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Spike蛋白募集ESCRT，释放病毒样颗粒，增强mRNA疫苗免疫效果

2023-05-27

疫苗信使RNA

对于 mRNA 疫苗来说，编码 Spike 蛋白的 mRNA，借助 LNP 递送载体，被宿主细胞摄取，将Spike 蛋白表达于宿主细胞表面，激活 B 细胞，同时，Spike 蛋白在宿主细胞质中翻译表达的过程会产生病毒多肽，经 MHCI 呈递给细胞毒性 T 淋巴细胞，还可激活 T 细胞反应。得益于此，新冠 mRNA 疫苗对于原始株的预防保护效率可以高达 90%以上。相比之下，蛋白纳米颗粒疫苗来很难激活 T 细胞反应，例如，NVX-CoV2373，因为其在进入机体以前就已经自组装完成，内部缺乏病毒核酸，一旦被宿主细胞摄取，不会发生翻译表达病毒抗原的过程。即便如此，NVX-CoV2373 触发的中和抗体滴度同样能够达到新冠 mRNA 疫苗的水平，这说明通过在细胞表面呈递病毒表面抗原或产生者病毒样纳米颗粒均可强效激活 B 细胞反应。一方面，人们总是希望疫苗触发的中和抗体滴度可以更高，在体内保持的时间变得更长，另外一方面，先前感染或者接种疫苗所诱导的抗体已经无法抵御新冠变异株的再次感染。正是基于上述原因，有人设想将 mRNA 疫苗和蛋白纳米颗粒疫苗两者的优势结合起来，向机体宿主细胞递送编码 Spike 蛋白的 mRNA，使得 Spike 蛋白既可表达在宿主细胞表面，又能触发 Spike 蛋白出芽，释放表面呈现 Spike 蛋白的 eVLPs(病毒样颗粒)。NVX-Cov2373 新冠蛋白亚单位疫苗制备流程。2023 年 5 月 25 号，加州理工学院生物与生物工程系 Pamela J. Bjorkman 教授团队在 Cell 发表文章：ESCRT recruitment to SARS-CoV-2 spike induces virus-like particles that improve mRNA vaccines，他们将 mRNA 疫苗与蛋白纳米颗粒疫苗相结合，编码产生可实现自我组装的包膜病毒样颗粒（eVLPs）。将 ESCRT-和 ALIX-结合结构域（EABR)插入到 S 蛋白细胞质尾巴区域，从而招募 ESCRT 蛋白，诱导 eVLP 从宿主细胞出芽。纯化后的 Spike-EABR eVLPs 表面排列着致密的 S 蛋白，免疫小鼠触发强烈的抗体反应。与编码 S 蛋白的 mRNA-LNP 疫苗或者纯化的 Spike-EABR eVLPs 相比，两剂编码 Spike-EABR 的 mRNA-LNP 疫苗不仅可触发强烈的 CD8+T 细胞反应，还可诱导靶向原始株以及变异株的更高水平的中和抗体滴度—加强免疫 3 个月后，靶向 Omciron 变异株的中和抗体滴度提升 10 倍以上。因此，以 mRNA 疫苗作为底层技术，结合 EABR 技术，自组装 eVLPs，可显著增强疫苗触发的免疫反应的强度和广度，使得接种者对于新冠病毒的预防感染持续更长时间。1 Spike-EABR 抗原序列设计首先，S 蛋白包含 D614G 突变，Furin 切割位点，2P 突变（稳定融合前构象），C 端截断 21 个残基△CT（移除移除内质网滞留信号，提升蛋白细胞表面表达）。其次，以短 Gly-Ser Linker（GS）为间隔，在 S 蛋白 C 端，插入来自人CEP55 蛋白的 EABR 片段。要想知道 EABR 是干什么用的？我们得先知道内吞体分选转运复合体（endosomal sorting complexes required for transport, ESCRT），它参与细胞分裂与包膜病毒的出芽过程。中间体是两个子代细胞最后的连接处，而细胞质膜在中间体（midbody）处切割，也称为脱落，是细胞分裂的最后过程。CEP55 蛋白募集 ESCRT 机器中两个关键组分 ESCRT-I 与 ALIX 到中间体，这是因为 CEP55 蛋白拥有ESCRT-I 与 ALIX 结合结构域（EABR）。也就是，研究人员在 S 蛋白中插入 EABR 片段的目的是为募集 ESCRT 相关蛋白，实现 S 蛋白的自我组装和 eVLPs 的出芽过程。最后，为防止 EABR-Spike 融合蛋白发生胞吞作用，而是使其在细胞质膜上停留更长的时间，以便同 ESCRT 蛋白发生相互作用，研究人员还插入了一段长 47 个残基，来自鼠 FcgRII-B1 胞质尾部区域的EPM基序（将 FcgRII-B1 与细胞骨架连接在一起，阻止 FcgRII-B1 发生胞吞）。1.1 为什么选择 CEP55 蛋白的 EABR 片段实现自组装？实际上，除了来自 CEP55 蛋白的 EABR，研究人员还在 Spike 蛋白 C 端插入了病毒晚期结构域（在病毒出芽过程中，募集早期 ESCRT 蛋白）来产生 eVLPs，包括来自 HIV-1 p6 蛋白的，来自 EBOV 病毒的 VP40 蛋白以及 EIAV 病毒的 p9 蛋白。研究人员用编码 S-EABR，S-p9，S-VP401-44 以及 S-p6 的质粒转染 Ex-pi293F 细胞，20%蔗糖超速离心，收集上清液，测定上清液中产生 eVLP 的数量。结果发现，来自 CEP55 的 EABR 高效触发 S 蛋白自组装成 eVLPs，要比 S-p9 蛋白组装的 eVLPs 高出 10 倍，相反，S-VP401-44 和 S-p6 质粒转染的细胞上清液中未检测到 eVLPs。研究人员据此认为对于高效组装 eVLP 来说，必须募集到 ALIX 和 TSG101，因为 EIAV 病毒的 p9 蛋白仅仅结合 ALIX。1.2 EABR序列优化处理研究人员发现添加 2×EABR 结构域，反而会导致 eVLP 产生量。接着，他们还将 CEP55 EABR 的 Tyr187 残基（对于结合 ALIX 至关重要）替换突变，结果发现基本检测不到 eVLP 产生，说明募集到 ALIX 对于 eVLP 组装来说至关重要。最后，如果将 EABR 序列进行截断（min1 或者 min2），eVLP 产生量减少或者阻断。此外，他们发现去除掉 EPM 序列，eVLP 产生量也会发生显著减少。1.3 比较其他 eVLP 生产方法当 S 蛋白与其他病毒结构蛋白共表达时，例如，HIV-1 Gag，SARS-Cov-2-M/N/M 或者 Ferritin(铁蛋白)，产生的 eVLP 数量也明显不如采用 EABR-Spike 融合蛋白产生的。EABR 插入到 Spike 蛋白胞质尾部，导致 eVLP 的出芽和释放。2 S-EABR-mRNA-LNP 疫苗免疫原性传统 mRNA 疫苗通过表达于细胞的表面 Spike 蛋白触发抗体反应，而编码 S-EABR 的 mRNA 疫苗不仅可在细胞表面表达 Spike 蛋白，而且可以诱导 eVLPs 的出芽和释放，将 eVLPs 散布于机体内，来更强烈的激活免疫细胞。同 S-mRNA-LNP 疫苗或者 S-EABR 类病毒颗粒样疫苗（加佐剂）相比，S-EABR-mRNA-LNP 疫苗可触发更加强烈的抗体反应和 T 细胞反应。3 结论目前，常规的用于生成 eVLP 的方法，一个是采用抗原与病毒与病毒衣壳蛋白共表达来生成 eVLP ，另外一个是Tag/Catcher 技术，基本原理是选择镶嵌 Catcher 序列的蛋白纳米颗粒作为骨架，例如，正八面体的 24 聚体铁蛋白（Ferritin）、正十二面体的 60 聚体 mi3 纳米颗粒蛋白（mi3）或者正二十面体的 120 聚体 I53-50 纳米颗粒蛋白（I53-50），然后，利用 Tag-Catcher 形成的酰胺键，将携带 Tag 序列的病毒抗原与纳米颗粒蛋白在体外孵育，使病毒抗原蛋白偶联到这不同蛋白纳米颗粒的表面。与上述方法相比，采用参与细胞分裂病毒出芽的 ESCRT 通路来驱动 eVLP 的组装和释放，可产生更高数量的 eVLP 。EABR 技术表现出更加吸引人的特征：首先， ESCRT 通路来驱动产生的 eVLP 只需要编码表达一种单一成分；其次，跨膜蛋白保留天然构象，以保证蛋白质的表达和稳定性；最后， eVLP 可以直接从培养上清液中纯化，不需要洗涤剂介导的细胞裂解和从细胞裂解物中分离膜蛋白抗原。将 ESCRT 通路来驱动 eVLP 技术与 mRNA 技术相结合，使得病毒抗原不仅能够呈递在细胞表面，还能出芽组装形成 eVLPs，散布机体内，使得呈递给免疫系统的病毒表面抗原整体增加，从而更加强烈地刺激体液免疫和细胞免疫。