连载专题+福利 | mRNA蓝图：质粒模板的制备与优化

2024-03-26

信使RNA疫苗

在上一次mRNA的连载专题文章中提到了mRNA疫苗&药物的分子设计（点击查看详情），那么在获得一个设计优化好的序列后，将其制备为mRNA转录模板则是从理论迈向实际的第一步。IVT转录模板的制备方式有很多种，常见的有聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）扩增产物、滚环扩增(RCA，rolling circle amplification）、质粒DNA扩增等。PCR及RCA产物的制备具有快速简便、重复性好、自动化等优点，可以在数小时内完成DNA片段的指数级扩增。但受限于仪器、反应体系和条件等的影响，两者产量一般只能达到μg级别，多应用于实验室及早研小试阶段，在大规模生产及工业应用场景下，通过发酵扩增获得的质粒DNA是主流的mRNA转录模板。01mRNA模板质粒mRNA的模板质粒，由5’UTR序列、CDS区域、3’UTR序列、poly（A）序列及质粒骨架构成。质粒骨架包含复制起始位点(ori)、启动子序列、线性化酶切位点及抗性基因。《中国药典》第三部总论中的“人用疫苗总论”里明确规定：疫苗生产中不得添加青霉素和其他β-内酰胺类抗生素，因此一般推荐使用卡那霉素作为抗性基因。质粒DNA常见有超螺旋、开环和线性三种构型，超螺旋为最理想的构型，两条DNA链为共价闭合的状态；当质粒出现断裂产生缺口，会变为开环构型，如果缺口出现在转录区域，那么将影响下游IVT产物的完整度，因此认为质粒超螺旋比例与IVT产物完整度有关联。质粒的构型与线性化程度通常可以使用琼脂糖凝胶电泳或HPLC进行检测。HPLC检测的的质粒的三种构型Poly（A）尾在真核生物mRNA中普遍存在，可以加强mRNA的稳定性和翻译功能。在mRNA体外生产的过程中，可以通过酶法加尾以及共转录加尾两种方式让mRNA形成Poly（A）尾。酶法加尾通过大肠杆菌Poly（A）聚合酶，以不依赖模板的方式在mRNA上形成Poly（A)尾，但此种加尾方式很难保证poly（A）长度的一致性，对后期质控带来挑战，并且转录后加尾在工艺上也较为复杂，因此，将Poly（A)序列直接插入质粒模板，通过共转录加尾制备mRNA的方法更受青睐。虽然共转录加尾的方法在工艺上存在更简便可控的优点，但与此同时长片段Poly（A）序列会导致质粒在转化、扩增和传代过程中极易因不可预测的DNA重组，发生poly(A)序列丢失。DNA同源重组，要求较大的同源DNA片段(>75bp)才能交换，且同时需要重组酶(RecA)等酶的参与，不同的感受态细胞的基因型不同，酶的表达有所不同，因而DNA同源重组的概率也有所不同。RecBCD也是DNA同源重组的关键酶，该酶有被称为chi的倾向性位点，因而DNA的序列也对DNA同源重组的概率有一定影响。并且，带有长片段Poly（A）序列的质粒，除了有极易发生Poly（A）序列丢失的特点外，相较于普通质粒，超螺旋比例会更低，更容易出现聚体。因此，mRNA模板质粒在mRNA生产工艺上带来简便的同时，对于质粒上游发酵工艺的开发有了更高的要求。02质粒上游发酵工艺mRNA模板质粒在整体发酵工艺流程上，与常规质粒基本相同，但是基于前文中提到的特点，除了通过在序列设计过程中引入分段设计提升Poly(A)稳定性外，在发酵工艺优化过程中，也需要对Poly（A）完整度指标进行特别的关注，通过对发酵质粒的骨架、感受态种类、单克隆的筛选等方面同时进行优化，来确保最终制备的质粒模板poly（A）序列完整性达到要求，这也是mRNA质粒模板区别于其他常规质粒发酵工艺的点。质粒骨架对mRNA质粒模板的影响：在感受态、目的序列及其他条件相同的情况下，不同的质粒骨架对poly（A）序列稳定性有较大的影响，瀚海新酶通过对不同质粒骨架的筛选，挑选出可以保持Poly（A）序列稳定扩增的骨架用于mRNA生产工艺。左右滑动查看更多左右滑动查看更多质粒骨架在放大发酵中对poly(A)稳定性影响显著感受态对mRNA质粒模板的影响：除了质粒骨架，不同的感受态细胞类型在生产过程中对mRNA质粒模板质量有较大的影响。同一个质粒使用不同的感受态细胞进行转化和扩增后，超螺旋比例和poly(A)序列稳定性会有不同的表现。瀚海新酶通过对不同的感受态细胞进行筛选，形成了适用于mRNA质粒模板的感受态细胞库，可以通过感受态的优化，提高质粒模板质量，获得更高完整度的下游IVT产物。左右滑动查看更多感受态细胞对polyA稳定性的影响需要注意的是，同一mRNA质粒的不同克隆间往往存在显著异质性，使用合适的感受态细胞只能提高获得高质量模板的概率，无法避免低质量模板的出现，因此，在使用合适的感受态的同时，对不同单克隆进行筛选也至关重要。<左右滑动查看更多>03质粒下游纯化工艺CDS区域序列优化【1】菌体收获：采用离心或中空纤维切向流过滤进行收获。传统的离心操作难以放大，具有较高的剪切力，对质粒这种对剪切力高度敏感的DNA，超螺旋结构很容易开环，并且工艺验证也困难。中空纤维有良好的线性放大能力，适合于工业生产过程。并且中空纤维柱采用的聚醚砜材质，物理化学耐受性好，可耐受1 M NaOH进行彻底清洗去除热源，水通量恢复完全；可进一步降低切向流过滤的操作成本。固含量越高选用内径越大越好。【2】菌体裂解：菌体裂解的方法有很多，常用的有反复冻融，超声破碎，高压破碎和化学方法裂解。目前常用的是利用酶、表面活性剂、碱液等使细胞膜、细菌胞壁等破裂，或是改变细胞壁或细胞膜的通透性，最终使大部分细胞壁及细胞膜成分裂解的方式，由Birnboim和Doly最早提出[1]。主要步骤为分为重悬，裂解，中和沉淀，离心取上清液即需要的质粒DNA。碱裂解过程中需注意温和的搅拌方式，因为剧烈的搅拌产生的机械剪切会导致 gDNA 断裂为类似 pDNA 大小片段（～10 kb），进入溶液；反之，搅拌混合效率不足会导致局部碱浓度过高，pDNA 容易形成不同的构型，加大下游纯化的挑战。NaOH最好新鲜配制，因为长时间保存的 NaOH 与空气中的 CO₂ 反应，导致实际浓度降低，影响裂解效果。同时裂解时间的控制也同样重要，裂解时间过长会导致 pDNA 不可逆的损伤，产物的收率和质量降低。【3】澄清：澄清的方法有离心，添加絮凝剂（硫酸铵沉淀，CaCl2沉淀）；添加NH4HCO3[2]或NaHCO3，自然分层；分级过滤20 µm-0.6 µm~0.4 µm；深层过滤等。通常通过澄清步骤来去除固形物。在裂解过程中添加硫酸铵或者CaCl2可沉淀去除大部分RNA[3]，常用于质粒纯化两步法的样品前处理阶段，利于pDNA的捕获。添加NH4HCO3能产生大量CO2，使气体能够带动絮凝物上浮至液体表面，使得后续深层滤器的载量增加。深层滤器的载量一般可达到100-300 L/m2，澄清度较好，具有高回收率、高容污能力，工艺稳健，可线性放大。在深层过滤开发过程中进行膜包进行筛选及载量开发等工艺优化。膜包载量的开发【4】浓缩：使用中空纤维柱或平板膜包进行浓缩，调整到所需的质粒浓度。【5】层析：传统的三步法是使用分子筛层析-嗜硫亲和层析-阴离子交换层析的方法，其中分子筛层析可收获质粒DNA，去除RNA、蛋白等大量杂质，嗜硫亲和层析主要分离ocDNA和scDNA，提高质粒的均一性，阴离子交换层析用于精纯，去除痕量杂质，如gDNA、内毒素、宿主蛋白等。两步法层析更加灵活，大量减少填料的用量，减少硫酸铵的用量及工艺时间。通过AEX和HIC进行两步法获取质量较高的超螺旋质粒HPLC检测超螺旋比例＞90%【6】浓缩换液：层析后的样品中含有大量的盐，采用100KD中空纤维柱进行缓冲液的置换，将样品置换到相应的制剂溶液中，最后进行无菌过滤。04质粒线性化工艺IVT过程中，T7 RNA聚合酶的转录会延伸至DNA的尽头，因此为了确保IVT产物无多余序列，并且所获得产物的长度一致，质粒模板用于下游IVT之前需要进行线性化处理。质粒线性化也是影响下游IVT结果的重要步骤，如果质粒线性化不完全，那么转录产物可能出现由未完全线性化的模板过度转录导致的后杂峰；反之，如果质粒被过度酶切，那么转录产物可能出现由被非特异性酶切切碎的模板转录导致的前杂峰，因此质粒模板线性化工艺对模板制备来说同样重要。左右滑动查看更多质粒线性化程度可以通过电泳、HPLC等方法进行鉴定，目前电泳法为最常用的判定线性化程度的方法,但是在日常实验中，由于序列或者mRNA质粒存在的聚体原因，部分质粒在酶切后电泳结果上并不会呈现单一条带，这种情况下应该考虑使用其他方法对质粒线性化程度进行判定。质粒模板线性化用的限制性内切酶推荐首选使用高保真酶，可以防止质粒因过度酶切被切碎；并且使用IIS型限制性内切酶，因为IIS型限制性内切酶的切割位点在识别序列外，可以确保酶切后poly（A）序列后无多余片段。限制性内切酶的酶切05上游质粒模板优化提高下游产物质量瀚海新酶通过对感受态种类、发酵工艺及质粒纯化工艺进行了优化，形成了适用于mRNA质粒的感受态库、质粒骨架及平台化的发酵和纯化工艺。针对某个mRNA模板质粒，通过对质粒骨架、感受态种类、发酵工艺及质粒纯化工艺的优化，将IVT完整度提升了10%以上。质粒优化的IVT完整度瀚海新酶“质粒DNA制备服务”全新上线，可提供不同规模科研级和工业级质粒及各类质粒质控检项。并且针对mRNA质粒，通过贯穿全流程的测序质控，保证mRNA质粒模板的poly(A)序列，并提供相关的IVT验证服务，确保客户拿到效果最佳的mRNA模板质粒。瀚海新酶提供：全套mRNA疫苗&药物相关高性能酶原料、化学底物、IVT试剂盒及质控试剂盒，拥有自主质粒制备、IVT工艺开发、mRNA纯化、LNP包封及相关质检平台，可为客户提供基于原料的全套解决方案，全面的工艺开发服务，助力客户快速推进新药开发。对于早研阶段客户可提供CRO服务、概念验证服务、第三方质检服务及各类成品mRNA原液产品，编码蛋白涵盖报告基因、靶点蛋白、基因编辑蛋白和抗原蛋白等。以《瀚海畅聊mRNA》为主题，瀚海新酶推出连载专题，已成功发布第一期“一切的起始：mRNA疫苗&药物分子设计”，受到热烈反馈，本次继续推出第二期专题《mRNA蓝图：质粒模板的制备与优化》，后续会继续就酶促体系、纯化工艺、递送系统及质量控制等方面进行分享与讨论，也欢迎随时联系咨询相关产品，期待与您进一步合作！好书申领助您疫苗研发事半功倍《疫苗创新技术》共36章，分为上、中、下三篇。上篇主要涉及疫苗设计以及原料制备方面的创新技术，如蛋白组学、结构生物学、反向疫苗学、反向遗传学、病毒减毒技术、细胞制备技术等；中篇主要涉及生产工艺以及临床应用的创新技术，如细胞发酵技术、纯化技术、冻干技术、序贯免疫、新型递送系统等；下篇主要包括疫苗检验检测和临床评价技术，如质谱和核磁检测技术、细胞免疫和体液免疫检测技术、真实世界评价技术等。参与方式1. 关注瀚海新酶公众号（后续多期《瀚海畅聊mRNA》专题文章推出，请持续关注！）2. 输入框回复：疫苗，登记信息活动时间2024年即日起-3.29获奖说明：后台进行审核，符合审核条件的15名幸运读者，将获《疫苗创新技术》一本，7个工作日内联系获奖寄送参与对象：截止目前，未在其他平台参与过本活动的行业内医学科研院所生物技术从业人员、相关专业生物检测应用人员(瀚海新酶内部人员不参与本活动)（本活动最终解释权归瀚海新酶生物科技有限公司所有）参考文献：[1]Birnboim HC, Doly J (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res 7:1513–1523[2]Blom, H., Bennemo, M., Berg, M., Lemmens, R., Flocculate removal after alkaline lysis in plasmid DNA production. Vaccine 2010, 29, 6–10.[3]Freitas S., Santos J., Prazeres D. (2006). Optimization of isopropanol and ammonium sulfate precipitation steps in the purification of plasmid DNA. Biotechnol. Prog. 22, 1179–1186公司介绍