抗体偶联药物的高效纯化技术：最新进展与挑战

2024-06-23

抗体药物偶联物

近年来，抗体偶联药物（ADCs）领域取得了显著进展。这些药物由单克隆抗体与具有细胞毒性的小分子药物通过共价键连接而成，其结构的复杂性为化学合成、生产过程和质量控制带来了挑战。在ADC药物的开发中，关键的质量属性包括工艺的优化、药物与抗体的结合比例、游离药物的接头以及聚集体的形成，这些都需要通过精细的纯化策略来严格管理和去除。本文综述了ADC药物的多种纯化技术，并对其未来的发展方向进行了探讨。 ADC的结构 ADC的结构主要由三个核心组成部分构成：单克隆抗体、药物载荷以及连接子系统（含连接子、配体和偶联位点）。单克隆抗体：这些抗体对肿瘤相关抗原展现出特异性结合能力，允许ADC精确地定位到肿瘤细胞及其微环境中，进而将药物载荷传递至肿瘤细胞（此部分的单抗也包括其衍生形式）。药物载荷：载荷通常是具有极高细胞毒性的小分子，例如美登木素生物碱和阿里他汀，其IC50值达到亚纳摩尔级别。鉴于其强烈的毒性，必须确保从ADC制剂中彻底去除任何未反应的药物载荷和连接子。连接子系统：该系统负责将单抗与药物载荷连接起来，对制造稳定而有效的ADC至关重要。连接子设计上通常需要较低的疏水性，并分为可裂解和不可裂解两种类型。可裂解连接子在血液循环中保持稳定，并在到达肿瘤组织后能够释放药物载荷；而不可裂解连接子则以其高稳定性为特点，依赖于抗体在溶酶体中的酶促降解来释放载荷。至于偶联位点的选择，必须确保不干扰抗体的抗原结合能力和FcRn相互作用。目前，所有经FDA批准的ADC药物的偶联位点均为位于赖氨酸侧链氨基或通过二硫键还原得到的半胱氨酸巯基的可接触位点。图 1. ADC各部分的结构和要求 ADC的典型生产方法图2展示了ADC的典型生产流程，特别强调了纯化环节的重要性。初始的单克隆抗体通常存在于一个有利于其稳定性的缓冲系统中。首先，通过切向流过滤（TFF）技术去除样品中的小分子物质（例如添加剂等），并将其转移到一个适宜进行偶联反应的缓冲环境中。然后，对单抗进行还原处理，并与小分子药物载荷进行偶联，形成ADC中间体。在偶联过程中，除了目标ADC分子外，还可能产生一些未反应的小分子、偶联副产物、DAR值异常的分子以及聚体等杂质。这些杂质需要通过纯化步骤去除。初步的纯化可以通过TFF去除小分子杂质，但对于DAR值异常和聚体等更复杂的杂质，则需要利用层析技术进行有效分离。经过纯化，ADC分子再次通过TFF进行缓冲液替换，以适应最终的储存条件。图 2. 生产ADC的典型制造方法切向流过滤切向流过滤（TFF）在抗体偶联药物（ADC）的生产流程中扮演着关键角色，尤其在去除有机溶剂、偶联副产物和缓冲液置换方面显示出其高效性。TFF以其开发简便、操作稳定性强和高回收率（通常超过90%）等优势而被广泛采用。应用场景：TFF特别适用于清除各类小分子杂质，包括溶剂、还原剂（如TCEP）以及药物-连接子复合物。这些杂质的分子量通常远低于TFF膜的截留阈值，因此可以透过膜而被有效清除。面临的挑战：疏水性化合物的自聚集问题：某些药物-连接子化合物由于其高度疏水性可能倾向于自聚集，形成胶束。当这些胶束的尺寸超出膜的截留能力时，它们将难以通过TFF清除。在这种情况下，可以考虑采用层析技术或通过化学手段降低这些化合物的疏水性。如图3所示，通过筛选不同的巯基衍生物来淬灭马来酰亚胺活性基团，发现使用L-半胱氨酸作为淬灭剂可以有效通过TFF去除药物载荷衍生物，而其他淬灭剂的效果则不尽人意。聚体的去除难题：TFF在去除分子量大于或等于ADC单体的聚体方面存在局限，因为这些聚体往往会被膜截留。 DAR值不同的ADC混合物的分离问题：TFF无法区分并分离具有不同药物抗体比例（DAR）的ADC混合物。在这种情况下，需要依赖层析技术来去除与单抗相关的杂质。图 3. 淬灭剂对TFF中游离药物linker相关杂质清除的影响。(A) 每种淬灭剂的插图, (B) Nadkarni课题组报道的各淬灭剂的比较尺寸排阻层析尺寸排阻层析（SEC）是一种基于分子量差异来分离蛋白质和杂质的技术。在抗体偶联药物（ADC）的提纯过程中，SEC扮演着重要角色，它不仅可以用于缓冲液置换（去除盐分）、去除低分子量的非蛋白杂质（例如药物载荷）和聚体，还能与质谱技术联用，以获得更丰富的信息。应用场景：SEC是实验室规模ADC纯化的优选方法，常用的层析柱如GE和PD-10，它们能够有效地去除小分子和大分子杂质。SEC的操作条件通常温和（室温下的中性缓冲液），ADC分子与层析介质之间几乎没有疏水性或电荷等复杂的相互作用，尽管也有报道指出存在一些非特异性的相互作用。挑战点：规模化应用：SEC在实验室小规模纯化中表现优异，但在大规模生产中，TFF技术更为常见。为解决规模放大的问题，一些供应商推出了大容量的SEC层析柱，例如EMP、CentriPure P50和P100，这些产品使得单次SEC层析能够处理数百毫克的ADC，从而满足规模化生产的需求。疏水相互作用层析在抗体偶联药物（ADC）的纯化过程中，除了清除小分子杂质和聚体外，不同药物抗体比例（DAR）值的ADC的分离也是一个关键环节。传统的TFF和SEC技术在这一分离任务中存在局限性。由于共价结合在单抗上的连接子和有效载荷通常具有疏水性质，DAR值的增加通常伴随着ADC疏水性的增强。利用疏水相互作用层析（HIC），可以在不改变ADC天然状态的前提下，有效地分离不同DAR值的ADC。应用场景：如图4所示，HIC层析被用于分离具有不同DAR值的ADC混合物。通过向样品中添加适当浓度的NaCl，促进样品与疏水层析介质的结合。DAR值为0的ADC由于缺乏疏水性，不会与HIC介质结合，从而在层析过程中被洗脱。随着洗脱过程中NaCl浓度的逐渐降低，DAR值为1和2的ADC由于疏水性的差异（DAR1 < DAR2）而依次被洗脱，实现了有效分离。进一步的实验结果表明，经过HIC纯化的ADC在细胞毒性和靶向选择性方面均保持了良好的活性。挑战点：在HIC层析中，不同洗脱峰之间的分辨率和ADC的收率是需要特别关注的。为了提高分离效果，可能需要对填料或流动相条件进行优化。例如，在图4中的案例中，最初使用的盐是硫酸铵，但由于收率较低，后来改用了NaCl体系。图 4. 用于分离不同DAR物质的HIC柱的色谱图结果离子交换、羟基磷灰石层析和其他柱层析方法离子交换层析（IEC）是一种基于电荷差异来分离目标蛋白和杂质的技术，它可用于区分电荷异构体、糖型变异和结构变化等。IEC不仅回收率高，还能有效去除非抗体相关的杂质，包括小分子物质和内毒素。尽管目前关于使用IEC进行ADC分析和纯化的案例较少，但其潜力不容忽视。羟基磷灰石层析（HA）利用其填料中的钙和磷酸盐矿物质，通过金属离子亲和力和阳离子交换的静电作用，实现抗体的结合和分离。HA在去除聚体方面表现出色，有案例显示其去除效率极高，能将聚体含量从60%大幅降至0.1%，同时也能有效去除DNA和内毒素等杂质。尽管HA层析在ADC纯化中的应用报道不多，但其效果值得关注。其他柱层析技术也在ADC的分析和纯化中发挥作用，包括亲和层析和亲水相互作用层析（HILIC）。TOSOH公司推出的亲和层析柱，由固定有重组FcγIIIa受体配体的无孔聚合物颗粒构成，能够在天然条件下对抗体进行聚糖分析。最近，有研究利用这种填料对ADC进行异质性评估。HILIC作为一种固定相技术，能有效分离复杂混合物中的极性化合物，如抗体的糖基化部分，其在ADC的分析和制备中也有应用案例。对于感兴趣的读者，可以在相关文献中找到更多详细信息。膜层析柱层析技术虽然在分离杂质方面表现出色，但也存在一些局限性。例如，它可能需要与填料长时间接触，以及依赖高浓度盐溶液来实现蛋白质的吸附和洗脱，这些因素都可能增加生产成本，甚至导致ADC的聚集或沉淀。为了解决这些问题，膜层析技术提供了一种替代方案，尽管目前关于其应用的报道还相对有限。有研究者采用Sartobind膜层析系统对ADC进行纯化，结果表明该技术能够有效地去除聚体、残留的药物-连接子以及非目标DAR值的ADC组分。此外，另一个案例通过将Sartobind S和Sartobind Phenyl膜层析技术串联使用，在保持高流速和低压力的条件下，成功去除了游离的药物-连接子和聚集体。未来ADC纯化的挑战定点偶联技术在ADC药物制造领域正迅速进步，它能够生产出成分更为一致的ADC产品。例如，利用酶催化实现定点偶联是一种充满潜力的技术。但同时，这种酶的分子大小和物理特性可能与ADC分子相近，这可能使得从ADC中间产物中去除这些酶成为一个难题。鉴于此，化学定点偶联技术可能因其使用的较小分子（例如亲和配体）而成为未来ADC生产的首选方法，这些小分子可以通过标准的TFF技术有效分离。 ADC的未来不仅仅局限于传统的单克隆抗体。预计，更复杂的抗体衍生物，如双特异性抗体和Fc融合蛋白等，将逐渐成为研发的热点。这一趋势将为ADC的纯化过程带来新的挑战。文献来源：Matsuda Y. Current approaches for the purification of antibody-drug conjugates. J Sep Sci. 2022 Jan;45(1):27-37. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。