Tosoh Corp.

摘要：在过去二十年中，抗体-药物偶联物因其与传统化疗相比扩大了治疗指数而日益受到关注。抗体-药物偶联物是高度复杂的结构，由与小分子细胞毒性药物共价结合的抗体组成。抗体-药物偶联物的复杂结构使得化学、制造和控制变得困难。与抗体生产不同，抗体与药物连接物结合后需要不同的纯化方法来进行制造。对于抗体药物偶联物的工艺开发，药物-抗体比率、游离药物连接物和聚集体是必须严格控制并通过适当的纯化技术去除的关键质量属性。在这篇综述中，描述并评估了用于纯化抗体药物偶联物的各种纯化方法的特点。抗体偶联物领域的未来前景也进行了简要讨论。 1.引言 在过去二十年中，ADC（抗体-药物偶联物）的生产在工业研发领域迅速增长。已有10种ADC获得FDA批准用于临床（表1），并且目前有超过90种ADC正在进行临床试验。ADC的结构可以分为五个部分：单克隆抗体(mAb)、细胞毒性药物有效载荷、连接子、附着点和偶联位点（图1）。与正常组织相比，单克隆抗体通常对肿瘤相关抗原具有特异性亲和力。因此，ADC是将药物输送到肿瘤细胞和肿瘤微环境的有前景的系统。mAb及其衍生的ADC通常来源于CHO细胞。由于从CHO细胞生产抗体的批量喂养过程估计平均价格为每克59美元，已有几项尝试降低这一成本的报道，包括使用微生物系统。 图1 ADCs各部分的要求 有效载荷化合物对于多年来一直在处理小分子化合物的合成有机化学家来说并不陌生。在过去的100年里，从自然环境中分离出并合成了大量可能适合作为有效载荷的化合物，目的是展示新的化学反应和优雅的合成策略，如发散合成、原子经济、氧化还原经济策略和无保护剂策略。然而，这些天然产物的宝库在ADC领域并没有得到有效利用，目前，只有少数天然化合物类似物成功应用于ADC。有效载荷需要具有极高的细胞毒性，如美登素和auristatins。auristatin衍生物如MMAE和MMAF在目前处于临床试验阶段的ADC中广泛使用。由于MMAE和MMAF具有极高的效力，残留的药物连接子必须从ADC组成中完全去除。因此，也需要特别考虑清除药物连接子的问题。 除了抗体和有效载荷外，包括偶联位点、连接子和附着点的偶联化学对于生产稳定有效的ADC至关重要。有效载荷通过连接子与抗体上的偶联位点反应连接，使用温和的化学反应，如硫醇/马来酰亚胺偶联或点击化学，形成ADC。连接子可以被切割，连接有效载荷和抗体的附着点需要具备几个特性，如低亲水性和在血浆中足够的稳定性，以稳定形成ADC。此外，连接子必须设计成便于在肿瘤组织内化后有效载荷的切割和释放。偶联方法的开发是ADC开发领域感兴趣的热门话题。关于这一不断发展的技术，已经发表了一些综述。目前，所有FDA批准的ADC都是通过在溶剂暴露的赖氨酸的氨基或半胱氨酸的巯基上进行偶联，通过二硫键还原来生产的。所生产的ADC的DAR（药物-抗体比率）对ADC的药物效力和安全性概况有重大影响。高DAR物种通常会导致ADC的聚集，并在体内显示出快速的清除率，导致安全性降低和药物效力降低。低DAR物种存在药物效力问题。ADC的最佳DAR会有所不同，优化DAR在ADC制造中至关重要。连接子结合的稳定性取决于偶联位点，这种共价连接的稳定性影响所准备的ADC的稳定性、药代动力学和体内效力概况。生产一种提供最宽治疗指数的理想ADC格式是ADC开发的主要目标，探索理想偶联方法的研究正在发展。 需要有前景的偶联技术来生产有效/安全的ADC，建立强大和简化的ADC制造流程。目前，可扩展ADC流程的开发对于制药公司和CDMOs来说仍然是一个极具挑战性的任务。从简单的CMC（化学、制造和控制）角度来看，化学偶联是有利的，因为这种方法除了药物连接子之外只需要少量的小分子化合物，如交联剂和/或还原剂。这一优势促使ADC开发者为他们的ADC候选产品选择化学偶联技术。 典型的ADC生产过程如图2所示，重点介绍了每个纯化步骤。起始的mAb在适当的缓冲液中重新溶解，然后进行TFF（切向流过滤）以去除mAb样品中的小分子，如稳定剂。这一TFF过程还有助于将原始稳定抗体的缓冲液换成适合偶联反应的溶液。抗体修饰步骤之后是偶联步骤，得到粗ADCs，通过单一TFF或包括适当的色谱后的顺序双重纯化以及TFF进行纯化。由于回收率更高，简化的单一TFF过程更受青睐；然而，这种方法不能分离DAR（药物-抗体比率）物种。工业上DAR物种的色谱分离是ADC工艺开发领域的热门话题。最近已经报道了一些有前景的方法；然而，这种方法仍然需要一个额外的TFF步骤来进行缓冲液交换以得到最终的ADC组成，因为色谱中使用的洗脱缓冲液含有高浓度的盐或pH值较低，这些条件对最终ADC配方并不理想。 图2 典型的ADCs生产方法 在这篇综述中，讨论了包括有潜力用于ADC纯化的各种纯化方法在内的最新报告。也简要讨论了抗体偶联领域的未来前景。 2.切向流过滤 目前，TFF在ADC生产过程中广泛用于去除有机溶剂和与偶联相关的杂质，如TCEP，以及进行缓冲液交换。TFF是一种简单而稳健的纯化方法，能够实现高回收率的ADC（通常超过90%）。2019年，Liao等人报告了DF步骤的技术评估，表明包括溶剂和TCEP相关副产品在内的小分子杂质的清除率受pH值、温度、膜载荷、跨膜压力和交叉流速的影响最小。这些研究为从事相关生物制药工艺开发的技术社区提供了技术指导。 除了去除小分子外，这些纯化方法在技术上还能够去除所有与药物连接子相关的杂质，因为这些化合物的分子量明显低于TFF系统中使用的膜的MWCO（分子量截止值）。然而，在某些情况下，清除这些细胞毒性有效载荷是具有挑战性的。药物连接子化合物具有很高的亲水性，可能会触发自组装，在缓冲液中产生不希望的胶束。因此，去除这些疏水性细胞毒性药物连接子需要额外的色谱纯化步骤，并且已经报道了有关这个问题的研究。2018年，Nadkarni等人仔细评估了TFF中清除游离药物连接子相关杂质的灭活剂（图2）。最初，进行了膜筛选和DF条件的调查，但所有尝试都被证明在提高药物连接子杂质的清除率方面都是无效的。通过筛选几种通过Michael加成使有效载荷的马来酰亚胺基团失活的硫醇衍生物，检查了偶联后降低其药物连接子化合物的亲水性。这些研究表明，使用L-半胱氨酸的灭活有效地去除了载荷衍生物，因为半胱氨酸加合物。此外，有报告表明酸性缓冲液增强了NAC灭活药物连接子的清除率。通过四极TOF-MS的提取离子色谱图分析了清除率，并揭示了通过TFF去除了超过99.4%的NAC灭活的MC-VC-MMAE。这个比率与这种分析方法的检测限相似。因此，NAC灭活的MC-VC-MMAE的清除可能非常接近100%。 使用TFF系统的UF/DF纯化是一种稳健且多功能的方法；然而，一些技术缺陷仍然存在。首先，这种纯化方法不能去除聚集体。聚集体的分子量与ADC相当，因此保留在最终ADC样品中。其次，TFF系统不能分离DAR物种，因此最终ADC作为DAR混合物获得。需要色谱程序来去除这些与抗体相关的杂质。 图3 在TFF中清除游离药物连接子相关杂质的灭活剂的影响。(A) 各种灭活剂的示意图。(B) Nadkarni小组报告的每种灭活剂的比较。 3.色谱法纯化 色谱法是从小培养基中纯化单克隆抗体的流行方法。特别是，亲和色谱法如Protein A经常用于实验室和生产规模的抗体纯化。然而，这种纯化技术需要酸性洗脱，可能会导致低回收率。此外，Protein A纯化可能会增加抗体聚集；尽管有几项研究报道了克服这一潜在问题的尝试，并且应该适合ADC纯化。在这篇综述中，主要讨论了正交色谱法，如尺寸排除色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱、羟基磷灰石色谱和膜色谱。 3.1.尺寸排除色谱 SEC根据其分子大小分离包括ADC在内的蛋白质，也称为凝胶过滤色谱。SEC在ADC生产中扮演着多种角色，包括缓冲液交换（脱盐）、去除非蛋白质杂质（如有效载荷等低分子量化合物）和去除聚集体。特别是，减少聚集是ADC制造中的主要目标，因为聚集促进免疫原性，这会导致严重的不良事件。SEC在广泛的条件下都是稳定的；然而，典型的柱条件是温和的，即室温下中性pH缓冲液。此外，SEC柱与有利的MS兼容，有几份报告使用SEC柱进行本征MS。 基于这些优势，尺寸排除色谱（SEC）是实验室中纯化ADCs的黄金标准方法。一次性SEC柱（例如GE Healthcare的PD-10柱）通常用于小规模ADC纯化，而前述的TFF则更受青睐并用于ADC规模化生产过程。然而，TFF系统可能会产生死角体积，这需要相应地稀释反应混合物。然而，过多的稀释可能导致材料损失和回收率降低。此外，与一次性SEC柱相比，TFF系统使用的缓冲液体积要大得多。为了支持小规模纯化和制造纯化过程之间的技术差距，据报道评估了更大的SEC柱（EMP Biotech的CentriPure P50和P100）到数百毫克ADC纯化水平，其中一种SEC柱，“CentriPure”系列，显示出ADC的足够回收率（>94%）。该柱在双重纯化后的载荷清除率也是可以接受的。 理想情况下，SEC柱没有二次相互作用，例如SEC固定相和ADCs之间的疏水或静电相互作用。不幸的是，这种不希望的相互作用在纯化过程中已有报道。Fekete等人检查了多种柱子的性能，揭示了依赖于所用柱子表面的显著不同的非特异性相互作用。这项研究应该有助于在使用SEC进行ADC纯化时的柱子选择。 3.2.疏水相互作用色谱 除了去除残留的小分子和聚集体外，DAR分离是ADC色谱纯化的另一个重要方面。为此，由于其分辨率较低，SEC不是合适的方法。因此，需要其他基于树脂的技术。疏水相互作用色谱（HIC）通常用于ADC的DAR测定，因为它具有非变性分析的可取优势。通常，与天然抗体相比，ADCs具有改变的物理化学性质，因为共价连接的疏水药物连接子。这种疏水性差异在HIC中被利用，因为这种色谱方法可以在没有任何预处理的情况下，在天然条件下对完整的ADCs进行。传统的基于半胱氨酸的ADCs，其目标DAR<8，通常是由五种主要物种（即DAR=0, DAR=2, DAR=4, DAR=6和DAR=8）组成的混合物。由于每个物种的有效载荷量不同，这些混合物中的物种通过HIC分离，并且可以通过计算ADCs的平均DAR获得具有视觉明确的物种分离的色谱图。除了用于DAR分析外，这种温和的天然色谱技术也可以用来纯化ADCs。2004年，Seattle Genetics（现在的名字是Seagen）的Francisco等人比较了通过制备HIC纯化的DAR=2, DAR=4和DAR=8的基于半胱氨酸的ADCs的体内效力和药代动力学。在这篇开创性报告之后，几个小组按照这种分离条件进行了DAR分离。 2020年，Ajinomoto的Mendelsohn等人报告了一种包括化学位点特异性偶联的ADC生产策略，称为AJICAP，然后是制备HIC纯化步骤。这种组合策略减少了生产的ADCs的异质性。在筛选移动相和树脂后，获得了均质化的“DAR=1.0”和“DAR=2.0”位点特异性ADCs。含有硫酸铵的移动相，通常用于HIC系统中捕获蛋白质，结果ADCs的回收率较低。这一现象可能由这种Hofmeister盐的负面影响所解释。含硫酸铵的树脂意外地捕获了ADCs，这些目标物种在这种洗脱条件下没有回收。选择氯化钠（NaCl），这是一种相对较弱的溶致性盐，以克服这个问题。除了优化回收率外，使用NaCl的移动相还显示出DAR依赖性特征（图4）。这个移动相没有捕获具有低疏水性的DAR=0化合物，这些材料在样品装载后刚通过柱子。DAR=0化合物可能通过可能与有限表达的靶抗原结合来影响ADCs的效力。从这个角度来看，完全去除DAR=0材料可能有助于产生有效的ADCs。这种色谱方法还分离了均质化的DAR=1和DAR=2化合物，这两种化合物都通过体外基于细胞的测定进行了评估。两种DAR化合物都显示出显著的效力，正如它们的DAR数字所反映的，针对抗原过表达的细胞系。相比之下，在使用低抗原表达的细胞系时没有观察到细胞毒性。这些结果表明，HIC纯化后的位点特异性ADCs既保留了相当的细胞毒性活性，又具有所需的目标选择性。 图4 用于分离不同DAR物种的HIC色谱柱的色谱图结果 利用HIC的纯化策略仍需要进一步优化，例如峰分辨率和ADCs回收。最近，Tosoh Bioscience的Müller等人报告了筛选树脂以纯化ADC模拟化合物，表明回收率依赖于移动相的pH值。Tosoh Bioscience生产的Toyopearl系列是用于各种蛋白质纯化协议最常用的HIC树脂，预计会进一步优化以应用于ADCs。 3.3.离子交换色谱 除了HIC外，另一种可能的在天然条件下进行ADC纯化的方法是离子交换色谱（IEC）。IEC用于蛋白质分析，如电荷变体分析、糖型分析和了解蛋白质的结构变化。尽管IEC是一种提供信息的技术，但很少有报告使用IEC进行ADC分析或纯化。通常，IEC产生高回收率，并去除非抗体相关化合物，包括小分子和内毒素。因此，IEC是纯化ADCs的一种有前景的方法。 3.4.羟基磷灰石色谱 羟基磷灰石（HA）色谱是单克隆抗体纯化的一种有用方法。HA是钙和磷的矿物质，这种合成形式通过钙金属亲和及磷酸根阳离子交换与抗体结合。这一独特的特性确保了在去除抗体溶液中的DNA和内毒素时，抗体聚集显著减少（从60%降至0.1%）。因此，HA色谱通常在Protein A色谱后使用。Protein A的洗脱液含有纯化的抗体以及与细胞培养和渗漏的Protein A相关的小残留杂质。HA色谱有效地去除了这些杂质。尽管有这些优点，HA通常只在日常流程中用于天然抗体的纯化。目前，只有少数报告描述了将HA色谱应用于ADCs的纯化。 3.5.膜色谱 除了相对较低的回收率外，基于树脂的色谱技术（如HIC和IEX）还有许多潜在风险。这些色谱技术需要在树脂表面长时间接触，并使用高浓度的盐，如NaCl和硫酸铵。这些盐在生产设施中构成废物问题，并可能引起ADCs的聚集和/或沉淀。对ADC分离的填充床色谱实验的报告限制迫使研究人员寻找多功能、成本效益高的替代品。膜色谱（MC）在日常的抗体下游过程中常规使用，是树脂基色谱有希望的替代品；然而，发表的ADCs纯化应用很少。非常最近，Abzena的Zhou等人报告了MC在纯化ADCs中的独特应用。他们使用Sartobind膜（来自Sartorius Stedim Biotech GmbH）的纯化方法能够从ADC组成中去除聚集体和残留药物连接子，以及DAR分离。有趣的是，他们还成功地纯化了基于吡咯并苯并二氮杂卓二聚体（PBD）的ADCs。PBDs是非常有毒的疏水有效载荷。这种高效性是一把双刃剑。最终ADC组成中少量残留的PBDs可能导致剂量限制毒性。除了单一的MC外，Zhou等人的报告还披露了串联膜色谱，这减少了纯化时间，使用的移动相数量最少。这两种不同的色谱的组合已成为分析领域的热门话题。这种吸引人的技术被称为二维液相色谱（LC × LC或2D）。2D-LC技术比单一色谱步骤提供更多信息，并通过快速高效的分析获得更大的分辨率。这种技术已应用于ADC表征。HIC× SEC组合可以与MS联用，因为第二维度（SEC）能够去除第一维度（HIC）中DAR分离所必需的非挥发性盐。像2D分析分离一样，Zhou小组成功地使用了两种不同的膜（Sartobind S和Sartobind Phenyl）进行串联纯化。MC系统的一个重要优点是分离模式在高流速和低压下进行。因此，串联系统可以通过简单地连接两种不同的膜而无需优化缓冲液/流条件来实现。这种优雅的纯化方法成功地去除了游离药物连接子和聚集体，同时通过单一单位的色谱操作细化了DARs。预计这种方法在生产ADCs中的进一步应用。 3.6.其他色谱 除了上述纯化方法外，还报道了一些其他色谱技术在ADC分析领域的应用。亲和色谱通常用于评估抗体的性质。除了Protein A外，Protein G和Protein L，它们对Fc受体有亲和力，可用于抗体表征。最近，Tosoh Bioscience推出了一种亲和色谱柱，由非多孔聚合物粒子固定重组FcγIIIa受体-配体。这个有用的分析工具在天然条件下用于抗体的糖谱分析。非常最近，这个工具被用来分析ADC并评估ADCs的异质性。这种色谱方法在天然条件下的性质可能在ADC纯化方面具有重要的潜力。亲水作用色谱（HILIC）是另一种可能的方法，用于评估抗体的糖基化谱，并在ADC分析和制备中有潜在应用。使用HILIC柱对生物类似抗体进行定性比较的报告。HILIC固定相是分离复杂混合物中极性化合物的有效方法。这一独特的特性应该激发分析化学家使用HILIC进行生物分析应用，因为代谢物的适当极性。尽管HILIC具有这种性质，但只有少数报告描述了将HILIC分离应用于ADC分析。 4.未来展望 最后，对ADC制备未来方向的预测如下。考虑到CMC的主要优势和扩大ADCs的治疗指数，探索位点特异性偶联技术以产生均质ADCs的趋势将会持续。例如，使用酶是实现ADCs位点特异性偶联的有前途的方法。已有几种酶被报道可以在不涉及基因工程的情况下修饰天然抗体。酶促修饰能够因为酶的独特属性而生产严格控制DAR的ADCs。目前正在进行几项关于酶位点特异性ADCs的临床前研究。然而，酶促方法可能存在可能阻碍其在ADC生产中使用的潜在问题，包括纯化步骤。从ADC制剂中去除酶可能具有挑战性，因为酶的分子大小和物理性质可能与ADCs非常接近，从而阻碍了它们的直接分离。显然需要开发纯化方法来克服这个问题。 化学位点特异性偶联由于其简单的组成，有能力简化ADC合成。从监管的角度来看，这种创新方法有很大的潜力成为提供下一代ADCs的标准方法。与传统的TFF系统相比，化学偶联通常需要相对较小的分子，如亲和试剂。因此，传统的TFF系统足以纯化ADCs。此外，色谱分离和位点特异性偶联的结合可能能够生产出具有均匀DAR和单一偶联位点的纯ADCs。除了新颖的偶联技术外，我们还必须考虑不断发展的新模态领域。在不久的将来，模态将多样化，以便于生产与“常规”抗体不同的分子格式。复杂的抗体相关物如双特异性抗体和Fc融合蛋白在肿瘤学界已经变得流行。此外，将这些抗体相关物转化为ADCs可能也会被要求。对于这些新型ADC亲属的生产，可能需要新的尖端纯化策略。 5.结论 这篇综述提供了ADCs纯化技术的概述，重点关注了最近的进步。TFF系统中的UF/DF和几种色谱纯化方法是ADC制造过程中的既定方法。然而，ADCs的异质性和潜在的残留和疏水药物连接子的污染风险是需要解决的问题。因此，需要进一步开发和优化纯化协议以确保ADCs的均质性和去除污染物。此外，ADCs纯化方法的发展必须跟上作为临床治疗使用的新型复杂大分子的发展步伐。ADCs纯化方法的演变应该补充为制造具有新模态的复杂结构而开发的稳健过程。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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近年来，抗体偶联药物（ADCs）领域取得了显著进展。这些药物由单克隆抗体与具有细胞毒性的小分子药物通过共价键连接而成，其结构的复杂性为化学合成、生产过程和质量控制带来了挑战。在ADC药物的开发中，关键的质量属性包括工艺的优化、药物与抗体的结合比例、游离药物的接头以及聚集体的形成，这些都需要通过精细的纯化策略来严格管理和去除。本文综述了ADC药物的多种纯化技术，并对其未来的发展方向进行了探讨。 ADC的结构 ADC的结构主要由三个核心组成部分构成：单克隆抗体、药物载荷以及连接子系统（含连接子、配体和偶联位点）。 单克隆抗体：这些抗体对肿瘤相关抗原展现出特异性结合能力，允许ADC精确地定位到肿瘤细胞及其微环境中，进而将药物载荷传递至肿瘤细胞（此部分的单抗也包括其衍生形式）。 药物载荷：载荷通常是具有极高细胞毒性的小分子，例如美登木素生物碱和阿里他汀，其IC50值达到亚纳摩尔级别。鉴于其强烈的毒性，必须确保从ADC制剂中彻底去除任何未反应的药物载荷和连接子。 连接子系统：该系统负责将单抗与药物载荷连接起来，对制造稳定而有效的ADC至关重要。连接子设计上通常需要较低的疏水性，并分为可裂解和不可裂解两种类型。可裂解连接子在血液循环中保持稳定，并在到达肿瘤组织后能够释放药物载荷；而不可裂解连接子则以其高稳定性为特点，依赖于抗体在溶酶体中的酶促降解来释放载荷。至于偶联位点的选择，必须确保不干扰抗体的抗原结合能力和FcRn相互作用。目前，所有经FDA批准的ADC药物的偶联位点均为位于赖氨酸侧链氨基或通过二硫键还原得到的半胱氨酸巯基的可接触位点。 图 1. ADC各部分的结构和要求 ADC的典型生产方法 图2展示了ADC的典型生产流程，特别强调了纯化环节的重要性。初始的单克隆抗体通常存在于一个有利于其稳定性的缓冲系统中。首先，通过切向流过滤（TFF）技术去除样品中的小分子物质（例如添加剂等），并将其转移到一个适宜进行偶联反应的缓冲环境中。然后，对单抗进行还原处理，并与小分子药物载荷进行偶联，形成ADC中间体。 在偶联过程中，除了目标ADC分子外，还可能产生一些未反应的小分子、偶联副产物、DAR值异常的分子以及聚体等杂质。这些杂质需要通过纯化步骤去除。初步的纯化可以通过TFF去除小分子杂质，但对于DAR值异常和聚体等更复杂的杂质，则需要利用层析技术进行有效分离。经过纯化，ADC分子再次通过TFF进行缓冲液替换，以适应最终的储存条件。 图 2. 生产ADC的典型制造方法 切向流过滤 切向流过滤（TFF）在抗体偶联药物（ADC）的生产流程中扮演着关键角色，尤其在去除有机溶剂、偶联副产物和缓冲液置换方面显示出其高效性。TFF以其开发简便、操作稳定性强和高回收率（通常超过90%）等优势而被广泛采用。 应用场景：TFF特别适用于清除各类小分子杂质，包括溶剂、还原剂（如TCEP）以及药物-连接子复合物。这些杂质的分子量通常远低于TFF膜的截留阈值，因此可以透过膜而被有效清除。 面临的挑战： 疏水性化合物的自聚集问题：某些药物-连接子化合物由于其高度疏水性可能倾向于自聚集，形成胶束。当这些胶束的尺寸超出膜的截留能力时，它们将难以通过TFF清除。在这种情况下，可以考虑采用层析技术或通过化学手段降低这些化合物的疏水性。如图3所示，通过筛选不同的巯基衍生物来淬灭马来酰亚胺活性基团，发现使用L-半胱氨酸作为淬灭剂可以有效通过TFF去除药物载荷衍生物，而其他淬灭剂的效果则不尽人意。 聚体的去除难题：TFF在去除分子量大于或等于ADC单体的聚体方面存在局限，因为这些聚体往往会被膜截留。 DAR值不同的ADC混合物的分离问题：TFF无法区分并分离具有不同药物抗体比例（DAR）的ADC混合物。在这种情况下，需要依赖层析技术来去除与单抗相关的杂质。 图 3. 淬灭剂对TFF中游离药物linker相关杂质清除的影响。(A) 每种淬灭剂的插图, (B) Nadkarni课题组报道的各淬灭剂的比较 尺寸排阻层析 尺寸排阻层析（SEC）是一种基于分子量差异来分离蛋白质和杂质的技术。在抗体偶联药物（ADC）的提纯过程中，SEC扮演着重要角色，它不仅可以用于缓冲液置换（去除盐分）、去除低分子量的非蛋白杂质（例如药物载荷）和聚体，还能与质谱技术联用，以获得更丰富的信息。 应用场景：SEC是实验室规模ADC纯化的优选方法，常用的层析柱如GE和PD-10，它们能够有效地去除小分子和大分子杂质。SEC的操作条件通常温和（室温下的中性缓冲液），ADC分子与层析介质之间几乎没有疏水性或电荷等复杂的相互作用，尽管也有报道指出存在一些非特异性的相互作用。 挑战点： 规模化应用：SEC在实验室小规模纯化中表现优异，但在大规模生产中，TFF技术更为常见。为解决规模放大的问题，一些供应商推出了大容量的SEC层析柱，例如EMP、CentriPure P50和P100，这些产品使得单次SEC层析能够处理数百毫克的ADC，从而满足规模化生产的需求。 疏水相互作用层析 在抗体偶联药物（ADC）的纯化过程中，除了清除小分子杂质和聚体外，不同药物抗体比例（DAR）值的ADC的分离也是一个关键环节。传统的TFF和SEC技术在这一分离任务中存在局限性。由于共价结合在单抗上的连接子和有效载荷通常具有疏水性质，DAR值的增加通常伴随着ADC疏水性的增强。利用疏水相互作用层析（HIC），可以在不改变ADC天然状态的前提下，有效地分离不同DAR值的ADC。 应用场景：如图4所示，HIC层析被用于分离具有不同DAR值的ADC混合物。通过向样品中添加适当浓度的NaCl，促进样品与疏水层析介质的结合。DAR值为0的ADC由于缺乏疏水性，不会与HIC介质结合，从而在层析过程中被洗脱。随着洗脱过程中NaCl浓度的逐渐降低，DAR值为1和2的ADC由于疏水性的差异（DAR1 < DAR2）而依次被洗脱，实现了有效分离。进一步的实验结果表明，经过HIC纯化的ADC在细胞毒性和靶向选择性方面均保持了良好的活性。 挑战点： 在HIC层析中，不同洗脱峰之间的分辨率和ADC的收率是需要特别关注的。为了提高分离效果，可能需要对填料或流动相条件进行优化。例如，在图4中的案例中，最初使用的盐是硫酸铵，但由于收率较低，后来改用了NaCl体系。 图 4. 用于分离不同DAR物质的HIC柱的色谱图结果 离子交换、羟基磷灰石层析和其他柱层析方法 离子交换层析（IEC）是一种基于电荷差异来分离目标蛋白和杂质的技术，它可用于区分电荷异构体、糖型变异和结构变化等。IEC不仅回收率高，还能有效去除非抗体相关的杂质，包括小分子物质和内毒素。尽管目前关于使用IEC进行ADC分析和纯化的案例较少，但其潜力不容忽视。 羟基磷灰石层析（HA）利用其填料中的钙和磷酸盐矿物质，通过金属离子亲和力和阳离子交换的静电作用，实现抗体的结合和分离。HA在去除聚体方面表现出色，有案例显示其去除效率极高，能将聚体含量从60%大幅降至0.1%，同时也能有效去除DNA和内毒素等杂质。尽管HA层析在ADC纯化中的应用报道不多，但其效果值得关注。 其他柱层析技术也在ADC的分析和纯化中发挥作用，包括亲和层析和亲水相互作用层析（HILIC）。TOSOH公司推出的亲和层析柱，由固定有重组FcγIIIa受体配体的无孔聚合物颗粒构成，能够在天然条件下对抗体进行聚糖分析。最近，有研究利用这种填料对ADC进行异质性评估。HILIC作为一种固定相技术，能有效分离复杂混合物中的极性化合物，如抗体的糖基化部分，其在ADC的分析和制备中也有应用案例。对于感兴趣的读者，可以在相关文献中找到更多详细信息。 膜层析 柱层析技术虽然在分离杂质方面表现出色，但也存在一些局限性。例如，它可能需要与填料长时间接触，以及依赖高浓度盐溶液来实现蛋白质的吸附和洗脱，这些因素都可能增加生产成本，甚至导致ADC的聚集或沉淀。为了解决这些问题，膜层析技术提供了一种替代方案，尽管目前关于其应用的报道还相对有限。 有研究者采用Sartobind膜层析系统对ADC进行纯化，结果表明该技术能够有效地去除聚体、残留的药物-连接子以及非目标DAR值的ADC组分。此外，另一个案例通过将Sartobind S和Sartobind Phenyl膜层析技术串联使用，在保持高流速和低压力的条件下，成功去除了游离的药物-连接子和聚集体。 未来ADC纯化的挑战 定点偶联技术在ADC药物制造领域正迅速进步，它能够生产出成分更为一致的ADC产品。例如，利用酶催化实现定点偶联是一种充满潜力的技术。但同时，这种酶的分子大小和物理特性可能与ADC分子相近，这可能使得从ADC中间产物中去除这些酶成为一个难题。鉴于此，化学定点偶联技术可能因其使用的较小分子（例如亲和配体）而成为未来ADC生产的首选方法，这些小分子可以通过标准的TFF技术有效分离。 ADC的未来不仅仅局限于传统的单克隆抗体。预计，更复杂的抗体衍生物，如双特异性抗体和Fc融合蛋白等，将逐渐成为研发的热点。这一趋势将为ADC的纯化过程带来新的挑战。 文献来源：Matsuda Y. Current approaches for the purification of antibody-drug conjugates. J Sep Sci. 2022 Jan;45(1):27-37.  识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

深度聚焦多肽、多肽偶联药物研发、质控、工艺开发，7月相约苏州，联系电话181 1603 6798文章来源：独角兽智库◇驱动：20230809司美改善心脏负担20%数据大超预期，带来用药人群数进一步扩大&用药时长极大拓展（每周一针打五年）2司美从减肥消费品领域再次出圈，拓展至中老年肥胖人群日常保健用品，适应症扩展空间巨大2023年9月11日盘前消息，礼来总市值突破5500亿美元，摩根大通提高了对减肥药的销售额预测，预计到2030年GLP-1受体激动剂（胰高血糖素样肽-1受体激动剂）类药物年销售额将超过1000亿美元。◇海外空间：根据美国 CDC 数据，肥胖造成美国医疗系统每年约1730亿美金的开支，而非直接开支更大。然而，现在商业保险覆盖减肥药的比例很低，若保险进一步覆盖减肥药，那么减肥药的市场天花板将会被再一次打开。市场空间多肽药物市场空间广阔，多肽原料药主要看重磅原研药专利到期，多肽创新药主要看新品种放量和在减肥适应症上的应用。根据Frost & Sullivan数据，2020年全球肽类市场规模达628亿美元，中国市场也有85亿美元，市场空间庞大。以糖尿病领域的利拉鲁肽、司美格鲁肽、度拉糖肽和Tirzepatide等为代表的重磅产品其原研药2022年销售超200亿美元，其中利拉鲁肽在中国专利已到期，司美格鲁肽和度拉糖肽在中国的专利也将干2026年到期，有望带来多肽仿制药的研发热潮。而随着司美格鲁肽的减肥适应症与2021年获批和Tirzepatide在减肥上表现的突出疗效，多肽在减肥领域将有望实现放量。多肽产业链迎来行业上行周期根据《中国心血管健康与疾病报告》,约12%的CVD死亡归因于高体重指数 (BMI)，年死亡人数已超5万。2019年中国归因于高体重指数的CVD死亡人数为54.95万，11.98%的CVD死亡归因于高BMI。预测2030年肥胖及超重人群超8亿，体重控制是中国人健康的重中之重。根据《中国心血管健康与疾病报告》,2030年成人、7-17岁青少年和<6岁儿童的超重与肥胖率可达65.3%、31.8%和15.6%，对应人群为7.90亿、0.59亿、0.18亿加和后达到8.67亿。中国超重肥胖产生的直接费用已超80亿美元，2030年时或将超4000亿元。根据《中国心血管健康与疾病报告》,中国因超重与肥胖产生的直接费用在84-239亿美元，间接费用为626亿美元，在未考虑医疗费用长期增长的情况下，2030年因肥胖与超重产生的医疗费用预计为4180亿元人民币。我们认为，中国目前超重与肥胖人群已超5亿，考虑到2030年或将超8亿，由于超重与肥胖将增加人群心血管事件以及多项疾病的发生风险，带来巨额的医疗费用支出，因此减少超重与肥胖人群数量是需要持续重视的社会健康问题下游应用市场GLP-1类药物减肥降糖市场未来广阔，探索更多潜在适应症降糖与减重适应症为核心赛道，NASE和阿尔兹海默症处于探索阶段。目前已进入临床阶段的的GLP-1药物共计144款，其中有119和60款药物布局了糖尿病与减重适应症，这两个适应症也是GLP-1类药物的核心竞争赛道有28和5款药物布局了NASE和阿尔兹海默症，目前未有GLP-1类药物在这两项适应症上获批，尚外于探索性阶段。多靶点药物已逐渐成为主流，集中于GIP与GCGR两靶点上。在104款临床药前药物中，多靶点药物已有44款，占比达42.3%。其中GLP-1/GIP、GLP-1/GCGR和GLP-1/GIP/GCGR分别为11、10和4款，在多靶点药物中占比达56.8%。NAFLD(非酒精性脂肪性肝病)已成中国第一大慢性肝病，可导致NASH(非酒精性脂性炎与HCC ( 肝细胞癌)NAFLD是一种与胰岛素抵抗相关的代谢性疾病，疾病谱中包括NASH、HCC、肝硬化和非酒精性肝脂肪变。NAFLD进展至中后期可发展为NASH，中国NASH患者超8000万。根据《非酒精性脂肪性肝病防治指南》及Science披露，中国成年人中NAFLD患者占比超25%，其中样本调查中NASH检出率超40%，测算下来我国成年NASH惠者已超8000万，患者数量庞大。司美格鲁肤可有效缓解脂肪性肝炎。在一项期研究中，相较于安慰剂组，司美格鲁肤组(0.4mg )可显著消除患者脂肪性肝炎 ( 59% s 17%,P<0.001);美格鲁肤组也可改善惠者肝纤维化，但与对照组无统计学差异(43% Vs 33%P=0.48)GLP-1类药物在NASH适应症上持续推进中。司美格鲁肤与替尔泊肤在NASH上的亚期与I期临床均在持续推进中，初始结果有望于2028年及2024年揭晓。诺和诺德司美格鲁肽 22年销售额已突破百亿美元，彰显市场潜力，礼来双靶点替尔泊胀 22 年于美国获批降糖适应症，空间广阔。诺和诺德司美格鲁肽产品包括Ozempic、 Rybelsus和Wegovy,2023年H1销售额为92.15亿美元，同比增长87%，占总营收57.74%。糖尿病板块的销售增长，主要得益于GLP-1销售额的增长。其中司美格鲁肽注射针Ozempic销售额61.87亿美元，同比增长58%:司美格鲁肽口服制剂Rbelsus销售额12.377美元同比增长97%。司美格鲁肽减肥针Wegovy2023年H1销售额17.9亿美元，同比增长367%。2023年上半年大中国区2型糖尿病治疗领域GLP-1产品销售31.18亿丹麦克朗(33.1亿人民币 )，同比增长97%，司美格鲁肽收入23.5亿人民币，同比增长了154%。反映出司美格鲁肽在中国区的强劲增长表现。竞争格局GLP-1临床优势明显，并已逐步成为减重赛道主流靶点：GLP-1R激动剂药物治疗2型糖尿病(T2DM)中显示出良好的治疗效果，且与目前在临床上使用的药物相比不会引起低血糖和体重增加的副作用。2023版ADA指南根据降糖药物的减重效 果排序，司美格鲁肽为“减重效果非常高”的药物，度拉糖肽和利拉鲁肽为“减重效果高”的药物。在目前21款开展肥胖 适应症的药物中18项为GLP-1/GLP-1R 激动剂，且双/多靶开始成为研发新趋势。GLP-1 类药物申报迎来爆发期，华东医药、恒瑞领跑国内：截止2023年6月，国内已经申请临床及以上的GLP-1 类药物一共99个，已经批准上市的创新药10个，生物类似药仅有华东医药的利拉鲁肽。除了礼来、诺和诺德等国外巨头进军国内GLP-1市场外，国内药企也抢滩登陆持续发力，目前信达生物、恒瑞医药研发进展领跑国内。此外， GLP-1/GLP-1R激动剂BD频出，2023年以来已有3项交易，未来BD值得期待。GLP-1进军多个蓝海领域潜力巨大：除已广泛应用的糖尿病外， GLP-1在减重领域增长迅猛，心血管风险控制效果已被验证，同时在多个适应症如肾病、肝病、阿尔默兹海默、外周动脉疾病等被初步验证，部分药物已有临床数据读出，市场潜力巨大。GLP-1受体激动剂是减肥药赛道最热门的“靶点”，掀起了全球新一轮的减肥药物研发热潮。根据天风国际研报，截至2023年8月份，共有106个GLP-1类减肥新药的临床试验项目，中国企业有43个，占比约40%。市场研发热情可谓高涨。商业模式多肽药物历史悠久，应用集中在肿瘤、消化道等领域多肽药物发展历史悠久，市场规模巨大，应用集中于肿瘤、消化道等领域。自1902 年首个多肽物质在人体内被发现，多肽研究至今已发展超过百年。目前全球获批的多肽类药物约 180 种，根据肽研社统计，2021 年全球多肽药物(包含胰岛素) TOP32 销售额达 505.3 亿美元，市场规模巨大。市场格局看,在获批多肽药物中,抗肿瘤领域数量最多(30%).其次消化道领域(14%)、糖尿病领域 (13%) 和罕见病 (11%)。工艺介绍：多肽合成工艺: 化学合成+生物合成多肽API合成:化学合成+生物合成。1) 多肽化学合成: 液相合成+固相合成。1) 液相合成:逐步一次连接、逐步纯化、可随意修饰、适合短肽(10 个氨基酸以下):2) 固相合成: 主流方法: 自动化程度高，适用于中长肽、缺点是物料投料量较大，且无法对中间产物进行纯化;多肽生物合成: 包括发酵法、基因工程法、酶解法等。其中发酵法是商业端应用较多的方法，优势是物料成本较低但前期设备投入较大，且提纯较为复杂，工艺放大难度较高 (放大后单位体积菌液收率可能下隆):半发酵: 对于结构较为复杂的多肽产品，在生产中通常将生物与化学合成法结合，即先利用发酵法制得多肽中间体，再通过化学合成得到目标胀段。◇国内相关公司介绍：国内华东医药利拉鲁肽生物类似物于23 年在国内获批降糖适应症国内其他在研品种有序推进，预计未来将共同推动行业扩容。中游: CDMO 及API企业，主要包括药明康德、凯莱英、圣诺生物、诺泰生物、昂博制药、安科生物翰宇药业等:上游:供应生产所需试剂等，包括缩合试剂(吴帆生物)、固相合成载体(蓝晓科技) 及氨基酸、填料等。建议关注吴帆生物及圣诺生物。常山药业：公司艾本那肽与司美格鲁肽同为GLP-1类药品。昊帆生物：国内多肽合成试剂领域昊帆生物处于龙头地位，其余厂商依赖特定的专精产品。多肽合成试剂主要可以分为缩合试剂、保护试剂与手性消旋抑制试剂。根据肽研社与昊帆生物招股书，2020年中国缩合试剂的市场规模达17.3亿元，保护试剂与手性消旋抑制试剂市场规模约为4.2-8.4亿元。目前国内的合成试剂厂商多数侧重于某一单一品类，昊帆生物是国内唯一拥有全系列多肽合成试剂产品的企业。2020年，昊帆生物占缩合试剂的市场份额约为9.54%，占保护试剂与手性消旋抑制试剂份额约为15-30%普利制药：公司已利用合成生物学技术成功开发了降糖和减肥原料药司美格鲁肽。诺泰生物：公司替尔泊肽原料药目前处于小试阶段。大多数多肽原料药已实现规模化生产，利拉鲁肽等多个长链修饰多肽药物的单批次产量超过5公斤。公司是国内少数以多肽药物为主要研究和发展方向的生物医药企业之一：围绕糖尿病、心血管疾病、肿瘤等疾病方向，以多肽药物为主、以小分子化药为辅，选择了具有较高技术壁垒和良好市场前景的仿制药进行研发，同时公司提供小分 子和多肽的定制类产品及服务。公司自主研发产品包括利拉鲁肽、司美格鲁肽、醋酸兰瑞肽等知 名品种。其中奥曲肽、胸腺法新及制剂已获得NMPA批准并通过GMP认证，奥曲肽、兰瑞肽已获得美国DMF并通过完整 性审核，依替巴肽已获得美国FDA批准。2022年，公司多肽类产品营业收入1.9亿元，同比增长126.27%。另外公司正在研发的一项GLP-1受体单靶点激动剂1类新药，目前临床试验申请已获得批准翰宇药业：多肽减重/降糖管线布局有替尔泊肽、司美格鲁肽注射剂及口服制剂美国申报正在积极筹备中、司美格鲁肽在国内申报正在按计划推进。蓝晓科技：公司的固相合成载体成功进入了礼来公司的供应链，并成为其减肥降糖药物替尔泊肽固相合成载体的主要供应商。2022年固相合成市场约6亿美金，占比2%。色谱填料/层析介质(主要用于多肽药物生产工艺中的分离纯化)2022年营收达到了19.2亿元，2017-2022年均复合增长率分别为147.7%与115.1%预计2025年国内市场将达到近百亿纳微科技：色谱填料/层析介质(主要用于多肽药物生产工艺中的分离纯化)2022年营收达到了7.06亿元.由于海外公司起步较早，因此国内的色谱填料/层析介质市场长期受Cytiva (GE)、Tosoh、bio-rad等海外公司主导。2020年以来，受疫情对国际供应链冲击的影响，国内各大医药企业纷纷将目光投向了本土厂商如纳微科技、蓝晓科技、博格隆等等，色谱填料/层析介质国产替代率明显提升。2017-2022年均复合增长率分别为147.7%与115.1%预计2025年国内市场将达到近百亿科源制药: 降糖减肥药+次新股公司曾互动表示，公司降糖领域的产品有二甲双那、格列齐特、维格列汀等。目前二甲双那适应症为用于单纯饮食控制不满意的II型糖尿病病人，尤其是肥胖和伴高胰岛素血症者，用本药不但有降血糖作用，还可能有减轻体重和高胰岛素血症的效果。金凯生科: 司美格鲁肽吸收增强剂中间体+次新股为司美格鲁肽口服制剂小分子吸收增强剂SNAC提供中间体服务。公司的一种产品是用于治疗糖尿病药物司美格鲁肽口服制剂小分子吸收增强剂SNAC的中间体。SNAC的出现可以让司美格鲁肽成为部分控制血糖注射剂的替代品，全面改善全球2型糖尿病患者依靠注射剂维持血糖的生活。中间体5000元/克司，GMP级单价超3万元/克。这也是目前国内唯一一家公布的，已经直接与诺和诺德有业务往来的公司；圣诺生物: 多药物CDMO1、公司是国内少数提供高水平多肽药物CDMO服务的企业，据2022年年报，公司已为新药研发企业和科研机构提供了40余个项目的药学研究服务，其中1个品种获批上市进入商业化阶段，18个多肽创新药进入临床试验阶段。多肽原料药年产量约为408kg2、公司利拉鲁时及利拉鲁肚注射液仿制药项目在国内尚处干临床[期阶段、司美格鲁肽现处干临床前研究阶段，均处干研发投入期:公司利拉鲁原料药2015年10月在美国DMF备案，目前尚无客户采购用于利拉鲁肽制剂的生产销售;司美格鲁脑原料药国外制剂客户尚未取得生产批件，所售原料药仅用于制剂研发使用。华东医药：国内厂家中目前唯一获批上市销售的GLP-1减肥药；其它各家基本都是临床期；公司目前已经布局司美格鲁肽注射液产品，为全资子公司中美华东与参股公司重庆派金合作开发，计划今年下半年进入Ⅲ期临床试验。利鲁平（利拉鲁肽类似药），仁会生物：贝那鲁肽注射液的超重适应症获批上市利拉鲁肽国内申请上市：通化东宝/科兴制药，翰宇药业，正大天晴万邦医药：利拉鲁肽（III 期）翰宇药业的司美格鲁肽注射液于2023年9月11日收到国家药品监督管理局签发的临床试验注册申请《受理通知书》。目前公司多肽减重/降糖管线布局有：替尔泊肽、司美格鲁肽、利拉鲁肽、艾塞那肽、二甲双胍缓释片、西格列汀二甲双胍、维格列汀、笔式注射器等，其中，利拉鲁肽原料药已经收获了海外制药企业商业批订单、利拉鲁肽制剂美国FDA申报已进入最后审评阶段；司美格鲁肽原料药已取得美国DMF备案、司美格鲁肽注射剂及口服制剂美国申报正在积极筹备中、司美格鲁肽在中国已收到国家药品监督管理局签发的临床试验注册申请《受理通知书》。感谢您的关注！来自 深交所互动易答复时间 2023-09-12 09:09:56药明康德：药物发现到商业化生产一体化CRDMO服务:总体积1万升+多肤固相合成仪，为礼来提供CDMO服务！凯莱英：多肤业务实验室级别到GMP生产全方位布局:2000平米GMP生产车间END深度聚焦多肽、多肽偶联药物研发、质控、工艺开发，7月相约苏州，联系电话18116036798戳“阅读原文”立即报名多肽药物论坛吧!