤细胞，而TAA则可在正常或肿瘤细胞都表达。BioNTech正在开发的mRNA癌症疫苗FixVac BNT111是针对四种黑色素瘤TAA的典型代表，4种TAA包括酪氨酸酶、黑色素瘤抗原家族A3（MAGE A3）、纽约食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）和跨膜磷酸酶与张力同源物（TPTE）。根据一项临床前研究，BNT111在I / II期临床试验中显示出对肿瘤的有效免疫反应，其中75％的患者在接受八次注射后至少对一种TAA产生免疫反应，且CD8+ T细胞在T细胞免疫反应中起关键作用。针对个体患者肿瘤特异性突变的BNT112和BNT113（即个体化疫苗）是mRNA疫苗另一类代表，它们靶向五种前列腺癌特异性抗原（PAP、PSA和三种未公开的抗原）和HPV16衍生的肿瘤抗原（HPV16 E6和E7癌蛋白）。此外，BNT122是一种组合疫苗，旨在编码个体肿瘤突变和一组个性化的预制造非突变共享肿瘤相关抗原（BNT114），目前正在进行临床试验评估其在治疗各种类型癌症中的安全性、耐受性和疗效。不同的疫苗候选者被用于治疗多种类型的癌症，如黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌等。5.mRNA疫苗临床试验mRNA疫苗可以用于控制多种危及生命的疾病传播，例如预防传染病和治疗癌症，这种类型的疫苗也可应用于免疫疗法。然而，目前预防传染病是mRNA疫苗主要布局领域，在所有正在进行的mRNA疫苗试验中占比约为70%。在COVID-19大流行和mRNA疫苗的成功推出之后，近年来基于mRNA的疫苗的临床试验数量显著增加。FDA最近批准了两种针对COVID-19的快速反应mRNA疫苗，这一项卓越的成就促进更多基于mRNA的疫苗进入临床试验，用于不同的医学应用。针对传染病的mRNA疫苗通常以一次性注射的方式给药，被免疫和非免疫细胞摄取后翻译成抗原。许多针对传染病和癌症的mRNA候选疫苗已经进入临床试验阶段，其中最常见的例子如表1所示。2015年的寨卡病毒感染是全球健康危机出现的传染病之一。这种感染导致轻度至重度症状，如发烧和疲劳，可能在怀孕期间发展为胎儿死亡。已经证明，针对任何寨卡病毒株的抗原（即prM-e蛋白）的免疫可以预防寨卡病毒引起的所有感染，因为该疾病是由单一血清型引起的。将编码寨卡病毒结构基因的优化mRNA封装到基于脂质纳米颗粒载体中是生产mRNA寨卡疫苗的多功能平台。使用编码寨卡病毒-E基因的优化mRNA疫苗的初次-加强疫苗免疫后，会产生病毒样颗粒，进而导致寨卡病毒中和抗体（nAbs）水平升高，从而保护免疫功能低下和免疫功能低下的小鼠。因此， mRNA寨卡疫苗接种诱导了针对寨卡病毒的保护性抗体反应。据报道，由携带prM-E mRNA的LNP组成的30μg或50μg mRNA疫苗产生的中和抗体是传统灭活病毒疫苗诱导的中和抗体的50-100倍。利用mRNA平台作为寨卡病毒候选疫苗显示出对寨卡病毒的强大中和抗体反应，为快速预防寨卡病毒感染提供了概念验证。尽管这种疫苗有效，但它的设计很差，会通过产生交叉反应抗体来激活登革热病毒感染反应。在一项临床试验中，新的寨卡病毒疫苗是由莫德纳公司通过将E蛋白中的突变融合环表位插入优化prM-E mRNA（mRNA-1893）中开发的。使用这种基于mRNA的疫苗的小鼠免疫结果显示出对寨卡病毒的保护作用，而没有产生登革热增强抗体。mRNA疫苗的关键优势之一是成功地同时靶向由不同蛋白质诱导的病毒感染。例如，Moderna设计的巨细胞病毒（CMV）疫苗（mRNA-1647）包含六种不同mRNA序列的混合物，一种编码CMV糖蛋白B（gB），另外五种编码五种不同蛋白质，形成五聚体蛋白质。莫德纳公司已经对一种编码灌注F蛋白的新候选疫苗（mRNA-1345）用于接种儿童预防呼吸道合胞病毒（RSV）进行了评估。该产品已配制成脂质纳米颗粒LNP，目前正处于临床试验2期和3期之间的阶段。一段编码全长刺突蛋白的未修饰的mRNA序列包封在脂质LNPs后形成了针对COVID-19的CureVac疫苗候选物(CVnCoV)。该疫苗候选物冰箱中放置三个月过程中显示出了良好的稳定性。两剂量的CVnCoV显示出与从COVID-19恢复者相似的中和抗体水平。尽管该疫苗候选物具有良好的性质，但临床试验结果表明CVnCoV针对COVID-19的有效性仅为约47%。Arcturus Therapeutics 公司生产了一种装载到LNP中的自我扩增mRNA疫苗候选物(ARCT-021)，该疫苗候选物编码完整长度的刺突蛋白。接种一剂ARCT-021疫苗就能通过提高体内IgG滴度和激发强烈的T细胞反应，有效保护接种小鼠免受SARS-CoV-2的感染，实现了单次接种后的完全免疫。除了传染病之外，癌症也是基于mRNA的制剂可以靶向和控制的主要疾病之一。开发了几种候选疫苗来治疗多种癌症类型，如黑色素瘤和癌症。BNT122是BioNTech公司和Genentech公司合作开发的产品之一，具有良好的安全性。它含有约20种特定患者的新表位，用于静脉注射（I.V.）治疗皮肤癌症（即黑色素瘤）。另一种基于mRNA的癌症个性化疫苗是mRNA-4157，其在单个mRNA链中编码多达34种新抗原。mRNA-4157疫苗是由莫德纳公司和默克公司合作开发的，采用肌肉注射（I.M.）给药，由脂质递送载体包封mRNA形成。与单独使用pembrolizumab作为高危黑色素瘤切除患者的辅助治疗相比，个性化的基于mRNA的癌症疫苗（mRNA-4157）与单克隆抗体化疗pembrolizhumab（Keytruda）联合使用提高了患者的无复发生存率（RFS）。如前一节所述，BNT111是一种癌症候选疫苗，靶向通常在肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原TAA。这种mRNA疫苗可以表达出四种不同的黑色素瘤相关抗原，以此提高靶向效率。BNT111通常单独通过静脉注射给药，或与赛尼哌联合给药以提高治疗黑色素瘤的疗效，赛尼哌是由再生元和赛诺菲共同开发的一种抗PD-1单克隆抗体。临床2期试验评估了BNT111与西米普利单抗联合使用，作为单药治疗抗PD1难治性/复发性不可切除的III期或IV期黑色素瘤患者的疗效。根据风险因素，在难治性或复发的情况下，存活期可能短至六个月。高达50%的患者在接受检查点抑制剂治疗后病情进一步发展。重复剂量的BNT111疫苗接种通过增加患者血浆中IFN-y、IFN-α、IL-6、TNF-α和其他细胞因子的分泌，诱导了对抗原的免疫反应。此外，CV9202是CureVac公司开发的靶向非小细胞肺癌的候选疫苗，由六种编码不同抗原的mRNA组成。mRNA也可以用作免疫疗药物，主要用于抗癌。在临床试验中研究了几个基于mRNA的候选药物，表明在免疫疗法中使用这种先进技术的巨大潜力。在表1中，对四种产品（BNT141、BNT311/GEN1046、BNT312/GEN1042和BNT211）进行了癌症有效免疫治疗的研究。BioNTech开发的BNT141产品通过靶向表达CLDN18.2的细胞，对不同类型的癌症都有效，如非小细胞肺癌癌症、胃食管交界腺癌、转移性癌症、癌症、癌症胆囊、癌症胰腺癌、胆道癌症、结直肠癌癌症和黏液性卵巢癌。BNT311/GEN1046和BNT312/GEN1042是mRNA免疫治疗药物，含有分别靶向PD-L1×4-1BB和CD40×4-1BB的双特性抗体。据报道，BNT311/GEN1046和BNT312/GEN1042可以刺激T细胞的增殖、细胞因子的分泌和抗肿瘤活性。这两种免疫治疗候选药物在给药后在外周血中表现出药效学免疫效应，表明其可用于治疗晚期难治性实体瘤患者。BNT211是BioNTech生产的另一种免疫治疗候选药物，可以通过靶向肿瘤特异性抗原Claudin-6（CLDN6）发挥作用。该疫苗的治疗表现出高达86%的疾病控制率和43%的总反应率。与mRNA疫苗给药相关的其中一个主要关注点是免疫接种后可能引发的严重不良事件（例如，过敏性反应）。据报道，辉瑞-BioNTech和Moderna的抗COVID-19 mRNA疫苗引起的过敏性反应是传统疫苗的2-4倍。抗体可能针对mRNA纳米递送载体或mRNA分子本身产生，从而促进严重的免疫反应，因此优化纳米载体的成分并对mRNA进行分子修饰是避免或减少不良反应的关键步骤。美国疾病控制和预防中心（CDC）建议，对辉瑞-BioNTech或莫德纳疫苗有过敏反应史的人应避免接种其他基于mRNA的疫苗。在低收入国家，保护免受传染病侵害是这些国家面临的最重大挑战。疫苗行业以及mRNA疫苗制造行业中需要解决的一个主要问题是提供某些储存条件，如-20℃。因此，需要开发一种可以在室温下稳定保存的耐热疫苗，以增强全球对mRNA疫苗的接种。最后需要注意的是，疫苗的出现使过去几十年间世界上几种致命的传染病得到根除，然而一些反疫苗运动也在传播不正确的信息，这些疾病又卷土重来。表1：进入临床试验的mRNA疫苗（截至2023年6月1日）6.mRNA疫苗的未来应用新冠肺炎mRNA疫苗的成功研发促进mRNA未来开发的创新，这些创新不仅可以产生具有更强表达和出色稳定性的下一代mRNA，还能提高临床前研究中mRNA递送的效率，从而加速其临床转化。6.1.mRNA疫苗开发中的未来考虑6.1.1.mRNA疫苗应用的多种形式自我扩增mRNA包括α病毒来源的复制子，其可以扩增编码表达蛋白的序列，因此需要的剂量比大多数传统非复制mRNA低得多。由于整合了额外的复制子基因，并且核苷酸修饰在复制过程中不适用，因此自我扩增mRNA比传统mRNA更具有重要意义。目前正在对几种候选者进行临床试验评估。基于自我扩增mRNA的SARS-CoV-2疫苗已经在动物中显示出诱导高水平的中和抗体。这些疫苗可以以较小的剂量（从1到10克）接种，低于已有SARS-CoV-2疫苗的非复制mRNA剂量（从30到100克）。环状信使RNA（circ.mRNAs）是结构为环状的单链RNA，通过后拼接过程产生。最近的研究表明，某些circ.mRNAs的蛋白质编码功能在蛋白质翻译中应用前景非常广阔，由于缺乏核酸外切酶降解过程所需的末端基序，circ.mRNAs比线性mRNAs具有更出色的稳定性。与未修饰的线性mRNA相比，环状RNA引起的免疫反应更少。与线性mRNA疫苗相比，circ.mRNA疫苗引起更多显著的中和抗体。公司正在研究circ.mRNAs的其他变体，包括优化的内部核糖体进入位点（IRES）。6.1.2.mRNA的理想递送系统LNP被认为是最常见的mRNA递送系统之一。非LNP系统，如类似逆转录病毒的蛋白PEG10，由于免疫刺激和毒性最小，具有mRNA递送潜力。EntosPharma公司创建了一个应用低毒性相关小跨膜（FAST）蛋白和中性脂质融合的蛋白脂质载体（proteo-lipid）平台，以将mRNA直接递送到细胞质中。来自相分离肽的还原响应凝聚体和pH值实现了mRNA在细胞质中对细胞的直接递送和还原响应的mRNA释放。为了提高LNP的效力，人们继续进行着各种目的的LNP创新研发。杂环类脂、不饱和脂质和炔脂可以改善LNP的效果。同时，其通过巯基或双磷酸基团进行结构修饰可以靶向地将mRNA作用于粘液或骨骼。具有两亲性的单组分可离子化树突状分子Janus可以有效地将mRNA递送到各种组织中，这表明现有的四组分LNP系统可能会简化。生物相容性载体由生物膜制成，可创建新的mRNA递送平台。不同的生物膜载体系统，包括细胞膜的囊泡、细菌外膜的囊泡和细胞外囊泡（如外泌体），已被用于在体内和体外环境中递送治疗性mRNA。例如，治疗实体瘤的Codiak BioSciences公司已经开始利用工程化外泌体的现有疗法进行人体试验。外泌体mRNA疫苗在小鼠体内比LNP载体刺激了更多的IgG和分泌型IgA。与现有平台相比，外泌体因其较低的免疫原性和毒性而被认为是一种有前景的mRNA递送平台。因此，它们是临床试验中多种mRNA给药的理想选择。为了扩大mRNA疗法在各领域的应用，已经实现了器官或细胞特异性mRNA的递送。为了将mRNA递送到小鼠的肺、脾或肝，已经开发了器官选择性靶向纳米粒子（OSTN）平台。通过新版OSTN平台含可电离磷脂膜的特性，mRNA递送的效率明显提高。另外的给药方法包括将mRNA纳米颗粒靶向递送至膀胱，口服靶向至消化道的机器人药丸，或经吸入靶向至肺。通过研发优化的LNP或聚合物纳米粒子药物，旨在实现mRNA向特定细胞类型的靶向递送和利用细胞特异性配体。随着研究的深入，这些靶向器官或细胞的mRNA递送系统将扩大mRNA疗法所能治疗的疾病范围。6.1.3.mRNA的给药途径与储存注意事项寻找mRNA的不同给药途径可以为其开辟更多新应用。已有研究表明使用超支化的聚β-氨基酸酯（hPBAEs）纳米制剂可通过吸入给药将mRNA递送到肺部，导致小鼠肺部荧光素酶蛋白的高表达。鼻内接种方式可以触发针对呼吸道感染的黏膜免疫反应，使其成为COVID-19疫苗给药的有前景的方法。由于其非侵入性、患者自理特征以及快速实施潜力，口服给药已成为疫苗给药的极佳替代途径。BioNTech公司与Matinas BioPharma公司合作，近期开发了一种潜在的新型口服脂质纳米晶体mRNA疫苗，该疫苗利用钙离子与阴离子磷脂相互作用形成脂质纳米晶体，从而将mRNA活性药物分子装载到纳米晶体层中。mRNA的热稳定性在开发mRNA新应用中发挥关键作用。CureVac开发的候选疫苗CVnCoV疫苗在5℃下可以保存至少3个月；室温条件下用于接种时，有效期为24h。但不幸的是，在临床2b/3期试验中，CVnCoV对COVID-19的疗效仅为47%。最近，CureVac针对第二代候选疫苗CV2CoV进行了优化，与CVnCoV相比，CV2CoV的蛋白翻译和免疫原性均有所提高。体内研究表明，CV2CoV表达的蛋白比CVnCoV更多，并诱导大鼠产生高水平的针对SARS-CoV-2变异株（B.1.1.7、B.1.1.298和B.1.351）的交叉中和抗体。6.2.mRNA疫苗的未来新颖和多功能疗法6.2.1.用于预防传染病的mRNA疫苗mRNA疫苗已在传染病、癌症、遗传病和再生医学等多个领域得到应用。mRNA疫苗已在COVID-19病毒感染预防中表现出显著的有效性和安全性，目前正在针对包括流感、寨卡病毒、狂犬病、HIV和结核病在内其他病原体进行开发。mRNA疫苗通过将编码特定抗原的mRNA递送到接种者细胞中，利用细胞表达抗原并将其呈递给免疫系统，mRNA疫苗可以诱导保护性免疫。此外，mRNA疫苗可以设计为靶向多种抗原或病原体株，以提高其有效性和对变异株及合并感染的抵抗力。6.2.2.用于癌症治疗的mRNA疫苗mRNA疗法可将肿瘤相关抗原、免疫调节因子或基因编辑组件递送到肿瘤患者体内，以刺激抗肿瘤免疫反应或纠正遗传缺陷。肿瘤相关抗原是肿瘤细胞而非正常细胞表达的蛋白质，免疫系统可识别其为外来抗原。免疫调节剂如细胞因子、检查点抑制剂和共刺激分子可刺激或抑制免疫反应。基因编辑组件包括Cas9（CRISPR）、转录激活剂样核酸酶（ETALN）和锌指核酸酶（ZF）等效应物。mRNA疗法可诱导肿瘤细胞死亡、激活免疫细胞、或通过将编码这些分子的mRNA递送到肿瘤细胞或免疫细胞中来调控肿瘤抑制基因或癌基因表达。6.2.3.用于遗传性疾病治疗的mRNA疫苗mRNA疗法可以取代或补充遗传性疾病中缺失或功能异常的蛋白质或基因，例如血友病、囊性纤维化和肌肉萎缩症。血友病是一种由凝血因子编码基因突变引起的出血性疾病。囊性纤维化跨膜调节因子（CFTR）编码基因中的任意突变会导致肺病，即囊性纤维化。肌肉萎缩症是由编码肌营养不良蛋白的基因突变引起的肌肉疾病。通过将编码这些蛋白质或基因的mRNA递送到病变细胞或组织中，mRNA疗法可以恢复其正常功能并缓解疾病症状。6.2.4.mRNA疫苗在再生医学中的应用在再生医学中，mRNA疗法可以诱导细胞的多能性、分化或重编程，以进行组织修复或器官移植。多能性是指细胞分化成机体所有类型细胞的能力。细胞针对特定功能进行特化称为分化。重编程是指将细胞从一种类型转化为另一种类型。mRNA疗法可通过递送可影响多能性、分化或重编程过程的转录因子、生长因子或信号分子等编码因子的mRNA，从体细胞（如成纤维细胞或血细胞）生成多功能性干细胞（PSCs）、分化细胞（心肌细胞或神经元）或重编程细胞（诱导多功能性干细胞或诱导神经元）。6.3.mRNA疫苗的优点和验收标准与依赖于弱化或灭活的病毒或其成分来诱导免疫的传统疫苗相比，mRNA疫苗在以下几个方面具有优势：6.3.1.生产速度一旦目标抗原的基因序列被确定，mRNA疫苗就可以被迅速设计和合成。这使得针对新出现的传染病（例如COVID-19）能够做出更快的反应；6.3.2.规模化生产mRNA疫苗可以使用经济高效的标准化技术（例如无细胞转录和纯化）大规模生产；6.3.3.安全性mRNA疫苗不包含传染性病原体或其成分，因此它们不会导致原本要预防的疾病。此外，它们不会干扰细胞功能或整合到宿主基因组中；6.3.4.多样性mRNA疫苗可以经过修饰以表达不同的抗原或抗原组合，从而能够开发针对多种病原体多价或通用疫苗。此外，mRNA疫苗也可以进行修饰以改善其稳定性、递送效率、免疫原性和特异性；6.3.5.有效性在临床试验中，mRNA疫苗已显示出对COVID-19的高度保护作用，有效性从94%到95%不等。此外，它们同时诱导体液免疫和细胞免疫反应，这对于长期免疫和防止变异株出现至关重要。6.4.mRNA疫苗的缺点和挑战对mRNA疫苗局限性的更深入理解，将无疑有助于未来设计更安全、更有效的mRNA疫苗。这些局限性包括以下几点：6.4.1.mRNA的稳定性酶和温度波动可以降解mRNA分子，从而限制其保质期和储存条件。mRNA疫苗需要超低温储存和专门的运输设备，这带来了物流方面的挑战并增加了成本。提高mRNA分子的热稳定性以及开发能够耐受更高温度的制剂对未来的mRNA应用至关重要。6.4.2.mRNA的递送在递送过程中，mRNA分子应受到保护以避免被酶降解并高效转运至目标细胞。将它们包裹在保护性载体中如脂质纳米颗粒LNPs、聚合物纳米颗粒或脂质-聚合物混合纳米颗粒，可以保护mRNA免于降解，增强其被细胞摄取和释放，以及调节其免疫原性。然而，LNPs也能导致不良反应，如炎症、过敏反应和免疫反应。6.4.3.可及性和接受程度mRNA疫苗生产过程的可及性和接受程度也是需要着重考虑的因素。mRNA疫苗制造需要标准化和高品质的原材料，如核苷酸、酶和脂质，以及用于合成、纯化和制剂的专门设备和设施。这些要求给mRNA药物的批量生产和分发带来了技术和物流方面的障碍。一些人群可能会由于误解、不信任和伦理方面的担忧而拒绝接种mRNA疫苗。6.4.4.变异mRNA疫苗被设计用于靶向一种特定抗原，例如SARS-CoV-2的刺突蛋白。然而，由于RNA病毒通常具有较高的突变率，它们会随着时间的推移而发生演变。这种突变可能会影响病毒的特性，例如其传播能力和病情严重程度。此外，变异株可能含有会改变与关键宿主成分的相互作用的突变。值得注意的是，选择压力能造成突变，使变异株能够逃避适应性免疫反应。6.4.5.免疫原性新的研究数据表明体液免疫和细胞免疫在保护人体免受病毒感染方面的重要性。mRNA疫苗可以诱导固有免疫系统调节抗原特异性免疫反应。然而，有关疫苗实测方法以及mRNA疫苗提供的保护持续时间描述的信息仍然不足。其他人类冠状病毒的经验表明，如果免疫反应减弱，再感染是可能的。目前仍然缺乏能够准确模拟人类免疫反应的动物模型。研究人员必须继续在人体试验中证明mRNA疫苗的临床疗效。6.4.6.群体间的差异免疫系统与固有免疫和适应性免疫相关联，监测接种人群的保护性免疫是确定疫苗效果的关键因素。身体状况、性别、年龄和遗传变异也可能影响疫苗的有效性。许多国家测试技术资源有限，难以量化个人感染的真实风险。世界卫生组织（WHO）的最新数据发现，SARS-CoV-2病毒主要在年轻人之间传播，40岁以下的人更容易感染。基于mRNA的抗病毒疫苗与传统疫苗相比具有显著优势，但对于不同人群接种效果方面仍存在争议。必须开展更多研究以了解多个个体的接种状况。了解造成mRNA疫苗效果个体差异的机制将有助于推动mRNA疫苗的发展。6.4.7.不良反应对于任何疫苗而言，接种后都有可能出现轻度到中度的副作用。有些严重的副作用也有可能发生，引起了人们的恐惧和焦虑。理论上，mRNA疫苗比其他类型的疫苗更安全，因为其生产过程中不涉及传染性病毒，且降低了毒力回复和插入突变的危险性。但由于受试者数量较少，临床试验可能本质上无法评估疫苗的安全性，因此需要全面和长期的疫苗安全监测。通过分析数据发现，并不是所有接种后的直接反应都是由mRNA本身引起，疫苗成分如赋形剂、非活性成分和脂质体传送载体都与过敏反应有关。研究表明不良反应的发生与剂量有关，但剂量是否影响不良反应的发生仍有待研究。此外，个体间固有免疫系统的差异也不容忽视。目前，mRNA疫苗安全性的评估受到接种个体样本量、比较组、随访时间、年龄、性别和种族/民族背景的限制。进一步研究接种疫苗与相关不良事件之间的关联实现了对mRNA候选疫苗的安全性进行更全面的评估。最后，继续开展公众教育和沟通对于提高对mRNA疫苗安全性和有效性的认识和信心至关重要，这有助于改善全球健康状况并挽救数百万人的生命。7.结论本综述文章强调了mRNA疫苗在彻底改变传染病预防和治疗干预措施中的重要作用。传统疫苗平台在可扩展性、开发速度和适应新病原体的能力方面存在局限性，而mRNA疫苗提供了一个有针对性地进行疫苗开发的通用且快速的平台。mRNA疫苗的模块化性质使其容易适应于不同的病原体，而其快速生产能力为应对任何可能出现的传染病提供了灵活性。然而，mRNA分子的有效递送构成了一个挑战，通过使用纳米颗粒作为输送系统解决了递送问题。脂质纳米颗粒LNPs已成为mRNA疫苗输送的主要纳米颗粒类别，可提供mRNA保护、有效的细胞摄取以及mRNA有效载荷的受控释放。本综述讨论的关键点包括不同类型mRNA疫苗的介绍、作用机制以及在开发过程中所需优化的环节。mRNA疫苗的临床试验特别是在COVID-19背景下进行的试验，均显示出良好的安全性和有效性。从这些试验中吸取的经验教训将为未来的研究和发展努力提供指引。mRNA疫苗的未来应用不仅限于传染病预防，还可能在癌症免疫疗法和解决遗传性疾病等医疗领域发挥潜力。本文还概述了针对不同疾病的mRNA疫苗的优势和局限性，以及需要克服的挑战。简而言之，mRNA疫苗为未来传染病和癌症防治提供了令人兴奋的可能性。mRNA疫苗具有的灵活性、适应性和快速生产能力使它们成为疾病预防和治疗干预的有价值工具。仍需要进一步研究探索其充分潜力、解决挑战并针对不同疾病情况优化使用。未来建议重点研究改善疫苗设计、输送系统和生产工艺。了解mRNA疫苗产生的免疫反应的长期安全性和持久性至关重要。此外，探索将mRNA疫苗与其他免疫治疗策略结合可以进一步提高其有效性。继续在mRNA疫苗领域进行研究与合作，将为创新性的疾病预防和治疗解决方案铺平道路。参考资料：Al Fayez N, Nassar MS, Alshehri AA, Alnefaie MK, Almughem FA, Alshehri BY, Alawad AO, Tawfik EA. Recent Advancement in mRNA Vaccine Development and Applications. Pharmaceutics. 2023 Jul 18;15(7):1972. doi: 10.3390/pharmaceutics15071972. PMID: 37514158; PMCID: PMC10384963.