猪圆环病毒2型疫苗：商业应用和研究进展

2024-03-25

疫苗

▲ 详细日程见文末 ▲摘要：猪圆环病毒2型(PCV2)感染可导致猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)，给全球养猪业造成巨大的经济损失。传统的疫苗接种是预防和控制该病的主要措施。当前国际市场上现有的5种商业PCV2疫苗以及中国市场的10种PCV2疫苗，均能通过减轻临床病理表现和提高猪群生长性能，表现出良好的抗病毒效果。除了上市的圆环疫苗，目前也研发了多种具有保护效力的实验性疫苗，包括减毒嵌合疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、多价疫苗和病毒载体疫苗。这些实验性疫苗已被证明在提高猪的生产效率和简化免疫程序方面有效。佐剂能使疫苗具有更高的免疫保护力。本文综述了多种商业疫苗的应用以及实验性疫苗的研究进展，为今后研发预防和控制PCV2感染的优质疫苗提供更多的可能性。关键词：PCV2；PCVAD；商业疫苗；实验性疫苗；保护效力；佐剂。1介绍猪的传染病对畜牧业、国际贸易和人类公共健康产生了深刻的影响。猪圆环病毒2型(PCV2)相关疾病(PCVAD)于1991年首次在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪身上被发现，现称为PCV2系统性疾病。此外，PCV2与亚临床感染、坏死性肺炎、脑病、先天性震颤和生殖障碍相关。PCV2感染可诱导猪的免疫抑制，从而增强对其它病原的易感性，对疫苗的免疫反应较差。PCVAD目前被公认为养猪国家和地区最重要的疾病之一，对全球的生猪生产造成了严重的经济损失。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，是最小的DNA病毒之一，直径为16-18nm。PCV2的基因组为一个小的、单链的、封闭的环状结构，长1.7kb。可检测到大约10个开放阅读框(ORF)，PCV2主要由两个是首尾相连的ORF构成，即ORF1和ORF2。ORF1编码一个35.7kDa的复制酶蛋白，参与病毒复制环节；ORF2编码一个27.8kDa的结构衣壳(Cap)蛋白，其主要功能是作为宿主的免疫保护性抗原。ORF3蛋白诱导细胞凋亡，参与体内外病毒的发病机制，而ORF4蛋白可抑制半胱天冬酶活性，并抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖。PCV2由PCV2a～PCV2h 8种基因型组成，主要基因型为PCV2a、PCV2b和PCV2d，其次为PCV2c、PCV2e、PCV2f、PCV2g和PCV2h。一项回顾性研究显示，PCV2a于1962年首次在德国发现，并成为接下来几十年的流行毒株。在已知的单链DNA病毒中，PCV2具有最高的核苷酸置换率(1.2 ×10−3置换/位点/年)。在2006年第一个商业疫苗问世之前，PCV2逐渐经历了基因型转变，全球流行毒株从PCV2a缓慢地转变为PCV2b，病毒的毒力大大增强。近年来，PCV2经历了第二次基因型转变，主要流行毒株由PCV2b转变为PCV2d。世界范围内越来越多的免疫接种猪中发现了新出现的PCV2d毒株，推测PCV2d可能突破了现有疫苗的保护作用。与全球PCV2流行情况相似，中国2002-2008年期间PCV2b是主要的流行基因型，但2009年以后逐渐由PCV2d替代。除了PCV2a、PCV2b和PCV2d基因型外，还出现了PCV2f和PCV2h基因型。目前，PCV2防控的主要方法是疫苗接种。早期商业PCV2疫苗主要是用PCV2a制备，在个体和群体规模上提高了猪的生长性能；然而，PCV2b和PCV2d对PCV2疫苗的开发提出了新的挑战。本文综述了PCV2商业疫苗和实验性疫苗的研究进展，旨在为PCV2的预防、控制和疫苗开发提供理论参考。2商业PCV2疫苗商业PCV2疫苗主要分为两大类:全病毒灭活疫苗和Cap蛋白亚单位疫苗。目前，国际市场上现有的5种PCV2疫苗均可显著降低PMWS感染猪的临床病理表现和提高生长性能。此外，还可以提高平均日增重、改善饲料转化率，并降低其用药成本。2.1.PCV2灭活疫苗PCV2感染的细胞通过物理或化学(福尔马林)方法灭活，使PCV2失去感染细胞的能力，但仍保持良好的免疫原性，加入佐剂混合乳化制备成PCV2灭活疫苗。2006年，梅里亚(法国)成功开发了世界上第一款以轻石蜡油为佐剂的PCV2疫苗Circovac®，并经欧盟批准上市。该疫苗已被批准用于母猪(2ml)和仔猪(0.5mL)的免疫接种，可有效降低病毒血症、病毒组织载量、减少排毒和传播，并促进新生仔猪生长性能。另一研究表明，接种疫苗后不会改变公猪精子数量和质量。随后研究发现，Circovac®可以交叉保护猪免受PCV2b和PCV2d的攻击，从而为抵抗更多PCV2基因型的感染提供了可能。第二款灭活疫苗是FosteraTM PCV，由美国辉瑞动物保健公司生产的PCV1-2a嵌合灭活疫苗。选取PCV2a的ORF2基因被克隆到无致病基因PCV1的基因组中，以角鲨烷中的硫酰胺-环糊精作为佐剂。结果表明，FosteraTM PCV在接种后迅速产生了高水平的抗PCV中和抗体，与单独接种PCV2相比，显著降低了PCV2病毒血症的持续时间和滴度。然而，也有其他研究表明，接种FosteraTM PCV并不能产生高水平的中和抗体，也不能防止垂直传播。灭活疫苗不刺激细胞免疫，通常需要佐剂来增强其效果。2.2.亚单位疫苗利用基因工程方法由病毒主要免疫成分可制成亚单位疫苗。商业PCV2亚单位疫苗主要基于ORF2设计和生产。Cap蛋白具有中和表位，因此，可以诱导保护性免疫反应。目前，三种亚单位疫苗(CircoflexTM、Circumvent和Porcilis PCV®)已获准在国际市场上使用，它们均采用杆状病毒系统进行ORF2的表达，在失活和纯化后，病毒样颗粒(VLPs)在形态上与PCV2颗粒相同。在接种不同PCV2分离株后，该疫苗能诱导高水平的PCV2特异性中和抗体，并防止PCV2病毒血症的发生，鼻腔和粪便的PCV2分离毒株排出量明显减少，。在一项评估Porcilis PCV®疫苗对不同PCV2分离株攻毒保护的有效性研究中，一剂型Porcilis PCV®能显著诱导细胞介导的免疫反应，降低PCV2的病毒血症。另一项实验同时评估了四种商业PCV2疫苗：取3周龄仔猪分别接种Circovac®、FosteraTM PCV、CircoflexTM和Porcilis PCV® 4种疫苗，接种4周后用PCV2攻毒。在攻毒后14天和21天，四个免疫组的平均日增重均高于对照组；与商业灭活疫苗相比，亚单位疫苗CircoflexTM和Porcilis PCV®组的病毒载量和排毒量更低、组织病理学病变更轻，淋巴结PCV2抗原评分更低，PCV2特异性中和抗体和细胞免疫水平更高。2.3.中国的PCV2疫苗市场2000年，中国首次报道了猪圆环病毒在猪群中感染并随后传播到其他省份。感染PCV2降低了猪的免疫水平，影响了猪的生长性能，给中国养猪业造成了巨大的损失。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制了国内首支PCV2(LG株)灭活疫苗。随后，灭活疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗等约10种PCV2疫苗相继被开发并在国内市场应用(表S1)。3实验性PCV2疫苗除了上述商业疫苗外，学者们还广泛研究了各种类型的实验性PCV2疫苗，如灭活疫苗、减毒疫苗、减毒活疫苗、DNA疫苗、亚基因疫苗和多价疫苗等。这些实验性疫苗有望解决面对PCV2基因型突变的挑战，并有利于简化繁琐的疫苗接种程序。3.1.减毒嵌合疫苗嵌合疫苗在遗传水平上改变病原体的结构，将两种或两种以上病原体的基因组片段剪接或替换到一个载体，构建可表达多种抗原物质的重组载体，用于制备减毒和灭活疫苗。目前报道的实验性PCV2减毒活疫苗是由PCV1-2a和PCV1-2b制备的。对PCV1-2a减毒嵌合活疫苗的研究表明，减毒嵌合PCV1-2a在细胞培养中遗传稳定，在猪体内可连续传代不具备致病性。嵌合病毒PCV1-2a可以诱导猪保护猪免受PCV2b或PCV2d的攻击。且该病毒毒力明显较弱，使用时未见猪死亡病例。与PCV2b野毒株感染猪相比，猪的淋巴组织病理学损伤程度的PCV2特异性抗原的数量始终较低。用减毒嵌合PCV1-2b与野生型PCV1-2a和PCV1-2b接种猪相比，猪血清和组织中的病毒载量明显降低，临床症状明显减轻，表明减毒嵌合PCV1-2b病毒在猪体内引起了强烈的体液免疫，诱导猪对PCV2a和PCV2b产生交叉保护免疫反应。此外，PCV1-2b诱导了大量的IFN-γ-SCs。PCV1-2b可能是改良减毒活疫苗的候选疫苗。值得注意的是，嵌合PCV1-2a是从2008年在加拿大爆发的急性猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)分离出来的。因此，推测PCV1-2嵌合株的起源有两种可能，一种是来自嵌合疫苗的人工菌株，另一种是由于PCV1和PCV2的自然重组而产生的。3.2.核酸疫苗核酸疫苗利用基因工程构建重组载体，用基因注射技术进行免疫接种。作为一种新型疫苗，可以以特定的方式激活机体的免疫机制，实现快速免疫。核酸疫苗主要分为DNA疫苗和RNA疫苗，在病毒感染的防控中起着重要作用。目前PCV2核酸疫苗的研究主要集中在DNA疫苗上。核酸疫苗的接种方法各不相同，选择合适的核酸接种方法有助于提高疫苗的有效性。2004年，Kamstrup等人率先研究了PCV2 DNA疫苗，用基因枪对小鼠进行了三次免疫；PCV2 DNA疫苗可提高小鼠血清中PCV2抗体水平。Zhang等人还发现，与感染PCV2相比,PCV-like P1 DNA疫苗两次肌内免疫小鼠后可刺激较温和的PCV2病毒血症和组织病理学变化。使用PCV2 Cap基因DNA疫苗免疫小鼠后，可诱导高水平的高特异性血清抗体和细胞因子(干扰素-γ和白细胞介素(IL)-10)，并降低组织中的PCV2病毒载量，对PCV2的感染具有很强的保护作用。然而，DNA疫苗的发展容易受到质粒降解和递送等因素的限制。为了克服这些局限性，研究人员通过优化质粒构建、佐剂选择和疫苗递送系统来增强DNA疫苗的免疫应答。未来，核酸疫苗或将成为畜牧养殖业疾病防治和人类疾病防控领域的代替生物制品，具有广阔的应用前景。3.3.病毒样颗粒(VLPs)亚单位疫苗VLPs模仿了病毒的结构，VLP疫苗可以刺激强烈的B淋巴细胞和T淋巴细胞介导的免疫反应。在昆虫细胞中表达的重组Cap蛋白能形成VLPs，用于制备商业化的PCV2亚单位疫苗。然而，由于受到细胞培养成本和纯化时间的限制，仍需对该方法进行改进。Cap蛋白的N端具有核定位信号(NLS)，该部分富含精氨酸残基和多种稀有密码子，阻碍了外源基因在大肠杆菌中的表达。通过密码子优化和使用含有一个额外的稀有tRNA基因的大肠杆菌宿主菌株，可以提高Cap蛋白的表达水平。Wu等人在大肠杆菌系统中成功表达了不含任何融合标签的全长Cap1-233 VLP，并发现Cys108是衣壳组装所必需的。PCV2 VLP免疫猪可诱导特异性抗体免疫应答，并能够抵抗PCV2的侵袭，这为大规模生产PCV2 VLP疫苗提供了基础。Chi等人利用gE缺陷型伪狂犬病病毒(PRV)构建了重组gE(−)/PCV2 cap(+)PRV，用PCV2的cap基因替换部分gE基因的上游基因，表达的cap蛋白自组装成VLPs，纯化后的VLPs在免疫小鼠或豚鼠后能诱导显著免疫反应。噬菌体核衣核融合蛋白可以在大肠杆菌中通过质粒表达，保持可溶性并与外源多肽形成噬菌体颗粒，用于疫苗生产实践中。有研究者将PCV2 Cap构建成噬菌体λ颗粒，并在大肠杆菌中表达，诱导PCV2中和抗体，引发B细胞和T细胞介导的免疫反应。弹性蛋白的疏水区域含有弹性蛋白样肽(ELPs)，重复序列基序为缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-Xaa-甘氨酸，其中Xaa可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。在大肠杆菌中，ELP与PCV2 Cap构建融合蛋白进行表达，PCV2 Cap通过反向转化循环得到高纯度蛋白。将纯化的ELP-Cap融合蛋白组装成Cap蛋白VLPs (ELP-VLPs)。并将该疫苗与袁立家商业灭活疫苗和CircoflexTM疫苗在有效性方面进行比较，发现ELPylated VLP PCV2疫苗产生的中和抗体水平和干扰素应答方面均明显较高。3.4.病毒载体疫苗养殖生产过程中，猪需要接种多种病原体疫苗。二价疫苗和多价分疫苗可大大简化免疫接种程序、减轻养猪业的经济负担。为了增加疫苗表位的宽度，已有开发一种PCV2a-PCV2b二价疫苗。PCV2疫苗对于不同基因型的交叉保护效果不理想，但二价PCV2疫苗能提供更好的保护。将猪IL-18基因、PCV2 Cap和马兽疫链球菌（SEZ）M样蛋白(SzP)基因共同插入猪痘病毒(SPV)基因组，构建重组猪痘病毒rSPV-ICS，对PCV2和SEZ的共同感染具有良好的保护作用。以猪PCV2 Cap VLP和猪细小病毒(PPV) VP2 VLP为基础的联合疫苗可显著提高仔猪的生长性能，减轻PCV2和PPV共同感染引起的PCVAD及相关疾病。重组疫苗BacSC-Dual-GP5-Cap在杆状病毒系统中同时表达PRRSV GP5糖蛋白和PCV2衣壳蛋白，可引起高水平的病毒中和抗体，并诱导淋巴细胞增殖反应。PCV2和肺炎支原体二价疫苗(FosteraTM PCV)也有很好的保护作用。腺病毒表达载体具有易构建及诱导体液、粘膜和细胞免疫的优势。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和CD40L或内含子A和WPRE-modified PCV2 Cap的腺病毒载体疫苗不及商业PCV2灭活疫苗有效。将重组腺病毒疫苗Ad-A-spCD40L-spCapspGMCSF-W与市售灭活疫苗PCV2 SH株结合后，表现出强大的免疫应答和保护作用，有望成为PCVAD的候选疫苗。此外，有研究表明假结核耶尔森菌侵袭素（Inv）蛋白能够增强免疫应答，可用于构建含有PCV2b Cap和InvC基因的重组腺病毒，使其拥有良好的免疫反应。4佐剂的应用佐剂可以增强猪对抗原的免疫反应，改变免疫反应的类型，提高机体抗体水平或产生更有效的保护性免疫。PCV2疫苗佐剂主要分为化学佐剂和分子佐剂两大类(表1)。表1 佐剂在PCV2实验性疫苗中的应用。4.1.化学佐剂含有油佐剂的PCV2全病毒灭活疫苗可引起猪高水平的体液免疫。接种脂质体佐剂的PCV2 DNA疫苗可明显提高猪细胞分泌干扰素γ和中和抗体的水平，经PCV2攻毒后，显著降低了PCV2病毒血症。4.2.分子佐剂结核分枝杆菌热休克蛋白70 (HSP70)的C端结合部分与PCV2 Cap基因融合，构成PCV2 DNA疫苗并发挥佐剂作用，增强小鼠血清中的IgG水平和辅助性Th1细胞免疫应答。此外，与PCV2 DNA疫苗结合的分子佐剂可增强小鼠中Th1细胞的免疫应答，以及cap基因特异性抗体水平。IL-2和GMCSF作为免疫佐剂，有效增强PCV2 cap亚单位疫苗对小鼠的免疫保护作用。壳寡糖(COS)通过与灭活疫苗物理混合或与亚单位疫苗共价连接来提高PCV2疫苗的免疫原性。虽然高度去乙酰化的COS与商业化佐剂有相似的作用。不过当进一步结合载体蛋白(卵白蛋白)时，COS-OVA-PCV2疫苗与商业化佐剂（ISA206）物理混合的PCV2疫苗相比，更能促使机体产生高水平的PCV2特异性抗体和细胞因子。猪CD40配体(CD40L)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)可以协同增强PCV2腺病毒疫苗(Ad-CD40L-Cap-GMCFS)的体液和细胞免疫应答,与Ad-Cap、Ad-CD40L-Cap或Ad-Cap-GMCSF组相比，在PCV2攻毒后，该腺病毒疫苗增强了小鼠PCV2特异性抗体水平和中和活性、淋巴细胞增殖活性和Th1细胞因子水平，降低了病毒载量。TLRs的微生物配体包括细菌DNA和细菌鞭毛蛋白的未甲基化胞嘧啶磷酸鸟嘌呤(CpG)基序，被人们认为是病原体相关分子模式(PAMPs)。有报道称，CpG基序作为免疫佐剂可对PCV2具有免疫效力。哺乳动物补体成分C3的末端降解产物(C3d)与B细胞上的补体受体2结合并被用作疫苗佐剂，调节适应性免疫应答。将多个拷贝的C3d分子或其最小结合域C3d-p28偶联到疫苗上，可以明显增强疫苗的特异性应答反应。利用PCV2d的CD3-P28基因和ORF2基因构建pVAX1-ORF2-C3d-P28.3 DNA疫苗，诱导体液和细胞免疫反应，并保护猪免受PCV2b和PCV2d的攻击。猪IFN-γ作为一种免疫佐剂，可显著提高Cap亚单位疫苗诱导免受PCV2的攻击。鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(FliC和FljB)通过激活TLR 5-positive DCs发挥免疫调节作用。鞭毛蛋白与PCV2 Cap在杆状病毒系统的融合表达，或在PCV2疫苗中使用FliC作为佐剂，均可增强小鼠和猪体内B细胞和T细胞介导的免疫应答反应。5PCV2疫苗的其他问题5.1.PCV2减毒疫苗的研发难点由于PCV2基因组的高突变率和新型PCV2亚型的出现，PCV2疫苗的研发一直处于不断更新的状态。与灭活疫苗相比，减毒疫苗能更好的介导细胞免疫，产生更快的免疫效果。据Fenaux研究发现，PCV2在PK-15细胞中连续传代120次后，ORF2基因仅发生328个(C328G)和573个(A573C)突变，由此产生的PCV2对SPF仔猪的毒力较低。然而，PCV2疫苗在120次连续传代后产生的潜在毒力可能会对实际的临床应用构成风险。5.2.适合PCV2增殖的细胞选择PCV2在复制过程中依赖于有丝分裂S期表达的蛋白，在PK-15细胞培养过程中加入氨基葡萄糖可刺激细胞分裂，从而促进PCV2复制。Hirai等发现猪肝原代细胞比猪肾细胞更适合PCV2的增殖。青岛澳兰百特生物工程有限公司通过克隆PK15-B1细胞系来提高PCV2的滴度，用于生产PCV2疫苗，灭活前的PCV2滴度≥107.5TCID50/mL。然而，目前大多数PCV2灭活疫苗仍在使用传统的PK-15细胞。5.3.PCV2疫苗评价的复杂性测定组织和血液中的病毒载量，病理评分和PCV2抗原在淋巴结分布，PCV2特异性抗体水平，淋巴细胞增殖活性和细胞因子水平，和/或生长性能均可用于评估PCV2疫苗的有效性。然而，目前对PCV2疫苗的效果评价尚无统一的标准。6结论目前，国际和中国市场上应用的商业疫苗对PCVAD具有良好的临床效果，且对PCV2的感染有效。然而，随着PCV2基因型的增加，开发能够提供预防和控制的疫苗至关重要。研究发现，一些实验性PCV2疫苗可以刺激机体的体液和细胞免疫，且在降低PCV2病毒血症和增加血清抗体水平方面优于市售疫苗。据多项研究报道，PCV2 VLP疫苗具有完整的PCV2病毒衣壳，并具有免疫原性。因此，开发佐剂来提高疫苗的效力是研究的重点。在预防人类疾病方面，体外转录(IVT)mRNA因其有效性、生产速度快、成本低、能够应对病毒突变等优点逐渐引起了研究者们的关注。然而，因其相对较新的技术和运输限制，mRNA疫苗还尚未被用作实验性PCV2疫苗的候选疫苗。随着这些问题的解决，mRNA疫苗将可用于预防和控制PCVAD。此外，PCV2疫苗的开发速度还远不及PCV2的进化速度。因此，研究PCV2流行株变异后的流行病学尤为重要。参考资料：Guo J, Hou L, Zhou J, Wang D, Cui Y, Feng X, Liu J. Porcine Circovirus Type 2 Vaccines: Commercial Application and Research Advances. Viruses. 2022 Sep 10;14(9):2005. doi: 10.3390/v14092005. PMID: 36146809; PMCID: PMC9504358.为了推动兽用生物制品行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展、乘风济海将于2024年4月17日-18日在南京共同举办“兽用生物制品研发和产业化大会”，系中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）中的一个分领域专业会议。诚邀全国相关领域研究者共享学术盛会。名称：兽用生物制品研发和产业化大会时间：2024年4月17日-18日（周三-周四）地点：南京国际展览中心主办单位：生物制品圈、抗体圈、四叶草会展，乘风济海媒体支持：药时空、细胞基因研究圈报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请（严格审核通过）。大会日程注：大会日程以会议现场为准。中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）是一场将“政、产、学、研、用、管、投”各方精英围绕全产业链新资源展开的合作大会，将于2024年4月16日-18日在南京国际展览中心举办。大会将主打“全产业链新资源对接”，围绕投资、立项、临床前研发、临床研究、生产、供应链国产化、销售、MAH合作、国际品种合作、公司股权合作与并购全产业链，为中国医药同仁带来全新的资源与商机。大会下设的同期会议包括：宠物药品、食品、保健品新资源大会兽用生物制品研发和产业化大会透皮技术研发生产与注册开年分享会吸入制剂研发、生产与注册新机遇新进展分享会中国改良新药与缓控释制剂全产业链合作大会多肽产业创新与发展大会新药典新型辅料与包材产品与技术交流会新药典新型实验室仪器与耗材实操演示交流会陆续更新中......识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。