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使用稳定悬浮生产细胞系开发用于连续慢病毒生产的灌流工艺

2023-11-30

基因疗法临床研究

用于基因治疗应用的临床级慢病毒载体（LV）的大规模生产仍然是一个挑战。贴壁细胞系和瞬时转染等方法的使用成本高昂，并且阻碍了工艺的可放大性和重现性。本研究描述了使用两种适应悬浮培养的稳定包装细胞系（称为 GPRG 和 GPRTG）来开发可放大的无血清 LV 生产工艺。两种稳定包装细胞系均基于诱导型 Tet-off 系统，因此需要去除强力霉素才能启动病毒生产。因此，我们比较了强力霉素去除的不同方法并接种了三个独立的 5L 生物反应器，并比较了稀释、声学细胞清洗器和手动离心的可放大诱导方法。生物反应器接种了稳定的生产细胞系，该细胞系编码携带临床相关基因的 LV。使用基于声波分离的细胞截留装置以灌流模式进行LV生产。所有三种方法均获得了可比的细胞特异性生产率，并且在 234 小时长的过程中每个生物反应器产生了高达 6.36 × 10^11 转导单元的累积功能产量，证明了稳定Tet-off 细胞系对于易于放大的悬浮工艺的可用性。值得注意的是，在高细胞密度下，细胞活性保持在 >90%，而不会影响整个过程的生产率，从而可以进一步延长工艺时间。鉴于其在病毒生产过程中的毒性影响较低，所提出的细胞系是开发完全连续的慢病毒生产工艺、以克服慢病毒生产中现有的瓶颈的绝佳候选细胞。简介慢病毒载体（LV）作为细胞和基因治疗中基因递送的工具很受欢迎，因为它们能够稳定地整合到分裂和非分裂细胞的宿主细胞基因组中，从而导致转基因的长期表达。安全性和有效性方面的持续改进使得针对淋巴瘤、镰状细胞病或 Wiskott-Aldrich 综合征等几种罕见和获得性疾病的临床试验获得批准。临床试验数量的不断增加以及慢病毒的商业用途增加了对高质量载体的需求，从而增加了对可重复的大规模生产工艺的需求。LV上游工艺中现有的瓶颈主要是由于常用的表达系统和载体稳定性较低。LV 的传统生产方法是用三到四个携带转基因、包装和辅助基因的质粒瞬时转染贴壁 HEK293 或 HEK293T 细胞。基于瞬时转染的生产工艺可以快速生产 LV，但容易出现批次间差异且难以扩大规模。此外，需要大量 GMP 级质粒，导致生产成本高昂，并且在下游工艺过程中需要去除残留物。为了克服瞬时转染的挑战，开发了稳定的包装和生产细胞系。由于广泛使用的水疱性口炎病毒 (VSV-G) 的囊膜糖蛋白表现出细胞毒性作用，其表达通常由诱导型表达系统控制，从而允许细胞扩增在开始病毒生产之前达到所需的规模。常用的是四环素诱导表达系统，存在两种不同的变体。首先是 Tet-off 系统，其中转录在四环素或多西环素存在下被抑制，其次是 Tet-on 系统，其中转录在四环素或多西环素存在下被激活。近二十年来，开发了几种稳定的包装和生产细胞系，主要基于 Tet-off 系统。一个例子是 Throm 等人开发的表征良好的稳定包装细胞系 GPRG 和 GPRTG，用于生成表达临床相关载体的几种稳定的生产细胞系。贴壁细胞系是通过使用γ-逆转录病毒载体（SIN-MLV）连续转导HEK293T细胞而建立的，携带病毒生产所需的遗传元件。gag-pol 构建体整合后，元件 rTA、rev 和 VSV-G 独立整合到细胞系中。与 GPRG 细胞系相比，GPRTG 细胞系额外整合了 tat 元件，并针对引入元件的表达水平进行了进一步优化。rev、VSV-G 和 tat 的表达受四环素控制的启动子 (p7tetO) 调节，因此可通过补充强力霉素来抑制。生产细胞系的产生是通过串联阵列的稳定转染来进行的，串联阵列是通过以1:25的摩尔比体外连接编码选择抗生素抗性的质粒和携带治疗基因盒的pTL20c载体而产生的，并且从而实现 SIN 载体基因组的高拷贝数整合。整合多西环素调节的载体基因组RNA表达盒后，两种细胞系在诱导后均能够产生高于1 × 10^7 TU/mL的功能载体浓度，从而克服了瞬时转染的局限性。尽管文章描述了这些细胞系的潜在可放大生产方法，例如使用固定床生物反应器 iCELLis®，但血清依赖性和贴壁细胞特性是不利的。使用血清生产病毒载体的成本昂贵，存在被外来因子污染的风险，增加批次之间的可变性，并可能使后续下游工艺复杂化。此外，与使用悬浮细胞系相比，使用贴壁细胞系的工艺更难以扩大规模并且提供的工艺灵活性较低。为了解决这些限制，在本文中，我们介绍了使用悬浮驯化的 GPRGs 和 GPRTGs 细胞系进行无血清 LV 生产。已经使用 Tet-on 系统描述了一些基于 HEK293 或 HEK293T 细胞系的悬浮驯化稳定生产细胞系，因为添加多西环素进行诱导可以很容易地以任何所需的规模进行。相比之下，大规模诱导基于 Tet-off 的悬浮细胞是一个重大挑战，因为需要减少上清液中的强力霉素。因此，我们首先开发了一种基于摇瓶稀释的诱导方法，以展示无需额外技术设备即可大规模诱导的一般可行性。为了解决功能载体滴度随着基因组大小的增加而降低的事实，我们打算使用 WAS-T2A-GFP 构建体作为转基因来表达临床相关的 Wiskott-Aldrich 综合征蛋白（WASp），但受益于绿色荧光蛋白（GFP）作为选择性标记，以促进感染滴度测定。WAS 是一种罕见的 X 连锁原发性免疫缺陷病，由编码 WASp 的 WAS 基因突变引起，该病已在慢病毒基因治疗试验中得到治疗，并取得了积极成果。T2A 序列源自 Thatsasigna 病毒 2A，其翻译会产生由核糖体跳跃介导的自切割肽。在比较不同的无血清培养基和补料添加对细胞生长和功能性载体生产的影响后，使用性能最佳的培养基组合物来研究所开发的稀释方法在 5 L 生物反应器规模下的可用性。该方法的效率与使用基于声波分离的细胞清洗器以及通过离心手动去除多西环素的诱导进行了比较。由于 LV 在生理温度下表现出较低的稳定性并且可能会因生产细胞的自转导而丢失，因此我们实施了灌流工艺，以提高载体产量并延长工艺长度。详细实验操作和结果，请参考原文。图4. 使用 GPRTGs-WAS-T2A-GFP 生产细胞系和 TransFx-H + CB5 培养基在摇瓶中批次模式和半灌流模式下病毒生产的比较。对于半灌流模式的生产，从 48 hpi 开始每天进行全体积培养基置换。数据是在每种条件下使用三个独立的摇瓶生成的。hpi，诱导后的小时数；VCD，活细胞密度；（a-d 的值显示为平均值±SD）。(a) 用于比较 216 小时批次和半灌流模式生产的 VCD。(b) 216小时内批次和半灌流模式生产的可行性比较。(c) 用于比较 216 小时批次和半灌流模式生产的每日感染滴度。(d) 半灌流模式下 120 小时批次生产和 216 小时生产的时空产量。对于批次生产，由于 120 hpi 时感染滴度最高，因此计算了 120 小时工艺的时空产率。图5. 基本生物反应器设置示意图。带三角形的圆圈表示蠕动泵。细胞截留装置 (Biosep) 基于声波分离，位于顶板上，无细胞收获液被泵出。连续的培养基添加通过重量或使用液位传感器来调节。在达到约 1.5××10^7 cells/mL 的活细胞密度后进行细胞废弃。图6. 使用 GPRTGs-WAS-T2A-GFP 生产细胞系和 TransFx-H + CB5 + AC 培养基在 5 L 生物反应器规模上比较三种不同的诱导方法。首先在添加有 1.0ng/mL 多西环素的 N-1 灌流种子培养生物反应器中扩增细胞（“N-1 Perfusion”）。种子培养用于接种三个 5 L 灌流生物反应器：1. 直接接种，无需更换培养基（“稀释”），2. 使用声学细胞清洗器（“APW-10”）或 3. 通过离心含有多西环素的上清液之后。接种摇瓶卫星作为对照。数据是根据条件使用单个生物反应器或摇瓶生成的。VCD，活细胞密度。(a) N-1 灌流种子培养生物反应器、生产生物反应器和摇瓶中的 VCD。(b) N-1 灌流种子培养生物反应器、生产生物反应器和摇瓶中的细胞活性。(c) 生产生物反应器和摇瓶中的葡萄糖浓度。(d) 生产生物反应器和摇瓶中的乳酸浓度。(e) 采样后使用外部 pH 计测定生产生物反应器中的 pH 值。(f) 生产生物反应器和摇瓶中的每日感染滴度。(g) 根据平均 VCD 计算的每日细胞特异性生产率。(h) 通过收集接种不同诱导策略的每个 5 L 生产生物反应器的所有收获液获得的总病毒产量。图7. 使用 GPRTGs-WAS-T2A-GFP 生产细胞系在接种带声学细胞清洗器 (APW-10) 的 5 L 生物反应器中研究长达 330 hpi 的延长病毒生产。所示数据是图 6 中所示 APW-10 生产生物反应器的延续。数据是使用单个生物反应器生成的。hpi，诱导后的小时数；VCD，活细胞密度。(a) VCD 和细胞活性的数据。(b) 感染滴度和细胞特异性生产力。根据平均 VCD 计算细胞特异性生产率。讨论由于传统生产方法，用于商业和临床用途的 LV 的可放大生产仍然是一个障碍，因此人们开始转向使用适应悬浮培养的稳定生产细胞系，以克服可放大性、再现性和工艺成本的限制。使用悬浮驯化稳定生产细胞系的诱导生产系统通常基于 Tet-on 系统，因为可以通过按所需规模添加诱导剂进行直接诱导。然而，基于 Tet-off 系统开发了几种稳定的细胞系，需要去除多西环素才能启动 LV 生产。虽然在贴壁细胞的情况下，当细胞附着在表面上时，可以很容易地去除含有多西环素的培养基进行诱导，但大规模基于 Tet-off 系统的稳定悬浮细胞系的诱导仍然是一个挑战。在这项研究中，我们提出了诱导基于 Tet-off 的悬浮生产细胞系的不同策略的开发和实施。因此，我们将 Throm 等人开发的贴壁包装细胞系 GPRG 和 GPRTG。（2009）驯化至悬浮。首先，我们生成了多克隆 GFP 生产细胞系，并研究了在摇瓶中使用 GPRGs-GFP 生产细胞系通过简单接种来诱导病毒生产的一般可行性。该工艺概念包括补充强力霉素的 N-1 灌流种子培养，使细胞在接种生产培养物之前生长至高 VCD，同时抑制病毒产生。由于与传统种子培养相比，N-1 灌流种子培养的细胞密度较高，因此直接接种生产培养时可达到更高的稀释倍数，因为需要更小的种子扩增培养体积即可达到生产生物反应器中的预期接种密度。我们研究了 0.1 至 5.0 ng/mL 之间不同浓度的强力霉素用于摇瓶中 N-1 灌流种子扩增。将每个种子扩增培养直接用于预先加入无强力霉素培养基的种子生产摇瓶，随后以批次模式培养72小时。令人惊讶的是，所有研究的、用于种子扩增的多西环素浓度都允许启动病毒生产，而不需要更换培养基。获得的结果证明了通过稀释诱导的可行性，无需额外的设备，从而大大简化了工艺放大。我们测试了 1.0ng/mL 的多西环素浓度，用于进一步扩大规模的策略，因为这可以成功抑制种子培养中的病毒产生，并在稀释后快速诱导。然而，生产培养中残留的多西环素可能会阻止或延迟完全诱导，这可能会降低滴度或总病毒产量。由于连续收获策略被描述为可增加 GPRG 和 GPRTG 衍生细胞系的产量，我们的目标是实施灌流工艺，这将进一步降低接种生产后的抑制剂浓度。通过培养基的大量置换在一定程度上可以在摇瓶中模拟灌流。然而，生物反应器规模的灌流模式培养需要连续的培养基置换。因此，我们决定在生物反应器规模上检查潜在剩余强力霉素的影响。大多数现有文献显示了携带 GFP 作为转基因的 LV 的生产，以简化功能滴度的测定，尽管临床相关的构建体通常较大，并且载体基因组大小的增加与功能滴度的降低相关。因此，我们使用 WAS-T2A-GFP 构建体开发了稳定的 GPRGs 和 GPRTGs 生产细胞系，导致 LV 基因组 RNA 大小增加至 6173bp。产量最高的多克隆 WAS-T2A-GFP 生产细胞系的感染滴度在 GPRGs 和 GPRTGs 衍生细胞系之间具有可比性。我们选择了多克隆 GPRTGs-WAS-T2A-GFP 细胞系，因为之前报道的 GPRTG 衍生载体对人类 CD34 + 细胞具有更高的转导效率。使用制备的载体转导后，靶细胞表达临床相关的 WASP 以及 GFP，促进感染滴度测定。应当指出的是，编码激活基因表达的四环素反式激活因子的 rTA 元件的整合已独立整合到 GPRG 和 GPRTG 细胞系中。结合反式激活因子所需的多西环素浓度，从而抑制 p7tetO 控制的遗传元件的转录，可能取决于其表达水平。然而，由于使用相同的 p7tetO 和 tTA 序列来建立两种细胞系，因此通过稀释发现的诱导结果被认为可以在两种细胞系之间转移，并在生物反应器规模上得到验证。在将开发的工艺扩大到生物反应器之前，我们测试了各种无血清培养基以及化学成分确定的补料 CB5 的添加对 GPRTGs-WAS-T2A-GFP 细胞系上感染滴度形成和细胞生长的影响。我们发现 TransFx-H + CB5 培养基在半灌流模式下支持高达 2.78 ×10^7 TU/mL 的最高平均感染滴度形成，以及诱导后细胞的强劲生长。与使用基础添加物相比，使用 TransFx-H + CB5 培养基将感染滴度提高了五倍。与其它稳定细胞系相比，我们还观察到与基础添加物相比，TransFx-H + CB5 的细胞特异性生产力增加了 3.5 倍。尽管所有培养基在诱导后都支持细胞生长，但不同培养基成分之间的功能滴度差异高达 10 倍，这证明了培养基成分对于病毒生产力的重要性。在确定小规模的最佳工艺参数后，我们打算将该工艺转移到生物反应器规模。正如我们所表明的，与在摇瓶中使用 TransFx-H + CB5 培养基进行 120 小时批量生产相比，216 小时工艺的连续收获策略将时空产量提高了 9.2 倍，合适的细胞截留需要用于生物反应器规模生产的装置。灌流中LV生产的既定方法基于声波分离，或基于切向流深层过滤 (TFDF)，使LV能够通过膜。在我们这里，与声波分离相比，使用切向流过滤进行细胞截留时，我们观察到更高的细胞损伤，这缩短了工艺时间，并导致稍后收获时间点的跨膜压力增加。因此，我们决定采用声波分离技术进行连续收获，根据供应商的说法，该技术可以将体积扩大到1000 L，原则上允许使用一个生物反应器收获数千升含有病毒的收获液。我们通过稀释至 5L 生物反应器规模，并使用声波分离进行后续灌流策略，成功扩大了开发的诱导方法。为了解决剩余强力霉素是否影响使用稀释方法的诱导水平的问题，我们直接将性能与其它方法进行比较，介导接种后生产生物反应器中残留种子培养上清液的百分比较低。因此，我们使用开发的稀释诱导法、基于声波分离的细胞清洗器或通过手动离心去除含有多西环素的培养基来接种三个独立的5L搅拌罐玻璃反应器。我们观察到稀释方法在 66 hpi 和 90 hpi 时间点的细胞特异性生产率略低，这可能表明由于剩余的多西环素而导致诱导略有延迟。然而，在进一步的工艺中，细胞特异性生产率与所研究的方法相当，这些方法支持在接种前去除含有强力霉素的上清液。通过稀释诱导和使用声波细胞清洗器诱导的峰值感染滴度和总病毒产量似乎相当。通过离心去除种子培养上清液后接种的生物反应器的相应值似乎略低，这可以通过 138 hpi 后平均 VCD 较低来解释。结果表明，直接接种时潜在残留的多西环素是一个可以忽略不计的因素，而开发的稀释方法支持有效诱导病毒产生。在技术可行性、可放大性和执行时间方面，所开发的稀释方法比研究的替代方法更具优势。种子培养物的直接转移可以直接以任何所需的规模进行，并且不需要额外的设备。使用声波细胞清洗器的工艺可以完全自动化，与稀释方法相比，减少了操作员的操作并降低了残留多西环素的百分比。然而，考虑到处理时间为 90 分钟，所用设备设计的直接可放大性仅限于 50 L 生物反应器的接种。较大的生物反应器可以通过延长设备的运行时间或多个设备的并行操作来接种，但这使得技术设置更加困难。离心方法确保了细胞与含有多西环素的上清液的有效分离，但需要操作者进行多次操作。由于连续离心系统（如 Ksep® 系统）可用，该方法可能以可放大的方式实现半自动化，但需要评估对细胞活性、离心后均质性和工艺时间的影响。因此，我们将稀释法作为标准方案实施。该程序极大地简化了工艺流程，促进了临床应用的技术转移和工艺验证，而无需额外的设备。值得注意的是悬浮驯化 GPRTGs 细胞系的生产概况以及所开发的生产工艺的稳健性。我们证明，GPRTGs 生产细胞系能够在诱导后的过程中产生进一步增加的感染滴度。尽管乍一看似乎是诱导后细胞密度增加的原因，但令人惊讶的是，细胞特异性生产率在后期生产时间点也有所增加。我们假设在诱导后的较晚时间点 VSV-G 密度增加或由于细胞系的多克隆性而导致细胞群发生变化。我们目前正在量化不同时间点诱导单克隆细胞系的 VSV-G 密度，以进一步研究这种效应。Tran 和 Kamen 最近描述了一种基于 TFDF 的工艺，使用表达 LV GFP 载体的 Tet-on 稳定生产克隆。经过 8 天的生物反应器生长期后，细胞被诱导达到高 VCD。作者报告称，诱导后 5 天 (dpi)，每 1 L 收获液的标准化累积功能产量为 1.2 × 10^11 TU。我们用于比较不同诱导方法的生物反应器工艺具有相当的总工艺长度，包括生物反应器中 4 天的 N-1 灌流种子扩增。如果考虑 13 天的总工艺时间进行比较，包括 N-1 灌流中的 4 天细胞扩增和随后的 9 天生产阶段，我们使用生物反应器实现了可比的结果，APW-10生物反应器为 1.2 × 10^11 TU/L，稀释生物反应器为 1.1 × 10^11 TU/L。Tran 和 Kamen 描述了在 72 hpi 时高达 4.4 × 10^7 TU/mL 的峰值功能滴度，显示出钟形生产曲线，而 >1 × 10^7 TU/mL 的功能滴度只能在 2 dpi 至 5 dpi 之间保持,很可能是由于表达的病毒成分的细胞毒性作用。相比之下，我们的工艺从 4 dpi 或 5 dpi 开始达到 >1 × 10^7 TU/mL 的功能滴度，并且可以维持到 14 dpi，达到高达 2.9 × 10^7 TU/mL 的峰值。考虑到生物反应器“APW-10”的14天生产阶段，我们能够在一次生物反应器运行中获得2.4 × 10^11 TU/L的累积功能产率，并且有可能通过延长生产时间进一步提高所获得的值。应该注意的是，功能滴度的直接比较只能在有限的范围内进行。计算的滴度取决于 LV 转基因以及用于感染滴度测定的细胞系、方法和方案。此外，在这项工作中，使用了多克隆细胞系。筛选和选择高产克隆可能会进一步提高感染滴度和工艺产量。之前已经描述过，通过优化固定床生物反应器中的 pH 设定点，贴壁 GPRTG 衍生细胞系的生产力可以维持较长的培养期。然而，由于贴壁细胞特性，细胞生长的表面积受到限制。当达到高水平汇合时，分裂细胞从表面分离，并且附着的生产细胞的细胞年龄随着时间的推移而增加。相比之下，由于我们的工艺使用悬浮细胞，因此我们能够实施细胞废弃。因此，在高达 330 hpi 的整个过程中，细胞活性保持在 >90%，并且我们能够在细胞密度、pH 值以及代谢物方面达到稳态条件。总体而言，在这项研究中，我们能够使用一组三台台式生物反应器产生 2.12 × 10^12 TU的累积功能病毒产量，并使用单个生物反应器产生高达 1.09 × 10^12 TU的累积功能病毒产量。由于保持病毒生产力和细胞活性，我们目前正在研究 >800 小时的生产时间，重点关注最终产品中的病毒质量参数，例如功能滴度与物理滴度的比率、病毒效力、慢病毒基因组序列和宿主细胞 DNA，确保商业应用的产品一致性。就技术可行性而言，预计细胞截留装置不会受到膜污染或堵塞等限制，因为声波分离是一种无膜技术。我们相信，这项研究的结果有助于克服大规模生产LV的现有挑战。我们成功地将两种稳定包装细胞系悬浮并产生了稳定生产细胞系。我们比较了不同的无血清培养基、以优化细胞生长以及感染滴度和产量。我们能够开发出一种直接可放大的诱导方法，证明了使用基于 Tet-off 的细胞系进行大规模工艺的可行性。此外，所提出的工作显示了建立完全连续的LV生产工艺的潜力，这将是LV生产领域的一个重要里程碑。原文：M.Klimpel, M.Terrao, N.Ching, et al., Development of a perfusion process for continuous lentivirus production using stable suspension producer cell lines. Biotechnology and Bioengineering, 2023.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。