REV

摘要：早期的基因治疗研究对于遗传性疾病的治愈抱有巨大希望，但各种基因毒性事件的发生导致临床试验暂停，对进展采取了更加谨慎的态度。遗传工程技术的最新进展重新点燃了人们的兴趣，导致2017年首个针对遗传突变的基因治疗产品获得批准。基因治疗（GT）可以在体内或体外进行。体外基因治疗方法具有优势，因为它允许在患者使用前对基因修饰细胞进行表征，并选择所需的特性。在此过程中还可以使用自体细胞，这消除了免疫排斥的可能性。本综述重点介绍了体外基因治疗的各个阶段、当前研究进展，这些进展提高了这一过程的效率和安全性，以及对人类免疫缺陷病毒（HIV）基因治疗研究的全面总结，其中大多数采用了体外方法。 1.引言 人类基因组的成功测序加深了我们对遗传性疾病和导致慢性及暂时性疾病状况的病理过程的理解。目前有超过5000种基因治疗产品正在针对各种遗传性、慢性和传染性疾病进行试验（https://clinicaltrials.gov/, 访问日期为2023年10月30日）。在开发基因治疗候选药物时，考虑一种有效的递送方法很重要，这将允许感兴趣的基因进行准确处理，在特定作用部位有足够表达，并持续预期的治疗效果，随后降解递送载体而不引起任何不良影响。由于存在引起严重不良反应的潜在危险，如肿瘤形成甚至基因修饰的生殖系传递，开发基因治疗产品（GTP）的过程非常严格，比其他治疗剂需要更长的时间。补充表S1总结了不同监管机构迄今为止批准的基因和细胞产品。最近发表了一篇综述，讨论了其中一些产品的发展。递送感兴趣基因的方法有两种：体内和体外（图1）。体内方法涉及将遗传物质直接递送到患者体内，可以是裸露的基因或封装在颗粒中。另一方面，体外方法涉及从患者或正常供体分离感兴趣的细胞，对它们进行遗传修饰，在某些情况下进行扩增，然后将它们给患者。因此，患者没有直接接触到转移载体。选择，即确保修饰的细胞相对于自然发生的缺陷细胞更优先植入患者体内，可以在给患者施用感兴趣基因之前或之后进行。最近发表了一些综述，强调了基因治疗在各个领域的应用：使用造血干/祖细胞（HSPCs）治疗造血障碍、遗传性皮肤病、神经系统疾病或中枢神经系统遗传性疾病和骨科疾病等。 图1. 体外递送感兴趣基因。使用Biorender.com创建。2.HIV基因治疗的治愈方法 由于存在对当前治疗有抵抗力的潜伏病毒库，因此获得HIV的治愈一直具有挑战性。这些病毒在转录上是不活跃的，但很大一部分具有复制能力。抗逆转录病毒治疗(ART)可能在潜伏病毒藏身的组织中吸收相对较差，如肠相关淋巴组织(GALT)和中枢神经系统(CNS)，这可能有助于这些部位病毒的持续存在。在停止ART后的几周到几个月内观察到病毒反弹。治愈的另一个挑战是HIV对免疫系统的影响：对HIV的体液反应差，中和抗体的产生不足，这通常在感染几个月后才会发生。此外，也有重建HIV特异性CD4+ T细胞的相对失败，这反过来又导致CD8+细胞毒性T细胞功能的降低。 因此，可以合理假设有效的治愈将旨在使潜伏病毒失活或移除，并重建免疫系统。基因修饰的细胞也应该能够抵抗持续的感染，治疗本身不应该引起严重的不良事件。为了重建或增强免疫系统的功能，已经在B细胞和T细胞的遗传工程方面取得了几项进展，包括嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗。图2提供了HIV治愈策略的总结。 国际艾滋病学会的多方利益相关者协商就HIV治愈目标产品的最低标准达成一致。临床疗效定义如下：维持病毒载量低于传播阈值(<200 HIV RNA拷贝/mL)，在研究的20%或更多人群中有效，平均每年复发率低于10%，缓解期超过2年，并且严重不良事件的可能性极小，如果有的话，即研究人群的不到1%。可能的治愈也可能需要结合不同的方法。 图2. HIV治愈策略。CRISPR—成簇规则间隔短回文重复序列；ZFN—锌指核酸酶；TALEN—转录激活因子样效应子核酸酶。使用Biorender创建。 为了实现对HIV的可能治愈，已经采用了四种策略。 第一种方法是干细胞移植，到目前为止已经治愈了六名患者：柏林患者、伦敦患者、纽约患者、“希望之城患者”、杜塞尔多夫患者和日内瓦患者。这些患者接受了造血干细胞移植以治疗恶性肿瘤。除了日内瓦患者外，所有患者都接受了与人类白细胞抗原（HLA）匹配的供体的干细胞移植，这些供体对于CCR5等位基因中的32个碱基对缺失（CCR5∆32）是纯合子。由于治疗的侵袭性、成本、发病率和死亡率，以及缺乏具有CCR5∆32的匹配无关供体，这种方法无法扩大到更广泛的人群，因此作为一种普遍适用的方法是不可行的。 第二种方法旨在从细胞库中移除所有活性潜伏病毒，实现无需ART即可检测到的血浆载量，因此提供一种无菌治愈。这种策略被称为“休克和杀死”方法，并已在早期阶段试验中进行了广泛研究。尽管目前这种治愈方法的形式并未采用基因治疗，但它已被包括在本综述中，以涵盖所有当前的HIV治愈方法。“休克和杀死”旨在使用潜伏期逆转剂激活潜伏病毒库中的病毒，这些逆转剂激活病毒转录，通过使用并行的ART阻止新细胞的感染，然后通过诱导凋亡、CD8+介导的溶解或通过体液免疫反应来根除感染的细胞。嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）细胞也可以被用来增强杀死感染细胞。 第三种策略旨在通过基因编辑根除整合病毒，使用基于核酸酶的工具或工程重组酶。基于核酸酶的工具包括CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列）、TALEN（转录激活因子样效应子核酸酶）和ZFN（锌指核酸酶）。也可以使用这些基于核酸酶的工具针对CCR5，使CD4+细胞对感染产生抵抗力，以及使用短干扰或短发夹RNA（siRNA或shRNA）沉默CCR5。基因编辑也可以通过工程重组酶进行，特别是针对HIV特异性长末端重复序列（LTR）的重组酶酶（TRE）重组酶。这是一种工程形式的Cre重组酶，针对5′LTR内的34个碱基对区域（称为loxLTR），从而在表达这种酶的感染细胞中去除整合的前病毒DNA。 第四种策略是“阻断和锁定”方法，旨在实现功能性治愈，即在不根除潜伏病毒的情况下保持其处于非活动状态，使血浆病毒载量保持在可检测水平以下。这是通过使用潜伏期促进剂永久沉默或编辑潜伏病毒库来实现的，这些潜伏期促进剂通过病毒启动子的抑制性表观遗传修饰“阻断”病毒转录并“锁定”病毒处于潜伏状态。 大多数HIV基因治疗研究使用体外方法。本综述将重点介绍体外基因治疗的各个阶段，并提供当前采用体外或体内基因治疗方法的HIV临床试验的总结。 3.体外基因治疗  在体外基因治疗研究中需要考虑的一个重要因素是将被修改以纠正特定疾病状况或遗传疾病的细胞来源。这些细胞可以是自体的，从患者自身获得，或同种异体的，从匹配的供体获得。自体来源是有利的，因为没有移植物抗宿主病的危险；然而，这可能不适合老年患者或严重疾病状况（例如，HIV，因为细胞可能是新感染的来源）。由于其自我更新和分化成几个谱系的能力，同种异体干细胞来源最近引起了更大的兴趣，尽管它们的使用存在局限性，如排斥、移植物抗宿主病和长期免疫缺陷。在临床前基因治疗研究中，可以从出生组织中获得干细胞，例如脐带血和胎盘。也可以从胚胎组织中获得干细胞，尽管这引发了伦理问题，或从诱导多能干细胞中获得。在临床研究中，可以根据患者的疾病状况从个体患者中获得细胞，或从与患者组织免疫兼容的供体中获得，或从其他细胞来源中获得，这些来源的细胞不太可能引发免疫反应，如由于缺乏或低表达HLA类I和II抗原而具有低免疫原性的胎盘细胞。体外基因治疗的过程包括获得这些感兴趣的细胞，对它们进行修改，并将它们给患者。为了确保修改后的细胞的有效和优先植入，使用各种调节和选择方法。 3.1.造血干细胞的来源 造血干细胞在单基因疾病和免疫系统疾病的基因治疗中很有用。造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）负责产生成人血细胞，并以特定标记为特征（图3）。CD34抗原，一种细胞表面粘附跨膜糖蛋白分子，长期以来一直被用作HSCs的标记，以及其他功能，如增强细胞增殖、阻止分化、改善HSCs和HPCs的迁移以及促进淋巴细胞在淋巴组织中与血管内皮的粘附。这些细胞能够分化成各种谱系的功能性血细胞，并且具有自我更新的能力；即，它们可以在不分化的情况下产生女儿HSCs（图1）。 图3. 造血干细胞发展的层级结构。NK-自然杀伤细胞；DC-树突细胞。使用BioRender.com创建。3.1.1.骨髓来源的造血干细胞 基因治疗应用中常用的造血干细胞(HSCs)来源包括骨髓、脐带血、外周血，以及最近的胎盘。在骨髓中，成骨细胞影响造血的平衡。原始人类成骨细胞对骨髓来源的CD34+ HSCs的存活至关重要，因为成骨细胞恒定地表达粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。同样，HSCs调节成骨细胞分泌IL-6、巨噬细胞炎症蛋白-1α和其他因素，以创造有利于造血的环境。基质衍生因子-1(SDF-1)及其受体C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)是建立骨髓的重要决定因素。Tie2，一种受体酪氨酸激酶，也被发现在维持成年骨髓中的HSCs方面不可或缺。CD34抗原具有多个磷酸化位点，其中有两处是蛋白激酶C的位点，一处是酪氨酸磷酸化位点。 Panch等人的文章总结了从骨髓、外周血和脐带血中采集HSCs的方法。简而言之，从骨髓中采集HSCs通常在全身麻醉下进行，大约每公斤体重收集20 mL，且不超过1.5 L的骨髓抽吸液，从髂后或髂前缘收集。在进行该程序之前，可能会从患者身上采集血液，以便在抽吸过程中失去的血液可以重新注入。 3.1.2.外周血来源的造血干细胞 从外周血采集造血干细胞的过程需要几天时间。早期动员方案使用了细胞毒性药物，如环磷酰胺、伊达比星、依托泊苷、铂类和表柔比星；然而，这些药物的使用现在仅限于接受移植治疗恶性肿瘤的患者。目前，在移植患者中，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）用于将CD34+细胞动员到外周血中，剂量为5-10 mg/kg/天，持续5至7天，目标是通过白细胞去除术采集至少2×106 CD34+细胞/kg体重。在G-CSF给药期间，血液中HSCs的浓度在3天后增加，大约在第5或6天达到峰值，然后在7天后开始下降。G-CSF的剂量由外周白细胞计数决定，外周CD34+计数是HSCs产量的良好预测指标。产量还取决于年龄、性别、基础条件和G-CSF剂量。G-CSF治疗并非没有挑战，患者可能会经历包括骨痛、头痛、疲劳、肌痛在内的副作用，以及在高风险个体中可能出现心肌梗塞和脑缺血。为了增强G-CSF的动员效果，可以使用AMD3100（Plerixafor，一种可逆的CXCR4拮抗剂）。CXCR4是基质衍生因子1（SDF-1）的受体，具有包括使HSC长期维持静止状态在内的多种功能。Plerixafor以240 µg/kg的剂量给药，在白细胞去除术前4至6小时，发现它可以改善CD34+细胞的采集，尤其是与G-CSF联合使用时。其他HSC动员剂目前正在开发中。 3.1.3.脐带血来源的造血干细胞 从脐带采集细胞涉及切断的脐带静脉穿刺，将血液排入含有抗凝剂的无菌袋中。通常，在过程中收集大约80至160 mL的脐带血（UCB）。CD34+细胞的产量范围为2至7×106/mL UCB，可能受到出生顺序（第一胎>第二胎>第三胎等）、出生体重甚至早期夹闭的影响。这种相对较低的产量限制了它们的应用。 3.1.4.胎盘来源的造血干细胞 人类胎盘最近作为干细胞来源而受到欢迎，因为胎盘干细胞抗原性低，没有伦理限制，并且是多能的。人类胎盘是生殖过程中首先发育的器官，有两个组成部分，胎儿部分（羊膜和绒毛膜）和母体部分（蜕膜）。从受精后6-7天出现到足月的胎盘发育已被详细描述。胎盘的作用是为发育中的胎儿提供营养物质并排除废物，具有各种分泌和免疫调节作用。它可以被划分为以下四个区域：羊膜上皮、羊膜间充质、绒毛间充质和绒毛滋养外胚层。胎盘有多种类型的干细胞，可以分化为造血和间充质组织（脂肪生成、软骨生成、成骨、肝脏、胰腺、肌肉、血管生成和神经生成），表达各种细胞标记，包括OCT4、SOX2和c-KIT等，这些标记也存在于胚胎干细胞中。胎盘HSCs缺乏或表达非常低的HLA类I抗原（HLA-A、HLA-B、HLA-C）和没有HLA类II抗原（HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR），这使它们适用于再生医学以及自体和同种异体移植。与骨髓细胞相比，这些细胞的免疫排斥机会较低，对凋亡有抵抗力，具有增强的细胞增殖和伤口愈合特性，并抑制如TGFβ等促纤维化因子。人类胎盘HSCs是胎儿来源（非母体），并且是CD34+和CD45-dim。用AMD3100（Plerixafor）以300 ug/L的浓度灌注人类胎盘，结果在灌注液中采集到的HSCs数量增加了六倍以上，这些细胞具有集落形成特性，缺乏内皮标记。间充质基质细胞是骨髓造血环境的重要组成部分，与HSCs共培养已被发现可以增强HSCs的增殖，特别是原始的CD34+和CD38-。 已使用脐带血和胎盘来源干细胞的混合物进行造血干细胞移植。已开发出各种协议来分离羊膜上皮细胞、间充质基质细胞和造血干细胞。所有协议都必须克服的一个主要障碍是生产大量具有所需细胞群高度纯度的细胞。 3.2.造血干细胞的分离、纯化和富集 为了确保基因校正细胞的优先植入，重要的是要富集具有构建体的细胞群，并对其进行纯化，以避免在培养过程中使用的蛋白质或其他分子的污染。已使用几种方法来富集HSCs。目前最常见的柱分离技术是德国科隆Milteny Biotech的磁激活细胞分选（MACS®）微珠分离技术（https://www.miltenyibiotec.com/ 于2023年6月4日访问）。在这种封闭系统技术中，微珠（超顺磁性氧化铁纳米颗粒）与CD34抗体偶联，用于磁性标记表达CD34+的细胞。将无菌细胞悬浮液装入MACS®（铁磁性）分离柱中，该柱放置在MACS®分离器的磁场中。在正选择技术中，标记的细胞被保留在柱中，而其他细胞则流过。然后可以从柱中洗脱CD34+细胞，一旦它被从由分离器产生的磁场中移除，就可以用于任何下游应用。也有用于分离CD133+细胞群和CD34+和CD38−细胞的微珠。Baldwin及其同事使用免疫磁珠富集CD34+细胞，然后用荧光激活细胞分选（FACS）对其进行分馏，以富集CD34+和CD38−细胞；另一方面，Radtke及其同事使用FACS分离CD34+、CD90+和CD45RA−细胞，发现这组细胞在表型上是HSC基因治疗的最明确目标，因为这些细胞推动了短期和长期的多谱系植入。他们使用GMP（良好生产规范）级流分选协议来分离这些细胞。这大大增加了所需的复杂性、成本和专业知识。在其他体外研究中，Kays及其同事使用MACS对细胞进行排序，这些细胞除了表达CD34+外，还表达CD105，即转化生长因子-β（TGF-β）受体复合体的组成部分，发现这些细胞富集了具有高植入和重聚能力的早期HSCs，即使在慢病毒转导后也是如此。Laje及其同事用信号淋巴细胞激活分子（SLAM）家族受体分子富集了注定要进行慢病毒转导的HSCs，发现这些细胞被有效转导并且与非转导细胞相比是稳定的。 研究表明，培养造血干细胞(HSCs)超过48小时会降低它们长期植入的能力，建议培养时间不应超过36小时，24小时是一个安全的时间段。Chen及其同事的一项研究发现，使用细胞因子（SCF、TPO和Flt3L）进行体外培养会导致线粒体氧化应激，从而导致丧失干细胞特性，并且CD34+/CD133+中的粘附GPCR G1阳性（ADGRG1+）群体可以在体外培养期间的氧化应激下富集功能性HSCs。 还努力减少培养过程中可能的污染源。重组人血清白蛋白（HSA），是从酵母中产生并用作GMP级组织培养基的组分，可能是其他不直接与白蛋白相互作用的蛋白质甚至色素和小分子的污染源。Wilkinson及其同事最近使用体外和体内小鼠模型发现，聚乙烯醇（PVA）可以作为HSA在培养小鼠和人类HSCs中的替代品，因为它支持HSCs的存活和生长，同时保持表型HSCs特征。PVA培养基中分泌因子的浓度较低，衰老相关基因表达较少，尽管PVA用于人类基因治疗的效果还有待评估。 3.3.使用感兴趣基因修饰造血干细胞 在考虑适当的载体进行基因传递时，需要检查要转导的细胞的特性和载体的特性；是否需要短暂或稳定表达基因修饰；以及在传递到组织时可能导致的“脱靶”效应。这些脱靶效应可能包括宿主-免疫反应和载体本身引起的免疫反应。用感兴趣基因修饰目标细胞可能面临各种挑战。例如，腺相关病毒载体由于阻碍核输入、解壳和第二链合成，因此不能有效转导HSCs。用VSV-G包膜伪装的慢病毒载体具有广泛的细胞嗜性，尽管由于缺乏或表达不足的LDLR受体（它通过该受体进入细胞），原始人类静息T细胞和CD34+细胞不能有效转导。另一方面，T细胞的激活提高了转导效率。在体内使用病毒载体进行基因治疗的情况下，对病毒的预先存在的免疫力可能导致基因修饰细胞数量的减少，这反过来又会限制体内重新填充的速率。转导和重新给药基因修饰细胞之间的时间间隔也至关重要，特别是对于可能分化并限制返回目标部位的干细胞。 为了保护它们的基因组结构，真核细胞具有防御机制，导致外来可移动元素或逆转录病毒的沉默，因此存在诱导沉默机制的可能性，这可能由于缺乏表达而使治疗基因失效。 4.通过病毒载体进行HIV基因治疗传递  用于体外基因传递的最常见病毒载体是慢病毒载体，因为它能够转导分裂和不分裂的细胞。最初，γ-逆转录病毒载体被用于基因传递；然而，它们靠近原癌基因整合并引起插入性突变的潜力变得明显。从那时起，已经多次尝试使病毒载体更安全、更有效地进行基因传递。选择病毒载体由要转导的细胞类型、病毒载体特性、感兴趣基因（转基因）的大小和期望的效果决定。下表1总结了不同病毒载体的载货量（插入大小）。 4.1.在HIV基因治疗中使用γ-逆转录病毒载体：并发症和提高安全性的方法 γ-逆转录病毒载体是最早用于有效基因治疗的病毒载体之一。这些载体以依赖细胞周期的方式转导活跃分裂的细胞，因此不转导静止的细胞。逆转录病毒最初是首选的载体，因为它们的使用导致转基因稳定地整合到宿主基因组中。然而，这一好处受到大约10%的患者观察到的一系列基因毒性事件的限制，表现为各种形式的白血病。例如小鼠白血病病毒，γ-逆转录病毒更倾向于靠近强增强子区域、转录起始位点、CpG岛和DNase-I高敏位点整合，并可能在靠近原癌基因时引起插入性突变。这些安全问题导致这些临床试验的暂停，因此，已经尝试提高它们的安全档案。现在已知，在逆转录病毒生命周期中，前整合复合体（PIC）与各种宿主转录因子相互作用，特别是溴结构域和外部末端家族蛋白（BET蛋白）和整合酶，导致整合到宿主基因组中。BET蛋白通过将病毒PIC系在宿主染色质上发挥作用，因此，开发不依赖BET的载体可以改变它们的整合档案。事实上，几个小组已经在细胞系和小鼠模型中证明了这种方法的有效性。另一种方法可能是修改整合酶，使其远离靠近原癌基因的整合。与慢病毒载体相比，创建自失活的RV载体的尝试不太成功，因为它们仍然保留着激活癌基因的能力。 4.2.慢病毒载体用于稳定基因表达：挑战和减轻这些挑战的策略 慢病毒是一类逆转录病毒，除了结构基因env、pol和gag外，还有辅助基因，如vpr、vpu、nef和vif，以及调节基因，如tat和rev。最著名的慢病毒是人类免疫缺陷病毒（HIV）。 工程化的慢病毒被认为是适合基因转移的，因为它们可以稳定地转导分裂和不分裂的细胞。与其他逆转录病毒的不同之处在于，大多数逆转录病毒的PIC需要核膜的破裂（在有丝分裂期间），以便允许进入细胞核，而慢病毒PIC通过核孔蛋白和importins的主动运输进入细胞核。PIC是病毒cDNA的组装，一些来自逆转录复合体的病毒蛋白和宿主细胞蛋白。逆转录后病毒DNA的整合是由整合酶和PIC介导的。一项研究发现，PIC更倾向于靶向靠近核孔的开放染色质区域，排除核内部区域和核纤层的周边区域。核周边的转录活跃基因与核孔复合体（NPC）相关，这影响了HIV-1基因表达。慢病毒更倾向于与积极转录的基因整合，整合模式得到目标细胞转录程序的支持。宿主细胞蛋白，晶状体上皮衍生生长因子（LEDGF/p75）直接与病毒整合酶相互作用，没有它，整合酶无法进入细胞核。现在已知LEDGF/p75将整合酶连接到染色质上。 4.2.1.慢病毒载体的演变 自从作为基因治疗载体被发现以来，慢病毒载体(LVs)经历了几次修改（见图4）。第一代LVs包括转基因构建、包膜构建和一个包含gag、pol和所有调节和辅助基因的包装构建。从HIV env改为VSV-G env或任何其他合适的病毒包膜（称为伪型化），允许有效转导多种细胞，尽管VSV-G导致静息淋巴细胞和HSCs的转导效率低下。第二代LVs包括转基因构建、表达VSV-G的包膜构建，以及包含gag、pol和调节基因tat和rev的包装构建。移除了所有辅助基因。第三代LVs在转基因构建中的病毒启动子中进行了修改，其中U3区域通过删除-418至-18的序列部分进行了修改，仅留下18 bp（移除了400 bp），因此创建了自失活(SIN)载体。因此，5′LTR具有18 bp U3、R和U5区域和一个PolyA尾。这使得载体仍然能够携带转基因盒，同时保持转录不活跃。U3被删除的部分被异源启动子替换，通常是巨细胞病毒（CMV）启动子或细胞启动子，如延伸因子1α（EF1α）。3′ LTR、U3区域也被删除，以防止在转染293T细胞过程中通过同源重组与5′LTR重组成完整病毒。载体构建还包含非编码域cPPT（中央多嘌呤区），这提高了RNA被包装进衣壳的效率，以及WPRE（Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件），这增强了转基因的转录后处理。包装构建被分割成gag-pol构建和rev构建，删除了tat，因为它的转录激活环已从5′LTR中移除。因此，第三代系统由四个质粒构建组成，如图4所示。三个单独的包装构建降低了在质粒扩增和病毒载体生产过程中形成复制能力慢病毒的重组机会，并减少了启动子干扰相关问题的机会。第三代慢病毒构建通过修改携带转基因的质粒进一步重新设计，可以被认为是第四代慢病毒载体。在这个系统中，称为LTR1或PBS1（引物结合位点1），5′LTR已被移除，RNA信号（PBS-Y-RRE）被放置在3′LTR的下游。因此，这些信号在载体生产过程中存在，但在逆转录过程中丢失，并且不与转导的转基因一起复制，从而进一步提高了安全性。 图4. 慢病毒载体生成的进步。第一代构建包括转基因构建、伪型包膜（通常是VSV-G）和包含gag、pol和所有调节及辅助基因的包装构建。第二代载体与第一代载体类似，只是去除了辅助基因。第三代载体是自失活慢病毒载体，在U3区域有400 bp的缺失。第四代慢病毒载体去除了5' LTR，并将RNA信号(PBS-Y-RRE)放置在3' LTR的下游。RRE：Rev反应元件；PM：细胞来源或其他启动子；cPPT：中央多嘌呤区；VSV-G：泡状口炎病毒G型；WPRE：Woodchuck肝炎病毒转录后调控元件；Y：包装信号。Ch5'：嵌合5' LTR；PAS：引物激活信号。 4.2.2.优化慢病毒转导 有效的慢病毒转导人类细胞可能受到人类细胞产生的限制因子的限制，这些限制因子限制了慢病毒感染，如三部分基序蛋白5α(TRIM5α)、tetherin和载脂蛋白B信使RNA编辑酶催化多肽样3(APOBEC3)。其中一个被证明导致慢病毒基因传递到静息记忆T细胞效率低下的因素是限制因子SAMHD1（含α motif和组氨酸-天冬氨酸(HD)结构域蛋白1）。SAMHD1是一种细胞脱氧核苷酸三磷酸水解酶，阻止逆转录。HIV-2编码的vpx基因被发现可以抵消SAMHD1的限制能力。事实上，一项研究发现vpx在他们测试的所有条件下都增加了基因治疗传递，但当基因治疗针对逆转录前的步骤时效果最大。 优化体外培养条件是提高基因转移速率的有用方法。使用Polybrene、鱼精蛋白硫酸盐、Retronectin、热带增敏受体增强子、如Lenti-X accelerator的磁珠、Vectofusin-1、LentiBOOST和Staurosporine等试剂已被发现可以增强转导过程。使用胎牛血清(FBS)在用慢病毒载体转导CD34细胞时并不令人满意，因为它导致祖细胞的转导增加，但HSCs的转导减少。此外，由于对其异种成分产生抗体，存在免疫风险的担忧。已经开发了各种无血清培养基，适用于不同类型干细胞的转导，例如，加拿大温哥华干细胞技术公司的StemSpan无血清扩增培养基(SFEM)。将敲除血清替代品(KSR)培养基添加到StemSpan培养基中，已被发现可以提高原代CD34+细胞和外周血单个核细胞(PBMCs)的转导效率。 4.2.3.慢病毒载体沉默 像γ-逆转录病毒载体一样，尽管程度较轻，慢病毒载体也容易受到转基因沉默和转基因效率变异的影响，这是由于转基因与宿主基因组（染色体位置效应）中其直接基因组邻域的相互作用。一些宿主和载体特征被假设可以引起这种效应，包括DNA甲基化和组蛋白修饰，包括由多梳家族蛋白介导的修饰。可以隔离转基因免受沉默的策略包括使用更强的增强子启动子、脚手架/基质附着区域(S/MARS)，这些可以保护增强子免受DNA甲基化，和染色质域隔离子，这些可以抑制抑制性位置效应。 4.2.4.减少插入性突变的策略 已经尝试了各种方法来减少插入性突变的机会。一种策略是将整合导向远离原癌基因的“安全基因组港湾位点”。Schenkwein等人使用I-PpoI，一种来自黏菌Physarum polycephalum的二聚体18-20 KDa同源性内切核酸酶，将整合导向一个高度保守的位点，28S核糖体RNA。这是通过识别该区域的15 bp位点来实现的。另一种策略是通过改变整合酶核心结构域(D64、D116和E152)的催化三联体来生产非整合慢病毒载体。虽然消除了插入性突变的风险，但这些载体只能用于瞬时基因表达。基因表达也低于整合慢病毒载体。修改LEDGF/p75的功能，其功能是指导慢病毒整合，可以允许整合到更安全的区域或更随机的整合，从而减少靠近原癌基因的整合机会。 4.3.腺相关病毒载体(AAVs)：限制其使用的挑战 重组腺相关病毒是在临床应用中首选的载体，当需要短暂表达转基因（根据感染细胞的周转时间，从几个月到几年不等）时。这些载体不含病毒DNA，而是基于蛋白质的纳米颗粒，被设计为穿越细胞膜并将DNA送入细胞核。这些载体非常稳定，能够承受操作过程中出现的物理或化学挑战。病毒基因组也容易操纵，并且具有良好的安全档案。AAVs可以携带高达4.5 kb的转基因盒。然而，AAVs的主要挑战是它们在自然界中广泛存在，因此抗AAV免疫很高，12种已知血清型的中和抗体的流行率在某些人群中从20%到100%不等。这些载体的给药也可能引发治疗后的体液反应。正在应用各种策略来克服衣壳免疫、补体固定和AAV基因组感知。一种策略是通过合理设计、随机突变和衣壳重组来工程化衣壳，以防止衣壳中和。另一种策略是免疫抑制，即阻断涉及B细胞激活的经典途径，从而抑制体液反应，尽管体外基因治疗的体液反应可能有限。为了减少AAV基因组感知，可以通过耗尽载体基因组中的CpG二核苷酸来阻止TLR信号传导。腺相关载体可以用来转导多种细胞，包括间充质基质细胞、神经细胞等，尽管它们不适合造血细胞。 许多研究小组正在研究使用AAVs将广泛中和抗体送入骨骼肌，以提供针对HIV的持久效果，无论是作为预防还是治疗，或两者兼有。最近一篇综述文章分析了它们在HIV感染中的使用，以及当前挑战和可以采用的策略来克服其有效性的障碍。 4.4.体外细胞选择和扩增 根据转导的细胞类型、载体类型、感染倍增性(MOI)和使用的转导技术，转导的细胞数量通常低于理论上的预期。因此，转导过程不是100%有效。然而，有几种方法可以最大化转导效率。除了第4.2.2节中提供的例子外，使用高MOI可以产生更高的载体拷贝数(VCN)，尽管这增加了异常剪接事件的风险。通过色谱法纯化载体颗粒也可以增加转导效率。转导后，选择携带转基因的细胞并扩增这些细胞以增强它们在体内的植入是有益的。这可以通过细胞表面标记或设计载体表达抗生素抗性基因来实现，然后在应用适当的抗生素时，将允许优先选择携带转基因的细胞。 转导HSC的扩增目标是在保留“干细胞特性”的同时增加数量。通常支持分化为成熟谱系的传统培养基导致自我更新能力的丧失。体外基因治疗的体液反应可能有限。为了限制污染的可能性，最好使用无血清培养基进行HSC扩增。Tajer等人最近的文章总结了添加到培养基中以增强扩增的因素。已经使用了几种细胞因子和生长因子，包括SCF、FLt3配体、TPO（血小板生成素）、IL-3和IL-6，尽管由于IL-3刺激祖细胞的扩增而不是HSCs，它并不包括在某些培养基中。还发现其他化合物也很有用。这些包括前列腺素E2 (PGE2)，它通过改善HSCs的归巢和自我更新能力来增强HSCs的植入，和Stem Regenin 1 (SR1)，一种芳香烃受体拮抗剂，用于扩增人类和小鼠CD34+，尽管它也被发现更有利于多能祖细胞而不是长期重聚干细胞。这与UM171形成对比，UM171是一种嘧啶哌啶衍生物，它支持干细胞的扩增而不是多能祖细胞。因此，它们可以组合使用，以促进两种谱系的扩增。其他使用小鼠模型的研究表明，可以调节调节干细胞归巢和分化的信号通路。这些包括Notch信号通路、Homeobox基因、Wnt等。锌指转录因子Sall4的过表达导致HSCs（CD34+细胞）在体外和小鼠模型中迅速有效扩增（增加50倍）。 5.基因修饰造血干细胞的给药：增强基因修饰细胞的优先植入  HSC输注后造血重建的第一阶段（最多6个月）是由于承诺的祖细胞（短期HSCs），它们具有有限的自我更新能力。大约6个月后，CD34+克隆减少，第一波克隆重建耗尽，长期HSC逐渐接管重建，它们能够自我更新，其效果甚至在基因治疗后3年仍然存在。因此，短期HSC在早期阶段活跃，而长期HSC在这一阶段进入静止状态，并在短期HSC耗尽时激活。 5.1.清空造血干细胞壁龛的调理方案 在用于造血障碍的自体基因治疗中，目标是用宿主细胞替代有特定遗传缺陷的细胞。在HIV基因治疗中，目标是用有抗性的细胞替代易感染的细胞，或能够对抗病毒的细胞。干细胞壁龛允许维持干细胞并调节其功能；HSC壁龛位于骨髓和脾脏的血管周围。清除用于转导HSCs吸收和消除未转导细胞的壁龛的过程，也称为调理，传统上一直使用化疗和放疗进行，这对目标器官没有特异性。进行调理是为了耗尽壁龛中的造血干和祖细胞，以减少同种异体移植的免疫排斥机会，在恶性疾病的病例中治疗任何恶性肿瘤。调理方案可以分为清髓性调理（MAC）、非清髓性调理（NMA）和减低强度调理（RIC）。清髓性方案由烷化剂组成，有或没有全身照射（TBI），导致全血细胞减少症和1-3周内造血耗尽，不允许自体血液学恢复。因此，为了生存，需要干细胞支持。MAC方案与毒性有关，有时甚至死亡，特别是如果植入出现问题。毒性迹象包括器官衰竭、粘膜炎、骨髓抑制、继发性恶性肿瘤、肌肉骨骼疾病和心脏、肺、生殖和内分泌异常。接受MAC治疗的人群的长期死亡率也高于普通人群。 由于这些不希望的副作用，开发了较低强度的方案。较低的强度意味着可逆的骨髓毒性，与MAC诱导的不可逆骨髓毒性相比。这些方案是NMA和RIC。非清髓性方案引起最小的细胞减少症，不需要干细胞支持。另一方面，减量调理涉及将MAC方案的剂量至少减少30%，虽然它不会导致干细胞的消融，但仍然需要干细胞支持才能在临床上实用。这些调理方案的细节已经回顾过。尽管RIC毒性较小，但发现它对基因治疗的效率较低，因为它导致外周血细胞中基因标记较少，这可能是由于壁龛清除效率低下或对转基因的免疫耐受性诱导不充分。在基因治疗中，辐射或化疗药物的剂量由正在治疗的疾病状况和患者特征决定，包括年龄和性别。欧洲骨髓移植组（EMBT）风险评分是一个用于评估癌症患者移植风险的工具，也可以扩展到任何需要移植的患者。它基于五个因素：患者年龄、疾病阶段、诊断到移植的时间间隔、供体类型（就HLA分型而言）和供体-受体性别组合。通常，30岁以后使用MAC方案死亡率增加，50岁以后不推荐使用。如果供体和受体不是同一性别，也有更高的排斥风险。 5.2.基因修正造血干细胞的体内选择 为了改进携带转基因细胞的选择，在动物模型的体内研究中采用了体内化学选择技术。使用药物抗性基因进行体内选择转基因需要药物抗性基因在转导细胞中高度表达，在非转导HSCs中根本不表达或表达水平低；选择药物应该耗尽大多数非转导细胞，对非造血毒性很小，并且在非恶性条件下不具有遗传毒性。在动物模型中用于选择的基因，特别是在小鼠中，包括多药抗性基因(MDR1)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、乙醛脱氢酶(ALDH)、胞嘧啶脱氨酶(CDD)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)。 一项研究使用了O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)的突变体，这是一种DNA烷基化修复酶。突变体MGMTP140K在非人灵长类动物中显示出稳定和有效的HSCs选择，尽管使用(Carmustine-BCNU，例如)的烷基化剂的致癌性质是一个缺点。另一项研究使用短发夹RNA(shRNA)敲除次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，在这些小鼠模型暴露于6-硫鸟嘌呤(6 TG)时实现HSCs的选择。使用这种方法很有吸引力，因为它允许转导的HSCs自我更新、增殖和分化，该方法用于清除壁龛并使携带转基因的细胞优先植入。诱导药物抗性的shRNA仅长48 bp，用于化学选择的6 TG量低，尽管6 TG可能诱发白血性。该组使用MOI为1，在两轮连续病毒暴露后，未用生长因子预刺激以保持“干细胞特性”，实现了20-30%的慢病毒转导效率。 5.3.清除壁龛的最新发展 提高壁龛清除和促进转导细胞植入的最新发展是使用与能够清除壁龛的药物结合的单克隆抗体。这些方法允许针对性地清除HSC壁龛，因此减少了上述调理方案非特异性相关的副作用，并使携带转基因的细胞优先植入。例如，为了改进HSCs的选择，最初的小鼠研究使用了CD45-抗体药物偶联物(CD45-ADCs)，但很快意识到这些对HSCs并不特定，并导致淋巴细胞耗尽，因为CD45也存在于淋巴细胞和其他白细胞表面。使用CD117-抗体药物偶联物(CD117-ADC)，可以更具体地针对HSCs，在小鼠模型中使内源性HSCs耗尽超过99%。2019年报道这种技术效果的第一组使用链霉亲和素连接子将CD117与毒蛋白连接起来，并测试了其对NOD SCID Gamma(NSG)小鼠和非人灵长类动物的效果。另一组使用了抗人CD117 IgG1单克隆抗体偶联物AMG 191，发现其在非人灵长类动物中有效，目前正在进行1/2期临床试验。另一组将CD117+与鹅膏毒素(MGTA-117)偶联，发现其在患有急性髓细胞性白血病(AML)的小鼠模型中非常有效（耗尽了超过95%的HSPCs）。CD117在AML细胞中高度表达，这种方案被发现可以减少这些小鼠的肿瘤负担。 6.基于体外HIV基因治疗的临床试验  如前所述，HIV的基因治疗努力集中在使免疫系统更擅长履行其功能，或旨在沉默或编辑整合的原病毒，使其复制能力不足或使细胞对感染有抵抗力。已经进行了几项临床试验，旨在检查HIV基因和细胞治疗产品的效用和安全性。 6.1.基于细胞治疗的HIV临床试验 最早的细胞治疗研究之一创建了嵌合T细胞受体：CD4-Zeta基因修饰T细胞。这项早期临床研究（NCT01013415）的结果发现，尽管病毒库在各组之间没有差异，但在接受了基因修饰细胞的组中，HIV负担从基线有所下降，并且复发性病毒血症的患者趋势减少。AGT103-T是一种产品，可以恢复慢性HIV病患者的gag特异性CD4+ T细胞反应。最初的1期临床试验结果（NCT03215004）显示了一些有希望的结果。对参加研究的患者进行了白细胞去除术。一旦细胞被基因修饰并通过了质量控制测试，患者在基因治疗产品输注前一周用环磷酰胺进行了非清髓性调理，剂量为1 g/m2。AGT103-T修饰细胞以每公斤体重2到2100万细胞的剂量输注。即使在基因治疗产品输注后6个月，也可以观察到细胞的基因标记。没有记录到严重不良事件。 SB-728是一种锌指核酸酶(ZFN)介导的，CCR5修饰的，自体CD4+ T细胞产品。这项研究的各种版本发现，即使在重复剂量给药后，也没有发现严重不良事件。当使用环磷酰胺进行调理时，植入效果更好。其中一项研究发现，尽管病毒反弹有延迟，并且CD8+ T细胞反应改善了6个月以上，但对潜伏病毒库没有长期影响。另一项研究，NCT03617198，将CAR-T细胞治疗与ZFN CCR5修饰相结合，作为一种双重治疗方法，确保CD4+细胞对感染有抵抗力，并且同时能够检测和清除HIV感染的细胞。最后，NCT04648046使用了编码双特异性抗gp120 CAR分子的慢病毒载体(LVgp120duoCAR-T)来针对表达HIV gp-120的细胞。 6.2.基于通过逆转录病毒载体进行基因传递的临床试验 早期直接针对HIV的研究使用了逆转录病毒载体来传递抗HIV基因。在一项研究中，使用了同种基因T细胞（来自同卵双胞胎），使用逆转录病毒载体传递了细菌基因NeoR（NCT00001353）。这项研究的目的是证明，通过基因转导的同种基因细胞实际上可以通过成熟细胞的分裂，而不是前胸腺干细胞的分裂，持续数周至数月。在涉及双胞胎的一项研究中（NCT00001535），从血清阴性的双胞胎中获得了同种基因CD4+淋巴细胞，并用携带反义TAR或反义Tat/Rev RNA，反式优势Rev蛋白或两者结合的逆转录病毒载体转导。临床前研究表明，所有使用的抗HIV载体都抑制了HIV，反式优势Rev蛋白显示出更大的抑制作用。尚未发布临床试验的结果。涉及双胞胎的所有研究的长期随访（Gemini Study—NCT04799483）目前正在进行中。另一项使用逆转录病毒载体的研究，NCT00002221，从计划进行自体骨髓移植的非霍奇金淋巴瘤HIV阳性患者中获得了外周血CD34+细胞，并将这些细胞分成三个池。一个细胞池用含有两个核糖酶序列“L-TR/Tat-neo”的逆转录病毒载体转导，第二个池用对照载体‘LN’转导，第三个池保持未修饰细胞。然后将这些细胞重新输注回患者体内。尚未发布这项研究的结果。除了逆转录病毒载体观察到的插入性突变风险外，这项后续研究的成功也可能因携带治疗基因的细胞比例低而受到阻碍。 RevM10是HIV-1 Rev基因的优势负性突变体。使用逆转录病毒载体将这个基因转导入CD4+ T细胞，结果抑制了HIV复制，并持续了6个月。尚未发布在造血干细胞中研究RevM10的结果（NCT00003942）。逆转录病毒载体也用于传递MazF，一种Tat依赖性内切核酸酶基因，在1期研究中评估其安全性、耐受性和免疫原性。MazF源自大肠杆菌，选择性地切割mRNA中的ACA序列，这些序列在HIV中很常见。这项研究发现，单次静脉注射用MazF转导的自体CD4+ T细胞导致CD4+和CD8+细胞增加，这种效果至少持续了6个月。 核酸酶是催化RNA分子，可以针对任何具有NUX切割位点的RNA序列，其中N是任何核苷酸，X是A、C或U中的任何一个。在一项概念验证的1期研究中，Rz2，一种针对tat基因起始密码子附近GUA序列的核酸酶，通过逆转录病毒载体传递到同种基因外周血单个核细胞(PBMCs)中，这些细胞是从血清阴性双胞胎的基因修饰细胞中获得的，然后输注到血清阳性双胞胎体内。共有4名患者参加了这项研究，该研究表明基因标记细胞的持续存在，无论是短期（24周）还是长期（44个月），在此期间没有观察到严重副作用。在一项相关的2期基因治疗试验中，通过逆转录病毒载体将一种抗HIV核酸酶转导到自体CD34+细胞中，患者接受了tat–vpr–特异性抗HIV核酸酶（OZ1）或安慰剂。没有与OZ1相关的不良事件。尽管在主要终点（大约48周）时OZ1和安慰剂组之间的病毒载量没有统计学上的显著差异，但在40周时观察到了显著差异，并且直到100周，OZ1组的CD4+ T细胞高于安慰剂组。在长期随访研究中，NCT01177059，最初入组的68人中有18人完成了研究，其中7人有严重不良事件，包括各种类型的肿瘤（例如，基底细胞癌、霍奇金病、卡波西肉瘤、乳头状甲状腺癌、皮肤癌），这些最有可能是由逆转录病毒载体引起的。 6.3.基于慢病毒载体的HIV研究 在VRX496（Lexgenleucel-T）研究中，使用携带针对HIV包膜的抗HIV反义基因的基于HIV的慢病毒载体修饰自体T细胞。安全性和耐受性研究，NCT00295477，发现血液中的植入半衰期为5周。一些患者的基因标记细胞甚至在5年后还存在。这项研究表明，基因修饰细胞可以对HIV施加遗传压力。 另一项使用慢病毒载体传递抗HIV基因的研究结合了针对CCR5的短发夹RNA（shRNA），它阻止病毒进入，人/恒河猴嵌合TRIM5α，一种在进入细胞质时破坏病毒衣壳解壳的天然分子，因此抑制HIV感染，以及转录激活反应（TAR）诱饵，它通过结合病毒Tat并将其隔离，因此阻止其介导前病毒DNA的有效转录。这项临床试验的结果尚未发布。 在一组研究中，接受自体移植治疗淋巴瘤的患者被输注了用含有tat-rev shRNA、TAR诱饵和CCR5核糖酶（LV Rhiv7-shITAR-CCR5RZ）的慢病毒构建体修饰的CD34+造血干细胞。四名患者的早期结果表明，基因修饰细胞在输注后第11天植入，并且即使在24个月时，载体仍然存在，并且在病毒血症后选择基因修饰细胞。尚未发布各个研究的结果。 Cal-1是一种双重抗HIV基因转移慢病毒构建体，它传递一种沉默CCR5的shRNA（sh5），并在不同的启动子下，编码一种小肽抑制剂的序列，这种抑制剂可以防止HIV包膜与宿主CD4+细胞的融合（C46）。已在不同地点对Cal-1进行了几项研究。在NCT01734850中，对13名患者进行了Cal-1治疗，并评估了该治疗的安全性。Cal-1的临床前研究表明，该治疗有效且安全。在临床试验中，使用白消安调理来清除壁龛，以允许基因修饰细胞的植入。在两个接受白消安调理的治疗组中观察到严重和危及生命的不良事件，与单剂量白消安相比，双剂量白消安的副作用更严重。未接受调理的组没有严重不良事件。患者目前正在进行长期随访研究（NCT02390297）。与调理相关的毒性是成功传递基因治疗的常见挑战，因此开发更安全、更有效的方法来清除壁龛，以实现成功和稳定的植入是值得的。 这些临床研究表明，在实现足够植入的足够清除壁龛、使基因修饰细胞的生产和由于调理导致的骨髓毒性之间存在微妙的平衡。 为了帮助推进HIV治愈方法的临床前研究，例如使用si/shRNA的“阻断和锁定”方法的研究报告，解决这些挑战至关重要。这组临床前小鼠研究已经报告了通过si/shRNA成功沉默HIV，尤其是shPromA，它针对病毒启动子中的串联NF-KB转录因子位点，以诱导下游病毒基因表达的转录基因沉默和抑制性表观遗传修饰（见图2）。结合含有CCR5 shRNA的Cal-1载体，目前正在研究针对启动子的si/shRNA PromA，以开发针对宿主CCR5和病毒启动子靶标的组合HIV基因治疗。 7.基于体内传递的HIV基因治疗临床试验  采用体内方法治疗HIV的研究主要处于临床前阶段。体内方法涉及直接将基因治疗产品通过病毒载体（如腺病毒载体、腺相关病毒载体或非整合慢病毒载体）或非病毒方法（如纳米粒子）引入患者体内。体内方法可能无法提供持久的治愈，因为没有转基因与宿主遗传物质的稳定整合，并且需要优化特定细胞的传递，以减少脱靶效应的机会。通过重组酶或核酸酶系统的基因编辑，或使用RNA干扰或可能的CRISPR干扰的沉默机制，可以使用体内方法。 目前的临床试验包括使用leronlimab的研究，leronlimab是一种抗CCR5人源化IgG4抗体，通过与CCR5相同的附着位点（细胞外环2和N-末端结构域）结合，竞争性地抑制HIV env附着到CCR5。这种药物通过皮下给药，该组目前正在使用合成AAV载体进行传递。这项研究的几个版本—NCT00642707、NCT02175680、NCT02355184、NCT02483078、NCT02990858、NCT03902522、NCT02859961和NCT05271370—证明了产品的安全性和有效性，患者大多经历了轻微的副作用，并且在较高剂量的525 mg和700 mg时观察到效果。 CRISPR-Cas9技术用于HIV治愈 CRISPR及其CRISPR相关核酸酶9（Cas9）系统是一种基因编辑系统，通过导向RNA介导的基因组区域的双链断裂，然后通过非同源末端连接途径进行修复。最近发表了几篇描述HIV临床前研究的综述文章[222,223]。最近使用CRISPR-Cas9治疗HIV的临床试验是NCT03164135，该试验使用这项技术在进行异体干细胞移植治疗血液恶性肿瘤的患者中敲除HSCs中的CCR5基因。一名急性淋巴细胞性白血病患者的初步结果显示，完全供体嵌合体的缓解，并且敲除CCR5的供体细胞持续了19个月，没有基因编辑不良事件。然而，携带修改的淋巴细胞的百分比仅为5%，团队正在研究如何使过程更有效。另一种基于CRISPR-Cas9的HIV基因治疗产品是EBT-101（NCT05144386）。这种基因治疗作为单次静脉注射给药，并通过使用两个导向RNA靶向整合原病毒的三个位置的AAV传递。最近有三名患者参加了1期临床试验，该公司（Excision Bio Therapeutics, San Francisco, CA, USA）在2023年10月的欧洲基因和细胞治疗年会上提出的初步结果显示，没有剂量限制毒性或严重不良事件。 CRISPR-Cas 9可以用来靶向HIV-5′LTR，这是启动子区域，因此可以阻止潜伏病毒的复制或激活；CCR5或CXCR4区域，使细胞对感染有抵抗力；或促进HIV复制的限制因子，阻断它们的活性。虽然目前还没有CRISPR-Cas9基因治疗被批准作为HIV治愈方法，但FDA最近批准了第一种用于镰状细胞病的基于CRISPR-Cas9的细胞基因治疗方法，Casgevy（https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-first-gene-therapies-treat-patients-sickle-cell-disease, 访问日期为2024年1月27日），突显了基因治疗的创新进步和CRISPR-Cas9作为HIV治愈方法的潜力。 8.结论  长期或永久表达抗HIV基因和修改CD4+和CD34+细胞以使它们对感染有抵抗力或允许破坏HIV生命周期是实现HIV治愈的重要策略。尽管联合抗逆转录病毒治疗的出现大大改善了患者的治疗结果和HIV感染者的生活质量，但治愈是可取的，特别是对于已经对当前方案产生耐药性的患者。至少提供功能性治愈的产品可能需要多重治疗剂与不同作用模式的组合，以最小化耐药性的机会，并且是长效的，或理想情况下需要单次给药。因此，至关重要的是要利用当前生物技术的进步来增强基因治疗方法，并使基因治疗产品更安全、更经济、更持久。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

用于基因治疗应用的临床级慢病毒载体（LV）的大规模生产仍然是一个挑战。贴壁细胞系和瞬时转染等方法的使用成本高昂，并且阻碍了工艺的可放大性和重现性。本研究描述了使用两种适应悬浮培养的稳定包装细胞系（称为 GPRG 和 GPRTG）来开发可放大的无血清 LV 生产工艺。两种稳定包装细胞系均基于诱导型 Tet-off 系统，因此需要去除强力霉素才能启动病毒生产。因此，我们比较了强力霉素去除的不同方法并接种了三个独立的 5L 生物反应器，并比较了稀释、声学细胞清洗器和手动离心的可放大诱导方法。生物反应器接种了稳定的生产细胞系，该细胞系编码携带临床相关基因的 LV。使用基于声波分离的细胞截留装置以灌流模式进行LV生产。所有三种方法均获得了可比的细胞特异性生产率，并且在 234 小时长的过程中每个生物反应器产生了高达 6.36 × 10^11 转导单元的累积功能产量，证明了稳定Tet-off 细胞系对于易于放大的悬浮工艺的可用性。值得注意的是，在高细胞密度下，细胞活性保持在 >90%，而不会影响整个过程的生产率，从而可以进一步延长工艺时间。鉴于其在病毒生产过程中的毒性影响较低，所提出的细胞系是开发完全连续的慢病毒生产工艺、以克服慢病毒生产中现有的瓶颈的绝佳候选细胞。简介慢病毒载体（LV）作为细胞和基因治疗中基因递送的工具很受欢迎，因为它们能够稳定地整合到分裂和非分裂细胞的宿主细胞基因组中，从而导致转基因的长期表达。安全性和有效性方面的持续改进使得针对淋巴瘤、镰状细胞病或 Wiskott-Aldrich 综合征等几种罕见和获得性疾病的临床试验获得批准。临床试验数量的不断增加以及慢病毒的商业用途增加了对高质量载体的需求，从而增加了对可重复的大规模生产工艺的需求。LV上游工艺中现有的瓶颈主要是由于常用的表达系统和载体稳定性较低。LV 的传统生产方法是用三到四个携带转基因、包装和辅助基因的质粒瞬时转染贴壁 HEK293 或 HEK293T 细胞。基于瞬时转染的生产工艺可以快速生产 LV，但容易出现批次间差异且难以扩大规模。此外，需要大量 GMP 级质粒，导致生产成本高昂，并且在下游工艺过程中需要去除残留物。为了克服瞬时转染的挑战，开发了稳定的包装和生产细胞系。由于广泛使用的水疱性口炎病毒 (VSV-G) 的囊膜糖蛋白表现出细胞毒性作用，其表达通常由诱导型表达系统控制，从而允许细胞扩增在开始病毒生产之前达到所需的规模。常用的是四环素诱导表达系统，存在两种不同的变体。首先是 Tet-off 系统，其中转录在四环素或多西环素存在下被抑制，其次是 Tet-on 系统，其中转录在四环素或多西环素存在下被激活。近二十年来，开发了几种稳定的包装和生产细胞系，主要基于 Tet-off 系统。一个例子是 Throm 等人开发的表征良好的稳定包装细胞系 GPRG 和 GPRTG，用于生成表达临床相关载体的几种稳定的生产细胞系。贴壁细胞系是通过使用γ-逆转录病毒载体（SIN-MLV）连续转导HEK293T细胞而建立的，携带病毒生产所需的遗传元件。gag-pol 构建体整合后，元件 rTA、rev 和 VSV-G 独立整合到细胞系中。与 GPRG 细胞系相比，GPRTG 细胞系额外整合了 tat 元件，并针对引入元件的表达水平进行了进一步优化。rev、VSV-G 和 tat 的表达受四环素控制的启动子 (p7tetO) 调节，因此可通过补充强力霉素来抑制。生产细胞系的产生是通过串联阵列的稳定转染来进行的，串联阵列是通过以1:25的摩尔比体外连接编码选择抗生素抗性的质粒和携带治疗基因盒的pTL20c载体而产生的，并且从而实现 SIN 载体基因组的高拷贝数整合。整合多西环素调节的载体基因组RNA表达盒后，两种细胞系在诱导后均能够产生高于1 × 10^7 TU/mL的功能载体浓度，从而克服了瞬时转染的局限性。尽管文章描述了这些细胞系的潜在可放大生产方法，例如使用固定床生物反应器 iCELLis®，但血清依赖性和贴壁细胞特性是不利的。使用血清生产病毒载体的成本昂贵，存在被外来因子污染的风险，增加批次之间的可变性，并可能使后续下游工艺复杂化。此外，与使用悬浮细胞系相比，使用贴壁细胞系的工艺更难以扩大规模并且提供的工艺灵活性较低。为了解决这些限制，在本文中，我们介绍了使用悬浮驯化的 GPRGs 和 GPRTGs 细胞系进行无血清 LV 生产。已经使用 Tet-on 系统描述了一些基于 HEK293 或 HEK293T 细胞系的悬浮驯化稳定生产细胞系，因为添加多西环素进行诱导可以很容易地以任何所需的规模进行。相比之下，大规模诱导基于 Tet-off 的悬浮细胞是一个重大挑战，因为需要减少上清液中的强力霉素。因此，我们首先开发了一种基于摇瓶稀释的诱导方法，以展示无需额外技术设备即可大规模诱导的一般可行性。为了解决功能载体滴度随着基因组大小的增加而降低的事实，我们打算使用 WAS-T2A-GFP 构建体作为转基因来表达临床相关的 Wiskott-Aldrich 综合征蛋白（WASp），但受益于绿色荧光蛋白（GFP）作为选择性标记，以促进感染滴度测定。WAS 是一种罕见的 X 连锁原发性免疫缺陷病，由编码 WASp 的 WAS 基因突变引起，该病已在慢病毒基因治疗试验中得到治疗，并取得了积极成果。T2A 序列源自 Thatsasigna 病毒 2A，其翻译会产生由核糖体跳跃介导的自切割肽。在比较不同的无血清培养基和补料添加对细胞生长和功能性载体生产的影响后，使用性能最佳的培养基组合物来研究所开发的稀释方法在 5 L 生物反应器规模下的可用性。该方法的效率与使用基于声波分离的细胞清洗器以及通过离心手动去除多西环素的诱导进行了比较。由于 LV 在生理温度下表现出较低的稳定性并且可能会因生产细胞的自转导而丢失，因此我们实施了灌流工艺，以提高载体产量并延长工艺长度。详细实验操作和结果，请参考原文。图4. 使用 GPRTGs-WAS-T2A-GFP 生产细胞系和 TransFx-H + CB5 培养基在摇瓶中批次模式和半灌流模式下病毒生产的比较。对于半灌流模式的生产，从 48 hpi 开始每天进行全体积培养基置换。数据是在每种条件下使用三个独立的摇瓶生成的。hpi，诱导后的小时数；VCD， 活细胞密度；（a-d 的值显示为平均值±SD）。(a) 用于比较 216 小时批次和半灌流模式生产的 VCD。(b) 216小时内批次和半灌流模式生产的可行性比较。(c) 用于比较 216 小时批次和半灌流模式生产的每日感染滴度。(d) 半灌流模式下 120 小时批次生产和 216 小时生产的时空产量。对于批次生产，由于 120 hpi 时感染滴度最高，因此计算了 120 小时工艺的时空产率。图5. 基本生物反应器设置示意图。带三角形的圆圈表示蠕动泵。细胞截留装置 (Biosep) 基于声波分离，位于顶板上，无细胞收获液被泵出。连续的培养基添加通过重量或使用液位传感器来调节。在达到约 1.5××10^7 cells/mL 的活细胞密度后进行细胞废弃。图6. 使用 GPRTGs-WAS-T2A-GFP 生产细胞系和 TransFx-H + CB5 + AC 培养基在 5 L 生物反应器规模上比较三种不同的诱导方法。首先在添加有 1.0ng/mL 多西环素的 N-1 灌流种子培养生物反应器中扩增细胞（“N-1 Perfusion”）。种子培养用于接种三个 5 L 灌流生物反应器：1. 直接接种，无需更换培养基（“稀释”），2. 使用声学细胞清洗器（“APW-10”）或 3. 通过离心含有多西环素的上清液之后。接种摇瓶卫星作为对照。数据是根据条件使用单个生物反应器或摇瓶生成的。VCD，活细胞密度。(a) N-1 灌流种子培养生物反应器、生产生物反应器和摇瓶中的 VCD。(b) N-1 灌流种子培养生物反应器、生产生物反应器和摇瓶中的细胞活性。(c) 生产生物反应器和摇瓶中的葡萄糖浓度。(d) 生产生物反应器和摇瓶中的乳酸浓度。(e) 采样后使用外部 pH 计测定生产生物反应器中的 pH 值。(f) 生产生物反应器和摇瓶中的每日感染滴度。(g) 根据平均 VCD 计算的每日细胞特异性生产率。(h) 通过收集接种不同诱导策略的每个 5 L 生产生物反应器的所有收获液获得的总病毒产量。图7. 使用 GPRTGs-WAS-T2A-GFP 生产细胞系在接种带声学细胞清洗器 (APW-10) 的 5 L 生物反应器中研究长达 330 hpi 的延长病毒生产。所示数据是图 6 中所示 APW-10 生产生物反应器的延续。数据是使用单个生物反应器生成的。hpi，诱导后的小时数；VCD，活细胞密度。(a) VCD 和细胞活性的数据。(b) 感染滴度和细胞特异性生产力。根据平均 VCD 计算细胞特异性生产率。讨论由于传统生产方法，用于商业和临床用途的 LV 的可放大生产仍然是一个障碍，因此人们开始转向使用适应悬浮培养的稳定生产细胞系，以克服可放大性、再现性和工艺成本的限制。使用悬浮驯化稳定生产细胞系的诱导生产系统通常基于 Tet-on 系统，因为可以通过按所需规模添加诱导剂进行直接诱导。然而，基于 Tet-off 系统开发了几种稳定的细胞系，需要去除多西环素才能启动 LV 生产。虽然在贴壁细胞的情况下，当细胞附着在表面上时，可以很容易地去除含有多西环素的培养基进行诱导，但大规模基于 Tet-off 系统的稳定悬浮细胞系的诱导仍然是一个挑战。在这项研究中，我们提出了诱导基于 Tet-off 的悬浮生产细胞系的不同策略的开发和实施。因此，我们将 Throm 等人开发的贴壁包装细胞系 GPRG 和 GPRTG。（2009）驯化至悬浮。首先，我们生成了多克隆 GFP 生产细胞系，并研究了在摇瓶中使用 GPRGs-GFP 生产细胞系通过简单接种来诱导病毒生产的一般可行性。该工艺概念包括补充强力霉素的 N-1 灌流种子培养，使细胞在接种生产培养物之前生长至高 VCD，同时抑制病毒产生。由于与传统种子培养相比，N-1 灌流种子培养的细胞密度较高，因此直接接种生产培养时可达到更高的稀释倍数，因为需要更小的种子扩增培养体积即可达到生产生物反应器中的预期接种密度。我们研究了 0.1 至 5.0 ng/mL 之间不同浓度的强力霉素用于摇瓶中 N-1 灌流种子扩增。将每个种子扩增培养直接用于预先加入无强力霉素培养基的种子生产摇瓶，随后以批次模式培养72小时。令人惊讶的是，所有研究的、用于种子扩增的多西环素浓度都允许启动病毒生产，而不需要更换培养基。获得的结果证明了通过稀释诱导的可行性，无需额外的设备，从而大大简化了工艺放大。我们测试了 1.0ng/mL 的多西环素浓度，用于进一步扩大规模的策略，因为这可以成功抑制种子培养中的病毒产生，并在稀释后快速诱导。然而，生产培养中残留的多西环素可能会阻止或延迟完全诱导，这可能会降低滴度或总病毒产量。由于连续收获策略被描述为可增加 GPRG 和 GPRTG 衍生细胞系的产量，我们的目标是实施灌流工艺，这将进一步降低接种生产后的抑制剂浓度。通过培养基的大量置换在一定程度上可以在摇瓶中模拟灌流。然而，生物反应器规模的灌流模式培养需要连续的培养基置换。因此，我们决定在生物反应器规模上检查潜在剩余强力霉素的影响。大多数现有文献显示了携带 GFP 作为转基因的 LV 的生产，以简化功能滴度的测定，尽管临床相关的构建体通常较大，并且载体基因组大小的增加与功能滴度的降低相关。因此，我们使用 WAS-T2A-GFP 构建体开发了稳定的 GPRGs 和 GPRTGs 生产细胞系，导致 LV 基因组 RNA 大小增加至 6173bp。产量最高的多克隆 WAS-T2A-GFP 生产细胞系的感染滴度在 GPRGs 和 GPRTGs 衍生细胞系之间具有可比性。我们选择了多克隆 GPRTGs-WAS-T2A-GFP 细胞系，因为之前报道的 GPRTG 衍生载体对人类 CD34 +  细胞具有更高的转导效率。使用制备的载体转导后，靶细胞表达临床相关的 WASP 以及 GFP，促进感染滴度测定。应当指出的是，编码激活基因表达的四环素反式激活因子的 rTA 元件的整合已独立整合到 GPRG 和 GPRTG 细胞系中。结合反式激活因子所需的多西环素浓度，从而抑制 p7tetO 控制的遗传元件的转录，可能取决于其表达水平。然而，由于使用相同的 p7tetO 和 tTA 序列来建立两种细胞系，因此通过稀释发现的诱导结果被认为可以在两种细胞系之间转移，并在生物反应器规模上得到验证。在将开发的工艺扩大到生物反应器之前，我们测试了各种无血清培养基以及化学成分确定的补料 CB5 的添加对 GPRTGs-WAS-T2A-GFP 细胞系上感染滴度形成和细胞生长的影响。我们发现 TransFx-H + CB5 培养基在半灌流模式下支持高达 2.78 ×10^7 TU/mL 的最高平均感染滴度形成，以及诱导后细胞的强劲生长。与使用基础添加物相比，使用 TransFx-H + CB5 培养基将感染滴度提高了五倍。与其它稳定细胞系相比，我们还观察到与基础添加物相比，TransFx-H + CB5 的细胞特异性生产力增加了 3.5 倍。尽管所有培养基在诱导后都支持细胞生长，但不同培养基成分之间的功能滴度差异高达 10 倍，这证明了培养基成分对于病毒生产力的重要性。在确定小规模的最佳工艺参数后，我们打算将该工艺转移到生物反应器规模。正如我们所表明的，与在摇瓶中使用 TransFx-H + CB5 培养基进行 120 小时批量生产相比，216 小时工艺的连续收获策略将时空产量提高了 9.2 倍，合适的细胞截留需要用于生物反应器规模生产的装置。灌流中LV生产的既定方法基于声波分离，或基于切向流深层过滤 (TFDF)，使LV能够通过膜。在我们这里，与声波分离相比，使用切向流过滤进行细胞截留时，我们观察到更高的细胞损伤，这缩短了工艺时间，并导致稍后收获时间点的跨膜压力增加。因此，我们决定采用声波分离技术进行连续收获，根据供应商的说法，该技术可以将体积扩大到1000 L，原则上允许使用一个生物反应器收获数千升含有病毒的收获液。我们通过稀释至 5L 生物反应器规模，并使用声波分离进行后续灌流策略，成功扩大了开发的诱导方法。为了解决剩余强力霉素是否影响使用稀释方法的诱导水平的问题，我们直接将性能与其它方法进行比较，介导接种后生产生物反应器中残留种子培养上清液的百分比较低。因此，我们使用开发的稀释诱导法、基于声波分离的细胞清洗器或通过手动离心去除含有多西环素的培养基来接种三个独立的5L搅拌罐玻璃反应器。我们观察到稀释方法在 66 hpi 和 90 hpi 时间点的细胞特异性生产率略低，这可能表明由于剩余的多西环素而导致诱导略有延迟。然而，在进一步的工艺中，细胞特异性生产率与所研究的方法相当，这些方法支持在接种前去除含有强力霉素的上清液。通过稀释诱导和使用声波细胞清洗器诱导的峰值感染滴度和总病毒产量似乎相当。通过离心去除种子培养上清液后接种的生物反应器的相应值似乎略低，这可以通过 138 hpi 后平均 VCD 较低来解释。结果表明，直接接种时潜在残留的多西环素是一个可以忽略不计的因素，而开发的稀释方法支持有效诱导病毒产生。在技术可行性、可放大性和执行时间方面，所开发的稀释方法比研究的替代方法更具优势。种子培养物的直接转移可以直接以任何所需的规模进行，并且不需要额外的设备。使用声波细胞清洗器的工艺可以完全自动化，与稀释方法相比，减少了操作员的操作并降低了残留多西环素的百分比。然而，考虑到处理时间为 90 分钟，所用设备设计的直接可放大性仅限于 50 L 生物反应器的接种。较大的生物反应器可以通过延长设备的运行时间或多个设备的并行操作来接种，但这使得技术设置更加困难。离心方法确保了细胞与含有多西环素的上清液的有效分离，但需要操作者进行多次操作。由于连续离心系统（如 Ksep® 系统）可用，该方法可能以可放大的方式实现半自动化，但需要评估对细胞活性、离心后均质性和工艺时间的影响。因此，我们将稀释法作为标准方案实施。该程序极大地简化了工艺流程，促进了临床应用的技术转移和工艺验证，而无需额外的设备。值得注意的是悬浮驯化 GPRTGs 细胞系的生产概况以及所开发的生产工艺的稳健性。我们证明，GPRTGs 生产细胞系能够在诱导后的过程中产生进一步增加的感染滴度。尽管乍一看似乎是诱导后细胞密度增加的原因，但令人惊讶的是，细胞特异性生产率在后期生产时间点也有所增加。我们假设在诱导后的较晚时间点 VSV-G 密度增加或由于细胞系的多克隆性而导致细胞群发生变化。我们目前正在量化不同时间点诱导单克隆细胞系的 VSV-G 密度，以进一步研究这种效应。Tran 和 Kamen 最近描述了一种基于 TFDF 的工艺，使用表达 LV GFP 载体的 Tet-on 稳定生产克隆。经过 8 天的生物反应器生长期后，细胞被诱导达到高 VCD。作者报告称，诱导后 5 天 (dpi)，每 1 L 收获液的标准化累积功能产量为 1.2 × 10^11 TU。我们用于比较不同诱导方法的生物反应器工艺具有相当的总工艺长度，包括生物反应器中 4 天的 N-1 灌流种子扩增。如果考虑 13 天的总工艺时间进行比较，包括 N-1 灌流中的 4 天细胞扩增和随后的 9 天生产阶段，我们使用生物反应器实现了可比的结果，APW-10生物反应器为 1.2 × 10^11 TU/L，稀释生物反应器为 1.1 × 10^11 TU/L。Tran 和 Kamen 描述了在 72 hpi 时高达 4.4 × 10^7 TU/mL 的峰值功能滴度，显示出钟形生产曲线，而 >1 × 10^7 TU/mL 的功能滴度只能在 2 dpi 至 5 dpi 之间保持,很可能是由于表达的病毒成分的细胞毒性作用。相比之下，我们的工艺从 4 dpi 或 5 dpi 开始达到 >1 × 10^7 TU/mL 的功能滴度，并且可以维持到 14 dpi，达到高达 2.9 × 10^7 TU/mL 的峰值。考虑到生物反应器“APW-10”的14天生产阶段，我们能够在一次生物反应器运行中获得2.4 × 10^11 TU/L的累积功能产率，并且有可能通过延长生产时间进一步提高所获得的值。应该注意的是，功能滴度的直接比较只能在有限的范围内进行。计算的滴度取决于 LV 转基因以及用于感染滴度测定的细胞系、方法和方案。此外，在这项工作中，使用了多克隆细胞系。筛选和选择高产克隆可能会进一步提高感染滴度和工艺产量。之前已经描述过，通过优化固定床生物反应器中的 pH 设定点，贴壁 GPRTG 衍生细胞系的生产力可以维持较长的培养期。然而，由于贴壁细胞特性，细胞生长的表面积受到限制。当达到高水平汇合时，分裂细胞从表面分离，并且附着的生产细胞的细胞年龄随着时间的推移而增加。相比之下，由于我们的工艺使用悬浮细胞，因此我们能够实施细胞废弃。因此，在高达 330 hpi 的整个过程中，细胞活性保持在 >90%，并且我们能够在细胞密度、pH 值以及代谢物方面达到稳态条件。总体而言，在这项研究中，我们能够使用一组三台台式生物反应器产生 2.12 × 10^12 TU的累积功能病毒产量，并使用单个生物反应器产生高达 1.09 × 10^12 TU的累积功能病毒产量。由于保持病毒生产力和细胞活性，我们目前正在研究 >800 小时的生产时间，重点关注最终产品中的病毒质量参数，例如功能滴度与物理滴度的比率、病毒效力、慢病毒基因组序列和宿主细胞 DNA，确保商业应用的产品一致性。就技术可行性而言，预计细胞截留装置不会受到膜污染或堵塞等限制，因为声波分离是一种无膜技术。我们相信，这项研究的结果有助于克服大规模生产LV的现有挑战。我们成功地将两种稳定包装细胞系悬浮并产生了稳定生产细胞系。我们比较了不同的无血清培养基、以优化细胞生长以及感染滴度和产量。我们能够开发出一种直接可放大的诱导方法，证明了使用基于 Tet-off 的细胞系进行大规模工艺的可行性。此外，所提出的工作显示了建立完全连续的LV生产工艺的潜力，这将是LV生产领域的一个重要里程碑。原文：M.Klimpel, M.Terrao, N.Ching, et al., Development of a perfusion process for continuous lentivirus production using stable suspension producer cell lines. Biotechnology and Bioengineering, 2023.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T，Chimeric abtigen receptor T cell）是指利用基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞中，使T细胞通过与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而激活，从而达到治疗肿瘤的目的。目前有多种方法用于T细胞修饰及CAR-T细胞产品制备，包括病毒载体转导（如γ-逆转录病毒载体或慢病毒载体）及非病毒载体转染等，目前已开展的临床试验中以病毒载体转导的方式为主。 ◉ 慢病毒( lentivirus)载体慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒（human immunodeficiency virus，HIV-1）为基础发展起来的基因治疗载体，属于逆转录病毒家族，又区别于一般的逆转录病毒载体，比逆转录病毒载体具有更强的感染能力，具有容纳外源性目的基因片段大、稳定整合、持久表达、免疫反应小等优点，是最常用的基因转移载体。而载体作为基因治疗的工具，可能带来插入突变、复制型病毒、外源因子污染等风险，同时其携带的遗传物质是CAR-T细胞的重要组成部分，是使T细胞具有强大的识别和杀伤肿瘤细胞活性的重要基础，考虑到病毒载体技术的广泛应用，具有复制能力的慢病毒/逆转录病毒检测成为重要问题，FDA及欧盟先后出台相关文件，要求建立灵敏、可靠的RCL/RCR检测方法。图1 慢病毒基因组HIV病毒基因组由两条正义链的RNA组成，约9kb的序列编码了9个蛋白，分别是gag、pol、vif、vpr、vpu、env、tat、rev、nef。其中三个最大的阅读框编码了三个最主要的结构蛋白：gag、pol和envgag：包含组成病毒中心和结构的蛋白质的基因(Gag, group specific antigen)pol：包含逆转录酶的基因(Pol, polymerase)env：包含组成病毒外壳的基因(envelope)（gag、pol、env是逆转录病毒的三个基本结构基因）复制性慢病毒/复制性逆转录病毒▌ RCL/RCR风险：1.RCL/RCR会同逆转录病毒载体一样，整合在细胞基因组中，从而产生因整合导致的原癌基因激活，抑癌基因破坏或者使促细胞生长的因子高度表达而造成二次肿瘤的风险。2.因其具有复制性，即产生具有复制能力的病毒，增加了因整合而造成的二次肿瘤的风险。▌ RCL/RCR产生的原因：慢病毒载体来源于病原体HIV-1，为了保证产品的安全性，目前基因治疗产品所用的慢病毒载体/逆转录病毒载体均为非复制性。通过将基因组中的辅助蛋白删除，并将结构基因分别通过3-4个质粒系统进行分别包装，形成三质粒系统或者四质粒系统，如图1所示，极大的降低了产生具有复制能力慢病毒的可能性，这意味着至少需要2-3次完整的重组时间才能产生一个具有复制能力的慢病毒，在此基础上进一步修饰改造，构建自失活的慢病毒载体（SIN），极大的提供包装病毒的安全性，此外使用VSV-G蛋白取代env蛋白增加载体的稳定性及受体细胞范围。RCL/RCR产生的主要原因是转移载体和包装载体同源序列的重组。随着新的载体系统的发展与应用，载体系统中各元件之间发生同源重组的变化导致 RCL/RCR生成机制和结构的变化愈加复杂。而且，重组不仅限于载体系统之间各组分发生的重组，也包括载体成分和细胞基因组之间的重组。图2 HIV-1基因组→三质粒系统→四质粒系统复制性慢病毒/复制性逆转录病毒检测▌ RCL/RCR检测的阶段虽然通过上述病毒制备体系的改进，很大程度上降低了RCL/RCR产生的风险，但是仍不能完全排除，美国FDA要求对于γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体，需要在整个生产过程及不同阶段进行RCL/RCR检测，需要对载体生产用主细胞库、工作细胞库、生产终末细胞、载体上清液及在体外培养超过4天的载体转到细胞进行检测，如图3所示：图3 RCL及RCR检测取样▌ RCL/RCR检测的方法FDA推荐的RCL检测方法是利用敏感细胞对病毒载体中可能存在的RCL进行培养扩增，并在培养终点进行检测。◉ 共培养测定法：图4 RCL测试• 扩增期：将待测物与对HIV-1易感并且可大量扩增病毒的细胞系( 通常用 C8166) 孵育，细胞传代 5 次以上，培养至少3周。• 指示期：3 周后收集培养上清，接种于C8166 细胞中培养 7d 后检测RCL 标志物。• 检测：A：P24 ELLISA 的方法：适用于由载体制备过程中病毒基因组之间的重组形成 RCL 的检测。B：PERT法：当 RCL 进行扩增后，也可应用PERT 检测方法测定逆转录酶活性。该方法的缺点是在某些细胞中存在高背景。C：qPCR方法：采用实时定量 PCR 方法( Q-PCR) 测定假型病毒 VSV-G 复制过程中的 VSV-G 基因序列或检测由载体质粒和包装质粒重组产生的psi-gag序列。 qPCR快检法 目前许多 CAR-T企业采用 Q-PCR方法直接测定CAR-T终产品中的 VSV-G 序列或 psi-gag 序列，因考虑到CAR-T细胞种产品一般需要新鲜输注的特殊情况，基于细胞培养法的RCL/RCR检测方法周期较长，建议在细胞产品制备过程中进行全面控制(如对慢病毒载体及生产终末细胞采用基于细胞培养方法测定 RCL/RCR，以确保生产工艺过程中不存在 RCL 的风险) ，细胞终产品阶段可采用qPCR快检测法快速放行。“新品”预告湖州申科自主研发将推出可用于基于细胞培养方法的qPCR检测以及CAR-T终产品qPCR检测的RCL及RCR检测专用试剂盒，分别以慢病毒载体包膜VSV-G基因和逆转录病毒载体包膜GALV基因为目标序列，建立荧光定量PCR检测方法，并对方法进行了性能验证，最低检测限分别可达4copies/reaction和3copies/reaction.新品即将上市如有订购需求请扫描下方二维码留言咨询‍