重组伪狂犬病病毒在猪传染病疫苗开发中的应用

2024-03-08

疫苗

▲ 详细日程见文末 ▲1摘要伪狂犬病病毒（PRV）是伪狂犬病（PR）PR）的病原体，属于α疱疹病毒亚科，具有编码约70种蛋白质的双链DNA基因组。PRV有许多复制非必需的区域，具有很强的容纳外来基因的能力，以及更多的基因改造区域。PRV 是一种理想的疫苗载体，可以使用基因缺失的PRV开发多价活病毒载体疫苗。免疫系统继续受到基因缺失的PRV的刺激，并维持持续4个月以上的长期免疫力。在这里，我们简要概述了PRV的生物学、重组PRV构建方法、高效构建重组PRV的技术平台以及重组PRV在疫苗开发中的应用。本文总结了PRV在猪传染病疫苗开发中的应用的最新信息，并通过疫苗学对推进预防医学提供了新的视角。关键词：伪狂犬病病毒,病毒修饰,病毒载体疫苗,重组PRV，猪传染病2引言伪狂犬病病毒（PRV）是伪狂犬病（PR）的病原体，属于疱疹病毒科，主要感染猪，偶尔可传播给牛、山羊、绵羊、猫和狗。PRV病毒是一种大小约为143 kb的双链DNA病毒，由长独特区（UL）、内部重复序列（IRS）、短独特区（US）和末端重复短病毒（TRS）组成。基因组中至少有70个开放阅读框（ORF），编码70-100种病毒蛋白，包括毒力相关蛋白和复制酶，以及许多对PRV复制不是必需的蛋白。PRV的大基因组允许插入数千碱基（kb）的外源DNA序列。外源基因的表达不影响病毒复制。因此，开发了以PRV为载体表达不同猪病原体主要抗原的多价疫苗。活载体疫苗可以刺激体液免疫和细胞免疫，这是开发猪传染病疫苗的主要目标。科学家通过插入外源基因或敲除自身毒力基因，产生了副作用小、免疫力强的PRV疫苗株。本文综述了PRV的生物学特性、构建PRV方法学原理和技术平台的特性、高效构建PRV重组体的方法学原理和技术平台，以及PRV重组体在疫苗开发中的应用。本综述旨在为PRV活载体疫苗的研发提供参考。3PRV的生物学特性PRV编码的糖蛋白有10种，根据病毒复制对它们的依赖程度分为两组（必需糖蛋白或非必需糖蛋白）。糖蛋白B（gB）在感染期间的膜融合和病毒在细胞间传播中起着至关重要的作用。由糖蛋白C基因编码的主要糖蛋白通过肝素结合结构域介导PRV与靶细胞的附着。在易感动物中，gB、gC和糖蛋白D（gD）诱导保护性免疫应答。在感染细胞的病毒包膜中，由糖蛋白I（gI）和糖蛋白E（gE）形成的异二聚体复合物在PR感染 PR感染和传播中起着至关重要的作用。Bartha-K61是原始PRV疫苗株，包含 US2、gE、gI 和 US9 基因的缺失。该疫苗株已在全球范围内广泛用于控制 PR。自1990年代以来，PRV Bartha-K61引起的猪PR病例很少。然而，PR爆发发生在接种Bartha-K61疫苗的猪场，这是由PRV变异引起的，从2011年开始造成了严重的经济损失。疫苗仍然是控制PRV感染的最有效方法。因此，PRV 变体已被用于生成几种具有 gE、gI 和 TK 缺失的基因突变疫苗。当受到PRV变异的攻击时，这些突变体提供了足够的保护。通过将来自其他猪病原体的外源基因引入PRV变体并随后接种疫苗，可以建立针对这些猪传染病的免疫保护。4PRV重组体构建PRV的大基因组中有一些非必需区域。由于这种特性，PRV可以容纳几个kb的外源DNA，而不会影响其稳定性。反向遗传学在PRV基因修饰中起着至关重要的作用，随着分子生物学技术的发展，许多反向遗传技术已被用于构建重组PRV。4.1 同源重组过去，PRV 重组体是在容纳细胞中通过同源重组（HR）产生的。基于HR原理的重组病毒的构建可分为两个步骤：转移质粒的构建和重组病毒的筛选。通常以病毒基因组为模板，通过PCR技术扩增作为重组同源臂的两个基因片段，然后将外源基因表达盒插入同源臂之间，构建含有外源基因表达盒和左右同源臂的转移载体。基因缺失或替换是通过真核易感细胞中转移载体和亲本毒株的同源重组来实现的。目前，有两种用于转染的方法。一种方法是转移载体和亲本病毒基因组的共转染，另一种方法是先转染转移载体，然后接种病毒。转移载体上携带的报告基因用于筛选重组病毒的斑块。通常，经过 5-10 代筛选后即可获得具有感染活性的重组病毒。Tong等和Wang等利用该方法，在gE缺失的PRV变异株中构建了表达CSFV的E2蛋白的重组PRV毒株；Yan等人构建了gC基因额外表达的重组病毒；Zheng等人制备了表达猪细小病毒VP2蛋白和猪IL-6的重组PRV。由于HR效率低，因此在PRV重组体的构建中不常用。4.2 细菌人工染色体与同源重组相比，细菌人工染色体（BAC）更有效。Red/ET重组技术可用于修饰来自大肠杆菌中的BAC，可分为两个步骤。第一步是构建具有标记基因且两端都含有同源臂序列的表达盒，并将其转化到通过电穿孔制备含病毒BAC的感受态细胞。经过耐药性筛选，获得了正确的重组体。第二步是构建具有外源基因的表达盒，两端都包含同源臂序列。通过抗药筛选获得标记基因缺失的重组体。Zhang等人使用强毒力的PRV AH02LA毒株构建了TK/gE缺失的AH02LA BAC，并使用En Passant诱变方法将猪流行性腹泻病毒（PEDV）变体刺突（S）表达盒插入四个不同的非编码区。此外，为了开发针对PRV变体的重组疫苗，Zhang等人构建了Bartha-K61的BAC克隆。以Bartha-K61 BAC为骨架，通过En Passant方法将Bartha的gD和gC替换为PRV变体（AH02LA）的gD和gC。与亲本Bartha-K61相比，gD/gC取代的Bartha-K61 ST细胞的生长特性没有差异。4.3. Fosmid库传统的HR方法在获得重组病毒方面效率不高。创建重组 BAC 构建体是一个劳动密集型且耗时的过程。当全基因组PRV克隆到BAC质粒时，在电穿孔过程中经常发生片段缺失，影响重组效率。相比之下，fosmid 文库生成效率更高。将PRV的巨大基因组随机剪切成各种片段，然后用fosmid载体连接每个片段，以筛选出覆盖PRV全基因组的各种组合，并将fosmid组合共转染到病毒易感的真核细胞中以挽救病毒。重组病毒的构建只需要修饰大肠杆菌中相应的磷酰胺。由于fosmid仅包含PRV基因组的一部分，因此获得病毒突变体的效率大大提高。大肠杆菌中磷酰胺的修饰也可以利用Red/ET重组技术。zhou基于PRV-TJ菌株的fosmid文库，将一组fosmid直接转染到Vero细胞中，挽救了重组PRV。此外，Red/ET系统成功挽救了表达绿色荧光蛋白的报告病毒。Abid等人利用该fosmid文库平台构建了共表达经典猪瘟病毒（CSFV）E2和猪圆环病毒2型（PCV2）Cap的PRV。此外，Qi等人还构建了PRV-SC菌株的fosmid文库。通过Red/ET重组EGFP基因插入PRV-SC的UL 36基因的N端。4.4 CRISPR/Cas9分子生物技术为研究病毒的复制和疫苗做出了巨大贡献。CRISPR /Cas9介导的基因组编辑系统已被广泛应用，成为构建PRV突变体的有力工具。研究人员使用CRISPR/Cas9技术构建PRV gE、gI或TK基因缺失的重组体。此外，CRISPR/Cas9可以与HR和BAC技术结合使用，以提高重组效率。Fu等利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了一种EGFP和萤火虫荧光素酶稳定表达的双报告病毒。Feng等人利用该技术将非洲猪瘟病毒（ASFV）CD2v基因插入TK、gE和gI缺失的PRV Fa菌株中。ASFV CD2v在重组病毒中表达稳定。Wu 等人通过 CRISPR/Cas9 介导的 HR 将 ORF2 基因的串联重复序列插入 PRV gE 和 gG 位点，并构建了基于 PRV-HNX 菌株的二价疫苗。为了优化用于生成表达预测或已知 ASFV 免疫原性蛋白的传染性重组 PRV 的方法，Fuchs 等人开发了一种基于标记强制重组和 CRISPR/Cas9 在 PRV 载体中插入外源基因的有效策略。他们共转染了有缺陷的 PRV Bartha-K61 BAC DNA（具有糖蛋白 G 的缺失和包含糖蛋白 D 的起始密码子和启动子的额外缺失，糖蛋白 D 的启动子在与受体结合中起着至关重要的作用）、挽救转移质粒（该构建体中包含一个 PRV 编码的转基因，两侧是同源重组序列和一个完整的 gD 启动子），和 CRISPR/Cas9 质粒到细胞中。在99%的后代病毒中观察到转基因替换。此外，CRISPR/Cas9 和 Cre/Lox 大大提高了多基因编辑效率并缩短了疫苗开发时间。Yao等人结合Cre/Lox和CRISPR/Cas9介导的基因插入系统，删除了TK和gE基因，同时插入了免疫调节因子基因。同源重组是生成重组PRV的传统方法。后来使用了BAC，并允许在大肠杆菌中操纵整个基因组。同源重组方法由于需要多轮斑块纯化，因此劳动强度很大。BAC系统比同源重组效率更高，但重组BAC构建体的生成耗时，且巨大的PRV基因组容易被破坏。与传统技术相比，fosmid文库和基于CRISPR/Cas9的PRV基因操作平台具有多项优势，但在重组体的构建过程中仍存在一些缺点（表1）。因此，我们需要考虑各种方法的优势，并开发一种更有效的方法来构建重组PRV。表1 重组PRV构建方法的优缺点。5重组PRV背后的原理外源基因的表达是评价活重组疫苗疗效的重要指标，受外源基因启动子和插入位点的影响。5.1 启动子影响外源基因表达外源基因的初始转录是基因表达的关键步骤，转录起始速率是基因表达的限速步骤。启动子和相关调控序列是构建良好表达系统的前提。外源基因表达的调控元件包括启动子、增强子、Kozak 序列和终止密码子。外源基因在PRV中的表达水平主要取决于上游启动子的强度，选择一般较强的启动子。gG和gE启动子总是被选择来构建重组PRV，这些PRV具有独特的结构和强大的活性。此外，还评估了更有效的异源增强子或启动子，如HCMV或MCMV启动子，替代gG启动子。测试了不同的启动子在PRV中表达ASFV基因，如HCMV、MCMV和由HCMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组成的嵌合启动子（chimeric promoter， CAG）。与巨细胞病毒即刻早期启动子相比，CAG启动子增强了PRV中外源基因的表达。5.2 插入位点是影响外源基因表达的主要因素对于活载体疫苗株，遗传稳定性至关重要。PRV 基因组包含许多用于插入和表达异源基因的位点，但几乎所有位点都位于 gI/gE、TK 或 gG 基因附近。在 Tong 等人的一项研究中，gD 和 gG 基因插入 E2 表达盒，表达盒的插入不会显著影响重组病毒的体外复制。并且用毒性PRV挑战仔猪受到重组病毒的保护。Wu 等人还将 PCV2 Cap 蛋白基因的串联重复序列插入 PRV gG 和 gE 位点。在该重组PRV中检测到高水平的PCV2 Cap蛋白表达。根据这些结果，gG和gD之间的基因间区域被证明是表达外源基因的极好位点。为了确定将外源基因插入PRV基因组的合适区域，Zhang等人在PRV基因组的不同非编码区域插入了PEDV变体的S蛋白表达盒，并删除了TK，gE和gI，例如US2-1，UL11-10，UL46-27和UL35-36。US2-1区对PRV复制至关重要，因为外源基因的插入未能挽救病毒，另外三个非编码区是S基因的合适位点;当S基因mRNA插入UL11-10位点时，其表达量较高。因此，UL11-10是S基因表达的新的合适插入位点。到目前为止，在选择外源基因的插入位点时，研究人员首先考虑了病毒复制的非必需区域。虽然PRV的基因组序列中含有大量非必需的复制区域，但这些区域与病毒毒力、免疫逃逸机制或宿主范围的关系等基本理论仍有待进一步研究。同时，外源基因在载体中的表达受外源片段大小、表达载体启动子、外源基因插入引起的插入位点效应的影响。因此，一定大小的外源基因、稳定的外源基因插入位点、安全高效的表达元件是重组活载体疫苗应用的基础。6重组PRV的应用PRV的大基因组包含许多插入位点，允许异源基因被整合和表达。因此，PRV已发展成为表达外源蛋白的强大载体系统。6.1 PRV Bartha K61 菌株作为表达外源抗原的载体在猪中，PRV Bartha K61 可靠地复制并引发广泛的体液和细胞免疫反应。此外，为了建立针对不同病原体的临床保护，可以将外来抗原引入 Bartha K61 骨架并接种疫苗。通过将猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的GP5基因引入Bartha K61，并随后接种疫苗，实现了显著的临床保护，并且在仔猪PRRSV攻击后病理病变减少。此外，通过接种表达猪流感H3N2血凝素的Bartha载体，可以保护小鼠免受猪流感H3N2的毒力攻击。此外，接种了表达大流行性H1N1猪源性流感病毒血凝素或神经氨酸酶的Bartha载体的猪在受到H1N1病毒攻击后也显示出对病毒复制的显著抑制。由于 Bartha K61 在预防 PRV 变体方面的局限性，Zhang 等人构建了 gD/gC 取代的 Bartha K61，其中 Bartha K61 的 gD/gC 被 PRV 变体的 gD/gC 取代（AH02LA）。gD/gC取代的Bartha K61是安全的，它能有效防止致命的PRV变异。因此，Bartha K61是多价疫苗开发的安全有效的支柱。6.2 减毒PRV变体作为表达外源性抗原的载体自 2011 年以来，接种了 Bartha-K61 疫苗的农场经历了由 PRV 变体引起的 PR 爆发。因此，研究人员尝试根据不同的PRV变体生成几种涉及gE/TK、gI/gE和gI/gE/TK缺失的基因突变疫苗。这些疫苗为PRV变异株挑战提供了足够的保护。这些基因突变疫苗还被用作外来蛋白质的载体系统，以开发针对多种猪传染病的多价活病毒载体疫苗。Tong等人和Wang等人构建了一种表达CSFV E2蛋白的重组蛋白，并评估了其对CSFV和PRV变异株的疗效。重组PRV似乎是一种很有前途的重组候选疫苗，用于控制和根除PRV变异株和CSFV。通过fosmid文库平台，Abid等人构建了具有gE/gI/TK基因缺失的CSFV共表达E2和PCV2Cap的重组共表达。重组菌株对猪和兔是安全的，免疫兔和猪的血清中可以检测到抗PRV抗体。但无法检测到抗 E2 和 PCV2 抗体，据推测是因为 E2 和 Cap 蛋白的表达水平太低而无法诱导抗体产生。此外，Wu等人构建了PCV2 Cap蛋白基因ORF2的串联重复序列，该基因与蛋白质定量配量连接子连接，并使用内源性PRV启动子驱动PRV中PCV2 Cap2的表达。重组二价候选疫苗免疫接种后 14 天检测到高水平的中和抗体，维持在第 21、42 和 60 天。在野猪和家猪中，非洲猪瘟病毒（ASFV）会引起致命的疾病，并且没有针对ASFV的有效疫苗。为了开发针对非洲猪瘟病毒的活载体疫苗。Feng等人将CD2v插入PRV变体Fa株（TK、gE和gI缺失）中，获得了表达CD2v基因的重组菌株。重组病毒刺激了抗CD2v抗体和特异性细胞免疫反应的产生。此外，重组病毒可以保护小鼠免受毒株（PRV-Fa）感染。6.3 PRV变体作为表达免疫调节因子的载体淋巴因子激活的杀伤细胞在细胞介导的免疫过程中识别与PRV gC相关的感染细胞，PRV gC在细胞毒性T淋巴细胞识别感染细胞中发挥作用。为了增强gC表达，Yan等人在gI和gE缺失区域插入了gC基因的额外表达盒。额外的gC基因表达增强了PRV gI/gE缺失疫苗在猪中的疗效。一种造血生长因子，Fms 相关酪氨酸激酶 3 配体（Flt3L），在造血细胞分化中起重要作用。在外周，FLT3L及其受体调节稳态DC分裂。FLT3L依赖性通路介导疫苗诱导的保护性免疫并增强T细胞的活化。Yao等基于Flt3L的免疫调节功能，构建了TK/gE基因缺失、Flt3L共表达的重组PRV。重组基因在DC激活和保护性免疫应答增强方面显示出潜在的功能。这些结果表明，t Flt3L是一种理想的佐剂，PRV可以加载免疫调节因子，实现佐剂和疫苗的同时免疫。6.4 PRV变异毒株表达报告基因的载体截至目前，PRV变异毒力增强的机制尚不清楚。报告病毒是基础病毒学研究的宝贵工具。因此，Fu等人基于PRV变体构建了一种EGFP和萤火虫荧光素酶稳定表达的双报告病毒。重组病毒显示出与亲本菌株相似的生物学特征，包括在20次传代中具有稳定的病毒滴度和荧光素酶活性。此外，Zhou和Qi分别基于PRV变异和传统株构建了报告病毒。EGFP 在这些重组体中融合到UL36的氨基末端。具有绿色荧光的单个病毒颗粒用于监测轴突中的逆向和顺向移动病毒粒子，这些报道的病毒将加速对PRV变体生物学的理解。7结论与展望转基因活载体疫苗可以有效避免传统疫苗的缺陷，简化养殖业的免疫程序，提高疫情防控效率。减毒PRV载体疫苗不诱发PR的任何临床症状，但对PRV和其他猪病原体提供完全保护，并已广泛用于针对猪传染病的重组多价疫苗的研究。采用BAC技术、CRISPR/Cas9技术和fosmid文库构建PRV重组体，显著提高外源基因表达效率（表2）。但我们仍需考虑如何保证免疫基因的遗传稳定性，如何保证活载体疫苗研发过程中重组病毒的安全性。重组PRV活载体疫苗在研制过程中显著的毒力基因被删除，显著降低了其对动物的毒力，但重组体的安全性仍需详细分析。PRV基因组中存在广泛的复制非必需区域，这为优化重组位点提供了基础。选择更好的插入位点和更安全高效的表达元件，特别是高效的启动子，是重组活载体疫苗应用的基础。进一步研究和利用重组PRV活载体疫苗的优势，将对动物疾病的防控发挥重要作用。重组疱疹病毒活载体疫苗将在未来的动物疫病防控中发挥重要作用。表2.重组PRV的特征。参考资料：Zhou M, Abid M, Cao S, Zhu S. Recombinant Pseudorabies Virus Usage in Vaccine Development against Swine Infectious Disease. Viruses. 2023 Jan 28;15(2):370. doi: 10.3390/v15020370. PMID: 36851584; PMCID: PMC9962541.为了推动兽用生物制品行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展、乘风济海将于2024年4月17日-18日在南京共同举办“兽用生物制品研发和产业化大会”，系中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）中的一个分领域专业会议。诚邀全国相关领域研究者共享学术盛会。名称：兽用生物制品研发和产业化大会时间：2024年4月17日-18日（周三-周四）地点：南京国际展览中心主办单位：生物制品圈、抗体圈、四叶草会展，乘风济海媒体支持：药时空、细胞基因研究圈报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请（严格审核通过）。大会日程注：大会日程以会议现场为准。中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）是一场将“政、产、学、研、用、管、投”各方精英围绕全产业链新资源展开的合作大会，将于2024年4月16日-18日在南京国际展览中心举办。大会将主打“全产业链新资源对接”，围绕投资、立项、临床前研发、临床研究、生产、供应链国产化、销售、MAH合作、国际品种合作、公司股权合作与并购全产业链，为中国医药同仁带来全新的资源与商机。大会下设的同期会议包括：宠物药品、食品、保健品新资源大会兽用生物制品研发和产业化大会透皮技术研发生产与注册开年分享会吸入制剂研发、生产与注册新机遇新进展分享会中国改良新药与缓控释制剂全产业链合作大会陆续更新中......识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。