Lanzhou Institute of Biological Products Co. Ltd.

中文摘要 目的   建立检测重组戊型肝炎疫苗宿主DNA残留量的荧光染色法，并进行方法验证。 方法   采用λDNA作为标准品建立标准曲线，重组戊型肝炎疫苗纯化后原液作为样品，进行线性、准确度以及精密度的验证。 结果   该方法在1.250~80.000 ng/ml范围内有良好的线性，决定系数大于0.99；准确性验证中DNA残留量加标回收率在90.00%~110.00%之间，且加标回收率相对标准偏差均小于15.00%。重复性验证和中间精密度验证的相对标准偏差分别为6.62%和10.30%，均小于15.00%。 结论   该方法快速、灵敏、准确，可以检测重组戊型肝炎疫苗宿主DNA残留量。 正文 戊型肝炎（戊肝）病毒为单股正链RNA病毒，主要通过粪-口途径传播，可引起戊肝。全球每年约发生2 000万例戊肝病毒感染，其中约330万戊肝病例，7万例与戊肝病毒感染相关的死亡病例。我国属于戊肝高发国家，近年来戊肝已成为急性病毒性肝炎的常见类型之一，发病人数已超过甲型肝炎，戊肝疫苗（hepatitis E vaccine，HepEV）的研发显得尤其重要。 近年来，随着基因工程技术的发展，基因重组疫苗的研发已愈发成熟，大肠埃希菌、酵母以及哺乳动物细胞等都已成为重组蛋白疫苗的宿主细胞。兰州生物制品研究所有限责任公司（兰州公司）第四研究室研发的HepEV由重组大肠埃希菌表达的病毒抗原经纯化冻干后制成，尽管经过多步纯化去除杂质，但宿主细胞大肠埃希菌的DNA仍有微量残留。不同宿主细胞DNA进入人体后可造成多种多样的后果，如致癌性和感染性。考虑到宿主细胞残留DNA的潜在安全风险，建立残留DNA定量测定方法并对其进行方法学的验证十分重要。本研究拟选用荧光染色法对HepEV原液中残余宿主DNA的含量进行定量测定。特异性荧光染料PicoGreen与双链DNA结合成的复合物在480 nm波长激发下产生荧光信号，检测波长在520 nm。由于一定DNA浓度范围内荧光强度与DNA浓度成正比，因此可根据荧光信号强度计算重组HepEV供试品中的DNA残留量。同时，根据中国药典2020年版三部（药典三部）中分析方法验证指导原则对建立的残余DNA定量方法进行方法学验证。 1 材料与方法 1.1 供试品 重组HepEV吸附前原液，由兰州公司第四研究室制备。 1.2 主要试剂及仪器 Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA试剂盒购自美国英杰生命技术有限公司，黑色酶标板购自美国康宁公司；酶标仪购自美国美谷分子仪器有限公司。 1.3 方法建立 将20×三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸〔tris（hydroxymethyl） aminomethane-ethylenediamine-tetraacetic acid，TE〕用灭菌注射水稀释为1×TE缓冲液。用稀释好的TE缓冲液将DNA标准品配成80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500及1.250 ng/ml的标准品溶液。将DNA标准品溶液和供试品溶液加至黑色96孔酶标板中，每孔100 μl，做3个复孔。用TE缓冲液200倍稀释双链DNA荧光染料，然后于黑色96孔酶标板中加入稀释的荧光染料，每孔100 μl。避光操作，混匀后于室温静置5 min。用酶标仪在激发波长480 nm、发射波长520 nm处测定荧光强度，读值在5 min内完成。以1×TE缓冲液测得的荧光强度为本底，测定标准品溶液和供试品溶液的荧光值。以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的荧光强度代入直线回归方程即求得供试品DNA浓度。 1.4 方法验证 1.4.1　线性关系　用稀释好的TE缓冲液将λDNA标准品配制成80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500及1.250 ng/ml的标准品溶液，每个浓度各6份。以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归，得出线性决定系数（R2）。 1.4.2　准确度　考察不同浓度的供试品在加标量低、中、高3种不同浓度水平下的回收率。取不同浓度的3份供试品溶液按1∶1比例各加入3种不同浓度的标准品，共制备9份供试品，高、中、低理论加标浓度分别为40.000、20.000以及10.000 ng/ml。每份供试品做3个复孔，结果取均值。根据标准曲线计算实际浓度，计算样品加标回收率。回收率=（实测值﹣供试品中被测成分量）÷加入标准品量×100%。 1.4.3　精密度 1.4.3.1　重复性　将供试品重复检测6次，计算6次残留DNA结果及其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。HepEV吸附前原液宿主细胞DNA残留量（ng/μg）=吸附前原液宿主细胞残留DNA浓度（ng/ml）÷吸附前原液的蛋白浓度（μg/ml），其残留DNA浓度的质量标准为不超过0.1 ng/μg。每剂HepEV的DNA残留量（ng）=吸附前原液宿主细胞残留DNA浓度（ng/μg）×每剂抗原含量（μg）。 1.4.3.2　中间精密度　考察不同分析人员、不同日期对精密度的影响。取供试品6份，3 d内由2人测定DNA残留量，每次测定2份供试品，同时每份供试品做3个复孔，结果取3个复孔的均值。结合6份供试品残留量试验数据，计算6次结果的RSD。 2 结果 2.1 线性关系 线性验证共制备6份不同浓度的标准品溶液绘制标准曲线，共进行6次检测。以标准品溶液的浓度为纵坐标，荧光强度值为横坐标作线性回归。由表1可知，标准品溶液在1.250~80.000 ng/ml范围内有良好的线性关系，R2均＞0.99。 2.2 准确度 供试品的加标回收率见表2，供试品加标10.000、20.000、40.000 ng/ml的回收率均在90.00%~110.00%之间，且加标回收率RSD均小于15.00%，表明该方法准确度符合要求。 2.3 精密度 2.3.1　重复性　将供试品重复测定6次后，测试结果平均残留DNA浓度为0.019 ng/μg，重复性RSD为6.62%（表3），所有结果均符合质量标准（≤0.1 ng/μg）。 2.3.2　中间精密度　由表4可知，不同人员和不同时间测量的供试品DNA残留量均符合质量标准，均值为0.018 ng/μg，RSD为10.30%，表明本方法中间精密度检测符合要求。 3 讨论 生物制品在生产过程中，尽管经过下游工艺去除了大量的宿主细胞DNA，但是仍有微量的DNA残留，导致有致癌和感染的风险。为了保证生物制品的安全性，各监管机构对生物制品中的残留外源DNA制定了严格的标准。药典三部规定，以中国仓鼠卵巢细胞生产的生物制剂中DNA残留量不能超过10 pg/剂，以真菌和细菌生产的疫苗中DNA残留量不能超过10 ng/剂。如今，宿主细胞残留DNA已作为生物制品安全性评价的重要指标，药典三部中介绍了3种外源性DNA残留量测定的方法：DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法。 本研究中建立了检测重组HepEV残余宿主DNA荧光染色法，并对建立的方法进行了线性、准确性以及精密度的验证。由验证结果可知残余DNA含量线性R2均＞0.99；准确性验证高中低浓度的加标回收率均在90.00%~110.00%范围内；重复性和中间精密度RSD均在＜15.00%的可接受范围内，表明该方法线性良好、准确性和精密度高，可用于检测重组HepEV残余DNA的含量。荧光染色法同DNA探针法相比，不受工程菌种类限制，且简便、快速；与定量PCR法相比，其操作简单，耗时短，也不需要设计特异性引物。 需要注意的是，由于荧光染色法荧光信号易受干扰，特异性较差，因此所有使用的材料和试剂都必须不含DNA，避免环境DNA污染。 作者 张巧玲1  张志豪2  秦海艳1  杨林鹏1  杨俊杰1 1兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室， 兰州  730030；2兰州生物制品研究所有限责任公司中试研究室， 兰州  730030 通信作者：杨俊杰， Email：jjyang@vacmic.com 引用本文：张巧玲, 张志豪, 秦海艳, 等. 重组戊型肝炎疫苗宿主细胞残余DNA荧光染色法检测方法的建立和验证 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(4): 203-206.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240105-00002 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

大河奔流，浩浩荡荡 中国生物兰州生物制品研究所 承载着使命与荣耀 用90年的坚守 讲述几代“兰州生物人”的奋斗故事 穿越时光长河 追溯星汉灿烂 1934年3月 西北防疫处 在兰州小西湖陇右公学房地成立 ▲西北防疫处原址 1949年8月，兰州解放 西北防疫处接受军管 改编为西北军区西北防疫处 开始恢复生产 ▲1949年的小西湖原所址大门 ▲1953年，中央拨款，在盐场堡现址购地进行扩建 1964年 开展肉毒病原及免疫研究 制备出A、B、C、D、E型分型血清 并根据需要分发新疆有关防疫部门使用 ▲建所初期，毒素室做产毒试验 1978年 王成怀研究员主持研制的 诊断、治疗、预防肉毒中毒成套制品 填补了我国防疫制品的空白 荣获1978年全国科技大会成果奖 ▲实验室中的王成怀 ▲20世纪80年代，菌苗研究组做深层培养 1991年7月 经过五个月的协作攻关 伤寒Vi荚膜多糖疫苗研究试制成功 1992年6月 “世行贷款中国疫苗项目工程”奠基开工 建成后成为具有先进水平的现代化、工业化 生物制品生产基地 ▲世行贷款的中国疫苗工程奠基仪式 1993年10月 独立研发出国内首创注射用A型肉毒毒素 是国际上继美英之后 第三家批准上市的厂家 1997年 由兰州生物制品研究所等多家机构 联合开展的流行性出血热灭活疫苗研究 获得卫生部、国家科委医药卫生科技进步一等奖 国家级科学技术进步一筹奖 该疫菌生产用毒株(LP1株) 兰州生物制品研究所拥有自主知识产权 1998年 口服轮状病毒活疫苗获得新药证书 2001年，获得正式生产批件 同年，获国家科技进步二等奖 2001年 国内第一支A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗 获得新药证书及生产批件 2003年 b型流感嗜血杆菌结合疫苗 率先在国内上市销售 填补了我国结合疫苗的空白 2023年 国内第一支口服三价重配轮状病毒 减毒活疫苗(Vero细胞)获批生产 同年，公司正在研制的 全球首个重组诺如病毒双价疫苗 开展III期临床研究 ▲全球首个重组诺如病毒双价疫苗III期临床研究项目顺利启动 回首90年来时路 兰州生物制品研究所 从黄河之滨诞生、成长、壮大 展望崭新未来 必将一如既往扎根这片深情的黄土地 脚踏实地，行稳致远 踏上新征程，续写新篇章 来源：兰州生物制品研究所 搜索“中国生物” 关注中国生物全媒体矩阵

肉毒素作为一种神经毒素，被广泛应用于除皱、塑形等医美领域，以及神经、康复、泌尿等临床治疗领域，且适应症仍在不断探索扩大中。根据ISAPS发布的Global Survey 2023数据，2023年全球共进行肉毒素注射约888万例，占非手术医美的46.3%，位居医美非外科手术处理类榜首。 目前，全球上市的肉毒素产品主要为天然A型肉毒素，市场主要被BOTOX®、Dysport®、XEOMIN®、Letybo®、NABOTA®、衡力®等几大产品占据。随着重组蛋白技术的发展，经过肉毒素领域科学家和研发专家多年探索，重组A型肉毒素开发获得成功并已推进到临床。重组A型肉毒素凭借其高纯度、低生物风险、低免疫风险、高生产效率、低成本等优势，有望带领肉毒素行业进入新时代。 01 肉毒素市场较为集中，产品创新发展加速 目前全球肉毒素市场集中，呈现寡头状况 早在上个世纪，肉毒素已在斜视、眼睑痉挛、除皱等应用领域进行治疗探索。1989年，美国FDA批准了肉毒素用于治疗眼睑痉挛和斜视；2002年，美国FDA批准了全球首个A型肉毒素产品——BOTOX®，用于改善中至重度眉间纹。目前，全球范围内已有超10款天然肉毒素产品上市。 天然肉毒素由肉毒杆菌发酵产生，其品质高度依赖于肉毒杆菌菌株的特性，同时由于活的肉毒杆菌具有高生物风险，相关生产在大部分国家受到限制甚至禁止，且生产设施投资成本高昂，再加之天然肉毒素的生产工艺复杂、产量有限等局限性，行业发展较为缓慢。并且肉毒素产品不同于传统药物，可应用于临床治疗及医美领域，而在医美市场的销售表现则较依赖于消费者对产品及品牌的认知。因此，肉毒素赛道的生产准入和商业竞争的门槛高，导致市场较集中。目前，在全球范围内，肉毒素主要产地集中在美国、欧洲、中国、韩国等少数几个国家，市场份额被BOTOX®为主的5-6个品牌所占据。 天然肉毒素产品在医美市场销售可观。ISAPS调查数据显示，近5年来肉毒素治疗量稳居医美非外科手术处理类TOP 1，从2019年的627.1万例增长到2023年的887.8万例，五年内增长约40%，市场规模不断扩大。 根据公司年报信息，2023年，Allergen的BOTOX®产品在医美领域和临床治疗分别获得26.8亿美元、30.0亿美元的销售业绩；Ipsen的Dysport®销售额达到约7.1亿美元；Hugel的Letybo®销售额为1.2亿美元。BOTOX®凭借其先发上市的优势、产品品质的优良及品牌的高认知度，2023年以56.8亿美元的销售额远超其它肉毒素品牌，在全球独占鳌头。此外，韩国在肉毒素领域拥有的生产企业和品牌最多，主要都应用于医美领域，但多个韩国品牌的肉毒素菌株来源未得到相关机构认证，专利纠纷多次发生，甚至产品许可被吊销。总体韩国的肉毒素生产企业实力、能力、质量等良莠不齐，在全球肉毒素市场份额中比例仍然较低。 资料来源：公司年报，沙利文分析 进口产品占据中国肉毒素市场主要份额，本土研发创新引领产业格局变迁 在中国市场，根据国家药品监督管理局（NMPA）信息，截至2024年9月13日，已有6款A型天然肉毒素产品上市，分别是Allergen公司研发的BOTOX®（保妥适®）、中国兰州生物制品研究所的衡力®、Ipsen公司研发的Dysport®（吉适®）、Hugel公司研发的Letybo®（乐提葆®），以及2024年2月上市的来自德国Merz的XEOMIN®（西马）和9月新获批的复星医药引进的Revance的达希斐®（Daxxify®）。其中，BOTOX®凭借其在医美领域的先发上市、品牌影响力、营销能力等优势，常年占据中国A型肉毒素市场份额TOP 1。 资料来源：NMPA，沙利文分析 同时，多家企业的多款A型肉毒素产品处于临床III期及上市申请阶段，包括大熊制药、爱美客（引进韩国的Huons）、Inibio、誉颜制药；艾尔建和兰州生物的已上市肉毒素产品处于拓展适应症的临床III期阶段。其中，誉颜制药的YY001管线为全球首个创新性采用重组蛋白技术并进入临床的重组A型肉毒素。重组A型肉毒素具有生物风险低、高纯度、免疫风险低、生产效率高、产能可控等优势，可破解天然A型肉毒素存在的限制成为新一代肉毒产品，有望改变现有A型肉毒素赛道格局。 资料来源：NMPA，沙利文分析 肉毒素在创新技术迭代上仍有很大的拓展空间。传统的天然A型肉毒素由于分子结构确定，主要应用场景已基本开发。而重组A型肉毒素在重组蛋白技术上，可进一步与分子异构、融合蛋白等技术联合应用，对A型肉毒素的分子结构及作用靶点进行分析与调控，从而针对实际需求开发出起效更快、效期更长、注射更精准、使用更方便、弥散度可调控等的新型肉毒素。 02 肉毒素应用场景广，在医美和治疗领域均具有重要价值 A型肉毒素作用机制 A型肉毒素属于Zn2+依赖的蛋白水解酶家族，由一条100kD的重链与一条50kD的轻链组成。A型肉毒素的重链可特异性地与神经细胞包膜结合进入细胞，轻链可特异性地水解突触前膜上的SNAP-25蛋白，从而影响参与细胞内吞、胞吐功能的SNARE蛋白活性，阻碍乙酰胆碱等神经递质小泡与突触前膜融合，不能释放神经递质，引起肌肉松弛、抑制腺体分泌等化学性去神经作用。 A型肉毒素根据使用场景的差异，包括在医美机构使用，目的为改善面颈部皮肤状态、局部塑形或治疗脱发等的医美领域，以及在医院神经、康复等科室使用，通过调节神经、肌肉、腺体等功能而发挥治疗疾病作用的临床治疗领域。 A型肉毒素在医美领域深受消费者青睐 在医美领域，A型肉毒素是一种深受消费者欢迎的微创医美手段，可应用于面颈部除皱、轮廓塑形、面部提升、改善腺体分泌、治疗脱发、预防性治疗等场景。 面颈部除皱：A型肉毒素通过阻断神经肌肉间的冲动传递，放松过度收缩的小肌肉，可以改善面部动力性皱纹。A型肉毒素常用于眉间纹、额纹、鱼尾纹、皱鼻纹、口周纹、木偶纹、颈横纹等面颈部皱纹的改善治疗。 轮廓塑形：A型肉毒素阻止神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放，导致神经无法支配肌肉运动，使肌肉因失去功能而萎缩减小，达到雕塑轮廓线条的目的。A型肉毒素可用于咬肌注射瘦脸，腓肠肌注射瘦腿，斜方肌注射改善肩颈部线条等。 面部提升：对面部降肌表浅肌纤维注射A型肉毒素，可削弱其肌肉拉力，使升肌作用占据优势，从而达到提升等目的。A型肉毒素提升外眼角和眉尾的下垂，颈阔肌注射可降低其对中下面部皮肤的牵拉，提升下面部，使下颌缘轮廓更清晰。 改善腺体分泌：皮脂腺表达α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAchR），故A型肉毒素可通过阻断胆碱能信号传导和抑制神经调节作用来有效减少皮脂产生、缩小毛孔。肉毒素微滴注射主要部位为皮脂溢出区，相关研究多见于前额。 治疗脱发：雄激素性脱发与二氢睾酮（DHT）及微循环不足相关。肉毒素可松弛头皮肌肉，改善局部血液灌注及含氧量，进而清除局部积累的DHT并减少DHT产生，从而减轻雄激素对易感毛囊的作用，减少毛发脱落。 预防性治疗：SAMCEP学会共识指出，随着人们认识到肉毒素注射对面部皱纹的预防和治疗以及面部稳定（主要是眉尾和嘴角）均有显著作用，越来越多的人要求在更早的年龄注射肉毒素。Rivkin等人研究发现，长期、连续性使用肉毒素可使皮肤和表皮重塑，预防皱纹形成，并具有改善皮肤质量潜在收益。 医疗领域潜在适应症众多，肉毒素临床价值持续展现 肉毒素具有强效的神经阻滞作用，对于肌肉过度收缩相关的异常运动或姿势、疼痛、自主神经功能亢进等疾病，肉毒素可能是有效的对症疗法。 治疗运动障碍：肉毒素具有降低痉挛肌肉肌张力的作用，改善痉挛发作频率和强度，可用于治疗眼睑痉挛、偏侧面肌痉挛、颈部肌张力障碍、喉肌肌张力障碍、肢体肌张力障碍、震颤、抽动障碍、口下颌肌张力障碍等疾病。 改善痉挛状态：肉毒素可用于上运动神经元损害所致的上、下肢痉挛状态。如对脑卒中所致上肢痉挛状态，肉毒素可降低受累腕指屈肌的肌张力或痉挛状态程度，减轻残疾程度；对成人上运动神经元损伤继发的下肢痉挛，肉毒素可降低肌张力，减少多发性硬化所致的下肢痛性痉挛，改善被动功能。 调节自主神经功能障碍：双侧腮腺或下颌下腺注射肉毒素，可改善患者流涎频率，减少唾液分泌量及严重性。在腋部、掌跖部注射肉毒素可抑制由胆碱能神经支配的汗腺分析，从而治疗多汗症。此外，肉毒素可改善神经源性膀胱过度活动症，改善膀胱容量、顺应性和逼尿肌稳定性。 镇痛：肉毒素可用于慢性偏头痛（有或无药物过量使用性头痛）的预防性治疗，可减少头疼发作天数；在三叉神经痛、带状疱疹后神经痛、糖尿病性周围神经痛等神经病理性疼痛也有应用，注射后患者疼痛改善或完全缓解。 预防和治疗瘢痕：肉毒素已被用于预防和治疗病理性瘢痕，但具体机制尚不明确，可能与肉毒素降低成纤维细胞增殖、减少胶原纤维沉积、抑制炎症因子释放和减少血管新生等机制有关。预防性治疗建议在术后14天内进行肉毒素注射；肉毒素联合糖皮质激素皮损内注射治疗增生性瘢痕或瘢痕疙瘩可能由于单糖皮质激素治疗。 治疗慢性鼻炎：A型肉毒素可改善慢性鼻炎症状，尤其是对流涕症状安全有效、疗效持久。作用机制可能包括：抑制鼻部或蝶腭神经节突触前胆碱能神经末梢释放乙酰胆碱，诱导鼻黏膜腺细胞凋亡，抑制鼻黏膜中炎症介质释放，减少鼻黏膜中的嗜酸粒细胞浸润和毛细血管扩张。 03 天然肉毒素监管严格，肉毒素行业准入壁垒高 监管审批门槛 天然肉毒素由肉毒杆菌发酵产生，若在生产过程中发生肉毒杆菌的泄露及传播，将造成严重的生化风险和公共卫生事件。因此，各国政府机构对天然肉毒素的研发和生产严格监管，开发和制造天然肉毒素除满足GMP要求外，还需在BSL-3或更高级别的环境中进行，并受到CDC监管。因监管严格，导致天然肉毒素产品生产门槛极高，从研发到上市的周期较长，因此产品集中在少数品牌。同时，过去由于肉毒素企业的销售和盈利可观，加之用肉毒杆菌研发过程存在安全风险，业内创新研发的动力和能力不足，监管也一直停留在传统的认知，偏于保守。 但是随着肉毒素产品技术研发热度提升，尤其是重组蛋白技术在肉毒素研发上的突破，研究领域、工业领域和监管机构对肉毒素的认知越来越深刻，对风险评估越来越客观，把控也越来越专业，加之监管机构自身的规范管理，提升效率等举措，目前肉毒素的审批时间已与其它药品类似，如分析乐提葆®（100单位/瓶）在中国药监局的上市审批时间表，从申请提报到注册获批总体历时约16个月。 生产工序复杂 肉毒杆菌是一种严格厌氧菌，对培养基要求严格，生产过程需使用BSL-3或以上的特殊建筑和设备，并对纳米加工水平要求高；鉴定纯化毒素，验证安全性及有效性较为困难；肉毒素产品贮存和运输过程普遍也需保持全程冷链。 批次间稳定性 肉毒杆菌生产肉毒素时会产生其它蛋白物质，天然肉毒素效果受到菌株、提纯工艺等因素影响，产品批次间可能出现差异。在定量检测阶段，由于制剂中蛋白含量在纳克级别，普通仪器难以精确检测，通常使用动物实验进行定量。但实验动物存在个体间偏差较大的问题，如何保证动物试验检测系统的稳定性和准确性，是肉毒素产品研发中一个关键环节，存在较高的技术壁垒。研发能力和经验强的团队，从菌株到工艺最终到动物实验的定量检测可形成系统性优势，使得批间产品质量更稳定一致，并体现为患者治疗的反应率更高，反之就可能出现产品质量起伏不定，患者治疗反应率低。 超敏反应 肉毒素本身为异体蛋白，注射后可能诱发机体发生超敏反应。目前上市的天然肉毒素产品，除XEOMIN®外，其它A型肉毒素产品均含有一组由若干血细胞凝集素（HA）和非毒性非血细胞凝集素（NTNH）组成的结合蛋白（NAPs），加之赋形剂的存在，注射后可能引起皮肤发生迟发型超敏反应。 免疫耐受 A型肉毒素通常注射后3~14天起效，有效期通常为3~6个月，需多次重复注射。随着肉毒素注射次数增多，机体产生的中和抗体的滴度逐步提高，可能导致注射后继发性无应答，出现多次使用后疗效降低的情况。 04 重组肉毒素具有更高的纯度、安全性和更显著的反应率 A型肉毒素主要技术路线分析 根据生产技术的差异，A型肉毒素可以分为天然A型肉毒素和重组A型肉毒素两类。 天然A型肉毒素：使用肉毒杆菌发酵进行生产，提纯后获得天然A型肉毒素。 重组A型肉毒素：通过将A型肉毒素的基因序列表达在大肠杆菌等工程菌中，工程菌发酵产生肉毒素前体蛋白，激活后获得重组A型肉毒素。 资料来源：公开信息，沙利文分析 重组肉毒素潜力看好，海内外多家企业相继布局 海外布局重组肉毒素的企业代表为Ipsen。官网数据显示，Ipsen目前仅IPN10200一条重组肉毒素管线。IPN10200为E型重组肉毒素，以患者未满足的长效治疗需求为动力，用于治疗神经系统相关的肌肉僵硬、痉挛和疼痛；通过工程化设计，提高肉毒素对受体亲和力，增强内化作用；降低肉毒素扩散到周围组织的风险，提高使用者的耐受性。IPN10200已于2021年进入临床研究，截至2024年3月，该管线有两个适应症处于临床II期试验，分别为中度至重度上面部皱纹、成人上肢痉挛。 国内布局重组肉毒素技术的企业较少。根据国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）数据，截至2024年9月13日，仅有3款重组A型肉毒素管线进入临床阶段，分别为誉颜制药的YY001管线、君合盟生物的JHM03管线和迪新宸科的DN001管线。三家企业的研发进度不一，且产品管线的技术工艺上也有所区别： 誉颜制药：CDE数据显示，誉颜制药的YY001于2022年3月获批开展临床I/II期试验，适应症为中至重度眉间纹，是全球范围内首个进入临床的重组A型肉毒素产品。I/II期临床试验已于2023年5月完成。同时，CDE数据显示该管线已于2023年12月启动III期临床。根据公司披露信息，YY001已于2024年9月12日召开了临床总结会，宣布完成III期临床，并启动BLA的申报。该管线采用大肠杆菌作为工程菌，模拟天然肉毒素产生过程，生产出的重组A型肉毒素YY001与天然A型肉毒素从分子结构、理化表征、生物活性等高度一致；且纯度高达99%以上，远超目前市场上占据绝大部分销售的天然A型肉毒素；临床试验显示使用效果更佳、安全性更优。此外，YY001还于2024年7月获CDE批准开展成人上肢肌肉痉挛临床试验，并于2024年9月14日宣布完成了第一例受试者入组，这是全球首次将重组A型肉毒素应用于医疗领域的重要里程碑。 君合盟：继誉颜制药之后，君合盟的重组肉毒素管线JHM03于2023年12月获CDE批准开展I/II期临床，适应症是中、重度眉间纹。根据公司披露信息，目前JHM03的II期临床试验即将结束。君合盟与誉颜制药均采用大肠杆菌发酵生产肉毒素，但据专业人士分析，其工艺技术和誉颜制药有所区别。该工艺与天然肉毒素产生过程有所不同，而是采取轻重链分别表达然后二硫键结合的工艺，可能导致分子结构变化，结构发生变化的分子也许不能完全等同于天然肉毒素，其在有效性、安全性和免疫原性等方面还有待大量长期的临床运用来验证。 迪新宸科：迪新宸科的重组A型肉毒素管线DN001于2024年8月获CDE批准开展I/II期临床，适应症也为中、重度眉间纹。对于该管线，公开信息尚无更多的披露。 根据公开信息，国内布局重组肉毒素赛道的企业还有若弋生物、耀海诺信等，其管线均处于临床前阶段： 若弋生物：通过自主建立了昆虫细胞-杆状病毒新型生产工艺平台，致力于开发自抑制型、减毒A型肉毒素，目前已完成上游、下游、制剂等工艺环节的开发，并进入商业批规模生产，预计2024年Q4申报IND。 耀海诺信：官网显示公司于2024年1月自研立项重组肉毒素开发，包括A型和E型两类重组肉毒素，且重组A型肉毒素已完成菌株筛选和成药性研究工作，其纯度超97%，活性在2*107 U/mg以上。 05 誉颜制药重组肉毒素临床表现优异，研发进度全球领先 誉颜制药在研管线YY001技术特点 誉颜制药运用基因重组和蛋白表达技术开发，使用工程化大肠杆菌进行A型重组肉毒素开发。YY001的产生过程与天然肉毒素产生过程一致，先使用工程化大肠杆菌发酵产生单链蛋白，再经蛋白酶切割后变为一条重链蛋白和一条轻链蛋白，重链和轻链蛋白通过一个二硫键连接构成150kDa单一活性双链蛋白，即重组肉毒素。YY001的分子结构与天然A型肉毒素相同。鉴于天然A型肉毒素已有超过三十年的使用经验，保证了具有同样分子结构的YY001的生物功能和药理药效作用。 誉颜制药创新设计了三重过滤技术，YY001产品纯度高、比活性高、反应率显著，150kDa神经毒素比例可高达99%以上，显著高于大多数天然肉毒素（通常占制剂的13%-15%）。YY001的高纯度可降低局部给药剂量，I/II/III期临床试验显示没有特异性抗体产生，安全性更好，免疫耐受性更低。 此外，公司建设了符合GMP规范的生产设施，设计YY001冻干制剂年基础产能为200万瓶，已于2023年第一季度开始投入使用；未来YY001上市后，誉颜制药YY001产能可根据市场需求灵活调整，产能储备可满足YY001商业化后5年内的20%以上市场总需求。 YY001应用场景广泛，临床数据优异 YY001具有多个潜在适应症类型，包括眉间纹、上肢肌肉痉挛、眼睑痉挛、咬肌肥大、以及潜在的疤痕、疼痛等。在2024年9月12日针对已完成的中、重度眉间纹适应症的III期临床总结会上，誉颜制药公布的临床数据显示，YY001在大规模人群的III期临床试验中，表现出与已完成的I/II期临床结果高度的一致性，其有效性、安全性、免疫原性等都全部达到既定的临床终点，较对照药的数据表现优异。此外，誉颜制药凭借其重组蛋白的技术平台，依靠肉毒素领域内全球性的专家人才和多年积累的丰富研发经验，可展开对A型肉毒素进一步优化升级，同时开发肉毒素的更多亚型；并通过分子异构、蛋白融合等技术，有望开发出更具临床价值、适应症更广的迭代创新产品。 获批在望，YY001先发优势显著 据悉，誉颜制药在成功完成YY001的III临床试验后，即将向NMPA提交上市申报，在全球范围内重组A型肉毒素的开发进展最快，先发优势明显。参比近几年中国获批上市的肉毒素产品注册申报时间，如吉适®注册申报时间约22个月，乐提葆®注册申报时间约16个月，达希斐®注册申报时间约17个月。考虑誉颜制药作为国内本土生产企业，相比国外生产企业在资料准备和沟通上的便捷性，预计YY001的上市申报有望更高效率实现，成为全球首款上市的重组A型肉毒素产品，从而在商业化销售上延续先发优势，将更有利于YY001上市后的市场表现。 携手华东医药，加快推进YY001市场渠道布局 2023年11月，华东医药与誉颜制药签署了产品独家经销协议，获得YY001在中国大陆、香港、澳门地区医美适应症领域的独家经销协议。 华东医药业务覆盖医药全产业链，其中医美业务板块聚焦全球医美高端市场，包括Sinclair、欣可丽美学等多家子公司，在全球多国设有研发中心及生产基地，建立了近300人的专业化市场推广团队，已搭建起全球化医美营销网络，产品销售已覆盖全球80多个国家和地区。其中，欣可丽美学为华东医药在国内的市场运营平台，在其推广下，再生型填充剂Ellansé®伊妍仕®自上市不到3年时间，已实现合作医院数量超600家，培训认证医生数超1,100人。YY001借助华东医药的医美市场营销平台，有望在上市后快速渗透全国医美机构，改写国内肉毒素竞争格局，并凭借其出色疗效成为全球化肉毒素品牌。 在重组肉毒素赛道，中国企业研发进度已走在世界前沿。未来，预计随着YY001作为全球首款重组肉毒素获批上市，中国将成为重组肉毒素制造和生产大国，引领全球肉毒素行业步入新时代。 关于沙利文生命科学事业部 沙利文生命科学事业部在生命科学领域拥有专业的分析能力和丰富的项目经验。依托沙利文全球智库资源和大中华区跨行业业务发展平台，沙利文生命科学事业部在生命科学产业投融资服务有着独特核心优势。沙利文生命科学事业部在中国拥有广泛的企业客户，并在过去20年里建立了庞大的客户网络，积累大量生命科学各细分领域的项目经验。 项目类型包括知识中心服务（深度内容宣传、品牌活动宣传）、国际化战略服务（出海策略、行业评估、全球品牌宣传、出海管线价值评估）、Pre-IPO服务（DCF估值、商业计划书服务）、IPO上市服务（行业顾问、临床稽查、募投撰写）、市场调研及战略咨询等，并与国内外知名的资讯平台及投融资机构合作，为企业提供生命科学专业细分领域行业一站式解决方案，受到投资者的广泛关注。 联系方式： 李谦（咨询总监）：18917935734（同微信） 徐潮（项目经理）：+86.21.3209.6800 ext. 8863 联系邮箱：hcknowledgecenter@frostchina.com 更多精彩！