轮状病毒疫苗温度挑战性研究

2024-03-30

疫苗临床研究诊断试剂

中文摘要目的探究口服轮状病毒活疫苗在高温保存和冻融后的病毒滴度变化趋势。方法选取2022年生产的3批口服轮状病毒活疫苗，于37 ℃放置0、7、9、11和14 d或-20 ℃-室温冻融0、1、2、3、4、5次，进行病毒滴度检测；选取2022年生产的5批口服轮状病毒活疫苗原液，于37 ℃放置0、3、5、7、9和11 d或-20 ℃-室温冻融0、1、2、3、4、5次，进行病毒滴度检测。结果口服轮状病毒活疫苗于37 ℃保存9 d时病毒滴度大于5.5 IgCCID50/ml；口服轮状病毒活疫苗原液于37 ℃保存9 d时病毒滴度不低于5.5 lgCCID50/ml；口服轮状病毒活疫苗5次冻融，病毒滴度不低于5.8 IgCCID50/ml；口服轮状病毒活疫苗原液5次冻融，病毒滴度不低于6.0 lgCCID50/ml；均符合质量标准。第1次冻融后口服轮状病毒活疫苗滴度明显降低，但不大于1 lg，后续4次反复冻融对滴度未产生明显影响。结论口服轮状病毒活疫苗在37 ℃可保存9 d，5次冻融后滴度仍符合质量标准。正文轮状病毒（rotavirus，RV）感染是导致全球婴幼儿急性胃肠炎的主要原因，是婴幼儿急诊和死亡的第2位病因，且不受营养、卫生和经济条件的影响。口服RV活疫苗用于预防婴幼儿A群RV感染取得了显著的免疫效果，预防婴幼儿感染性腹泻的作用也日益突出。兰州生物制品研究所有限责任公司（兰州公司）研制的口服RV活疫苗（商品名：罗特威）于2001年上市，大量临床试验和20多年的临床应用证明，该疫苗与肠套叠等严重不良反应无关联，保护效果稳定，安全有效。目前国内外对疫苗的冷链要求愈发严格，口服RV活疫苗保存温度为2~8 °C。本研究拟对兰州公司生产的口服RV活疫苗进行极端条件下有效性试验，观察其在高温保存和冻融后病毒滴度变化趋势，为口服RV活疫苗生产、运输、安全服用的可靠性提供依据；由于原液与成品具有相近的变化趋势，因此同时拟考察原液的高温和冻融适应性，以对成品的滴度试验结果进行佐证。1材料与方法1.1疫苗、疫苗原液、检定细胞3批口服RV活疫苗（批号：试20220101、试20220102、试20220103）和5批口服RV活疫苗原液（批号：试B-20220101、试B-20220102、试B-20220103、试B-20220104、试B-20220105）均由兰州公司生产，每批样品取样后放置在不同温度，取样时按照文件规定进行，样品具有批代表性。检定用MA104细胞由兰州公司提供。1.2主要试剂及仪器口服RV活疫苗诊断试剂盒（批号：20210301）由兰州公司诊断用品室提供，INC153二氧化碳培养箱购自德国Memmert公司，BCM-1000超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司，Multiskan MK3酶标仪购自美国Thermo公司。1.3检定方法采用微量细胞病变滴定法结合ELISA进行病毒滴度检测。RV经胰蛋白酶激活并适当稀释后感染MA104细胞板，置37 °C、5% CO2培养6 d。经冻融1次，将MA104细胞板中各孔样本加至RV检测酶标试剂盒的各孔中，加入酶结合物37 °C显色后，使用酶标仪检测450 nm吸光度值，按照Spearman-Karber法计算样品病毒滴度。1.437 °C高温挑战试验1.4.1 疫苗成品将3批2022年生产的口服RV活疫苗，按照国家食品药品监督管理总局批准的口服RV疫苗注册标准和中国药典2020年版三部的要求置于37 °C进行热稳定性试验，分别于0、7、9、11和14 d取样，检测病毒滴度。疫苗成品病毒滴度应在5.5~7.0 lgCCID50/ml之间，37 °C放置7 d后病毒滴度应不低于5.5 lgCCID50/ml，滴度下降不高于1.0 lg。1.4.2 疫苗原液将5批2022年生产的疫苗原液置于37 °C进行热稳定性试验，分别于0、3、5、7、9和11 d取样，检测病毒滴度。疫苗原液病毒滴度应在5.5~7.5 lgCCID50/ml之间。1.5-20 ℃-室温冻融挑战试验1.5.1 疫苗成品将3批2022年生产的口服RV活疫苗置于-20 °C冷冻、室温融解，在冻融0、1、2、3、4、5次后取样，检测病毒滴度。疫苗成品病毒滴度应在5.5~7.0 IgCCID50/ml之间。1.5.2 疫苗原液将5批2022年生产的疫苗原液置于-20 °C冷冻、室温融解，在冻融0、1、2、3、4、5次后取样，检测病毒滴度。疫苗原液病毒滴度应在5.5~7.5 lgCCID50/ml之间。2结果2.137 °C高温挑战试验2.1.1 疫苗成品 3批成品的初始滴度分别为6.5、6.8、6.8 IgCCID50/ml，在37 °C放置9 d，病毒滴度分别降至5.8、6.0和6.0 IgCCID50/ml；放置11 d，1批疫苗成品病毒滴度降至5.2 lgCCID50/ml；放置14 d，3批病毒滴度均降至5.5 lgCCID50/ml以下，见图1。3批成品的病毒滴度在14 d内均呈下降趋势，在9 d时分别下降1.0、0.8、1.0 lg，但滴度均大于5.5 IgCCID50/ml；虽然在11 d时滴度下降均超过1.0 lg，但仍有 2 批不低于5.5 lgCCID50/ml；14 d时下降滴度最大为2.6 lg，3批成品滴度均低于5.5 IgCCID50/ml。疫苗成品在37 °C保存至9 d时，病毒滴度仍符合注册标准的要求。2.1.2 疫苗原液 5批疫苗原液的初始滴度分别为6.8、6.6、6.8、6.8、6.8 IgCCID50/ml，在37 °C保存9 d，病毒滴度分别降至5.6、5.5、5.7、5.5、5.7 lgCCID50/ml，见图 2。5批原液的滴度在11 d内均呈下降趋势，在9 d时下降均≥1.1 lg，但滴度均≥5.5 lgCCID50/ml；在11 d时滴度下降最大为1.8 lg，5批原液滴度均低于5.5 lgCCID50/ml。疫苗原液在37 °C保存至9 d时病毒滴度仍符合注册标准的要求。2.2-20 °C-室温冻融挑战试验2.2.1 疫苗成品 3批疫苗成品的初始病毒滴度分别为6.5、6.8、6.8 lgCCID50/ml，置于-20 ℃-室温冻融至第5次，病毒滴度分别降至5.8、6.0、6.2 lgCCID50/ml，滴度下降分别为 0.7、0.5、0.8 lg，见图 3。3批疫苗成品的滴度在第1次冻融时均有明显下降，下降值分别为0.5、0.8、0.8 lg，在第2~5次冻融时病毒滴度在5.8~6.2 lgCCID50/ml之间波动，未继续下降，且病毒滴度均符合注册标准的要求。2.2.2 疫苗原液 5批疫苗原液的初始滴度分别为6.8、6.6、6.8、6.8、6.8 lgCCID50/ml，冻融至第5次，病毒滴度分别降至6.2、6.0、6.2、6.0、6.0 lgCCID50/ml，滴度下降分别为0.6、0.6、0.6、0.8、0.8 lg，见图 4。5批疫苗原液的病毒滴度在第1次冻融时未见明显下降，病毒滴度分别为7.0、6.5、6.8、6.5、6.5 IgCCID50/ml，滴度下降分别为-0.2、0.1、0.0、0.3、0.3 lg，在第2~4次冻融时病毒滴度逐渐下降至6.0~6.2 lgCCID50/ml，在第5次冻融时病毒滴度在6.0~6.2 lgCCID50/ml之间波动，未继续下降，病毒滴度仍符合注册标准的要求。3讨论大量的临床应用证实，口服RV活疫苗保护效果稳定，安全有效，可以有效地减少或减轻RV腹泻症状。对于疫苗的稳定性，国家及国际药品监管机构建议应充分考虑运输时可能遇到的最差条件，并评估产品短暂脱离拟定保存条件对产品质量的影响。疫苗的冷链要求十分严格，短暂的超温现象可能会导致产品的废弃。鉴于疫苗产品本身价值较高且供货短缺的市场情况，探讨极限条件下的疫苗质量具有十分重要的现实意义。疫苗运输稳定性及RV疫苗稳定性影响因素的相关研究表明，温度是影响病毒疫苗有效性的关键因素。考虑到在运输中和临床使用过程中确实存在温度短暂超出规定温度2~8 °C的风险，本研究旨在将口服RV活疫苗运输过程中可能遇到的最差条件作为研究对象，为偶发的短暂超温现象提供解决依据，为疫苗临床使用中出现的短暂超温情况提供一定的参考和数据支撑，以解决疫苗临床使用中出现的此类困扰。本研究中，在37 °C条件下3批疫苗成品的滴度检测结果显示，保存至第9天时病毒滴度仍符合规定，表明RV的活性在37 ℃条件下仍可保持一定时间，滴度呈现缓慢下降趋势；疫苗成品冻融5次后病毒滴度检测结果仍符合质量标准，病毒滴度在第1次冻融后明显下降，在第2~5次冻融时未继续下降，表明RV的活性在第1次冻融时会有一定下降，之后保持稳定，对低温有较强的耐受性。同时5批疫苗原液的滴度检测结果显示，在37 °C条件下保存至第9天时和在-20 °C-室温冻融5次的情况下，病毒滴度检测结果仍符合质量标准，也可以佐证成品滴度的稳定性。由此可见口服RV活疫苗的产品质量稳定，保存温度超出2~8 °C时，在一定条件下仍可保证其关键指标符合要求。口服RV活疫苗在国内已上市多年，有良好的保护效果并且安全稳定，但对疫苗的极限保存温度试验鲜有报道。希望本研究可以为口服RV活疫苗的临床应用提供更多的数据，同时也为其他疫苗的研发和临床使用提供更多的参考。作者石岩1 刘晓凡1 刘军2 马希强1 陈刚1 张丽君11兰州生物制品研究所有限责任公司质量保证部，兰州 730046；2兰州生物制品研究所有限责任公司质量检定室，兰州 730046通信作者：张丽君，Email：hi_zhanglijun@126.com引用本文：石岩, 刘晓凡, 刘军, 等. 轮状病毒疫苗温度挑战性研究 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(1): 7-10. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230428-00037